Holesterol kot membranski receptor

Med vsemi lipidi, ki sestavljajo celične membrane, je holesterol značilna lastnost sesalskih celic. Ena izmed prilagoditev CDC-jev je izkoriščanje te lastnosti, saj je njihova citolitična aktivnost popolnoma odvisna od prisotnosti holesterola (Giddings in sod., 2003, Palmer, 2004). Holesterol je sterol, ki ima rigidno planarno strukturo, sestavljeno iz štirih zlitih obročev na katero je pritrjena ena polarna hidroksilna skupina in kratka

6

nepolarna ogljikovodikova veriga. S svojo rigidno strukturo holesterol vpliva na lastnosti lipidnih dvoslojev (Fernández-Pérez in sod., 2018).

Slika 1: Orientacija molekul holesterola v lipidnem dvosloju. Prirejeno po: BIOLOGY4IDP, pridobljeno 4.3.2021 iz Raba interneta v Sloveniji: https://biology4ibdp.weebly.com/13-membrane-structure.html.

1.2.3.1 Interakcija CDC-jev s holesterolom

CDC-ji na molekuli holesterola specifično prepoznajo 3-OH skupino na obroču A (Prigent in Alouf, 1976). Vezava proteinske domene na površino membrane je v splošnem dvo-stopenjski proces, ki vključuje nastanek nespecifičnega kompleksa ob trku proteina z membrano, čemur sledi tvorba močno vezanega kompleksa (Heuck in sod., 2010). Prva stopnja je difuzijska in lahko vključuje elektrostatske interakcije, medtem ko se v drugi stopnji stabilizirajo interakcije prve stopnje, tako da nepolarne aminokisline prodrejo v membrano, in/ali preko specifičnih interakcij med proteinom in lipidi membrane (Cho in Stahelin, 2005). Srečanje z membrano približa nepolarne aminokisline medfazni regiji dvosloja, kar olajša njihovo izpostavitev hidrofobnemu jedru. Nepolarne aminokisline po navadi niso izpostavljene na površini proteina, zato so za interakcijo s površino membrane potrebne točno določene konformacijske spremembe (Heuck in sod., 2010).

1.2.3.2 Dostopnost holesterola v membrani

Molekule holesterola se v lipidnem dvosloju orientirajo s hidroksilno skupino v bližino polarnih glav sosednjih fosfolipidnih molekul (slika 1). Rigidni steroidni obroči interagirajo z ogljikovodikovimi verigami fosfolipidov in jih deloma imobilizirajo. Z omejevanjem mobilnosti prvih nekaj metilenskih skupin ogljikovodikovih verig fosfolipidnih molekul, holesterol utrdi lipidni dvosloj in zmanjša njegovo permeabilnost za majhne vodotopne molekule, a hkrati ne zmanjša fluidnosti membrane (Witold K.

Subczynski, 2018). Pri visokih koncentracijah, ki jih najdemo v večini plazemskih

7

membran evkariontov, holesterol preprečuje združevanje in posledično kristalizacijo ogljikovodikovih verig (Heuck in sod., 2010). Visoko koncentracijo holesterola, ki je potrebna za vezavo CDC-jev na membrano, lahko pripišemo tesnim interakcijam molekul holesterola z okoliškimi fosfolipidi, saj postane holesterol dostopen na površini membrane le, kadar so interakcije med sterolnimi in fosfolipidnimi molekulami nasičene (Johnson in sod., 2012). Zraven 3D strukture vezavne domene proteina je za uspešno vezavo ključna tudi orientacija holesterolnih molekul v dvosloju. V membrani je molekula holesterola nameščena v nepolarnem jedru dvosloja skoraj paralelno z acilnimi verigami fosfolipidov. Nepolarni rep ogljikovodikov holesterolne molekule se orientira proti središču dvosloja, 3-β-OH skupina pa se nahaja v bližini estrskih vezi, ki jih tvorijo verige maščobnih kislin in ogrodje glicerola fosfolipidov v bližini medfaze med vodo in membrano (slika 1). V primerjavi s polarnimi glavami fosfolipidov, polarna skupina holesterola ni izpostavljena površini membrane. Zato ni presenetljivo, da relativno majhne koncentracije holesterola niso dostopne za interakcijo z vodotopnimi molekulami (Lange in Steck, 2008).

Dostopnost holesterola na površini v multikomponentnih membranah regulirajo interakcije med holesterolom in drugimi komponentami membrane (fosfolipidi, glikolipidi, proteini) (Heuck in sod., 2010). Bolj kot holesterol interagira s komponentami membrane, manj je dostopen za interakcijo z molekulami izven nje. Dejavniki, ki vplivajo na interakcijo holesterola s fosfolipidi, so dolžina acilnih verig in prisotnost dvojnih vezi v njih, velikost polarnih glav in sposobnost tvorbe vodikovih vezi med fosfolipidi in hidroksilno skupino holesterola (Ohvo-Rekilä in sod., 2002). Kadar je membrana sestavljena iz holesterola in le ene vrste fosfolipida, se pojavita dve koncentracijsko-odvisni fazi (Mouritsen in Zuckermann, 2004). Holesterol med membranskimi fosfolipidi ni naključno razporejen, temveč z njimi tvori steihiometrične komplekse (McConnell in Radhakrishnan, 2003). Kadar so fosfolipidi v prebitku, večina molekul holesterola z njimi tvori komplekse, ki so v čisti fosfolipidni fazi netopni, posledično se v membrani pojavi dvo-fazna mešanica. Z višanjem koncentracije holesterola bo naraščalo število netopnih kompleksov, dokler le-ti ne bodo tvorili enojne faze. Nad to točko se bodo dodane molekule holesterola (prosti holesterol) mešale s kompleksi, dokler ne dosežejo meje topnosti in precipitirajo izven membrane (Mason in sod., 2003). Ker molekule holesterola v vodni raztopini ne tvorijo stabilnih dvoslojev, v prebitku ne morejo tvoriti nove stabilne faze. Zato proste molekule holesterola v prebitku »odletijo« stran od membrane, kjer so podvržene agregaciji in posledično kristalizaciji (Harris, 1988). Nedostopnost holesterolnih molekul na površini membrane si lahko razlagamo tudi s hidrofobnim efektom, v katerem se polarne glave fosfolipidov orientirajo proti površini membrane, da bi zaščitile hidrofobne molekule holesterola od manj ugodnega vodnega okolja. Kadar

8

koncentracija holesterola v membrani preseže zaščitniško kapaciteto polarnih glav, so molekule holesterola bolj nagnjene k »pobegu« od membrane (Lange in Steck, 2008).

CDC se bo vezal na membrano in/ali tvoril poro v njej pri visokih koncentracijah holesterola, pri katerih je prost holesterol dostopen, zato oba opisana modela lahko razložita eksperimentalna opažanja. V bolj komplesnih lipidnih mešanicah, pri katerih membrano sestavlja več kot le ena vrsta fosfolipida, se bo holesterol med nastalimi fazami razporedil neenakomerno (Goñi in sod., 2008). Koliko holesterola je prisotno v posamezni fazi, je odvisno od interakcije med holesterolom in drugimi komponentami membrane (lipidi in proteini) (Epand, 2006). V nasprotju z modelnimi membranami, na distribucijo in dostopnost holesterola v celičnih membranah vplivajo mnogi dejavniki, kot je membranski transport, sinteza in modifikacije lipidov, prisotnost membranskih proteinov in/ali asociacija membrane s citoskeletom (Silvius, 2005). Glede na to, da je koncentracija holesterola v plazemski membrani tesno regulirana, ni presenetljivo, da CDC-ji prepoznajo točno določeno koncentracijo holesterola.

1.2.3.3 Mejna vrednost za vezavo na holesterol

Iz poskusov na liposomih iz lipidne mešanice fosfatidilholina in holesterola je znano, da je za vezavo in tvorbo pore pri CDC-jih kot so PFO, SLO, LLO in PLY potrebna koncentracija holesterola višja od 30 mol. % (Flanagan in sod., 2009). Kadar je molarna koncentracija holesterola v membrani liposoma manjša od ~30 %, pri PFO ni videti vezave (Flanagan in sod., 2009). Če holesterol deluje samo kot receptor in PFO kot ligand, bi zmanjšanje koncentracije holesterola v dvosloju vplivalo le na kinetiko citolitičnega procesa; zmanjšanje vsebnosti holesterola v membrani bi torej le podaljšalo čas, ki je potreben za tvorbo pore. Kljub temu je opaziti oster prehod pri vezavni izotermi in ta nakazuje, da je osnova prepoznave bolj kompleksna od enostavne frekvence srečanja med PFO in posamezno molekulo holesterola (Heuck in sod., 2000).

Na vezavo prav tako posredno vpliva pH medija, od katerega je odvisna konformacija D4. Protonacija določenih aminokislin vpliva na konformacijo D4 in posledično sposobnost prepoznave holesterola. Znižanje pH iz vrednosti 7,5 na 6,0 povzroči konformacijsko spremembo PFO, ki izpostavi triptofanske ostanke v D4 vodnemu topilu ter posledično spremeni mejno vrednost koncentracije holesterola, ki je potrebna za vezavo na liposomsko membrano (Nelson in sod., 2008). Podoben efekt opazimo pri LLO, ki doseže optimalno aktivnost pri kislem pH (Bavdek in sod., 2007). Izgubo aktivnosti LLO pri nevtralnem pH lahko povrnemo s povečanjem koncentracije holesterola v membrani (Bavdek in sod., 2007; Ruan in sod., 2016).

9