Blag pufer za odstranjevanje protiteles iz
membrane (1L) Pufer za umerjanje pH metra (pH=7,00) Na₂HPO₄*2H₂O/K₂HPO₄ Pufer za umerjanje pH metra (pH=4,00) Citronska kislina/NaOH/HCl Pufer za umerjanje pH metra (pH=10,00) H3BO3/KCl/NaOH
3.1.7. PRIPRAVA GELA ZA POLIAKRILAMIDNO GELSKO ELEKTROFOREZO
Pomemben je vrstni red dodajanja raztopin, kot je naveden v preglednici VIII. APS in TEMED smo dodali v komori z laminarnim pretokom zraka. V originalnem predpisu navajajo 10 % SDS in 30 % akrilamid. V laboratoriju MCMB smo imeli 20 % SDS in 37,5
% akrilamid, zato smo prilagodili predpis tako, da smo upoštevali redčenje z destilirano vodo.
Preglednica VIII: Ločitveni (A.) in koncentracijski gel (B.) za poliakrilamidno gelsko elektroforezo in prenos Western
17 B.
Koncentracijski gel, SDS PAGE, 12 % Količina za 2 gela (V=10 mL)
H2O 6,21 mL
Tris (pH= 6,8) 2,5 mL
10 % SDS 50 µL 20 % SDS + 50 µL H2O
37,5 % akrilamid 1,08 mL
APS 100 µl
TEMED 10 µl
3.2. METODE
3.2.1. PRIPRAVA CELIČNIH LINIJ (ODMRZOVANJE IN NASAJANJE CELIC)
Celice MKN45 (približno 3 milijone celic) so bile shranjene v mikrocentrifugirkah z navojem v raztopini FBS in DMSO v razmerju 9:1 in zmrznjene v tekočem dušiku.
Vsebino mikrocentrifugirke smo prenesli v centrifugirko z gojitvenim medijem RPMI-1640, tako da smo raztopino celic počasi nadplastili v medij. Raztopino celic v mediju smo centrifugirali 5 minut pri 1000 x g pri sobni temperaturi, da smo odstranili DMSO. Po centrifugiranju smo odstranili supernatant in celice resuspendirali v 1 mL medija za celično linijo MKN45. Ustrezen volumen celic smo prenesli v gojilne posode T25, v katere smo predhodno dodali 5 mL medija. Celice smo inkubirali v inkubatorju pri 37 °C in v atmosferi s 5 % CO2. Enak postopek smo uporabili za celice MCF-10A, s to razliko, da smo uporabili gojitveni medij DMEM/F12.
3.2.2. GOJENJE CELIČNIH LINIJ MKN45 IN MCF-10A
Celice MKN45 in MCF-10A smo presadili, ko so dosegle 80 % preraščenost (konfluentnost). Običajno so to stopnjo dosegle po treh dneh gojenja pri 37 °C in v atmosferi s 5 % CO2. Medij za gojenje celic smo odpipetirali v centrifugirko, pritrjene celice sprali z raztopino DPBS in jim dodali raztopino tripsin-EDTA. Ko so se celice odlepile s površine, smo jih prestavili v centrifugirko z medijem za gojenje in centrifugirali 5 minut pri 1000 x g pri sobni temperaturi. Po centrifugiranju smo odstranili supernatant z aspiracijsko pipeto in celicam dodali 1 mL gojitvenega medija. Ustrezen volumen celic smo nasadili v gojitvene posode T75 ali gojitvene plošče 150 cm2, v katere smo dodali ustrezen medij za gojenje celic. Celice smo inkubirali v inkubatorju pri 37 °C in v atmosferi s 5 % CO2.
18 3.2.3. ŠTETJE CELIC
Štetje celic smo izvedli po centrifugiranju, ko smo jih ponovno resuspendirali v mediju ali DPBS. S serološko pipeto smo izmerili končni volumen resuspendiranih celic. Del zmesi celic v suspenziji smo odpipetirali v mikrocentrifugirko in jim dodali barvilo tripansko modrilo v razmerju 1:1. V komoro za štetje celic Countess smo odpipetirali 10 L te zmesi. Naprava za štetje celic Countess Ⅱ nam je podala celokupno koncentracijo celic v komori, pri čemer je bilo že upoštevano redčenje zaradi barvila, ter odstotek živih in mrtvih celic. Končno celokupno koncentracijo živih celic smo izračunali tako, da smo podatek o koncentraciji živih celic pomnožili s končnim volumnom, ki smo ga prej izmerili. Na podlagi tega podatka smo po potrebi redčili zmes celic.
3.2.4. TRETIRANJE CELIČNE LINIJE MKN45 Z GASTRINOM
Za pripravo poizkusa z gastrinom smo celično linijo MKN45 nasadili v gojišče za izolacijo zunajceličnih veziklov in dodali gastrin. Komercialni gastrin je v obliki prahu, zato smo ga raztopili v DPBS. V epruveto z gastrinom smo dodali raztopino DPBS, da se je gastrin raztopil in pazili, da pri dodajanju DPBS-a niso nastajali skupki. Nato smo tako raztopljeno zmes gastrina in DPBS še 5-krat redčili z DPBS do končne koncentracije 60 µM.
Raztopino gastrina v DPBS smo alikvotirali po 100 µL v mikrocentrifugirke in jih zamrznili pri -80 ºC. Mikrocentrifugirke, ki smo jih potrebovali za eksperiment, smo odtajali v ledeni kopeli.
Celice MKN45 smo najprej za 24 ur izpostavili mediju brez seruma (FBS). Nato smo z aspiracijsko pipeto odstranili gojišče brez seruma. Večina celic je bila pritrjenih na površino, prisotnih pa je bilo nekaj prosto plavajočih celic. Celic nismo spirali in celicam nismo dodajali tripsina, temveč smo v gojilne posode 150 cm2 dodali gojišče za izolacijo zunajceličnih veziklov in gastrin do končne koncentracije 10 nM. Za kontrolo smo pripravili celice MKN45, ki smo jih gojili v 16 mL gojišča za izolacijo zunajceličnih veziklov, brez dodatka raztopine gastrina. Celice smo inkubirali 48 ur pri 37 ºC v atmosferi s 5 % CO2, da so se v medij lahko izločili zunajcelični vezikli.
3.2.5. IZOLACIJA ZUNAJCELIČNIH VEZIKLOV
Medij z izločenimi zunajceličnimi vezikli smo prestavili v ustrezno označene centrifugirke in jih centrifugirali 5 minut pri 1000 x g pri sobni temperaturi, da smo odstranili celice in/ali celične ostanke. Supernatant z zunajceličnimi vezikli smo prestavili v nove, ustrezno
19
označene centrifugirke. Celice na ploščah smo sprali z DPBS in jim dodali raztopino tripsin-EDTA, da so se odlepile od podlage. Nato smo celice prešteli.
i. IZOLACIJA ONKOSOMOV
Centrifugirke z zunajceličnimi vezikli smo centrifugirali 10 minut pri 2800 x g pri 20 ºC.
Tako smo zagotovili, da so se na dno centrifugirke najprej posedli večji zunajcelični vezikli in onkosomi. Supernatant smo prenesli v nove centrifugirke za nadaljnje ločevanje zunajceličnih veziklov z ultracentrifugiranjem. Usedlini večjih zunajceličnih veziklov oziroma onkosomov smo dodali raztopino DPBS, ki smo jo predhodno prefiltrirali skozi filter s porami velikosti 0,2 µm. Nato smo celotno vsebino prenesli v mikrocentrifugirke, ki na stene ne vežejo proteinov. Mikrocentrifugirke smo centrifugirali 10 minut pri 2800 x g pri 20 ºC. Po centrifugiranju smo usedlino zunajceličnih veziklov na zunanji strani mikrocentrifugirke označili in previdno odstranili ves supernatant. Usedlini smo dodali 50 µL filtrirane raztopine DPBS in vzorce shranili pri -80 ºC.
ii. IZOLACIJA MIKROVEZIKLOV
Centrifugirke s supernatantom, ki smo ga pridobili po prvem centrifugiranju raztopine zunajceličnih veziklov, smo centrifugirali v ultracentrifugi 30 minut pri 10 000 x g pri 4 ºC. Po centrifugiranju smo označili položaj usedline mikroveziklov na zunanji strani mikrocentrifugirke in hitro prenesli večino supernatanta v nove centrifugirke. Iz centrifugirke z usedlino mikroveziklov smo previdno odstranili ves preostali supernatant.
Nato smo tej usedlini dodali 50 µL filtrirane raztopine DPBS in centrifugirke shranili v ledeni kopeli. Z mešanjem s pipeto smo razbili skupke mikroveziklov in vzorce prenesli v mikrocentrifugirke, ki na stene ne vežejo proteinov, in jih shranili pri -80 ºC.
iii. IZOLACIJA EKSOSOMOV
Za izolacijo eksosomov smo najprej pripravili ultracentrifugirke s 5,6 mL raztopine 20 % saharoze. Supernatant z eksosomi, ki smo ga pridobili po drugem centrifugiranju raztopine zunajceličnih veziklov, smo najprej prefiltrirali, da smo se znebili možnih nečistoč in večjih veziklov, in nato še koncentrirali vzorce pri 4000 x g in 20 ºC do končnega volumna okoli 20 mL. Nato smo počasi dodali vzorce v ultracentrifugirke s predpripravljeno raztopino 20 % saharoze tako, da se raztopini supernatanta z eksosomi in saharoze nista zmešali. Centrifugiranje smo izvedli v ultracentrifugi, v vakuumu pri 100 000 x g in 4 ºC.
Čas centrifugiranja je bil 2h in 15 minut. Usedlino eksosomov smo označili na zunanji strani centrifugirke in z aspiracijsko pipeto odstranili ves supernatant. Dodatno smo
20
odrezali vrhove ultracentrifugirk, zato da smo s papirnato brisačo previdno obrisali odvečno gojišče, nato smo odrezane ultracentrifugirke položili v posodo z ledom. Usedlini eksosomov smo dodali 50 µL filtrirane raztopine DPBS in mešanico inkubirali v posodi z ledom 30 minut. Med inkubacijo smo mešanico večkrat premešali s pipeto. Po 30 minutah smo raztopine eksosomov prestavili v mikrocentrifugirke, ki na stene ne vežejo proteinov, in jih shranili pri -80 ºC.
Slika 5: Shema celotne izvedbe poizkusa (ZV-zunajcelični vezikli, gastrin-označuje celice, z dodanim gastrinom v gojišču).
3.2.6. MERJENJE KONCENTRACIJE PROTEINOV
Za merjenje koncentracije proteinov smo uporabili predhodno pripravljene reagente za določanje koncentracije proteinov (angl. BCA protein assay kit). Za pripravo umeritvene krivulje smo izbrali standardne raztopine s koncentracijami 2000 µg/mL, 1500 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL in 125 µg/mL. Reagenta A in B, ki sta del kompleta reagentov za določanje koncentracije proteinov (angl. BCA protein assay kit), smo zmešali v razmerju 50:1. Nato smo v luknjice 96-mestne mikrotitrske ploščice prenesli po 200 µL mešanice reagentov A in B. Mikrocentrifugirke z vzorci zunajceličnih veziklov smo pred nanosom v mikrotitrsko ploščico za kratek čas centrifugirali pri 4 ºC, da smo se znebili skupkov veziklov. Nato smo v mikrotitrsko ploščo dodali po 5 µL standardih raztopin z znanimi koncentracijami proteina, po 5 µL qH2O, DPBS in pufra RIPA, ki so služile kot negativne kontrole. Nato smo nanesli po 5 µL raztopin vzorcev zunajceličnih veziklov, raztopljenih v DPBS, za določanje koncentracije zunajceličnih veziklov za migracijske teste, in po 5 µL raztopin vzorcev zunajceličnih veziklov, raztopljenih v pufru RIPA, za določanje
21
koncentracije zunajceličnih veziklov za prenos Western. Mikrotitrsko ploščo smo zavili v aluminijasto folijo in jo 30 minut inkubirali pri 37 ºC. Po inkubaciji smo v spektrofotometru Synergy H4 izmerili absorbance v vidnem spektru pri valovni dolžini 562 nm. Iz podatkov o izmerjeni absorbanci, smo izračunali mase in koncentracije proteinov na površini veziklov po enačbi: y=ax+b, kjer x predstavlja maso proteinov.
Koncentracijo proteinov [µg/µL] smo izračunali tako, da smo maso proteinov delili z volumnom vzorca v luknjici. Končne volumne vzorcev veziklov smo izmerili s pipeto, saj smo ta podatek potrebovali za izračun koncentracije.
3.2.7. PRENOS WESTERN
Prenos Western je semi-kvantitativna metoda za določanje in opredelitev velikosti specifičnih proteinov. Prvi korak je izločanje proteinov iz zunajceličnih veziklov s pomočjo lizirnega pufra RIPA in priprava gela. Sledi nanos vzorcev na gel, elektroforezna ločba proteinov, prenos proteinov na nitrocelulozno membrano. Pri prenosu proteinov gre za zrcalno migracijo proteinov z gela na nitrocelulozno membrano, pod mokrimi pogoji.
Zadnji korak je kemiluminiscentna detekcija proteinov s specifičnimi primarnimi in sekundarnimi protitelesi.
Najprej smo pripravili ločitveni in koncentracijski gel po zgoraj opisanem postopku (preglednica ⅤⅢ), nato pa smo pripravili vzorce. V mikrocentrifugirke, ki na stene ne vežejo proteinov, smo za en vzorec napipetirali 5 µL nanašalnega pufra (angl. loading buffer), 14 µL vzorca in 1 µL DTT, v tem vrstnem redu, ter vsebino hitro premešali na mešalu za epruvete in pripravljene vzorce 10 minut segrevali pri 70 °C. V luknjice v gelu smo nanesli 2,5 µL vzorca proteinske velikostne lestvice in po 20 µg vzorca.
Poliakrilamidno gelsko elektroforezo smo izvajali 10 min pri 150 V v pufru za elektroforezo (angl. running buffer). Nato smo izvedli prenos proteinov na membrano v 1-kratnem pufru za prenos proteinov (angl. transfer buffer). Postopek smo izvajali pri 100 V, 1 uro in 15 min.
3.2.8. DETEKCIJA PROTEINOV PO PRENOSU WESTERN
Po prenosu proteinov smo odstranili gel in membrano. Membrano smo barvali s Ponceau rdečim barvilom približno 10 minut, nato smo jo spirali z destilirano vodo. Ko smo odstranili barvilo, smo membrano potopili v 5 % mleko in jo nežno stresali na stresalniku za 1 uro. Membrano smo razrezali in na različne dele dodali različna primarna mišja protitelesa, ter membrano stresali 24 ur pri 4 °C. Membrano oziroma dele membran smo
22
odstranili iz raztopine primarnih protiteles in jo/jih spirali z 1-kratnim pufrom TBS-Tween približno 30 minut. Na vsak del membrane smo dodali sekundarno proti-mišje protitelo in jih stresali 2 uri. Po koncu smo odstranili sekundarno protitelo, dele membran spirali z 1-kratnim pufrom TBS-Tween približno 30 minut in nato s kemiluminiscenco detektirali proteine na membrani s kompletom reagentov Pico ali Femto.
3.2.9. OPTIČNO SLEDENJE POSAMEZNEMU DELCU (ANGL. NTA)
S to metodo analiziramo delce v suspenziji, glede na analizo Brownovega gibanja, v realnem času. Metoda je primerna za delce velikosti od 50 do 1000 nm. V primeru, da imamo znan tudi volumen vzorca, lahko določimo še koncentracijo delcev. S posebnim računalniškim algoritmom hkrati sledimo gibanju posameznih delcev v realnem času tako, da snemamo video približno v 30 sekundnih intervalih. S programsko opremo nato določimo velikost posameznega delca. Za določanje koncentracije izvedemo kalibracijo, s setom standardov znanih velikosti in koncentracij, in na podlagi volumna vzorcev, ki smo jih vnesli v napravo, izračunamo še koncentracijo (79).
Z napravo Nanosight NS300TM smo izvedli analizo mikroveziklov in eksosomov. V mikrocentrifugirko, ki na stene ne veže proteinov, smo napipetirali 5 µL vzorca in ga redčili v 995 µL filtriranega DPBS ter vsebino premešali na mešalu. Najprej smo posneli video za filtriran DPBS, nato pa smo še za vsak vzorec posneli 5 videov; vsak je bil dolg 60 s. Vse meritve smo izvedli s kamero na nivoju 14, s pragom 5, pri temperaturi 25 °C.
Detekcijo in analizo vzorcev smo izvedli s programom NTA 3.4 – Sample Assistant Build 3.4.4-SA.
3.2.10. PRETOČNA CITOMETRIJA
Pretočna citometrija je tehnika, s katero analiziramo lastnosti posameznih delcev, v suspenziji, ki drug za drugim prehajajo ozek snop laserske svetlobe (80). Količina prejete svetlobe na fotodetektorju FSC (angl. forward scatter) in fotodetektorju SSC (angl. side scatter) je sorazmerna z velikostjo in granuliranostjo (kompleksnostjo) delca. Delce lahko dodatno označimo s fluorescenčnimi barvili in tako pridobimo dodatne informacije o delcih. Podatke prikažemo s točkovnim diagramom (81). Za določanje značilnosti naših vzorcev smo izbrali karboksifluorescein sukcinimidil ester (CFSE) (521 nm), ki sveti zeleno in protitelo CK18, ki je konjugirano s fikoeritrinom (PE) (576 nm) in sveti oranžno (82). Lastnost CFSE, da pasivno difundira skozi membrano, tam pa se hidrolizira z
23
znotrajcelično esterazo in tako postane fluorescenten, smo izkoristili za jasno razlikovanje zunajceličnih veziklov z intaktno membrano od celičnega drobirja (83).
S pretočnim citometrom lahko dobro ovrednotimo delce večjih velikosti, zato smo s to metodo analizirali onkosome in mikrovezikle, ne pa eksosomov. Najprej smo naredili optimizacijo protokola in ugotovili, da se tako onkosomi kot tudi mikrovezikli lepo barvajo s 4,5 µM raztopino CFSE, ki je specifična za proteine. Za označevanje CK18 smo izbrali monoklonsko protitelo anti-CK18, označeno s PE. Za CK18 smo se odločili, ker se je to protitelo, v predhodnih poizkusih prenosa Western, izkazalo kot najbolj specifično za določanje onkosomov in mikroveziklov (neobjavljeni rezultati, Pia Pužar Dominkuš).
Preverili smo tudi avtofluorescenco onkosomov in mikroveziklov in ugotovili, da je zanemarljivo majhna. Uporabili smo dvojno barvanje, da smo ločili med zunajceličnimi vezikli in proteinskimi agregati, ki lahko motijo analizo. V prvem koraku smo z mešanico velikostno kalibriranih flourescentnih kroglic (fluorosfere), velikosti 2 µm (nizka svetilnost) in 3 µm (srednja in močna svetilnost), določili, kje na točkovnem diagramu se nahajajo onkosomi in mikrovezikli. V mikrocentrifugirkah, ki na stene ne vežejo proteinov, smo pripravili po 25 µL vzorcev in jih 4-krat redčili s filtrirano raztopino DPBS.
Vsebino smo nežno premešali na mešalu. 50 µL redčenih vzorcev smo prenesli v nove mikrocentrifugirke. Vzorcem smo dodali 7,5 µL raztopine CK18 in raztopino CFSE v končni koncentraciji 4,5 µM ter vsebino premešali na mešalu. Vzorce smo 20 minut inkubirali v temi pri sobni temperaturi. Nato smo vzorce mikroveziklov centrifugirali 30 minut pri 10 000 x g pri 4 °C, vzorce onkosomov pa 10 minut pri 2800 x g pri 4 °C.
Supernatant smo previdno odstranili in vzorce resuspendirali v filtrirani raztopini DPBS do končnega volumna 150 µL. Vzorce smo prenesli v polistirenske epruvete in premešali vsebino. Za določanje koncentracije veziklov smo vzorcem dodali še kroglice z znano koncentracijo; 10 µL za onkosome in 50 µL za mikrovezikle. Koncentracijo posameznih veziklov smo izračunali po formuli navedeni v sliki 6.
Slika 6: Enačba za določanje koncentracije mikroveziklov in onkosomov, s pomočjo fluorescenčnih kroglic znanih koncentracij. (Zzunajcelični vezikli; v tem primeru onkosomi ali mikrovezikli, R-redčitev, N-število, V-volumen, FS-fluorescenčne kroglice znane koncentracije, c-koncentracija)
24
V pretočnem citometru smo najprej izmerili neoznačene onkosome in mikrovezikle, da smo določili mejo med pozitivno in negativno skupino veziklov, nato smo pomerili raztopine fluorescenčnih kroglic z znano velikostjo (2 µm in 3 µm). Na koncu smo pomerili vzorce onkosomov in mikroveziklov, označene s CFSE in PE, z dodanimi polietilenskimi kroglicami za štetje znanih koncentracij.
3.2.11. OPTIMIZACIJA TESTOV MIGRACIJE CELIC MKN45 IN MCF-10A
V mikrocentrifugirke smo si pripravili tri različne koncentracije celic MKN45 (5*105 celic/mL, 8*105 celic/mL, 10*105 celic/mL), v gojitvenem mediju RPMI-1640, in tri različne koncentracije celic MCF-10A (2*105 celic/mL, 4*105 celic/mL, 6*105 celic/mL), v gojitvenem mediju DMEM/F12. Celice smo nanesli v treh ponovitvah za vsako koncentracijo v mikrotitrski ploščici s 24 luknjicami (ena ploščica za eno celično linijo), v katere smo vstavili vstavke Ibidi. Nato smo celice inkubirali pri 37 °C, v atmosferi s 5 % CO2. Po 24 h smo preverili, ali so celice tvorile monosloj. Na napravi Incellis cell imager smo posneli slike pri 10-kratni povečavi, v časovnih enotah 0 h, 6 h, 24 h, 30 h, 48 h, 54 h.
Slike smo analizirali s programom ImageJ.
3.2.12. ANALIZA CELIČNE MIGRACIJE
V luknjice na mikrotitrski plošči 24 smo vstavili vstavke za migracijske teste. Celičnim linijam MKN45 in MCF-10A, ki smo jih predhodno namnožili na ploščah, smo dodali raztopino tripsin-EDTA, jih centrifugirali 5 minut pri 1000 x g pri sobni temperaturi in prešteli z napravo Countess Ⅱ. Nato smo celice ponovno resuspendirali v mediju (RPMI-1640 za celično linijo MKN45, DMEM/F12 za celično linijo MCF-10A). Za celično linijo MKN45 smo v vsako luknjico v vstavkih za migracijske teste dodali po 105 000 resuspendiranih celic, za celično linijo MCF-10A pa smo dodali 70 000 resuspendiranih celic. Mikrotitrsko ploščo smo inkubirali pri 37 °C v atmosferi s 5 % CO2 toliko časa, da so namnožene celice tvorile monosloje. Ko so nastali monosloji celic, smo s sterilno pinceto odstranili vstavke za migracijske teste, celice sprali z medijem za izolacijo veziklov in v luknjice dodali po 500 µL medija za izolacijo veziklov. V luknjice smo nato dodali kontrolne zunajcelične vezikle oziroma zunajcelične vezikle, izolirane iz celic, spodbujenih z gastrinom. Mikrovezikle in eksosome smo nanesli v končni koncentraciji 20 µg/luknjico ter onkosome v končni koncentraciji 10 µg/luknjico. Kot negativno kontrolo smo uporabili filtrirano raztopino DPBS. Z mikroskopom Incellis cell imager smo posneli slike celic pri 10-kratni povečavi v različnih časovnih obdobjih, to je ob času 0 h (ob dodatku zunajceličnih veziklov), nato pa še 6 h, 24 h, 30 h in 48 h po dodatku
25
zunajceličnih veziklov. Za analizo migracije smo pri celični liniji MKN45 uporabili programsko opremo ImageJ. Migracijo celične linije MCF-10A smo analizirali s programsko opremo mikroskopa Incellis cell imager za določanje celične konfluence. Za vsak vzorec smo izvedli dve tehnični ponovitvi in dve biološki ponovitvi.
Slika 7: Shema izvedbe testa migracije za celični liniji MKN45 in MCF-10A (ZV-zunajcelični vezikli).
26
4. REZULTATI
4.1. ANALIZA ZUNAJCELIČNIH VEZIKLOV S POVRŠINSKIMI OZNAČEVALCI
Zunajcelične vezikle smo okarakterizirali s prenosom Western, da bi potrdili prisotnost specifičnih proteinov in čistost izoliranih zunajceličnih veziklov. Izbrali smo biooznačevalce, značilne za posamezne skupine zunajceličnih veziklov ter negativen biooznačevalec za vezikle – citokrom C (cyt C) (Slika 8).
Slika 8: Karakterizacija zunajceličnih veziklov s prenosom Western. Skupine zunajceličnih veziklov, izolirane iz celične linije MKN45, in celični lizati so označeni z značilnimi proteinskimi označevalci (Pia Pužar Dominkuš, neobjavljeni rezultati) (EKSO-eksosomi, MV-mikrovezikli, ONKO-onkosomi, CL-celični lizati)
Celični lizati so služili kot pozitivna kontrola. V teh vzorcih smo zaznali vse izbrane proteine. V vzorcu eksosomov smo zaznali močne signale za proteine Alix, HSC70, Tsg101 in CD9. To je v skladu s pričakovanji, saj so ti proteini značilni za eksosome (84,85). CK18 je značilen protein za mikrovezikle, zato ga v vzorcu eksosomov nismo zaznali. V vzorcu mikroveziklov smo zaznali šibkejše signale proteinov, značilnih za eksosome (Alix, HCS70, Tsg101 in CD9). Zaznali pa smo močan signal za CK18, ki je obogaten v mikroveziklih. Rezultati so pokazali tudi, da se na onkosomih močno izražata proteina HSC70 in Tsg101. Zaznali smo tudi šibek signal za CK18, medtem ko drugih proteinov nismo zaznali. Cyt C je mitohondrijski protein, zato daje močan signal pri celičnih lizatih in ni prisoten pri eksosomih in mikroveziklih. Pri onkosomih smo ga zaznali kot šibek signal, iz česar sklepamo, da so v tej frakciji prisotni še celični ostanki. S prenosom Western smo potrdili, da smo uspešno izolirali tri različne frakcije zunajceličnih veziklov, ki so obogatene z onkosomi, mikrovezikli oziroma eksosomi.
27
4.2. DOLOČANJE KONCENTRACIJE PROTEINOV
Zanimalo nas je, ali gastrin vpliva na izločanje zunajceličnih veziklov iz celične linije MKN45. Z merjenjem absorbanc smo izračunali koncentracijo proteinov na površini vseh izoliranih veziklov po enačbi, opisani v poglavju 3.2.6. Koncentracije proteinov smo normalizirali na milijon celic (106) in podatke prikazali v preglednici Ⅸ. Izračunali smo še povprečje koncentracij za vsako skupino zunajceličnih veziklov ter razmerje koncentracij in podatke prikazali v preglednici Ⅹ in na sliki 9. Celice, spodbujene z gastrinom, izločajo za četrtino manj mikroveziklov v primerjavi s kontrolo. Pri onkosomih in eksosomih nismo opazili spremenjenega trenda izločanja pri celicah spodbujenih z gastrinom. Gastrin je torej zmanjšal izločanje mikroveziklov iz celične linije MKN45.