Analiza tretjega sklopa vzorcev

VzorecS1 1 mM oligo 300 mM KCl - d(G2AG4AG2):

Za začetek se osredotočimo na meritve s slik 4.5a in 4.5b. S pomočjo translacij-ske difuzijtranslacij-ske konstante (slika 4.25a), izluščimo iz VH meritev rotacijsko difuzijsko konstanto (slika 4.25b). Kvantitativni rezultati so zbrani v tabeli 4.9.

Glede na to, da je presek G-kvarteta (slika 1.2) ocenjen na d ∼ 2,6 nm [6], je rezultat preseka d v tabeli 4.9 zelo presenetljiv in zelo vprašljiv, saj je zagotovo za red ali dva premajhen. Razlog morebiti tiči pri formaciji oborine, ki smo jo v tem vzorcu prvič opazili 13. maja 2021. Sum prihaja tudi iz analize hitrega in počasnega relaksacijskega načina vseh meritev izbranega vzorca, izvedene v VV načinu. Analizi sta prikazani na slikah 4.26, kvantitativni rezultati pa so razvidni v tabeli 4.10. Opazno je krepko odstopanje vrednosti translacijske difuzijske konstante D^r ob prisotnosti oborine. Opazna je tudi precejšnja razlika pri obnašanju počasne

Poglavje 4. Eksperimenti in meritve

relaksacijske frekvence, na katero bi lahko dodatno vplivala tudi temperatura. Vrh počasne relaksacijske frekvence ocenimo pri kotu θ ∼95°−110°.

(a) (b)

Slika 4.25: (a) Prileganje premice k dobljenim podatkom iz VV načina merjenja pri temperaturi 24,8°C. (b) Prileganje konstante k izračunomconst= 6D^r =f_{V H}(q²)− D^tq² pri temperaturi 24,5°C.

Tabela 4.9: Rezultati vzorca S1 1 mM oligo 300 mM KCl za izbrane meritve.

količina σ_i količina σ_i

D^t [m²/s]3,09·10⁻¹¹0,02·10⁻¹¹⟨D^t⟩ [m²/s]3,01·10⁻¹¹0,02·10⁻¹¹

R_h [nm] 7,8 0,2 ⟨R_h⟩ [nm] 8,0 0,2

D^r [kHz] 35 12 ⟨D^r⟩ [kHz] 10,3 6,3

L [nm] 100 – 67 ⟨L⟩ [nm] 153 – 118

d [nm] 0,2 – 1,3 ⟨d⟩ [nm] 0,02 – 0,11

(a) (b)

Slika 4.26: Analiza vseh meritev vzorca S1 1 mM oligo 300 mM KCl v VV načinu.

(a) Hiter relaksacijski način in (b) počasen relaksacijski način.

4.1. Dinamično sipanje svetlobe - DLS Tabela 4.10: Tabela rezultatov vseh meritev vzorca S1 1 mM oligo 300 mM KCl v VV načinu.

datum naprava temp D^t [m²/s] D^t(25°C) [m²/s] R_h [nm]

25. maj 2021 stac 24,5°C(3,09±0,02)·10⁻¹¹(3,13±0,05)·10⁻¹¹7,8±0,2 5. feb 2021 pren 23,1°C(2,56±0,02)·10⁻¹¹(2,69±0,04)·10⁻¹¹9,1±0,2 14. jan 2021 pren 21,6°C(2,48±0,04)·10⁻¹¹(2,72±0,05)·10⁻¹¹9,0±0,2

VzorecS1 3 mM oligo 100 mM KCl - d(G2AG4AG2):

Najprej se posvetimo analizi izbranih meritev s slik 4.5c in 4.5d, kjer najprej želimo pridobiti informacijo o translacijski in rotacijski difuzijski konstanti. Grafični prikaz analize vidimo na slikah 4.27, kvantitativni podatki pa so predstavljeni v tabeli 4.11.

(a) (b)

Slika 4.27: Analiza izbranih meritev vzorca S1 3 mM oligo 100 mM KCl dne 19.

in 20. maja 2021. (a) Prileganje premice k dobljenim podatkom iz VV načina merjenja. (b) Prileganje konstante k izračunomconst= 6D^r =f_{V H}(q²)−D^tq².

Tabela 4.11: Rezultati vzorca S1 3 mM oligo 100 mM KClza izbrane meritve.

količina σ_i količina σ_i

D^t [m²/s]4,24·10⁻¹¹0,03·10⁻¹¹⟨D^t⟩ [m²/s]4,10·10⁻¹¹0,04·10⁻¹¹

R_h [nm] 5,7 0,1 ⟨R_h⟩ [nm] 5,9 0,1

D^r [kHz] 37,9 7,4 ⟨D^r⟩ [kHz] 16,2 3,7

L [nm] 103 – 86 ⟨L⟩ [nm] /

d [nm] 0,01 – 0,06 ⟨d⟩ [nm] /

Zelo presenečata rezultata za premali presek d in preveliko dolžino L. Pri izra-čunu⟨d⟩ in⟨L⟩ rezultatov niti ne dobimo. Vrednost rotacijske difuzijske konstante

Poglavje 4. Eksperimenti in meritve

je zelo primerljiva z vzorcem S1 1 mM oligo 300 mM KCl, ki je tvoril oborino. Kar postavlja tudi nov dvom, če in koliko nastanek oborine vpliva na meritve in rezultat, saj je pri tem vzorcu nismo opazili.

O možnem vplivu temperature na počasni relaksacijski način smo že govorili.

Da je počasen relaksacijski način bolj viden pri višji temperaturi, opazimo tudi pri tem vzorcu. Obnašanje počasne relaksacijsek frekvence je vidno na desni sliki 4.28. Kot, pri kateri vrh vrednosti počasne relaksacijske frekvence, ocenjujemo, da je θ ∼ 95° −110°. Na levi sliki 4.28 imamo prikaz treh rezultatov translacijske difuzijske konstante D^t, v tabeli 4.12 pa njihove vrednosti. Rezultat stacionarne DLS naprave vidno odstopa od preostalih dveh. Razlog je neznan.

(a) (b)

Slika 4.28: Analiza vseh meritev vzorca S1 3 mM oligo 100 mM KCl v VV načinu.

(a) Hiter relaksacijski način in (b) počasen relaksacijski način.

Tabela 4.12: Tabela rezultatov vseh meritev vzorca S1 3 mM oligo 100 mM KCl v VV načinu.

datum naprava temp D^t [m²/s] D^t(25°C) [m²/s] R_h [nm]

20. maj 2021 stac 23,7°C(4,24±0,03)·10⁻¹¹(4,39±0,07)·10⁻¹¹5,6±0,1 4. feb 2021 pren 23,3°C(3,89±0,02)·10⁻¹¹(4,07±0,06)·10⁻¹¹6,0±0,1 14. jan 2021 pren 21,7°C(3,82±0,02)·10⁻¹¹(4,17±0,06)·10⁻¹¹5,9±0,1

Vzorec S1 3 mM oligo 300 mM KCl - d(G₂AG₄AG₂):

Poleg meritev na slikah 4.5e in 4.5f, izvedenih na stacionarni DLS napravi, smo vzorec pomerili še 5. februarja na prenosni DLS napravi v polariziranem - VV načinu. Če si najprej ogledamo analizo meritev v polariziranem - VV načinu (sliki 4.29), ugotovimo s prileganjem premice, da gre za izredno počasen relaksacijski način, saj je naklon premice reda ∂f /∂q² ∼10⁻¹³ m²/s.

4.1. Dinamično sipanje svetlobe - DLS

(a) (b)

Slika 4.29: Analiza meritev vzorca S1 3mM oligo 300 mM KCl dne (a) 12. maja 2021 pri temperaturi 24,8°C in (b) 5. februarja 2021 pri temperaturi 23,1°C. Oborino na dnu vzorca smo prvič opazili 12. maja 2021.

Meritve v polariziranem - VV načinu smo med seboj primerjali, saj smo 12. maja 2021 na dnu vzorca prvič opazili nastanek bele oborine. Primerjava je vidna na sliki 4.30. Tudi tukaj sumimo, da nastanek oborine vpliva na rezultat.

Slika 4.30: Primerjava počasnega relaksacijskega načina vzorca S1 3mM oligo 300 mM KCl.

Preostanejo nam še meritve depolariziranega - VH načina, kjer imamo dva rela-ksacijska načina. Iz hitrega relaksacijskega načina (slika 4.31a) ne moremo pridobiti

“točne” informacije o rotacijski difuzijski konstantiD^r, saj nimamo podatka o tran-slacijski difuzijski konstantiD^t. Kljub temu lahko zanemarimo vplivD^tin naredimo približekf_{V H} ≈6D^r. Ta približek bi lahko uporabili že prej, saj veljaD^tq² ≪f_{V H}. Dobimo rezultata:

D^r [kHz]= 77,5±4,7 in

⟨D^r⟩ [kHz]= 35,0±2,2.

Na sliki 4.31b je lepo razvidno obnašanje počasne relaksacijske frekvence. Vrh po-časne relaksacijske frekvence ocenjujemo, da je pri kotu θ ∼100°−120°.

Poglavje 4. Eksperimenti in meritve

(a) (b)

Slika 4.31: Analiza VH meritev vzorca S1 3mM oligo 300 mM KCl pri temperaturi 24,7°C. (a) Prileganje konstante k izračunomconst= 6D^r ≈f_{V H}(q²)in (b) počasen relaksacijski način.

4.2 Diferenčna dinamična mikroskopija - DDM

4.2.1 Eksperiment

DDM eksperimentalno napravo na IJS so razvili Matej Arko, Andrej Petelin in drugi. Shemo eksperimentalne naprave smo že videli na sliki 3.4. Za osvetljevanje vzorca se uporablja zelena LED dioda proizvajalca Thorlabs z vrhom spektra pri 565 nm. Dioda je priključena na napajalnik, ki ji omogoča delovanje v pulznem načinu, s katerim dosežemo večjo osvetljenost vzorca. Svetloba se detektira z dvema identičnima monokromatskima kamerama proizvajalca FLIR, tipa Blackfly, s CMOS senzorjema Sony IMX287, ločljivosti 720×540 slikovnih točk in dimenzijo slikovne točke na detektorju 6,9 µm. Z uporabo objektiva NIKON, z 20-kratno povečavo in numerično aperturo NA = 0,35, dobimo na sliki slikovno točko velikosti p= 0,344 µm. Z uporabo enačbe (3.71) lahko izračunamo eno enoto sipalnega valovnega vektorja q₀ ≈ 0,0357 µm⁻¹. Pri izračunu smo upoštevali, da uporabljamo vidno polje na kameriM xN = 512x 512 slikovnih točk, kljub temu, da je resoulcija kamer večja. S tem se izognemo nevšečnostim, ki bi lahko nastale ob neizbiri N = 2ⁿ ali M = 2^m. Obe kameri sta proženi z mikrokontrolerjem Arduino Uno ATmega328P.

Za DLS napravo smo že dobili pripravljene vzorce za meritev. Vzorce za DDM meritev smo zato morali pripraviti sami. Uporabili smo 50 µL steklene kapilare s pravokotnim profilom. Kapilare smo pomočili v suspenzijo željenega vzorca, ki so se zaradi kapilarnega dviga napolnile. Z obeh strani smo jih nato zaprli z dvokompo-nentnim lepilom Torr Seal, da smo preprečili izhlapevanje. Vzorce v kapilarah smo pustili mirovati en dan in jih nato pomerili.