Kemikalije in reagenti

Za analize smo uporabili naslednje kemikalije:

 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH•) reagent (Sigma, Nemčija)

 2,4-dinitrofenilhidrazin (DNPH) reagent (97%, Aldrich, Avstrija)

 aluminijev triklorid (AlCl3) (Sigma, Nemčija)

 etanol (96 %, Honeywell Riedel-de Haën, Nemčija)

 fenazin metasulfat (PMS) (Sigma, Nemčija)

 Folin-Ciocalteu reagent (Sigma, Švica)

 galna kislina (monohidrat; C7H6O5·H2O) (Sigma, Nemčija)

 kalijev dihidrogenfosfat (KH2PO4) (Merck, Nemčija)

 kalijev hidroksid (KOH) (Sigma, Švica)

 kvercetin (Sigma, Nemčija)

 metanol (Merck, Nemčija)

 naringenin (Sigma, Nemčija)

 natrijev hidrogen fosfat (Na2HPO4) (Merck, Nemčija)

 natrijev hidroksid (NaOH) (Merck, Nemčija)

 natrijev karbonat (Na2CO3) (Merck, Nemčija)

 natrijev nitrit (NaNO2) (Alkaloid, Makedonija)

 nikotinamid adenin dinukleotid (NADH) (Sigma, Nemčija)

 nitrotetrazol modro (NBT) (Sigma, Švica)

 rutin (trihidrat; C27H30O16·3H2O) (Sigma, Nemčija)

 žveplova (VI) kislina (95-97 %, Merck, Nemčija) 3.1.3 Naprave in pribor

Za analizo smo uporabili naslednje naprave in pribor:

Naprave:

 analitska tehtnica (Mettler Toledo AT201, Švica)

 avtomatske pipete (Eppendorf, Nemčija)

 centrifuga (Tehtnica Centric200, Slovenija)

 centrifuga (Tehtnica Centric322A, Slovenija)

 hladilnik

 konvekcijski sušilnik (Memmert VO400, Nemčija)

 liofilizator (CHRIST Alpha 1-2 LD plus, Nemčija)

 magnetno mešalo (IKA RCT basic, Nemčija)

 pH meter

 stresalnik (Tehtnica VIBROMIX 314 EVT, Slovenija)

 tehtnica (Mettler Toledo PB3002-5, Švica)

 termoblok (Starlab, Švica)

 ultrazvočna vodna kopel (Kambič WB-30 STE, Slovenija)

 ultrazvočna vodna kopel (Omnilab, Nemčija)

 UV-VIS spektrofotometer (Hewlett – Packard 8453, ZDA)

 vrtinčnik

 filter papir (Sartorius 389, z velikostjo por 125 mm)

 lij

 merilni valj

 nastavki za pipete (Eppendorf, Nemčija)

 plastična ladjica za tehtanje

 plastične centrifugirke (Eppendorf, Nemčija)

 plastične epruvete z navojem

 plastične kivete (Brand, Nemčija)

 puhalka

Vse postopke obdelave in analize smo izvajali v treh paralelkah.

3.2.1 Določanje deleža vode v vzorcih cvetnega prahu

Delež vode v vzorcih smo določali s sušenjem cvetnega prahu osmukanca do konstantne mase. Natehtali smo po 2,5 g cvetnega prahu osmukanca (na 0,001 g natančno) v steklene tehtiče in cvetni prah sušili pri 105 °C 3 h. Nato smo vzorce postavili v eksikator in hladili 30 – 45 min. Tehtiče z vzorci smo stehtali in jih ponovno postavili na 105 °C za 3 h. Postopek smo ponavljali do konstante mase. Slika 4 prikazuje eksikator z vzorci.

Slika 4: Eksikator z vzorci cvetnega prahu osmukanca

3.2.2 Vpliv temperature in časa toplotne obdelave cvetnega prahu

Uporabili smo vzorce cvetnega prahu z oznako CP8, CP10 in CP11. Zatehtali smo po 1,5 g cvetnega prahu v plastične epruvete z navojem in jih postavili v konvekcijski sušilnik pri temperaturi in za čas toplotne obdelave, kot opisuje preglednica 2. Ekstrakcijo smo izvedli največ dva dni po obdelavi.

Preglednica 2: Način obdelave vzorcev cvetnega prahu osmukanca Oznaka vzorca Način obdelave

CP8 40 °C/ 24 h, 50 °C/ 6 h, 50 °C/24 h, 70 °C/6 h in 70 °C/24 h CP10 40 °C/ 24 h, 50 °C/ 6 h, 50 °C/24 h, 70 °C/6 h in 70 °C/24 h CP11 40 °C/ 24 h, 50 °C/ 6 h, 50 °C/24 h, 70 °C/6 h in 70 °C/24 h

3.2.3 Vpliv liofilizacije kot načina sušenja cvetnega prahu

Uporabili smo vzorce cvetnega prahu z oznako CPA, CPB in CPC. Za sušenje v liofilizatorju (slika 5) smo zatehtali po 2,0 g cvetnega prahu in vzorce predhodno zamrznili pri –80 °C.

Nato smo jih postavili v liofilizator (temperatura = –50 °C, tlak < 0,1 mbar) za 22 h (do konstantnega tlaka). Liofilizacija vzorcev je potekala v liofilizatorju, ki je prikazan na sliki 5.

Za primerjavo smo izvedli še sušenje v konvekcijskem sušilniku, pri čemer smo zatehtali po 2,0 g cvetnega prahu in ga sušili pri 60 °C 24 h.

Slika 5: Liofilizator

3.2.4 Ekstrakcija

Za ekstrakcijo smo uporabili 96 % etanol. V epruvete z navojem (15 mL) smo natehtali po 3 g predhodno temperiranih vzorcev cvetnega prahu in dodali po 9 mL etanola (96 %).

Vsebino epruvet smo dobro ročno premešali. Epruvete z navojem smo postavili na stresalnik in prekrili z aluminijevo folijo. Sledilo je stresanje na stresalniku s 175 obr/min. Na vsakih 30 min smo vzorce dobro ročno premešali in postavili nazaj na stresalnik. Po 2 h stresanja smo postavili vzorce za 30 min v ultrazvočno kopel. Nato smo postavili vzorce nazaj na stresalnik za 3 h in jih ročno premešali na vsako uro. Po končani ekstrakciji smo vzorce filtrirali in filtrat centrifugirali 10 min na 4000 obratih/min. Supernatant smo odlili v nove epruvete z navojem in izvlečke shranili v hladilniku do analiz.

3.2.5 Skladiščenje izvlečkov

Vpliv skladiščenja izvlečkov cvetnega prahu osmukanca na vsebnost skupnih fenolnih spojin smo ugotavljali pri šestih izvlečkih svežega cvetnega prahu (CP7, CP8, CP9, CP10, CP11, CP12) in pri šestih izvlečkih skladiščenega cvetnega prahu (D35S, K35S, H35S, DZS, KZS, HZS).

Po ekstrakciji cvetnega prahu smo izvlečke prelili v 2 mL epice, zamašili in prekrili s parafilmom. Epice z izvlečki smo postavili: a) na sobno temperaturo/svetloba, b) na sobno temperaturo/tema in c) v hladilnik (4 °C) za tri mesece. Po preteku treh mesecev smo v izvlečkih določali vsebnost skupnih fenolnih spojin.

3.2.6 Določanje vsebnosti skupnih fenolnih spojin

Vsebnost skupnih fenolnih spojin smo določali z metodo Folin-Ciocalteu (Gutfinger, 1981).

Fenolne spojine v izvlečkih reagirajo s kompleksom fosfomolibden/fosfovolfram Folin-Ciocalteu reagenta in tvorijo modro obarvan kompleks, ki ga je mogoče kvantificirati s spektrofotometrijo.

Priprava reagentov:

 Folin-Ciocalteujev reagent smo pripravili tako, da smo ga razredčili z bidestilirano vodo v volumskem razmerju 1 : 2 (Folin-Ciocalteujev reagent : bidestilirana voda).

 Za pripravo 20 % (w/v) raztopine Na2CO3 smo natehtali 20 g Na2CO3 v 100 mL bučko in dopolnili do oznake z bidestilirano vodo.

Za pripravo umeritvene krivulje smo uporabili raztopino galne kisline s koncentracijo 100 mg/L. Na stekleno ladjico smo zatehtali 22,12 mg monohidrata galne kisline, kvantitativno prenesli v 200 mL bučko in do oznake dopolnili z bidestilirano vodo. V epicah smo pripravili različne razredčitve izhodne raztopine z bidestilirano vodo. Vse razredčitve so bile pripravljene v treh ponovitvah. V epice smo k ustrezno razredčeni raztopini galne kisline dodali 0,125 mL pripravljenega Folin-Ciocalteujevega reagenta in začeli meriti čas.

Po 5 min smo dodali 0,125 mL 20 % raztopine Na2CO3 in dopolnili z bidestilirano vodo do 1 mL. Nato smo vzorce centrifugirali 10 min na 13000 obr/min. Po 40 min od dodatka Folin-Ciocalteujevega reagenta smo pomerili absorbanco pri valovni dolžini 765 nm (A765) proti slepemu vzorcu (96 % etanol).

Umeritveno krivuljo z galno kislino, ki prikazuje A765 v odvisnosti od koncentracije galne kisline (γ) v reakcijski zmesi, smo pripravljali dvakrat, saj smo analize opravljali z večjim časovnim zamikom. Vrednosti A765I v preglednici 3 in na sliki 6 prikazujejo podatke za umeritveno krivuljo I, ki smo jo uporabili pri poglavjih 4.1, 4.2, 4.3 in 4.5. Vrednosti A765II v preglednici 3 in na sliki 7 prikazujejo podatke za umeritveno krivuljo II, ki smo jo uporabili pri poglavju 4.4.

Preglednica 3: Masna koncentracija galne kisline (γ) v reakcijski zmesi in povprečne vrednosti izmerjenih absorbanc pri valovni dolžini 765 nm

Z linearno regresijo smo določili smerna koeficienta (k) premic. Vrednost k premice na sliki 6 je 0,1051 (R² = 0,9919), vrednost k premice na sliki 7 je 0,1047 (R² = 0,9942).

Slika 6: Umeritvena krivulja I z galno kislino

Slika 7: Umeritvena krivulja II z galno kislino

Za določitev vsebnosti skupnih fenolnih spojin smo temperirali izvlečke in pripravili ustrezne razredčitve v 96 % etanolu. V epice smo odpipetirali 0,200 mL ustrezno razredčenega izvlečka in nadaljevali s postopkom za določanje skupnih fenolnih spojin.

Vsebnost skupnih fenolnih spojin v cvetnem prahu smo izrazili v ekvivalentih galne kisline kot mg galne kisline na gram suhe snovi (mg GA/gs.s.). Do vrednosti smo prišli s pomočjo naslednjih zvez. Najprej smo iz A765 in smernega koeficienta premice izračunali masno koncentracijo fenolnih spojin v reakcijski zmesi:

γreakc.zmesi =A₇₆₅

k ...(1)

γreakc.zmesi – masna koncentracija fenolnih spojin v reakcijski zmesi (mg/L) A765 – absorbanca pri valovni dolžini 765 nm

k – smerni koeficient premice

Nato smo izračunali masno koncentracijo fenolnih spojin v razredčenem izvlečku:

γrazred.izvleč.= ^γreakc.zmesi · Vreakc.zmesi

Vrazred.izvleč.

...(2)

γrazred.izvleč. – masna koncentracija fenolnih spojin v razredčenem izvlečku (mg/L) Vreakc.zmesi – volumen reakcijske zmesi (1,0 mL)

Vrazred.izvleč. – volumen razredčenega izvlečka (0,2 mL)

Iz masne koncentracije v razredčenem izvlečku in razredčitvenega faktorja smo izračunali masno koncentracijo fenolnih spojin v izvlečku in z upoštevanjem volumna celotnega izvlečka maso fenolnih spojin v izvlečku:

mv celot.izvleč. = γ_izvleč.· Vcelot.izvleč. ...(3)

γizvleč. – masna koncentracija fenolnih spojin v izvlečku (mg/L) mv celot.izvleč. – masa fenolnih spojin v celotnem izvlečku

Vcelot.izvleč. – volumen celotnega izvlečka pri ekstrakciji

Masa fenolnih spojin v celotnem izvlečku je enaka masi fenolnih spojin v zatehti cvetnega prahu osmukanca, zato smo maso fenolnih spojin na g cvetnega prahu izračunali iz naslednje zveze:

mna g cvetnega prahu= mv celot.izvleč.

m_cv.prahu ...(4)

mna g cvetnega prahu – masa fenolnih spojin na g cvetnega prahu (mg/g) mcv.prahu – masa cvetnega prahu (g)

Nato smo s pomočjo podatka o vsebnosti vode v vzorcih cvetnega prahu izračunali maso fenolnih spojin na gram suhe snovi in jo izrazili kot ekvivalent galne kisline v mg GA/gs.s.. 3.2.7 Določanje vsebnosti skupnih flavonoidov in posameznih skupin flavonoidov 3.2.7.1 Določanje vsebnosti skupnih flavonoidov

Vsebnost skupnih flavonoidov je mogoče določati spektrofotometrično z uporabo AlCl3. Ta metoda temelji na reakciji aluminijevih ionov s flavonoidi v bazičnih pogojih. Produkti

reakcije so rdeče obarvani aluminijevo-flavonoidni kelatni kompleksi (Pękal in Pyrzynska, 2014).

Priprava reagentov:

 Za pripravo 5 % (w/v) raztopine NaNO2 smo 2,50 g NaNO2 raztopili v majhnem volumnu bidestilirane vode (približno 30 mL) v čaši na magnetnem mešalu, kvantitativno prenesli v 50 mL bučko in dopolnili do oznake z bidestilirano vodo.

 Za pripravo 5 % (w/v) raztopine AlCl3 smo natehtali 2,50 g AlCl3 v čašo in počasi dodajali bidestilirano vodo (približno 20 mL, v digestoriju). Nato smo raztopino kvantitativno prenesli v 50 mL bučko in dopolnili do oznake z bidestilirano vodo.

 Za pripravo raztopine NaOH (1 mol/L) smo natehtali 10 g NaOH v čašo, raztopili na magnetnem mešalu, kvantitativno prelili v 250 mL bučko ter dopolnili do oznake z bidestilirano vodo.

Za pripravo umeritvene krivulje za določanje vsebnosti skupnih flavonoidov smo uporabili rutin. Pripravili smo dve umeritveni krivulji, saj smo določene analize izvajali z večjim časovnim zamikom.

Prvo umeritveno krivuljo z rutinom smo pripravili z uporabo izhodne raztopine rutina s koncentracijo 0,5 mg/mL. Na ladjico smo zatehtali 5,44 mg trihidrata rutina, ga kvantitativno prenesli v 10 mL bučko in dopolnili do oznake s 96 % etanolom. Za drugo umeritveno krivuljo smo pripravili izhodno raztopino rutina s koncentracijo 0,96 mg/mL. Na ladjico smo zatehtali 10,45 mg trihidrata rutina, ga kvantitativno prenesli v 10 mL bučko in dopolnili do oznake s 96 % etanolom. Nato smo odpipetirali različne volumne izhodne raztopine in dodali 96 % etanol do skupnega volumna 0,250 mL. K 0,250 mL ustrezno razredčene raztopine rutina smo dodali 1,25 mL bidestilirane vode in 0,075 mL raztopine NaNO2 ter pustili, da reagira 5 min. Nato smo dodali 0,15 mL raztopine AlCl3. Po 6 min od dodatka zadnjega reagenta (raztopina AlCl3) smo dodali 0,5 mL raztopine NaOH in 0,775 mL bidestilirane vode (do skupnega volumna 3 mL). Po dodatku vsakega reagenta smo vzorce dobro premešali na vrtinčniku. Po 30 min od dodatka zadnjega reagenta (raztopina NaOH) smo izmerili absorbanco pri valovni dolžini 510 nm (A510). Slepi vzorec smo pripravili na enak način, le namesto raztopine rutina smo uporabili etanol (96 %).

Masne koncentracije rutina v reakcijski zmesi in izmerjene A510 so prikazane v preglednici 4.

Preglednica 4: Masna koncentracija rutina v reakcijski zmesi (γ) in povprečne vrednosti izmerjenih absorbanc pri valovni dolžini 510 nm

γ (mg/L) A510I ± sd A510II ± sd 8,3 0,0977 ± 0,002 0,0992 ± 0,003 16,7 0,2047 ± 0,011 0,2011 ± 0,002 25,0 0,2983 ± 0,005 0,3060 ± 0,007 33,3 0,3997 ± 0,009 0,4167 ± 0,005 41,7 0,5146 ± 0,005 0,5279 ± 0,006

48,0 - 0,5882 ± 0,007

64,0 - 0,7793 ± 0,016

80,0 - 0,9787 ± 0,018

Slika 8 prikazuje graf A510I v odvisnosti od koncentracije rutina v reakcijski zmesi. Z linearno regresijo smo določili k premice, ki je 0,0122 (R² = 0,9993).

Slika 8: Umeritvena krivulja I z rutinom

Slika 9 prikazuje graf A510II v odvisnosti od koncentracije rutina v reakcijski zmesi. Z linearno regresijo smo določili k premice, ki je 0,0123 (R² = 0,9995).

Slika 9: Umeritvena krivulja II z rutinom

Za določanje vsebnosti skupnih flavonoidov smo k določenemu volumnu odpipetiranega izvlečka dodali 96 % etanol do skupnega volumna 0,250 mL. Postopek smo nadaljevali po metodi, kot je opisano pri pripravi umeritvene krivulje.

Vsebnost skupnih flavonoidov v cvetnem prahu smo izrazili v ekvivalentih rutina kot mg rutina na gram suhe snovi (mg RU/gs.s.). Do vrednosti smo prišli s pomočjo naslednjih zvez.

Najprej smo iz absorbance in smernega koeficienta premice izračunali masno koncentracijo skupnih flavonoidov v reakcijski zmesi:

γreakc.zmesi =A₅₁₀

k ...(5)

γreakc.zmesi – masna koncentracija skupnih flavonoidov v reakcijski zmesi (mg/L) A510 – absorbanca pri valovni dolžini 510 nm

k – smerni koeficient premice

Nato smo po naslednji zvezi določili masno koncentracijo skupnih flavonoidov v izvlečku:

γ_izvleč. =^γreakc.zmesi· Vreakc.zmesi

V_izvleč. ...(6)

γizvleč. – masna koncentracija skupnih flavonoidov v izvlečku (mg/L) Vreakc.zmesi – volumen reakcijske zmesi (3 mL)

Vizvleč. – volumen odpipetiranega izvlečka

Z upoštevanjem volumna celotnega izvlečka pri ekstrakciji smo izračunali maso skupnih flavonoidov v izvlečku.

mv celot.izvleč. = γ_izvleč.· Vcelot.izvleč. ...(7)

mv celot.izvleč. – masa skupnih flavonoidov v celotnem izvlečku Vcelot.izvleč. – volumen celotnega izvlečka pri ekstrakciji

Masa skupnih flavonoidov v celotnem izvlečku je enaka masi skupnih flavonoidov v zatehti cvetnega prahu osmukanca, zato smo maso skupnih flavonoidov na g cvetnega prahu izračunali z naslednjo zvezo:

mna g cvetnega prahu= mv celot.izvleč.

m_cv.prahu ...(8)

mna g cvetnega prahu – masa skupnih flavonoidov na g cvetnega prahu (mg/g)

mcv.prahu – masa cvetnega prahu (g)

Nato smo s pomočjo podatka o vsebnosti vode v posameznih vzorcih cvetnega prahu izračunali maso skupnih flavonoidov na gram suhe snovi in jo izrazili kot ekvivalent rutina v mg RU/gs.s..

3.2.7.2 Določanje vsebnosti skupnih flavonov in flavonolov

Vsebnost skupnih flavonov in flavonolov smo določali po nekoliko modificirani metodi z uporabo raztopine AlCl3, ki so jo opisali Popova in sod. (2004). Vsebnost smo določali spektrofotometrično.

Priprava reagentov:

 Za pripravo 5 % (w/v) raztopine AlCl3 smo natehtali 2,50 g AlCl3 v čašo in počasi dodajali bidestilirano vodo (približno 20 mL, v digestoriju). Nato smo raztopino kvantitativno prenesli v 50 mL bučko in dopolnili do oznake z bidestilirano vodo.

Za pripravo umeritvene krivulje smo uporabili raztopino kvercetina s koncentracijo 1 mg/mL. Na ladjico smo zatehtali 10 mg kvercetina, vsebino ladjice kvantitativno prenesli v 10 mL bučko in dopolnili do oznake s 96 % etanolom. Nato smo odpipetirali različne volumne izhodne raztopine in dodali 96 % etanol do skupnega volumna 100 μL. Tako smo pripravili pet različnih razredčitev raztopine kvercetina, vsako v treh paralelkah. K 100 μL ustrezno razredčene raztopine kvercetina smo dodali 1 mL etanola, 50 μL raztopine AlCl3 in začeli meriti čas. Nato smo mešanici dodali še 96 % etanol do skupnega volumna 2,5 mL.

Vzorce smo dobro premešali na vrtinčniku po dodatku vsakega reagenta. Po 30 min od dodatka raztopine AlCl3 smo pomerili absorbanco pri valovni dolžini 425 nm (A425) proti slepemu vzorcu, katerega smo pripravili na enak način, le da smo namesto raztopine kvercetina dodali etanol (96 %).

Preglednica 5: Masna koncentracija kvercetina v reakcijski zmesi (γ) in povprečne vrednosti izmerjenih absorbanc pri valovni dolžini 425 nm

Narisali smo umeritveno krivuljo odvisnosti A425 od masne koncentracije kvercetina v reakcijski zmesi, kot je razvidno iz slike 10, in z linearno regresijo določili k, ki znaša 0,0831 (R² = 0,9996).

Slika 10: Umeritvena krivulja s kvercetinom

Za določanje vsebnosti skupnih flavonov in flavonolov v izvlečkih cvetnega prahu smo najprej pripravili ustrezne razredčitve tako, da smo v steklene epruvete odpipetirali po 33 μL posameznega izvlečka in 67 μL 96 % etanola (skupno 100 μL). Ustrezno razredčenim izvlečkom smo dodali 1 mL etanola in nadaljevali s postopkom za določanje vsebnosti flavonov in flavonolov, kot je opisano pri pripravi umeritvene krivulje.

Vsebnost skupnih flavonov in flavonolov v vzorcih cvetnega prahu smo izrazili v ekvivalentih kvercetina kot mg kvercetina na gram suhe snovi (mg KV/gs.s.). Do vrednosti smo prišli s pomočjo naslednjih zvez. Najprej smo iz A425 in smernega koeficienta premice izračunali masno koncentracijo flavonov in flavonolov v reakcijski zmesi:

γreakc.zmesi =A₄₂₅

k ...(9)

γreakc.zmesi – masna koncentracija flavonov in flavonolov v reakcijski zmesi (mg/L) A425 – absorbanca pri valovni dolžini 425 nm

k – smerni koeficient premice

Nato smo po naslednji zvezi določili masno koncentracijo flavonov in flavonolov v izvlečku:

γ_izvleč. =^γreakc.zmesi· Vreakc.zmesi

V_izvleč. ...(10)

γizvleč. – masna koncentracija flavonov in flavonolov v izvlečku (mg/L) Vreakc.zmesi – volumen reakcijske zmesi (2,5 mL)

Vizvleč. – volumen odpipetiranega izvlečka (0,033 mL)

Z upoštevanjem volumna celotnega izvlečka pri ekstrakciji smo izračunali maso flavonov in flavonolov v izvlečku.

mv celot.izvleč. = γ_izvleč.· Vcelot.izvleč. ...(11)

mv celot.izvleč. – masa flavonov in flavonolov v celotnem izvlečku Vcelot.izvleč. – volumen celotnega izvlečka pri ekstrakciji

Masa flavonov in flavonolov v celotnem izvlečku je enaka njihovi masi v zatehti cvetnega prahu osmukanca, zato smo maso flavonov in flavonolov na g cvetnega prahu izračunali iz naslednje zveze:

mna g cvetnega prahu= mv celot.izvleč.

m_cv.prahu ...(12)

mna g cvetnega prahu – masa flavonov in flavonolov na g cvetnega prahu (mg/g) mcv.prahu – masa cvetnega prahu (g)

Nato smo iz podatkov o vsebnosti vode v vzorcih cvetnega prahu preračunali vsebnost flavonov in flavonolov na gram suhe snovi in jo izrazili v ekvivalentih kvercetina kot mg KV/gs.s..

3.2.7.3 Določanje vsebnosti skupnih flavanonov in dihidroflavonolov

Vsebnost skupnih flavanonov in dihidroflavonolov smo določali po nekoliko modificirani metodi, ki so jo opisali Popova in sod. (2004). Temelji na reakciji med flavanoni/dihidroflavonoli in 2,4-dinitrofenilhidrazinom (DNPH) v kislem okolju in tvorbi obarvanega fenilhidrazona. Vsebnost smo določali spektrofotometrično.

Priprava reagentov:

 Raztopino DNPH smo pripravili tako, da smo 0,5 g DNPH zatehtali v 50 mL bučko, ga raztopili v 1 mL 96 % žveplove (VI) kisline ter dopolnili do oznake s 96 % etanolom.

 Za pripravo 10 % (w/v) raztopine KOH smo 10,0 g KOH raztopili v majhnem volumnu bidestilirane vode (približno 60 mL) v čaši na magnetnem mešalu, kvantitativno prenesli v 100 mL bučko in dopolnili do oznake z bidestilirano vodo.

Umeritveno krivuljo smo naredili z raztopino naringenina. Za pripravo raztopine naringenina z masno koncentracijo 1 mg/mL smo 10 mg naringenina zatehtali na ladjico, kvantitativno prenesli v 10 mL bučko in dopolnili do oznake s 96 % etanolom. Nato smo v epice pripravili različne razredčitve raztopine naringenina, kot prikazuje preglednica 7 in dodali 96 % etanol

do skupnega volumna 0,10 mL. Vsako razredčitev smo pripravili v treh ponovitvah. Nato smo dodali 0,20 mL raztopine DNPH in 50 min segrevali v vodni kopeli pri 50 °C (v termobloku). Ko se je zmes ohladila na sobno temperaturo, smo dodali 0,70 mL raztopine KOH in nato 10 min centrifugirali pri 13000 obr/min. V steklene epruvetke smo odpipetirali 2,32 mL etanola (96 %) in dodali 0,18 mL supernatanta. Po dodatku vsakega reagenta smo vzorce dobro premešali na vrtinčniku. Po 30 min od dodatka KOH smo vzorce prelili v kivete in pomerili absorbanco proti slepemu vzorcu pri valovni dolžini 486 nm (A486). Absorbance smo merili proti slepemu vzorcu, kjer smo namesto raztopine naringenina uporabili 96 % etanol.

Preglednica 6: Masna koncentracija naringenina v reakcijski zmesi (γ) in povprečne vrednosti izmerjenih absorbanc pri valovni dolžini 486 nm

γ (mg/L)

A486 ± sd

1,44 0,0340 ± 0,008 2,88 0,0645 ± 0,003 4,32 0,0928 ± 0,005 5,76 0,1319 ± 0,004 7,20 0,1758 ± 0,002

Iz masne koncentracije naringenina in vrednosti A486 smo narisali umeritveno krivuljo (slika 11) in z linearno regresijo določili k, 0,0233 (R² = 0,9933).

Slika 11: Umeritvena krivulja z naringeninom

Vsebnost skupnih flavanonov in dihidroflavonolov v vzorcih cvetnega prahu osmukanca smo določili tako, da smo v 1,5 mL epice odpipetirali 0,10 mL izvlečka in nadaljevali s postopkom za določanje flavanonov in dihidroflavonolov, kot je opisano pri pripravi umeritvene krivulje.

Z uporabo smernega koeficienta premice in izmerjenih A486 smo nato najprej izračunali masno koncentracijo flavanonov in dihidroflavonolov v reakcijski zmesi po naslednji zvezi:

γreakc.zmesi =A₄₈₆

k ...(13)

γreakc.zmesi – masna koncentracija flavanonov in dihidroflavonolov v reakcijski zmesi (mg/L) A486 – absorbanca pri valovni dolžini 486 nm

k – smerni koeficient premice

Nato smo izračunali masno koncentracijo flavanonov in dihidroflavonolov v izvlečku (v spodnjo zvezo vstavljena zveza za izračun masne koncentracije (γcelotnega razred.izvlečka) v mešanici Vcelotnega razred.izvlečka).

γ_izvleč. =^γreakc.zmesi· Vreakc.zmesi· Vcelotnega supernatanta

V p supernatanta· V_izvleč. ...(14)

γizvleč. – masna koncentracija flavanonov in dihidroflavonolov v izvlečku (mg/L) Vreakc.zmesi – volumen reakcijske zmesi (2,5 mL)

Vcelotnega supernatanta – (Vizvleč. (0,1mL) + volumen raztopine DNPH (0,2 mL) + volumen raztopine KOH (0,7 mL) = 1 mL)

Vp supernatanta – volumen supernatanta, ki ga odpipetiramo (0,18 mL) Vizvleč. – volumen izvlečka (0,1 mL)

Z upoštevanjem celotnega volumna izvlečka pri ekstrakciji smo izračunali maso flavanonov in dihidroflavonolov v celotnem izvlečku.

mv celot.izvleč. = γ_izvleč.· Vcelot.izvleč. ...(15)

mv celot.izvleč. – masa flavanonov in dihidroflavonolov v celotnem izvlečku Vcelot.izvleč. – volumen celotnega izvlečka pri ekstrakciji

Masa flavanonov in dihidroflavonolov v celotnem izvlečku je enaka njihovi masi v zatehti cvetnega prahu osmukanca. Zato smo maso flavanonov in dihidroflavonolov na g cvetnega prahu izračunali z naslednjo zvezo:

mna g cvetnega prahu= mv celot.izvleč.

m_cv.prahu ...(16)

mna g cvetnega prahu – masa flavanonov in dihidroflavonolov na g cvetnega prahu (mg/g)

mcv.prahu – masa cvetnega prahu (g)

Vsebnost flavanonov in dihidroflavonolov smo v vzorcih cvetnega prahu osmukanca izrazili v ekvivalentih naringenina kot mg naringenina na gram suhe snovi (mg NA/gs.s.).

3.2.8 Določanje sposobnosti lovljenja radikala DPPH•

AOP vzorcev cvetnega prahu osmukanca smo določali z uporabo radikala 1,1’-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH•) po metodi, ki so jo opisali Brand-Williams in sod. (1995) z določenimi modifikacijami. Metoda temelji na reakciji med prostim radikalom DPPH• in antioksidantom. Radikal DPPH• prejme vodikov atom antioksidanta in s tem preide v nereaktivno obliko (iz vijolične v rumeno barvo), kar vpliva na manjšo absorpcijo svetlobe.

Priprava reagentov:

 Raztopino DPPH• smo pripravili tako, da smo v plastično ladjico natehtali 7,88 mg DPPH•, kvantitativno prenesli v 200 mL čašo, ovito v aluminijasto folijo in dobro raztopili na magnetnem mešalu. Nato smo raztopino kvantitativno prenesli v 200 mL bučko in dopolnili do oznake s 96 % etanolom.

Za določitev sposobnosti lovljenja radikala DPPH• izvlečkov cvetnega prahu osmukanca smo pripravili po štiri različne razredčitve vsakega izvlečka v 96 % etanolu, vsako v treh paralelkah. Steklene epruvete smo ovili v aluminijasto folijo in vanje odpipetirali 0,1 mL ustrezno razredčenega izvlečka, dodali 2,9 mL raztopine DPPH• ter začeli meriti čas.

Mešanico smo dobro premešali na vrtinčniku. Po 30 min od dodatka raztopine DPPH• smo vzorce prelili v kivete in pomerili absorbanco pri valovni dolžini 517 nm (Av517). Kontrolne vzorce smo pripravili po enakem postopku, le namesto vzorca smo dodali 96 % etanol.

Absorbanco kontrolnega vzorca (Ak517) smo pomerili pred in po vsakem sklopu meritev.

Spektrofotometer smo predhodno umerili na slepi vzorec, za katerega smo uporabili 96 % etanol.

Pri izračunu sposobnosti lovljenja radikala DPPH smo si pomagali z naslednjimi zvezami.

Najprej smo izračunali delež DPPH• (wpreostalega DPPH (%)), ki po inkubaciji preostane v reakcijski zmesi:

wpreostalega DPPH= A_v517

A_k517· 100 % ...(17) Av517 – absorbanca vzorca pri valovni dolžini 517 nm

Ak517 – absorbanca kontrolnega vzorca pri valovni dolžini 517 nm

In document VPLIV RAZLIČNIH POSTOPKOV OBDELAVE CVETNEGA PRAHU OSMUKANCA NA ANTIOKSIDATIVNI POTENCIAL (Strani 29-0)