4.1 Dinamično sipanje svetlobe - DLS
4.2.2 Meritve in analiza
4.2.2.2 Analiza DDM meritev vzorcev S3 in S4
Vzorca S3 - d(GCG2AG4AG2) in S4 - (GCG2AG4AG2CG) sta si kvalitativno zelo podobna. Pri analizi DDM meritev obeh vzorcev se je izkazalo, da se k meritvam te-oretična krivuljag(1)ujema bolje, če razteznemu parametruγ1dovolimo, da zavzame vrednosti večje od 1. Pri tem smo upoštevali še pogoj γ2 < 1 drugega razteznega parametra. Prilegali smo tudi teoretično krivuljo, kjer smo oba raztezna parametra γ1 inγ2 omejili, pri čemer velja γ1, γ2 <1.
S3 - d(GCG2AG4AG2)
Za vzorec S3 - d(GCG2AG4AG2) so nekatera prileganja krivulj za izbrane sipalne valovne vektorje q pri temperaturi 24,4°C vidna na slikah 4.41. Poleg so prikazane normirane krivulje in ustrezno normirani podatki. Kot vidimo, so prileganja kri-vulje g(1)(q, τ) k meritvam mnogo boljša, kadar ne omejimo parametra γ1. Da je relaksacija hitrejša od eksponentne, je nepričakovano. Pojava zaenkrat ne znamo pojasniti.
(a)γ1>1,γ2 ≤1 (b)γ1, γ2≤1
(c) γ1 >1,γ2≤1 (d)γ1, γ2≤1
Slika 4.41: Prileganje dvorelaksacijske funkcije g(1)(q, τ)za vzorec S3. Prikazane so le izbrane meritve pri določenih q/q0 brez merilnih negotovosti zaradi boljše pregle-dnosti. Pri (a) in (b) je razvidno prileganje krivulje k “neobdelanim” podatkom. Pri (c) in (d) so krivulje in podatki ustrezno normirani.
Najprej si poglejmo dobljeno frekvenčno odvisnost od q2 hitrega relaksacijski načina, ki je vidna na sliki 4.42. Rezultata sta si precej podobna, ne glede na
Poglavje 4. Eksperimenti in meritve
pogoje prileganja krivulje. Vidna je izrazita nelinearna odvisnost, kar je v nasprotju z dosedanjimi ugotovitvami hitrega relaksacijskega načina. Možno je, da gre za poseben relaksacijski način, za katerega nimamo izdelanega modela.
Slika 4.42: Frekvenca hitrega relaksacijskega načina za vzorec S3 - d(GCG2AG4AG2) v odvisnosti od q2.
Drugače je s počasnim relaksacijskim načinom, kjer dobimo tudi kvantitativen rezultat, s katerim ga potrdimo. Iz grafov odvisnosti frekvence od q2 na slikah 4.43, razberemo počasne difuzijske konstante. Pri pogojih γ1 >1in γ2 ≤1 sta vrednosti počasne difuzijske konstante:
Dt= (8,44±0,06)·10−13 m2/s in ⟨︁
Dt⟩︁
= (5,99±0,03)·10−13 m2/s. Pri pogojih γ1, γ2 ≤1 dobimo za počasni difuzijski konstanti:
Dt= (4,22±0,03)·10−13 m2/s in ⟨︁
Dt⟩︁
= (3,94±0,02)·10−13 m2/s. Vrednost počasne difuzijske konstante je 2-krat višja pri boljšem ujemanju teore-tičnih krivulj g1(q, τ) k merjenim podatkom. Zanimivo pa je, da se DDM rezultati
Slika 4.43: Dobljeni rezultati frekvence počasnega relaksacijskega načina za vzorec S3 - d(GCG2AG4AG2) v odvisnosti odq2 pri različnih pogojih prileganja teoretične krivulje g(1)(q, τ).
4.2. Diferenčna dinamična mikroskopija - DDM
počasne relaksacijske frekvence z rezultati počasne relaksacijske frekvence DLS me-ritev nepričakovano bolje ujemajo pri pogojih, pri katerih je prileganje teoretične krivulje g(1),(q, τ) k merjenim podatkom slabše. Primerjava med DDM in DLS re-zultati, pridobljenih iz meritev 28. junija 2021 pri temperaturi 24,4°C na prenosni DLS napravi, je vidna na slikah 4.44.
Slika 4.44: Primerjava počasne relaksacijske frekvence na DDM in DLS napravi za vzorec S3 - d(GCG2AG4AG2).
S4 - d(GCG2AG4AG2CG)
Za vzorec S4 - d(GCG2AG4AG2CG) veljajo podobne ugotovitve kot za prejšnji vzo-rec. Analizo smo pričeli s prileganjem teoretične krivuljeg(1)(q, τ)k meritvam, ki so bile izvedene pri temperaturi 24,2°C. Prileganje teoretične krivulje je vidno na slikah 4.45. Tudi tukaj je prileganje teoretične krivuljeg(1)(q, τ)boljše, če upoštevamo pri tem pogoj razteznega parametra hitrega relaksacijskega načina γ1 >1.
Na slikah 4.46 so prikazani rezultati hitre in počasne frekvenčne odvisnosti od q2 za vzorec S4 - d(GCG2AG4AG2CG). Tudi tukaj je vidna izrazita nelinearna fre-kvenčna odvisnost odq2hitrega relaksacijskega načina. Pri počasnem relaksacijskem načinu, so rezultati pri pogoju γ1, γ2 <1manj smiselni, kljub temu, da ni velikega odstopanja prilegajoče se teoretične krivulje k merjenim podatkom. Zato smo v na-daljni analizi primerjali rezultate le pri pogoju prileganja teoretične krivulje γ1 >1 inγ2 ≤1.
Ponovno si podrobneje lahko pogledamo počasen relaksacijski način. Tudi tokrat razberemo iz naklona prilegajoče se premice k dobljenim frekvencam prepričamo, da gre za počasen relaksacijski način, katerega rezultat počasne difuzijske konstante je
Dt = (4,97±0,03)·10−13 m2/s in ⟨︁
Dt⟩︁
= (4,±0,02)·10−13 m2/s. Rezultate počasnega relaksacijskega načina smo primerjali še z rezultati meritev stacionarne DLS naprave z dne 28. junija 2021 pri temperaturi 24,4°C. Primerjava je vidna na slikah 4.47. Tudi tukaj se nakazuje, da so si rezultati med seboj primerljivi.
Z DDM napravo smo sicer uspeli pridobiti podatke skoraj do sipalnega valovnega vektorja q ≈4,24·106 m−1, kar ustreza kotu θ≈15,5° na DLS napravi. Manjkajo nam seveda podatki med kotoma 15° in 30°. S tem bi povezava med rezultati DDM in DLS naprave, če so pridobljeni rezultati seveda smiselni, bila bolje vidna.
Poglavje 4. Eksperimenti in meritve
(a) γ1 >1,γ2≤1 (b)γ1, γ2 ≤1
(c)γ1>1,γ2 ≤1 (d)γ1, γ2 ≤1
Slika 4.45: Prileganje dvorelaksacijske funkcije g(1)(q, τ) za vzorec S4 -d(GCG2AG4AG2CG). Prikazane so le izbrane meritve pri določenih q/q0 brez me-rilnih negotovosti zaradi boljše preglednosti. Pri (a) in (b) je razvidno prileganje krivulje k “neobdelanim” podatkom. Pri (c) in (d) so krivulje in podatki ustrezno normirani.
(a) Hiter relaksacijski način. (b) Počasen relaksacijski način.
Slika 4.46: Frekvenčna odvisnost od q2 hitrega in počasnega relaksacijskega načina za vzorec S4 - d(GCG2AG4AG2CG) pri temperaturi 24,2°C.
4.2. Diferenčna dinamična mikroskopija - DDM
(a) DDM rezultati. (b) Kombinirani rezultati.
Slika 4.47: Primerjava počasne relaksacijske frekvence na DDM in DLS napravi.
Poglavje 4. Eksperimenti in meritve
Poglavje 5
Analiza rezultatov in razprava
Pri DLS meritvah se je izkazalo, da je zelo pomembna kalibracija eksperimentalne naprave. Pomembna je tudi čista čaša, v katero nalijemo deionizirano vodo. Z vsako prisotno nečistočo, analiza meritev postane težja. Zelo pomembno je tudi vpetje vzorca. Želimo, da kolikor se le da, potuje žarek ravno skozi vzorec in se čim manj lomi. Pri začetnih meritvah smo bili manj pozorni na omenjene malenkosti, zato so meritve, opravljene v letu 2021, mnogo boljše in zanesljivejše. To se še posebej opazi pri počasnem relaksacijskem načinu in manj pri hitrem relaksacijskem načinu.
Rezultate bi lahko izboljšali z izbranim manjšim časovnim zamikom meritev na korelatorju. Meritve smo opravili pri časovnem zamiku okoli 0,1 µs. Najmanjši časovni zamik, ki ga je korelator še sposoben zaznati, pa je nekaj ns. Predvsem nam bi to izboljšalo rezultate meritev v VH načinu in s tem oceno preseka d in dolžine L v privzetem modelu cilindričnih paličic.
Izkazalo se je tudi, da je stacionarna DLS naprava boljša od prenosne DLS na-prave, kar se najbolj opazi pri depolariziranih - VH meritvah in rezultatih, ki pa imajo še vedno veliko negotovost. Kljub temu smo zelo zadovoljni, saj smo poka-zali, da so delci v suspenzijah anizotropni in da zagotovo gre za večje strukture.
Z napovedmi se skladajo tudi rezultati vzorcev S3 in S4, pri katerih smo trdili, da se posamezni kvadrupleksni dimeri ne povezujejo v večje strukture. Pri teh dveh vzorcih nismo dobili signala v depolariziranem - VH načinu merjenja. Njuna tran-slacijska difuzijska konstanta je tudi večja od ostalih za 1 velikostni red, kar je še drugi pokazatelj, da gre za občutno manjše sipalce, kot v ostalih vzorcih.
Porajalo se nam je vprašanje, ali so meritve ponovljive. Odgovor je delno pri-trdilen. Če si pogledamo rezultate translacijske difuzijske konstante meritev ob različnih datumih, so si vrednosti relativno podobne. Rezultati so večinoma podani z negotovostjo na 2. decimalnem mestu. Menimo, da je pri večini rezultatov podana negotovost podcenjena in bi morala biti 2-krat ali 3-krat tolikšna. V okviru večje negotovosti lahko pričnemo govoriti o zelo dobri ponovljivosti meritev. Drugače je pri počasnem relaksacijskem načinu, za katerega ob drugačnih pogojih, na primer pri drugačni temperaturi merjenja ali drugem dejavniku, dobimo precej različen re-zultat. Točnega razloga, zakaj je tako, ne moremo določiti. Kljub temu pa opazimo ponavljajoč se vzorec. Počasna relaksacijska frekvenca najprej narašča nelinearno, kjer imamo na abscisni osi skaloq2, doseže vrh in prične padati proti začetnim vre-dnostim ali ostane na platoju. Zanimivo je, da vrednosti večinoma dosežejo vrh pri kotu θ∼90°−110°, pri tem je potrebno poudariti, da je ta ocena zelo subjektivna.
Poglavje 5. Analiza rezultatov in razprava
Zaradi zgoraj naštetih razlogov o ponovljivosti počasnega relaksacijskega načina težko govorimo.
Vzorce je koristno razporediti še po velikostih hidrodinamskega polmeraRh, ki je bolj zanesljivo merilo o velikostih delcev, kot rezultat presekad in dolžineL. Vzorci si po velikostih Rh, od večjega do najmanjšega sledijo: S1_264 > S1 1mM oligo 300 mM KCl > S1 1 mM oligo 100 mM KCl, 3 mM oligo 100 mM KCl S1_t363
> S1_363 > S3 > S4. Zelo nas pa veseli rezultat, da dobimo v okviru modela cilindričnih paličic, presek d v okviru do sedaj ocenjenega preseka d ∼ 2,5 nm posameznih G-kvartetov [6] za vse pomerjene vzorce. Izjema so le vzorci 3. sklopa, katerih rezultati, za rotacijsko difuzijsko konstanto, so zelo nenavadni. Vrednost rotacijske difuzijske konstante je za faktor 3 – 6 - krat manjša kot za vzorec S1 1mM oligo 100 mM KCl iz drugega sklopa. Pri vzorcih 3. sklopa smo želeli pridobiti tudi informacijo o vplivu koncentracije dodanih posameznih kvadrupleksnih enot ali soli.
Pri tem smo bili neuspešni. Ugotovili smo le, da oba vzorca s 300 mM koncentracijo soli, tvorita oborino. Iz neznanega razloga tvori oborino tudi vzorec S1_363. Vzorci, ki so tvorili oborino, so prikazani na slikah 5.1.
Oborina
S1 363 - d(G3AG6AG3)
S1 - d(G2AG4AG2) 3 mM oligo 300 mM KCl
S1 - d(G2AG4AG2) 1 mM oligo 300 mM KCl
Slika 5.1: Vzorci z oborino v steklenih cevkah za NMR spektroskopijo. Vsebina je označena z rdčeo krožnico. Oborina se nahaja na dnu zaprte steklene cevke. Pri meritvah je laserski žarek potekal skozi zgornji, prozoren del vzorca.
Z DDM napravo pridobimo informacijo o sistemu pri mnogo nižjih kotih oz.
mnogo manjših sipalnih valovnih vektorjih q, kot pri DLS napravi. S tem bi lahko naredili primerjavo rezultatov med obema tehnikama. Vodilo k temu so pripomogli tudi rezultati počasnega relaksacijskega načina, ki je bolj opazen pri nižjih kotih.
Želeli smo preveriti, ali se rezultati DDM meritev nadaljujejo in so skladni z rezultati DLS meritev. Delno nam je to sicer uspelo. Vseeno z meritvami in rezultati nismo povsem zadovoljni. Možno je tudi, da razlika izvira iz drugačne priprave vzorcev za DDM napravo.
Kot opisano, smo z DDM napravo želeli še dodatno analizirati počasen relaksa-cijski način, kljub temu, da njegov pojav v celoti ni znan. Obstaja pa utemeljen sum, da počasen relaksacijski način povzroča precipitat oz. delci oborine ali drugi večji sipalci v vzorcu, saj smo pri meritvah zaznavali nekakšen šum, kadar teh delcev ni bilo v vidnem polju.
Na tej točki moramo priznati, da se v podrobnosti delovanja DDM naprave nismo spuščali kot pri DLS metodi. Tu predvsem mislimo na algoritem računanja avto-korelacijske funkcije, ki deluje v ozadju. Pričakovali bi, da poljska avtokorelacijska funkcija g(1) pri zelo majhnem časovnem zamiku τ →0, doseže vrednost g(1) ∼1in pri zelo dolgem časovnem zamikuτ → ∞zavzame vrednostg(1) = 0. Kot vidimo na grafih 4.33a, 4.35a, 4.37a, 4.39a, 4.41a in 4.45c, se to ne dogodi in nam je povzročalo kar precej preglavic pri analizi. Pri prileganju poljske avtokorelacijske funkcije g(1) k meritvam smo si zato pomagali razteznim faktorjemj in popravek bazne linijey0. Pri primerjavi DDM meritev in rezultatov z DLS meritvam in rezultati, smo izbrali takšne DLS meritve, pri katerih je bila temperatura najbolj podobna tempe-raturi, pri katerih so bile izvedene DDM meritve. S tem smo upali, da pridobimo najboljšo primerjavo med obema tehnikama. Kot smo videli, se z obema tehnikama najbolje ujemajo rezultati vzorca S1_363. Pogojno se ujemajo tudi rezultati poča-sne relaksacijske frekvence vzorcev S3 in S4. Kot že omenjeno ni jasno, zakaj ima dodatno opažen relaksacijski način občutno hitrejšo relaksacijo od eksponentne z razteznim faktorjem γ1 > 1. Pri ostalih vzorcih rezultati kažejo na ujemanje med obema tehnikama. Za potrditev ujemanja manjkajo DLS meritve med kotoma 15°
do 30°.
Poglavje 5. Analiza rezultatov in razprava
Poglavje 6 Zaključek
V magistrskem delu smo se poglobili v metodo dinamičnega sipanja svetlobe - DLS in predstavili osnove metode diferenčne dinamične mikroskopije - DDM. Z meto-dama smo merili suspenzije z gvaninom bogatih oligonukleotidov, ki ob prisotnosti ustreznih kationov tvorijo daljše strukture imenovane G-žičke. Pri analizi smo na DLS meritvah implementirali model Brownovega gibanja cilindričnih paličic in pri tem bili dokaj uspešni. Pri tem smo se skoncentrirali predvsem na hiter relaksacijski način, s pomočjo katerega smo ocenili, kateri vzorci tvorijo največje agregate. Podali smo tudi ocene za parametra presek d in dolžino L za model cilindričnih paličic.
Poleg hitrega relaksacijskega načina smo opazili tudi počasen relaksacijski način, za katerega sumimo, da ga povzročajo večji delci, ki so lahko posledica precipitata oz. oborine v vzorcu ali drugih večjih sipalcev. Do tega zaključka smo prišli na podlagi uporabe DDM merilne metode, s katero smo želeli podrobneje analizirati počasen relaksacijski način, ki je vidnejši pri manjših sipalnih valovnih vektorjih q. Delno smo pokazali tudi, da se rezultati počasnega relaksacijskega načina DDM merilne metode ujemajo z rezultati DLS merilne metode, pri kateri bi bilo koristno narediti še meritve med koti 15° in 30°.
Po naši oceni je za določevanje velikosti G-žičk prejetih vzorcev boljša metoda DLS merilna tehnika. S krajšim izbranim časovnim zamikom τ na korelatorju bi končne ocene dimenzij G-žičk najverjetneje bile tudi natančnejše, čeprav, kot že omenjeno, so rezultati s to merilno tehniko zadovoljivi. Nekoliko več prostora za napredek omogoča DDM merilna tehnika, pri kateri bi lahko že drugačna priprava vzorcev izboljšala meritve in s tem končen rezultat. Kljub temu smo pokazali, da se določene lastnosti vzorcev s to tehniko lahko zaznajo in merijo, rezultati obeh merilnih metod pa se med seboj smiselno dopolnjujejo.
Poglavje 6. Zaključek