Izolacija plazmida - Neža Žerjav

3.2 Metode

3.2.2 Izolacija plazmida

Celice bakterije E. coli DH5α, ki so zrastle v tekočem gojišču LBA smo centrifugirali 10 minut na 4 °C pri hitrosti 5400 g. Supernatant smo zavrgli. Za izolacijo plazmida smo uporabili komplet reagentov GeneJET Plasmid Miniprep Kit. Bakterije smo najprej resuspendirali in lizirali, čemur je sledilo obarjanje genomske DNA, ki smo jo nato odstranili s centrifugiranjem. Preostanek smo prenesli na kolono, ki vsebuje silikatni nosilec, na katerega se ujame plazmidna DNA. Plazmidno DNA smo nato sprali s pufrom za spiranje in eluirali s 30 µL deionizirane vode. Koncentracijo plazmidne DNA smo določili z merjenjem absorbance pri 260 nm, njeno čistost pa iz razmerja: ^𝐴²⁶⁰

𝐴₂₈₀. 3.2.3 Transformacija celic E. coli BL21[DE3]

Alikvot celic bakterije E. coli BL21[DE3] smo odmrznili na ledu in v mikrocentrifugirko dodali 1 µL plazmida pMCSG7 z zapisom za protein ORF8 ali protein N. Celice smo 20 minut inkubirali na ledu in jih občasno pretresli. Sledil je temperaturni šok, ko smo bakterije in plazmid 45 sekund inkubirali pri 42 °C. Bakterije smo nato vrnili na led in jim nato pri sobni temperaturi aseptično dodali 800 µL tekočega gojišča LB. Sledilo je enourno inkubiranje bakterij na 37 °C pri stresanju 130 rpm. 50 µL bakterijske kulture smo nato aseptično prenesli na ploščo LBA, ki smo jo nato inkubirali na 37 °C čez noč.

3.2.4 Precepljanje celic E. coli BL21[DE3] v MDG

Po eno kolonijo bakterije E. coli BL21[DE3] z zapisom za enega od rekombinantnih proteinov, ki je zrastla na trdnem gojišču LBA, smo aseptično precepilli z nastavkom pipete v 30 mL tekočega gojišča MDG v 100 mL stresalni erlenmajerici. Naredili smo tudi kontrolo, pri kateri smo uporabili prazen nastavek pipete. Stresalne erlenmajerice smo nato inkubirali na 37 °C pri stresanju 130 rpm čez noč.

3.2.5 Poskusno izražanje

V šestih 100 mL stresalnih erlenmajericah smo pripravili 50 mL tekočega gojišča TB/Glu/Asp. Vanje smo odpipetirali 100 µL bakterijske kulture iz tekočega gojišča MDG. Tri paralelke smo pripravili z bakterijsko kulturo E. coli BL21[DE3] z zapisom za protein ORF8, tri pa z zapisom za protein N. Bakterije smo inkubirali na 37 °C pri stresanju 130 rpm 3 do 4 ure. Nato smo bakterijski kulturi izmerili absorbanco pri 600 nm, ki smo jo nato merili na vsakih 15 do 30 minut, dokler ni dosegla vrednosti med 0,6 in 0,8, kar je pomenilo, da so celice dosegle logaritemsko fazo rasti. Takrat smo izvedli indukcijo in bakterijam dodali 50 µL 1M IPTG. Bakterijske kulture smo nato inkubirali pri 18 °C, 25 °C in 37 °C čez noč.

Prekonočnim bakterijskim kulturam v gojišču TB/Glu/Asp smo izmerili absorbanco.

Kot slepo vrednost smo uporabili gojišče TB, bakterijske kulture pa smo 10-kratno redčili – 100 µL bakterijske kulture smo dodali 900 µL gojišča TB. S pomočjo vrednosti absorbance smo izračunali volumen pufra Na-Tris, potreben za resuspendiranje bakterijskih celic. Upoštevali smo enačbi 𝑓 = ^{270 µL}

150 µL × 𝐴600 ×10 in 𝑉_{𝑟𝑒𝑠.}= ^{4 × 𝑉}^{𝑜𝑑𝑣.}

5 ×𝑓 , pri katerih je:

A600 – vrednost absorbance, izmerjene pri 600 nm, f - faktor, odvisen od absorbance,

Vres. - volumen pufra, potreben za resuspendiranje celic, Vodv. - volumen odvzete bakterijske kulture.

Bakterijske kulture v tekočem gojišču TB/Glu/Asp smo centrifugirali 10 minut pri 8000 g. Supernatant smo zavrgli, pelet pa resuspendirali v ustreznem volumnu pufra Na-Tris. Bakterijske celice smo nato shranili pri −80 °C.

3.2.6 Izražanje v večjem merilu

V osmih 2 L stresalnih erlenmajericah smo pripravili 400 mL tekočega gojišča TB/Glu/Asp. V štiri erlenmajerice smo iz tekočega gojišča MDG nacepili 800 µL bakterijske kulture z zapisom za ORF8, v štiri pa za N. Erlenmajerice smo inkubirali pri 37 °C in stresanju 130 rpm 3 do 4 ure, nato pa pričeli z merjenjem absorbance pri 600 nm. Ko je vrednost absorbance prenehala naraščati, smo v vsako erlenmajerico dodali 400 µL IPTG in jih prekonočno inkubirali pri 37 °C in stresanju 130 rpm. Po enakem postopku kot pri poskusnem izražanju smo 10-krat redčenim vzorcem prekonočnih kultur izmerili absorbanco in jih centrifugirali. Pelet smo resuspendirali v 40 mL pufra Na-Tris in ga shranili pri −80 °C.

3.2.7 Priprava vzorcev za analizo z NaDS-PAGE

Vzorce bakterijskih celic smo odmrznili na ledu in odpipetirali 1 mL vzorca v mikrocentrifugirko. Bakterijske celice smo lizirali s sonifikatorjem, tako da smo vsak vzorec sonificirali trikrat po 30 sekund. Delali smo v hladni sobi, vzorci so bili ves čas na ledu, s čimer smo morebitno prisotnim proteazam preprečili razgradnjo proteina.

Cikel sonifikatorja je bil 0,8, amplituda pa 80 %. Lizat smo nato centrifugirali 10 minut na 4 °C pri hitrosti 15 000 g. Po centrifugiranju je prišlo do ločitve topne in netopne frakcije proteinov. Slednjo smo resuspendirali v 800 µL pufra z ureo.

Pripravili smo 12 mikrocentrifugirk z nikljevimi kroglicami. V vsako mikrocentrifugirko smo odpipetirali 50 µL v etanolu resuspendiranih nikljevih kroglic.

Po 15-minutnem posedanju kroglic smo odpipetirali supernatant in kroglice sprali z deionizirano vodo. Kroglicam smo dodali 200 µL deionizrane vode in jih centrifugirali 1 minuto na 4 °C pri 700 g ter zavrgli supernatant. Postopek smo ponovili dvakrat.

Sledila je inkubacija kroglic v pufru – tistim, namenjenim vezavi netopne frakcije smo dodali 200 µL pufra z ureo, tistim, namenjenim vezavi topne frakcije pa 200 µL pufra Na-Tris. Kroglice smo centrifugirali 1 minuto na 4 °C pri 700 g ter zavrgli supernatant.

Postopek smo ponovili dvakrat. V vsako mikrocentrifugirko z nikljevimi kroglicami smo dodali 200 µL vzorca in jih inkubirali 20 minut na 4 °C. Vzorce smo nato centrifugirali 1 minuto na 4 °C pri 700 g ter zavrgli supernatant. Vse vzorce smo po prej opisanem postopku še enkrat sprali s pufrom Na-Tris. Po spiranju smo vzorcem dodali 10 µL štirikratnega nanašalnega pufra z reducentom in 30 µL pufra Na-Tris. Vzorce smo nato 5 minut inkubirali pri 100 °C.

Vzporedno smo pripravili tudi vzorce brez nikljevih kroglic. Odpipetirali smo 18 µL vzorca topne ali netopne frakcije in mu dodali 6 µL štirikratnega nanašalnega pufra z reducentom. Vzorce smo nato 5 minut prekuhavali pri 100 °C.

3.2.8 Analiza proteinov z NaDS-PAGE

Pripravili smo gele za analizo proteinov z NaDS-PAGE. V model smo najprej ulili ločevalni gel, ko se je ta zamrežil, pa še koncentracijskega. Reagenta TEMED in APS, ki sprožita zamreževanje akrilamida ter bisakrilamida smo dodali šele, ko je bila mešanica preostalih reagentov že ulita v modele. Za hitrejšo polimerizacijo smo dodali dvakratno količino APS. Polimerizacija posameznega gela je trajala približno 20 minut.

Stekelca z geli smo nato iz modelov prenesli v kadičko s pufrom za elektroforezo in v žepke na gelu nanesli 12 µL vzorca in 8 µL proteinskega standarda. Kadičko smo priključili na električno napetost 200 V, tok pa je znašal 35 mA/gel. Elektroforeza je tekla tako dolgo, da je linija barvila dosegla spodnji rob gela.

Za barvanje gela smo uporabili barvalno raztopino. Gel smo v petrijevki s pokrovom prelili s približno 20 mL barvalne raztopine in ga pustili na stresalniku čez noč.

Po barvanju smo iz petrijevke odlili barvalno raztopino in gele prelili z razbarvalno raztopino. Gele smo v petrijevki stresali še 20 minut in nato razbarvalno raztopino odlili ter gele splaknili z deionizirano vodo in jih v njej tudi hranili.

3.2.9 Izolacija proteinov z nikljevo afinitetno kromatografijo

Inducirane in resuspendirane bakterijske celice, ki so bile shranjene pri –80 °C smo odmrznili in prelili v 100 mL čašo, ki smo jo ves čas hranili na ledu. Celice smo nato lizirali s sonifikacijo. Sonificirali smo s sonifikatorjem Hielscher UP100H v petih triminutnih intervalih, med katerimi je bila minuta premora, da smo preprečili pregrevanje vzorca. Iz istega razloga smo vzorec tudi neprestano hranili na ledu in sonificiranje izvajali v hladni sobi. Cikel sonifikatorja je bil 0,8, amplituda pa 80 %. Po sonifikaciji smo lizat prelili v 50 mL centrifugirko in ga centrifugirali 20 minut pri 16 000 g na 4 °C. Supernatant smo nato filtrirali najprej skozi 0,45 µm filter in nato še skozi 0,2 µm filter. V dve mikrocentrifugirki smo shranili 50 µL topne frakcije in pelet, ki smo ga resuspendirali v 50 µL deionizirane vode.

Za afinitetno čiščenje smo uporabili kolono z imobiliziranimi nikljevimi ioni HisTrap™

FF s kapaciteto 1 mL. Za nanos vzorca smo uporabili peristaltično črpalko. Kolono smo najprej sprali z 10 mL destilirane vode, nato pa še z 10 mL vezavnega pufra. Pretok je bil 1 mL/min. Sledil je nanos topne frakcije vzorca na kolono, pretok smo upočasnili na 0,5 mL/min, da je bila vezava proteinov učinkovitejša. Pri nanosu vzorca na kolono se protein s heksahistidinsko oznako veže na imobilizirane dvovalentne nikljeve ione, preostali proteini pa se ne vežejo ali pa se vežejo zgolj nespecifično. Ko je preko kolone stekel ves vzorec, smo odvzeli 50 µL nevezane frakcije in ga shranili v mikrocentrifugirko. Kolono smo nato sprali z 10 mL vezavnega pufra, da smo odstranili nespecifično vezane proteine. Shranili smo tudi 50 µL sprane frakcije. Vezani protein smo s kolone odstranili z izokratsko elucijo. Na kolono smo nanašali elucijski pufer z imidazolom, ki se veže na nikljeve ione in z njih izpodrine protein. V mikrocentrifugirke smo zbrali deset frakcij po 1 mL. Kolono smo sprali najprej z 10 mL destilirane vode in nato z 10 mL 20 % etanola.

Frakcijam smo izmerili absorbanco in tako določili, v katerih frakcijah se nahaja protein. Dobljene vzorce smo analizirali tudi z NaDS-PAGE.

3.2.10 Zamenjava pufra z dializo

Protein N je velik 45,6 kDa, zato smo za dializo uporabili celulozno dializno črevo s porami velikosti 14 K. Črevo smo čez noč inkubirali v 3 L dializnega pufra ob stalnem mešanju z magnetnim mešalom pri 4 °C. S tem smo odstranili imidazol, ki je ostal v vzorcu po čiščenju na nikljevi afinitetni koloni. Po koncu dialize smo vzorec

odpipetirali v 15 mL centrifugirko in ga centrifugirali 20 minut na 4 °C pri 16 000 g.

Supernatant smo odpipetirali v svežo centrifugirko, pelet pa zavrgli. Vzorcu smo izmerili absorbanco in ga nato shranili pri –80 °C.

3.2.11 Cepitev proteinov s proteazo TEV

S proteazo TEV smo odcepili histidinsko oznako na proteinu, kar nam je omogočilo dodatno stopnjo čiščenja. Vzorec smo čez noč dializirali v pufru, v dializno črevo smo skupaj z vzorcem dodali proteazo TEV. Masa proteaze TEV je bila 100-krat manjša od predvidene mase proteina, ki smo jo izračunali iz njegove koncentracije, določene z merjenjem absorbance. Koncentracija proteaze TEV je bila 4,5 mg/mL. Po dializi smo vzorec odpipetirali v 15 mL centrifugirko in centrifugirali 20 minut na 4 °C pri 16 000 g. Supernatant smo odpipetirali v svežo centrifugirko, pelet pa zavrgli. Vzorec smo nanesli na kolono za nikljevo afinitetno kromatografijo na enak način kot pri čiščenju proteina s pomočjo heksahistidinske oznake. Nevezane frakcije smo v mikrocentrifugirkah zbrali v mililitrskih alikvotih. Ko je zmanjkalo vzorca, smo kolono sprali še z vezavnim pufrom, tako da smo dobili 15 alikvotov. Sledil je nanos elucijskega pufra na kolono, pri čemer smo zbrali osem mililitrskih alikvotov eluirane frakcije. Vsem alikvotom smo z merjenjem absorbance določili koncentracijo proteina in jih analizirali z NaDS-PAGE. Vzorce smo čez noč shranili na ledu v hladni sobi.

3.2.12 Koncentriranje proteina

Za koncentriranje smo uporabili centrifugirni filter Amicon Ultra-4, ki smo ga najprej sprali s 4 mL deionizirane vode. Naenkrat smo skozi membrano centrifugirali 3 mL vzorca, centrifugirali smo 10 minut na 4 °C pri 7500 g. Med vsakim centrifugiranjem smo skoncentrirani vzorec premešali s pipetiranjem. Po koncentriranju smo vzorcu zamenjali pufer z dializnim pufrom, tako da smo dodali 2 mL dializnega pufra in ponovno centrifugirali. Ta postopek smo ponovili štirikrat. Na koncu smo dobili približno 250 µL vzorca, ki smo ga shranili pri –80 °C.

3.2.13 Merjenje absorbance z uporabo naprave Nanodrop

Z merjenjem absorbance smo določali koncentracijo plazmidne DNA in proteinov.

Koncentracijo plazmidne DNA smo določili z merjenjem absorbance pri 260 nm, določili pa smo tudi razmerje absorbanc pri 260 nm in 280 nm, s čimer smo preverili čistost vzorca. Kot slepi vzorec smo uporabili 4 µL deionizirane vode, analizirali smo 2,5 µL vzorca.

Koncentracijo proteinov smo določili z merjenjem absorbance pri 280 nm, kjer imajo svoj absorpcijski maksimum aromatske aminokisline. Spektrofotometer Nanodrop smo umerili s 4 µL pufra, v kakršnem smo hranili proteine. Absorbanco smo izmerili 2,5 µL posameznega vzorca.

3.2.14 Sinteza aminofunkcionaliziranih monodisperznih delcev SiO2

Metodo sinteze monodisperznih delcev SiO2 so pred skoraj pol stoletja razvili Werner Stöber, Arthur Fink in Ernst Bohn¹⁷. Kontrolirana rast sferičnih delcev silicijevega dioksida enake velikosti poteka s hidrolizo alkil silikatov in sledečo kondenzacijo silicijeve kisline v raztopinah alkoholov. Reakcijo katalizira amonijak. Primer rekcije je hidroliza tetraetil ortosilikata (TEOS) v etanolu:

Si(OC2H5)4 + 4H2O → Si(OH)4 + 4C2H5OH, ki ji sledi polimerizacija ortosilikata:

nSi(OH)4 → (SiO2)n + 2nH2O¹⁸.

Kondenzacija silicijeve kisline povzroči vidno spremembo. Po dodatku tetraetil ortosilikata mešanici etanola in amonijaka ali amonijevega hidroksida v nekaj minutah reakcijska mešanica postane opalescentna, nato pa v roku desetih minut postane mlečno bela. V tem delu sinteze se iz tekoče faze izločijo majhna kondenzacijska jedra, velika približno 10 nm, ki nato rastejo z nadaljnjo polimerizacijo ortosilikata. Vrsta alkohola vpliva na hitrost reakcije (reakcija poteka hitreje pri nižjih alkoholih) in velikost delcev (višji alkoholi povzročijo sintezo večjih delcev). Enako vpliva tudi vrsta alkil silikata.

Amonijak katalizira reakcijo in vpliva na morfologijo delcev – pri reakcijah brez amonijaka nastanejo delci nepravilnih oblik. Večja koncentracija amonijaka omogoča nastanek večjih delcev¹⁷.

Delce smo sintetizirali na dva načina, s čimer smo dobili sva seta delcev različnih velikosti. Za delce, velike 200 nm, smo uporabili direktno metodo, pri kateri smo v 100 mL bučki zmešali 49 mL etanola in 10 mL raztopine amonijaka. Posebej smo zmešali 1 mL etanola in 1 mL TEOS, ter ju počasi dodali v bučko. Mešanico smo pustili mešati dve uri in jo nato očistili po spodaj navedenem postopku. Delce, velike 80 nm, smo pripravili po Stöberjevi metodi, kjer smo v 100 mL bučki zmešali 47 mL etanola, 3,3 mL amonijevega hidroksida in 4 mL TEOS ter mešanico pustili mešati 24 ur.

Aminofunkcionalizacijo delcev smo izvedli tako, da smo mešanicama dodali 0,3 mL APTES in ju pustili mešati 24 ur.

Po 24 urah funkcionalizacije z APTES smo delce očistili. Vsebino bučke smo v dveh 50 mL centrifugirkah centrifugirali 5 minut pri hitrosti 8000 g na 4 °C. Supernatant smo zavrgli in peletu dodali približno 10 mL etanola, v katerem smo delce nato resuspendirali z ultrazvokom. Sledilo je ponovno centrifugiranje. Ta postopek smo ponovili šestkrat.

3.2.15 Funkcionalizacija monodisperznih delcev SiO2 s proteinom N

Za kovalentno vezavo proteina na monodisperzne delce SiO2 morajo imeti ti na svoji površini aktivne skupine. Najprimernejše so aminske in karboksilne funkcionalne skupine. Sami delci SiO2 imajo na površini proste hidroksilne skupine, na katere lahko s kondenzacijo vežemo aminofunkcionaliziran alkoksisilan¹⁹. Primer reakcije z APTES prikazuje slika 2.

Slika 2: Aminofunkcionalizacija delcev SiO2 s (3-aminopropil)trietoksisilanom¹⁹.

Na nastale aminofunkcionalizirane delce nato uvedemo homobifunkcionalni prečni povezovalec, ki reagira z aminskimi skupinami, preko katerih lahko na delce vežemo protein²⁰. Primer tovrstne funkcionalizacije z glutaraldehidom in nadaljnji proces vezave liganda s prosto aminsko skupino na delec prikazuje slika 3.

Slika 3: Funkcionalizacija aminofunkcionaliziranih delcev SiO2 z glutaraldehidom in kovalentna vezava liganda²⁰.

Aminofunkcionalizirane delce smo pred funkcionalizacijo posušili, s čimer smo odstranili etanol. V mikrocentrifugirke smo odpipetirali 1 mL suspenzije in

mikrocentrifugirke pustili odprte čez noč. Funkcionalizirali smo 10 mg delcev, velikih 80 nm ali 200 nm. V 1 mL pufra za spiranje (PBS) smo z ultrazvokom resuspendirali posušene delce, nato pa jih centrifugirali 5 minut pri hitrosti 7500 g in temperaturi 4 °C.

Supernatant smo zavrgli. To smo ponovili dvakrat. Po spiranju smo delce resuspendirali v 1 mL 10 % raztopine glutaraldehida in jih na sobni temperaturi pustili mešati 2 uri. S tem smo nanje uvedli karbonilne funkcionalne skupine. Delce smo nato s pufrom za spiranje dvakrat sprali po prej navedenem postopku in jih na koncu resuspendirali v 50 µL PBS.

Količino proteina N, potrebno za funkcionalizacijo delcev, smo izračunali po enačbi:

𝑆 = 𝐶 × ⁶

𝜌𝑆 × 𝑑, pri kateri so:

S – količina proteina, potrebna za površinsko nasičenost delcev (mg proteina/g delcev), C – vezavna kapaciteta površine monodisperznih delcev za dani protein,

ρS – gostota monodisperznega delca (za SiO2 ta znaša 2,0 g/cm³), d – premer delcev.

Za funkcionalizacijo smo uporabili desetkratnik izračunane potrebne mase proteina. Za funkcionalizacijo 80 nm delcev bi za monosloj potrebovali 0,1125 mg proteina N/g delcev. Končna koncentracija proteina N je bila 0,075 mg/mL, zato smo za funkcionalizacijo z 10-kratnim prebitkom uporabili 150 µL raztopine proteina. Za funkcionalizacijo 200 nm delcev bi za monosloj potrebovali 0,045 mg proteina/g delcev, desetkratniku te vrednosti za 10 mg delcev ustreza 60 µL raztopine proteina.

Delcem, resuspendiranim v PBS, smo dodali protein in jih v hladni sobi pustili mešati 3 ure. Po inkubaciji delcev s proteinom smo jih centrifugirali 5 minut pri hitrosti 7500 g in temperaturi 4 °C, odstranili supernatant, jih še enkrat sprali s PBS in nato z mešanjem resuspendirali v 1 mL dušilne raztopine s 35 mM glicinom, ki je s svojimi primarnimi aminskimi skupinami reagiral s prostimi aldehidnimi skupinami na delcih, in govejim serumskim albuminom, ki je deloval kot molekula za blokiranje in preprečil nespecifične interakcije delcev in netarčnih molekul. Mešanico smo nato inkubirali v hladni sobi 30 minut pri stalnem mešanju. Po inkubaciji smo delce centrifugirali 5 minut pri hitrosti 7500 g in temperaturi 4 °C, odstranili supernatant in delce z mešanjem resuspendirali v 1 mL pufra za shranjevanje.

3.2.16 Dokazna reakcija z uporabo hitrih antigenskih testov

Za dokaz prisotnosti proteina N v vzorcu smo uporabili hitre antigenske teste Immupass VivaDiag™ SARS-CoV-2 Ag Rapid Test. Po navodilih proizvajalca smo na vzorčno območje testnega pripomočka (označeno s S) nanesli 60 µL vzorca in počakali 15 minut, da je vzorec s kapilarnim vlekom potoval skozi membrano in reagiral z antigeni na testni in kontrolni liniji. Vijolično obarvanje na kontrolni liniji je potrdilo veljavnost testa, vijolično obarvanje na testni liniji pa prisotnost proteina N v vzorcu.

4 Rezultati in razprava

4.1 Transformacija bakterijskih celic

4.1.1 Izolacija plazmida

Iz celic E. coli DH5α smo z uporabo kompleta reagentov izolirali plazmid pMCSG7 z zapisom za protein N ali ORF8. Po izolaciji smo z merjenjem A280 določili koncentracijo plazmida in z izračunom razmerja ^𝐴²⁶⁰

𝐴280 določili čistost vzorca. Vrednost razmerja ^𝐴²⁶⁰

𝐴280 za raztopino čiste dvoverižne DNA je 1,8. Kontaminacija vzorca z RNA to vrednost poviša, saj je razmerje ^𝐴²⁶⁰

𝐴280 za čisto RNA 2,0. Kontaminacija s proteini ali fenoli pa vrednost zniža. Izmerjene vrednosti so znašale:

A280 (N) = 73,2 ng/µL

𝐴280 je bilo v obeh primerih večje od 1,8, torej je bila v obeh vzorcih prisotna še RNA, kar pa bistveno ne vpliva na transformacijo.

4.1.2 Transformacija E. coli BL21[DE3]

Celice smo transformirali z vektorjem pMCSG7 z zapisom za protein N ali ORF8.

Uporabili smo ekspresijski sev bakterije Escherichia coli BL21[DE3], ki v svojem genomu že vsebuje zapis za RNA-polimerazo T7 iz bakteriofaga λ. Bakterijski sev prav tako ne vsebuje endogenih proteaz Lon in OmpT, kar zmanjša razgradnjo rekombinantnih proteinov²¹. Po transformaciji smo bakterijske celice razmazali na trdno LBA gojišče. Na plošči smo nanesli 100 µL kulture bakterijskih celic z zapisom za ORF8 ali N. Na obeh ploščah so zrastle kolonije, izmed katerih smo nato eno precepili v tekoče gojišče MDG.

4.2 Poskusno izražanje

Proteina ORF8 in N smo poskusno izražali pri treh različnih temperaturah. V 100 mL stresalne erlenmajerice smo pripravili 50 mL tekočega gojišča TB/Glu/Asp in iz tekočega gojišča MDG vanj prenesli 100 µL kulture bakterijskih celic E. coli BL21[DE3], transformiranih s plazmidom pMCSG7-ORF8 ali pMCSG7-N. Celice smo preko noči inkubirali pri temperaturah 18 °C, 25 °C in 37 °C. Nato smo celicam izmerili A600. Uporabili smo 10-krat redčen vzorec, kot slepo vrednost pa smo uporabili gojišče TB. Vrednosti absorbance prikazuje tabela 8.

Tabela 8: Vrednosti absorbance 10-krat redčenega vzorca celic E. coli BL21[DE3] v gojišču TB/Glu/Asp, ki izražajo protein ORF8 ali N, pri različnih temperaturah.

Temperatura A600 (ORF8) A600 (N)

18 °C 0,058 0,262

25 °C 0,288 0,280

37 °C 0,388 0,449

Bakterijske celice smo lizirali s sonifikacijo, nato pa ločili topno in netopno frakcijo ter ju analizirali z NaDS-PAGE. Obe frakciji smo analizirali bodisi z dodanimi nikljevimi kroglicami IMAC Sepharose™ 6FastFlow bodisi brez njih. S tem smo preverili sposobnost vezave proteinov na dvovalentne nikljeve ione. Rezultati elektroforeze so vidni na slikah 4-6. V vseh vzorcih vidimo na gelu veliko število lis, kar pomeni, da je prisotnih še mnogo drugih proteinov, torej bo izolacija želenega proteina nekoliko otežena. Protein N je skupaj s heksahistidinsko oznako velik 46,4 kDa. Na elektroforeznih gelih pri vseh netopnih frakcijah proteina N opazimo intenzivno črto nekoliko nad oznako standarda, ki ustreza 45 kDa. Na enaki višini pri topnih frakcijah opazimo šibkejšo liso. Protein se očitno nahaja predvsem v netopni frakciji, možno pa je, da se ga nekaj nahaja tudi v topni obliki. Iz intenzitete lis ne moremo sklepati, pri kateri temperaturi se je izrazilo največ proteina. Protein ORF8 je skupaj s heksahistidinsko oznako velik 14,6 kDa, Črto, ki bi ustrezala tej velikosti vidimo v vseh netopnih frakcijah, vendar ni intenzivna. V primeru topnih frakcij črte ne vidimo, torej se protein nahaja predvsem v netopni obliki. Zaradi tega smo se odločili, da proteina ORF8 ne bomo skušali izolirati iz topne frakcije in smo delo nadaljevali le še s proteinom N.

Slika 4: Analiza poskusnega izražanja proteinov v E. coli BL21[DE3] z NaDS-PAGE. Oznake vzorcev: st. – proteinski standard, 1 – topna frakcija proteina N, izražena pri 18 °C, na Ni-kroglicah, 2 – topna frakcija proteina N, izražena pri 18 °C, 3 – topna frakcija proteina N, izražena pri 25 °C, na Ni-kroglicah, 4 – topna frakcija proteina N, izražena pri 25 °C, 5 – topna frakcija proteina N, izražena pri 37

In document Neža Žerjav (Strani 32-0)