Po aminofunkcionalizaciji smo delce SiO2 odpipetirali v mikrocentrifugirke in jih posušili na zraku. Nato smo z glutaraldehidom nanje uvedli aktivne karbonilne funkcionalne skupine, na katere se je vezal protein N.
Uspešnost funkcionalizacije smo preverili s hitrimi antigenskimi testi Immupass VivaDiag™ SARS-CoV-2 Ag Rapid Test. Najprej smo preverili, če bo sam protein N v resnici dal pozitiven rezultat. Rezultati so vidni na sliki 11. Po navodilih proizvajalca smo na testno polje, označeno s S, nanesli 60 µL vzorca. Na liniji kontrole kakovost (C-linija) ima antigenski test linijo protimišjih poliklonskih protiteles IgG. C-linija se je pojavila tako pri pozitivni kot pri negativni kontroli, torej sta oba testa veljavna. Na detekcijski liniji (T-linija) so monoklonska protitelesa anti-N-SARS-CoV-2, ki reagirajo s proteinom N. T-linija se je pojavila pri vzorcu čistega proteina N, torej je bil rezultat testa pozitiven.
Slika 11: Test prisotnosti proteina N v vzorcu. A) Kot pozitivno kontrolo smo uporabili raztopino proteina N. Rezultat testa je pozitiven. B) Kot negativno kontrolo smo uporabili pufer PBS. Rezultat je negativen.
Nadalje smo s hitrimi antigenskimi testi preverili uspešnost funkcionalizacije monodisperznih delcev SiO2. Rezultati so vidni na sliki 12. Vsi testi so bili veljavni.
Oboji delci so dali pozitiven rezultat. Kot negativni kontroli smo uporabili delce, ki jim nismo dodali glutaraldehida, in nefunkcionalizirane delce. V obeh primerih se protein
34
nanje ne bi mogel vezati in bi pričakovali negativen rezultat, vendar sta bila rezultata obeh negativnih kontrol pozitivna. Čeprav smo po funkcionalizaciji odstranili raztopino s proteinom N in delce SiO2 sprali še s PBS in dušilno raztopino, je zaradi velike občutljivosti testov verjetno prišlo do pozitivnega rezultata tudi pri negativnih kontrolah, verjetno zaradi detekcije majhne količine proteina, ki se je adsorbiral na nanokroglice. Zgolj na podlagi teh rezultatov ne moremo sklepati, ali je bila funkcionalizacija uspešna, saj so bili rezultati pozitivni že samo zaradi prisotnosti ostankov proteina N.
Slika 12: Test uspešnosti funkcionalizcije. Od leve proti desni si sledijo: vzorec 80 nm delcev – rezultat je pozitiven, vzorec 200 nm delcev – rezultat je pozitiven, delci brez glutaraldehida (negativna kontrola) – rezultat je pozitiven, nefunkcionalizirani delci (negativna kontrola) – rezultat je pozitiven.
35
5 Zaključek
V bakterijah E. coli BL21[DE3] smo izrazili koronavirusna proteina N in ORF8. Slednji se je nahajal le v netopni frakciji, zato ga nismo skušali izolirati. Protein N smo izolirali iz topne frakcije z nikljevo afinitetno kromatografijo in ga nato dodatno očistili z odcepom heksahistidinske oznake s proteazo TEV ter ponovno nikljevo afinitetno kromatografijo. Sintetizirali smo tudi monodisperzne delce SiO2 velikosti 80 nm in 200 nm, jih aminofunkcionalizirali in nanje vezali glutaraldehid. S proteinom N smo nato delce funkcionalizirali. Uspešnost funkcionalizacije smo želeli preveriti z uporabo hitrih antigenskih testov, vendar zaradi njihove prevelike občutljivosti nismo mogli ugotoviti, ali je protein N resnično vezan na delce ali pa gre zgolj za ostanke adsorbiranega proteina v raztopini. Nedvoumno bi to lahko dokazali tako, da bi na protein N vezali fluorescenčno označena protitelesa in delce analizirali s konfokalnim mikroskopom.
V primeru, da je tovrsten postopek funkcionalizacije uspešen, bi si želeli na delce vezati protitelesa proti proteinu N, opisati optične lastnosti sistema in ugotoviti, kako vezava proteina na protitelo vpliva na sipanje svetlobe na delcih. Če bi uspeli ugotoviti kvantitativno zvezo, bi to lahko uporabili kot biosenzor za detekcijo proteina N v vzorcu, če pa obstaja tudi kvantitativna povezava, bi lahko ugotavljali celo njegovo koncentracijo.
37
6 Literatura
1 Y. A. Malik: Properties of coronavirus and SARS-CoV-2. Malays. J. Pathol. 2020, 42(1), str. 3–11.
2 S. Kumar, R. Nyodu, V. K. Maurya, S. K. Saxena: Morphology, Genome Organization, Replication, and Pathogenesis of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2). 2020, 2, str. 23–
31.
3 L. Zinzula: Lost in deletion: The enigmatic ORF8 protein of SARS-CoV-2. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 2020.
4 T. G. Flower, C. Z. Buffalo, R. M. Hooy, M. Allaire, X. Ren, J. H. Hurley: Structure of SARS-CoV-2 ORF8, a rapidly evolving coronavirus protein implicated in immune evasion. bioRxiv 2020, str. 1–6.
5 S. Mohammad, A. Bouchama, B. M. Alharbi, M. Rashid, T. S. Khatlani, N. S. Gaber, S. S. Malik: Sars‐
cov‐2 orf8 and sars‐cov orf8ab: Genomic divergence and functional convergence. Pathogens 2020, 9(9), str. 1–26.
6 P. Grumati, I. Dikic, A. Stolz: ER-phagy at a glance. J. Cell Sci. 2018, 131(17), str. 1–6.
7 Y. Zhang, J. Zhang, Y. Chen, B. Luo, Y. Yuan, F. Huang, T. Yang, F. Yu, J. Liu, … H. Zhang: The ORF8 protein of SARS-CoV-2 mediates immune evasion through potently downregulating MHC-I.
bioRxiv 2020.
8 J. Y. Li, C. H. Liao, Q. Wang, Y. J. Tan, R. Luo, Y. Qiu, X. Y. Ge: The ORF6, ORF8 and nucleocapsid proteins of SARS-CoV-2 inhibit type I interferon signaling pathway. Virus Res. 2020, 286(June), str.
198074.
9 W. Zeng, G. Liu, H. Ma, D. Zhao, Y. Yang, M. Liu: Biochemical characterization of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2020. 527(June), str 618-623
10 W. Zeng, G. Liu, H. Ma, D. Zhao, Y. Yang, M. Liu: Biochemical characterization of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2020. 527(June), str 618-623
11 J. Mu, J. Xu, L. Zhang, T. Shu, D. Wu, M. Huang, Y. Ren, X. Li, Q. Geng, … X. Zhou: SARS-CoV-2-encoded nucleocapsid protein acts as a viral suppressor of RNA interference in cells. Sci. China Life Sci.
2020, 63(9), str. 1413–1416.
12 B. Zhou, J. Liu, Q. Wang, X. Liu, X. Li, P. Li, Q. Ma, C. Cao: The Nucleocapsid Protein of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Inhibits Cell Cytokinesis and Proliferation by Interacting with Translation Elongation Factor 1α. J. Virol. 2008, 82(14), str. 6962–6971.
13 A. Senning: The Etymology of Chemical Names: Tradition and Convenience vs. Rationality in Chemical Nomenclature. Berlin, Boston: De Gruyter 2019.
14M. Snoj: Slovenski etimološki slovar, www.fran.si, dostop 12. 6. 2021.
15 F. Marlow, Muldarisnur, P. Sharifi, R. Brinkmann, C. Mendive: Opals: Status and prospects. Angew.
Chemie - Int. Ed. 2009, 48(34), str. 6212–6233.
16 W. S. Lee, T. Kang, S. H. Kim, J. Jeong: An antibody-immobilized silica inverse opal nanostructure for label-free optical biosensors. Sensors (Switzerland) 2018, 18(1), str. 1–10.
17 W. Stöber, A. Fink, E. Bohn: Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range, Journal of Colloid and Interface Science, 1968, 26(1), 62-69
18 S. V. Filin, Puzynin A. I., V. N. Samoilov: Some Aspects of Opal Synthesis. Australian Gemologist.
2002, p. 278.
19 Y. An, M. Chen, Q. Xue, W. Liu: Preparation and self-assembly of carboxylic acid-functionalized silica. J. Colloid Interface Sci. 2007, 311(2), str. 507–513.
20 Bangs Laboratories Inc.: Tech Note 205. 2013
21 M. Dolinar: Molekulsko kloniranje: navodila za vaje - 1. spletna izd. - El. knjiga. - Ljubljana : Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo UL, 2016
22 W. Gao, M. Rigout, H. Owens: Facile control of silica nanoparticles using a novel solvent varying method for the fabrication of artificial opal photonic crystals. J. Nanoparticle Res. 2016, 18(12).
39