2.2.1 Flavonoidi
Flavonoidi spadajo v skupino fenolnih spojin z nizko molekulsko maso in so široko razširjeni v kraljestvu rastlin. Imajo številne pozitivne biokemijske in antioksidativne učinke, povezane s preprečevanjem različnih bolezni, kot so rak, Alzheimerjeva bolezen, ateroskleroza in podobno. Povezuje se jih s številnimi pozitivnimi učinki na zdravje ljudi, zato so nepogrešljiva komponenta v številnih nutracevtskih, farmacevtskih, medicinskih in kozmetičnih izdelkih. Temu naj bi bilo tako zaradi njihovih antioksidativnih, protivnetnih, antimutagenih in protikancerogenih lastnosti. Prav tako so znani po svoji funkciji inhibicije številnih encimov, kot so ksantin oksidaza, ciklooksigenaza in lipoksigenaza (Vaya in sod., 2003; Panche in sod., 2016).
Flavonoide je mogoče razdeliti v podskupine: flavone, flavonole, flavanone, antocianidine, flavanole (katehin), halkone, izoflavone in neoflavonoide (Kocot in sod., 2018).
Skoraj vse skupine flavonoidov imajo sposobnost antioksidativnega delovanja. Glede na raziskave naj bi bili pri zaščiti telesa pred reaktivnimi kisikovimi zvrstmi (ROS) med bolj močnimi flavoni in katehini. Celice v telesu so v neprestani nevarnosti pred prostimi radikali oz. ROS, ki se tvorijo ob celičnem dihanju ali zaradi različnih zunanjih dejavnikov (Panche in sod., 2016). Mehanizmi in zaporedje dogodkov, po katerih se prosti radikali vključujejo v celične funkcije, še ni popolnoma razumljeno. Med pomembnejše reakcije naj bi spadala lipidna peroksidacija, ki poškoduje lipidno membrano. Poškodbe vodijo v spremembo osmotskega tlaka in posledično do celične smrti. Za zaščito pred ROS so živi organizmi
razvili številne mehanizme (endogena antioksidativna zaščita telesa), vendar pa zvišana proizvodnja ROS med poškodbami vodi do porabe oziroma izčrpanja teh endogenih lovilcev (Sharma, 2014).
Flavonoidi lahko preprečijo poškodbe, ki jih povzročajo prosti radikali na več različnih načinov, eden od teh je direktno lovljenje prostih radikalov. Flavonoidi reagirajo s prostimi radikali, ti pa s tem postanejo manj reaktivni (Hanasaki in sod, 1994). Hanasaki in sod.
(1994) so ugotovili, da imajo flavonoidi, kot sta epikatehin in rutin, močno antiradikalsko učinkovitost in da je le-ta verjetno posledica inhibitorne aktivnosti na encim ksantin oksidaza. Vaya in sod. (2003) so poročali, da lahko flavonoidi z lovljenjem prostih radikalov preprečijo oksidacijo lipoproteinov nizke gostote, to je delcev LDL (low density lipoprotein;
in vitro). Zaščitili naj bi delce LDL in imeli tako preventivno vlogo pri aterosklerozi.
Mnoge študije kažejo na negativno povezavo med incidenco srčno-žilnih bolezni in kapi ter vnosom flavonoidov, predvsem kvercetina, s prehrano (Hertog in sod., 1993).
In vitro študije so pokazale, da imajo številni flavonoidi sposobnost inhibicije acetilholin esteraze (AChE) in butirilholinesteraze (BChE). Acetilholinesteraza je glavni encim v centralnem živčnem sistemu. Inhibicija le-tega vodi do povišanja nivojev acetilholina, kar je ena od terapij oziroma načinov simptomatskega blaženja pri Alzheimerjevi bolezni (Khan in sod., 2009; Imran in sod., 2020).
Kot že prej omenjeno, so flavonoidi glavna skupina fenolnih spojin v cvetnem prahu.
Prevladujoča podskupina so flavonoli, predvsem derivati kamferola, kvercetina, izoramnetina in miricetina. Pogosto so prisotni tudi flavoni, predvsem derivati apigenina in luteolina (Anjos in sod., 2019; Kostić in sod., 2019).
Flavonoidi cvetnega prahu imajo različne farmakološke in medicinske vloge, kot so antioksidativna aktivnost, aktivacija encimov, ekspresija genov, hormonska regulacija, protimikrobno delovanje, protikancerogeno in protidiabetično delovanje (Denisow in Denisow-Pietrzyk, 2016; Kieliszek in sod., 2018), vendar je njihova učinkovitost v preprečevanju bolezni močno odvisna od stopnje biološke dostopnosti in asimilacije prebavnega sistema ljudi (Crozier in sod., 2010).
2.2.2 Fenolne kisline in druge fenolne spojine
Glavne neflavonoidne spojine, ki so pomembne v prehrani ljudi, so fenolne kisline. Le-te lahko v grobem razdelimo v dva tipa – derivate benzojske in derivate cimetne kisline. Med hidroksibenzojskimi kislinami je pomembnejša galna kislina. V hrani se v večjih količinah nahaja v rdečem vinu in zelenem čaju. Najbolj pogoste hidroksicimetne kisline so p-kumarna, kavna, ferulna in sinapinska kislina. Pojavljajo se kot konjugati z vinsko in kina
kislino (klorogenske kisline). Manj pogosto se v hrani nahajajo derivati fenilvalerianske kisline, fenilmlečne kisline in fenilpropionske kisline. Te spojine so metaboliti črevesne mikrobiote številnih prehranskih polifenolov in se zlahka absorbirajo. Zato bi lahko igrali pomembno vlogo pri nekaterih bioloških učinkih, povezanih s polifenolnimi spojinami bogato dieto (Crozier in sod., 2009).
Med neflavonoidne fenolne spojine spadajo tudi stilbeni, predstavnik katerih je resveratrol.
Nahaja se predvsem v rdečem vinu, arašidih, v manjših količinah pa tudi v jagodičevju in nekaterih drugih živilih (Crozier in sod., 2009).
Pomembnejše fenolne kisline v cvetnem prahu so galna kislina, vanilinska kislina, protokatehujska kislina, kavna kislina, fenetilni ester kavne kisline in druge (Thakur in Nanda, 2020).
2.3 OKSIDATIVNI STRES IN ROS
Oksidativni stres je definiran kot neravnovesje med proizvodnjo in akumulacijo ROS. Je posledica neravnovesja med njihovo proizvodnjo in odstranjevanjem s strani antioksidativnih molekul v celicah in tkivih. Številne študije nakazujejo, da lahko oksidativni stres privede do različnih bolezni, kot so visok krvni tlak, kardiomiopatija, gastrointestinalne motnje, cerebralna ali srčna ishemija, ateroskleroza ali rak (Pizzino in sod., 2017).
ROS se tvorijo med številnimi oksidativnimi procesi, vključno z aerobnim metabolizmom, metabolizmom arahidonske kisline, aktivnostjo NADPH oksidaz, ksantin oksidaz in drugimi fiziološkimi ali patološkimi pogoji (Cho in sod., 2011).
Med ROS uvrščamo proste radikale, kot so (Rao in sod., 2011):
superoksidni anionski radikal (O2•),
Do oksidativnega stresa pride zaradi zmanjšanja bioloških sistemov za razstrupitev oziroma deaktivacijo teh reaktivnih zvrsti (Pizzino in sod., 2017).
Superoksidni anionski radikal nastane s pomočjo delovanja NADPH oksidaze, ksantin oksidaze in peroksidaze. Pomembno vlogo ima pri iniciaciji oksidacijskih reakcij, povezanih s staranjem (Valko in sod., 2007). Vključen je v reakcije, v katerih se tvorijo druge ROS, kot so vodikov peroksid, hidroksilni radikal, peroksinitrit, hipoklorna kislina in singletni kislik.
Vključuje se v reakcije s kovinskimi ioni, kar privede do tvorbe vodikovega peroksida. V reakcijah med vodikovim peroksidom z železovimi in bakrovimi ioni (Fe2+ in Cu+) nastane hidroksilni radikal (Fentonova reakcija), ki je najbolj reaktiven prosti radikal in vivo.
Hidroksilni radikal lahko nastane tudi z direktno reakcijo med superoksidnim anionskim radikalom in vodikovim peroksidom, vendar je reakcija hitrejša ob prisotnosti kovinskih ionov. Nastale reaktivne kisikove spojine inicirajo oksidativne poškodbe DNK, maščob in beljakovin (Pizzino in sod., 2017).
Prosti radikali so zvrsti z nesparjenim elektronom v orbitali, kar jih dela nestabilne in zelo reaktivne. Za zagotovitev stabilnosti prejmejo elektron drugih spojin v okolju, zaradi česar postanejo prizadete spojine same prosti radikali. Nastale spojine tako inicirajo reakcije, ki vodijo v poškodbe celic (Rao in sod, 2011).
Presežek ROS oziroma prostih radikalov v telesu (posledica oksidativnega stresa) reagira oz. “napade” vitalne celične komponente, kot so koencimi, nevrotransmiterji in makromolekule (nukleinske kisline, beljakovine, maščobe in ogljikovi hidrati). Pri tem jih poškoduje, kar lahko privede do celične smrti. Mitohondrijska DNK je dovzetna za napade ROS. Poškodbe mitohondrijske DNK lahko privedejo do mutacij v genomih, kar lahko vodi v razvoj različnih bolezni in poveča resnost obstoječih bolezni (Campos in sod., 2003; Guo in sod., 2013).
Celični sistem za lovljenje prostih radikalov, katerega sestavni del so antioksidativni encimi, nevtralizira proste radikale in tako prepreči poškodbe. Ker pa imajo celice v telesu omejeno kapaciteto za lovljenje prostih radikalov (Campos in sod., 2003; Guo in sod., 2013), je pomembno, da se primanjkljaj nadoknadi z vključevanjem eksogenih antioksidantov v telo preko prehrane in se tako poveča zaščita telesa.
2.4 ANTIOKSIDATI IN AOP
Antioksidanti preprečijo oksidativne poškodbe na različne načine: z odstranitvijo kovinskih ionov, s preprečevanjem tvorbe aktivnih spojin, s pretvorbami in deaktivacijo ROS oz.
prostih radikalov ali z deaktivacijo prooksidativnih encimov. Pri tem gre za prekinjanje verižnih reakcij in popravljanje poškodb celic, ki nastanejo zaradi delovanja prostih radikalov (Rao in sod., 2011; Aguilar in sod., 2016). Glede na njihovo aktivnost se delijo na
dva tipa, encimske in neencimske. Deli pa se jih tudi glede na izvor, na endogene, katere proizvede telo in eksogene, katere v telo vnašamo s prehrano (Rao in sod., 2011).
Endogeni antioksidanti vključujejo encimske antioksidante, kot so superoksid dismutaza, katalaza, glutation peroksidaza, tioredoksin reduktaza, peroksiredoksin, glutation-s-transferaza, glutation reduktaza in neencimske antioksidante, kot so albumin, bilirubin, glutation, sečna kislina, melatonin, poliamin in beljakovine, ki vežejo kovinske ione (ceruloplazmin, transferin). Eksogene antioksidante je v telo mogoče dobiti s prehrano.
Čeprav je najboljše v telo dobiti antioksidante s prehrano, bogato s sadjem, zelenjavo in drugimi bogatimi živili, pa je vedno bolj popularno vključevanje prehranskih dopolnil, ki te vsebujejo (Aguilar in sod., 2016; Rao in sod., 2011).
Čebelji cvetni prah velja za potencialni naravni vir antioksidantov zaradi visoke antioksidativne aktivnosti njegovih učinkovin/sestavin, zlasti fenolnih spojin in karotenoidov. Fenolne spojine preprečujejo poškodbe DNK in tkivne poškodbe, povezane z oksidativnim stresom, ki bi nastale zaradi različnih dejavnikov (Kocot in sod., 2018; Panche in sod., 2016). Lahko imajo učinek na AOP, izražanje genov, encime za metabolizem drog, imajo fitoestrogeni potencial in kažejo zaščitne učinke proti okoljskemu onesnaževalu dioksinu (Šarić in sod., 2009). Delujejo kot antioksidanti z direktno pretvorbo prostih radikalov, z interakcijo z encimi ali z vezavo kovinskih ionov v komplekse. Pretvorba (oz.
deaktivacija, stabilizacija) prostih radikalov je posledica oddaje elektrona prostemu radikalu (Fatrcova-Šramkova in sod., 2016).
Antioksidativna aktivnost cvetnega prahu je v glavnem povezana z vsebnostjo fenolnih kislin (galna, vanilinska, protokatehujska, kavna, fenetilni ester kavne kisline), flavonoidov (kvercetin, rutin, pinocembrin, apigenin, krizin, galangin, kamferol, izoramnetin) in drugih spojin, kot so karotenoidi, vitamin C in vitamin E (Denisow in Denisow-Pietrzyk, 2016;
Bonvehi in sod., 2001). Te spojine vplivajo na izgled, barvo in okus cvetnega prahu (Zuluaga in sod., 2015).
Karotenoidi so naravno prisotni pigmenti, odgovorni za rumeno, oranžno in rdečo barvo v rastlinah, algah in fotosintetizirajočih bakterijah. Proste radikale lovijo na različne načine, kot so prenos elektronov in reakcije adicije in eliminacije vodika (Mãrgãoan in sod., 2014;
Fatrcova-Šramkova in sod., 2016).
Antioksidativna aktivnost cvetnega prahu je odvisna od njegove kemijske sestave, ki lahko variira zaradi različnih dejavnikov, kot so botanični izvor, geografski izvor, vremenske razmere, sezona in entomološki izvor. Na kemijsko sestavo lahko vplivajo tudi čebelarji med čiščenjem, dehidracijo, pakiranjem in drugimi postopki obdelave cvetnega prahu, z namenom podaljšanja obstojnosti in odstranitve tujkov (Campos in sod., 2008; Almeida-Muradian in sod., 2005).
Raziskave so pokazale, da imajo sestavine cvetnega prahu sposobnost lovljenja prostih radikalov in zavirajoč učinek na lipidno peroksidacijo. Številne metode za ocenjevanje AOP cvetnega prahu temeljijo ravno na mehanizmih oziroma sistemih antioksidativne zaščite, kot je odstranjevanje ali inhibicija prostih radikalov ali kelacija kovinskih ionov (Aličić in sod., 2014; Leja in sod., 2007). Ker je AOP cvetnega prahu odvisen od njegove sestave, pa raziskave cvetnega prahu različnega geografskega in botaničnega izvora velikokrat dajejo precej različne rezultate vrednosti AOP. Rezultati se velikokrat razlikujejo tudi glede na uporabljeno metodo določanja (Kocot in sod., 2018; Leja in sod., 2007; Saral in sod., 2019).
3 MATERIAL IN METODE
3.1 MATERIAL IN OPIS POSTOPKA 3.1.1 Vzorci cvetnega prahu
V raziskavi smo uporabili cvetni prah osmukanec (svež, posušen/skladiščen, zamrznjen/
skladiščen), ki smo ga dobili iz Čebelarske zveze Slovenije (ČZS) in je bil zbran na različnih geografskih območjih po Sloveniji. Svež cvetni prah so zbrali spomladi leta 2019 in leta 2020. Vzorce posušenega/skladiščenega cvetnega prahu so zbrali leta 2017, posušili pri 35 °C/72 h ali pri 40 °C/24 h ter dve leti hranili pri sobni temperaturi v temi.
Zamrznjen/skladiščen cvetni prah so zbrali leta 2017 in hranili dve leti v zamrzovalniku pri –18 °C. Podrobneje vzorce opisuje preglednica 1.
Preglednica 1: Opis vzorcev cvetnega prahu osmukanca, ki smo jih prejeli iz ČZS
Št. Oznaka vzorca Opis vzorca Čas zbiranja (leto, obdobje), geografsko območje
1 CP7 svež 2019, pomlad, osrednja Slovenija
2 CP8 svež 2019, pomlad, Gorenjska
3 CP9 svež 2019, pomlad, Gorenjska
4 CP10 svež 2019, pomlad, Zasavje
5 CP11 svež 2019, pomlad, jugovzhodna Slovenija
6 CP12 svež 2019, pomlad, Primorska
7 CPA svež 2020
8 CPB svež 2020
9 CPC svež 2020
10 D40S posušen pri 40 °C, skladiščen 2017 11 K40S posušen pri 40 °C, skladiščen 2017 12 D35S posušen pri 35 °C, skladiščen 2017 13 K35S posušen pri 35 °C, skladiščen 2017 14 H35S posušen pri 35 °C, skladiščen 2017
15 DZS zamrznjen skladiščen 2017
16 KZS zamrznjen skladiščen 2017
17 HZS zamrznjen skladiščen 2017