1. UVOD
1.1 KOZMETIČNI IZDELKI IN KOZMETIČNO AKTIVNE SESTAVINE
snov ali zmes, namenjena stiku z zunanjimi deli človeškega telesa (povrhnjico, lasiščem, nohti, ustnicami in zunanjimi spolnimi organi) ali z zobmi in sluznico ustne votline zaradi izključno ali predvsem njihovega čiščenja, odišavljenja, spreminjanja njihovega videza, njihovega varovanja, ohranjanja v dobrem stanju ali korekcije telesnega vonja« (1).
Poleg opredelitve pojmov ter ostalih predpisov in določil, pomembnih za izdelavo in trženje KI, Uredba o kozmetičnih izdelkih 1229/2009 navaja kriterije za zagotavljanje varnosti in kakovosti KI. Kot predpogoj za varnost označuje izdelavo KI v skladu z dobro proizvodnjo prakso. Za doseganje kakovosti, varnosti in istovetnosti, pa predlaga vzorčenje in analize izdelkov npr. za preverjanje vsebnosti prepovedanih snovi in snovi z omejitvami uporabe.
Priloga 1 Uredbe o kozmetičnih izdelkih 1229/2009 vsebuje tudi nekatere potrebne podatke za izdelavo poročila o varnosti. Le-to mora vsebovati: kvantitativno in kvalitativno sestavo KI, fizikalne/kemijske značilnosti in stabilnost KI, mikrobiološko kakovost, nečistote, sledi, podatke o embalažnem materialu, normalno in razumno predvidljivo uporabo, izpostavljenost KI, izpostavljenost snovem, toksikološki profil snovi, neželene in resne neželene učinke, informacije o KI in oceno o varnosti KI. Ker za kozmetiko ni potrebno priložiti dokaza o njenem delovanju, se kontrola vsebnosti (aktivnih) sestavin ne zahteva (1).
Poleg pomožnih sestavin (zgoščevala, površinsko aktivne snovi, topila, barvila in druge) lahko KI vsebujejo tudi kozmetično aktivne sestavine (KAS), ki imajo na koži dokazano aktivno/učinkovito delovanje (2, 3).
Pri tem se v zadnjem času uveljavlja izraz kozmecevtiki, ki opisuje izdelke na meji med farmacevtskimi in kozmetičnimi izdelki. Predstavlja KI, ki naj bi imeli boljšo učinkovitost, kar naj bi pritegnilo uporabnike, vendar pa regulativa te skovanke še ne opredeljuje. V Sloveniji velja, da lahko le zdravila oglašujemo z zdravilnimi učinki (2).
Podobno je tudi z vidika oglaševanja vedno bolj priljubljenega izraza – nutricevtiki.
Označuje prehranske izdelke, ki vplivajo na delovanje in videz kože, las in nohtov. Gre za prehranska dopolnila, ki vsebujejo aktivne sestavine z različnimi mehanizmi delovanja na koži, laseh in nohtih. Zasledimo pa tudi poimenovanje lepotna dopolnila (ang. beauty supplements) (4).
2 1.2 VITAMINI B-KOMPLEKSA
V skupino vitaminov B spada 8 vodotopnih vitaminov. Nekateri so se s svojimi pozitivnimi učinki, ob nanosu na kožo, uveljavili kot dragocene KAS v raznovrstnih KI (2).
1.2.1 Vitamin B1 – TIAMIN
INCI ime: Thiamine HCl (tiaminijev klorid), Thiamine diphosphate (tiamin difosfat), Thiamine nitrate (tiaminijev nitrat)
Vitamin B1 ali tiamin (Slika 1) je spojina s kemijsko formulo C12H17N4OS, ki tvori brezbarvne kristale in je naravno prisotna v žitih in kvasu (2, 5). V KI se pogosto nahaja v obliki soli (klorida), običajno v kombinaciji z ostalimi vitamini B-kompleksa z namenom nege poškodovane kože. Uporablja se tudi kot pomožna sestavina za prekrivanje neprijetnega vonja oz. za odišavljanje izdelka (2, 6).
1.2.2 Vitamin B2 – RIBOFLAVIN INCI ime: Riboflavin (riboflavin)
Vitamin B2 ali riboflavin (Slika 2) je spojina z molekulsko formulo C17H20N4O6 (7). Nahaja se v mleku, kvasu, jajcih, listnati zelenjavi, jetrih. V hrani in KI se zaradi svoje značilne oranžno-rumene barve uporablja predvsem kot barvilo (ima tudi svojo oznako kot aditiv v hrani – E 101) (6).
1.2.3 Vitamin B3 – NIACIN
INCI ime: Niacinamide (niacinamid), Niacin (niacin)
Pod izraz vitamin B3 uvrščamo nikotinsko kislino (niacin) C6H5NO2 in nikotinamid C6H6N2O (Slika 3), ki se v telesu pretvarjata eden v drugega. Najdemo ju v mleku, jajcih, žitih, mesu in pivskem kvasu. Oba tvorita brezbarvne igličaste kristale (2, 8, 9).
Pomanjkanje vitamina B3 vodi v bolezensko stanje, katerega simptomi se med drugim kažejo tudi na koži (pordelost, vnetje in srbenje kože na področjih, izpostavljenih soncu). To bolezen imenujemo pelagra. Zdravimo jo z vitaminom B3, zato še danes kje zasledimo poimenovanje vitamin PP. Kratica pomeni preprečuje pelagro in izhaja iz angleščine (ang.
pelagra preventing) (2).
Slika 1: Strukturna formula tiamina.
Slika 2: Strukturna formula riboflavina.
3
Vitamin B3 je zelo pogosta sestavina KI, pojavlja pa se tudi v dermatikih (10). V izdelkih večinoma najdemo nikotinamid (bolje topen od kisline), ki v primerjavi z nikotinsko kislino nima učinka širjenja žil (2, 6). Nikotinska kislina se zato uporablja v KI za pospeševanje prekrvitve kože, na njej pa povzroči eritem oz. rdečino (2).
Niacinamid ima na koži protivnetno delovanje in učinek zmanjšanja nastajanja sebuma, kar pripomore k izboljšanju stanja aknaste kože. Prav tako izboljša barierno funkcijo kože in zmanjša transepidermalno izgubo vode, zaradi stimuliranja sinteze holesterola, proteinov, ceramidov in prostih maščobnih kislin. Sinteza ceramidov je namreč zmanjšana pri starejši, suhi koži in pri atopijskem dermatitisu (2, 10, 11, 12). Nikotinamid zmanjša tudi drobne gube in poveča elastičnost kože, ker poveča sintezo kolagena in zmanjša preveliko količino kožnih glikozaminoglikanov (starejši fibroblasti jih proizvajajo preveč) (2, 12). Deluje tudi posvetlitveno (zmanjša hiperpigmentacijo), saj zavira prenos melanosomov iz melanocitov v keratinocite (2, 12). Ker je prekurzor kofaktorjev nikotinamid adenin dinukleotida in nikotinamid adenin dinukleotid fosfata (NAD(P)/H) ima tudi antioksidativno delovanje, posledično zmanjša porumenelost (antiglikacijski učinek) in deluje fotoprotektivno (12). V raziskavah so odkrili tudi njegovo sodelovanje pri preprečevanju kožnega raka (2, 11, 12).
Če se nanese takoj po izpostavitvi UVA in UVB sevanju, ščiti pred imunosupresivnim delovanjem teh vrst UV žarkov (2, 11, 12). Poročajo pa tudi o inhibiciji proteaz in stimulaciji popravljanja DNK (11).
Slika 3: Strukturna formula niacina (levo) in nikotinamida (desno).
1.2.4 Provitamin B5 – D-PANTENOL
INCI ime: Panthenol (pantenol), Calcium Pantothenate (kalcijeva sol pantotenske kisline) Pantenol je alkoholni analog pantotenske kisline (vitamina B5) in je njen prekurzor (Slika 4). Po izgledu je skoraj brezbarvna, viskozna in bistra tekočina, ki se lahko nahaja v obliki D- ali L- optičnega izomera. Vendar pa samo iz desnosučne oblike lahko nastane biološko aktivna D-pantotenska kislina. Zaradi boljše stabilnosti je v KI v glavnem prisotna alkoholna oblika (2, 13, 14). V naravi najdemo pantotensko kislino (kemijska formula: C9H17NO5) v jetrih, ledvicah, jajčnem rumenjaku, polnozrnatih žitih, stročnicah in kvasu, pantenol (C9H19NO4) pa pridobivamo sintezno (2, 13, 14).
4
Pantenol je pogosta sestavina KI in dermatikov. Po dermalnem nanosu pantenol enostavno prodira v kožo, kjer se oksidira do pantotenske kisline. Tako D-, kot L-pantenol na koži delujeta vlažilno, saj zaradi svoje higroskopnosti pritegneta vodo iz spodnjih plasti povrhnjice in usnjice v roženo plast (2, 6, 15). Na ta način kožo naredita mehkejšo in bolj elastično. D-pantenol pa dodatno tudi pospešuje delitev fibroblastov in epitelizacijo poškodovane kože ter tako pospeši celjenje ran in obnovo poškodovane kože (2). Obenem ima tudi protivnetno delovanje in pomirja srbečico. Ker ga koža zelo dobro prenaša, je idealna in pogosto uporabljena sestavina v KI za nego kože dojenčkov in v KI za občutljivo kožo (2).
Kot humektant deluje tudi na laseh, torej v njih poveča vsebnost vode, kar pa povzroči da postanejo bolj elastični. Lase tudi krepi in jim daje sijaj, jih naredi bolj mehke in zmanjša njihov statični naboj. Prodira v korenine las in kožo lasišča, kjer se pretvori v kislino (pantotenska kislina je normalno prisotna v laseh). Po raziskavah naj bi namakanje las v 2
% vodni raztopini pantenola povečalo premer las do 10 % (2, 15).
Ker je od zmožnosti keratina za vezavo vode odvisna prožnost in trdnost nohtov, je pantenol aktualen tudi pri negi nohtov (2).
Zaradi vseh teh učinkov se pantenol uporablja v raznovrstni kozmetiki; od vsakdanje nege kože, krem za celjenje ran in obnovo kože na pleničnem predelu, krem za zaščito pred soncem in nego po sončenju, pa vse do šamponov, balzamov in KI za oblikovanje pričesk in KI za nego nohtov (2).
Slika 4: Strukturna formula pantotenske kisline (levo) in D-pantenola (desno).
1.2.5 Vitamin B6
INCI ime: Pyridoxine (piridoksin), Pyridoxine HCl (piridoksinijev klorid)
Vitamin B6 je skupno ime za 3 biološko aktivne oblike: alkohol (piridoksin C8H11NO3), aldehid (piridoksal C8H9NO3) in amin (piridoksamin C8H12N2O2) in njihove fosforilirane oblike (Slika 5) (2, 16, 17, 18). Vse oblike so na pogled brezbarvni kristali in jih v naravi najdemo v perutnini, kvasu, ribah, semenih in oreščkih, mleku ter jajcih. V primeru pomanjkanja vitamina B6 se razvijejo različne oblike dermatitisov za katere so značilne seboroične lezije okoli ust, oči in nosu, skupaj z vnetjem ustne sluznice in jezika (2, 6).
5
V KI se najpogosteje uporablja piridoksinijev klorid ali estri piridoksina s palmitinsko kislino. Ker lahko uravnava izločanje sebuma, je priljubljen v KI za aknasto kožo. Uporablja se tudi v izdelkih za nego (občutljive) kože in v KI za nego las, saj ima tudi antistatičen učinek (2).
1.2.6 Vitamin B7 – BIOTIN INCI ime: Biotin (biotin)
Vitamin B7 ali biotin (Slika 5) je spojina, ki tvori brezbarvne igličaste kristale in ima kemijsko formulo C10H16N2O3S (19). V naravi je prisoten predvsem v kvasu, jetrih, rumenjaku, mleku in zelenjavi, njegovo pomanjkanje pa lahko vodi v motnje rasti las, nohtov in kože – posledice so izpadanje las, krhki in lomljivi nohti ter dermatitis (2, 6). Zaradi njegove pomembne vloge v izgradnji kože in las (nemško Haut und Haar) ga je madžarski znanstvenik poimenoval vitamin H, kar lahko zasledimo še danes (2, 6, 20).
V kozmetiki se uporablja v izdelkih za nego las, nohtov in kože, pripisujejo pa mu tudi antiseboroičen učinek. Biotin je zanimiva sestavina tudi iz vidika nutricevtikov, saj obstajajo dokazi o izboljšanju krhkosti nohtov po njegovem rednem uživanju (2).
1.2.7 Vitamin B9 – FOLNA KISLINA INCI ime: Folic Acid (folna kislina)
Folna kislina je sintezna oblika vitamina B9 (Slika 6), ki se zaradi stabilnosti običajno uporablja v izdelkih. Ima kemijsko formulo C19H19N7O6 in tvori kristale rumeno-oranžne barve (2, 21).
Kot KAS jo najdemo v »anti-age« kozmetiki (kozmetika proti staranju), saj ima pomembno vlogo pri regeneraciji kožnih celic ter pri sintezi in popravljanju njihove DNK (23). Po dermalnem nanosu skupaj s kreatinom ščiti DNK pred poškodbami zaradi UV sevanja. Prav tako izboljša čvrstost kože in pospeši njeno obnavljanje ter zmanjša drobne in globoke gube (2, 22). V študiji vrednotenja hidratacije in elastičnosti kože so ugotovili, da je po 4 tednih
Slika 5: Strukturni formuli piridoksina (levo) in biotina (desno).
6
redne uporabe krema s folno kislino izboljšala hidratacijo in elastičnost kože ter zmanjšala njeno hrapavost in globino gub v primerjavi s placebom (23).
1.2.8 Vitamin B12 – KOBALAMINI INCI ime: Cyanocobalamin (cianokobalamin)
Kobalamine najdemo v različnih oblikah, ki se razlikujejo glede na substituente na mestu -R. Glede na to ločimo 4 različne oblike vitamina B12, v kozmetiki pa najpogosteje uporabljamo cianokobalamin (Slika 7), ki ima na mestu -R ciano skupino (C63H88CoN14O14P) (2, 24). Cianokobalamin tvori kristale značilne temno rdeče barve.
Naravno je prisoten v izdelkih živalskega izvora; mleku, jajcih in drobovini. Za uporabo v kozmetiki ga pretežno pridobivamo s pomočjo biotehnologije (2, 6).
V raziskavah so odkrili, da ob dermalnem nanosu lajša nekatere kožne bolezni kot so atopijski dermatitis, ekcemi na otroški koži, v kombinaciji z avokadovim oljem pa je učinkovit tudi pri lajšanju simptomov luskavice (2).
1.3 STABILNOST KOZMETIČNIH IZDELKOV
Stabilnost definiramo kot zmožnost (kozmetičnega) izdelka, da skozi rok uporabe v razumno predvidljivih pogojih shranjevanja ohranja svoje lastnosti znotraj predpisanih mej (25). S
Slika 6: Strukturna formula folne kisline.
Slika 7: Strukturna formula kobalamina.
7
tem zagotavljamo, da KI vzdržuje načrtovano fizikalno, kemijsko in mikrobiološko kakovost ter uporabnost. Stabilnost KI zmanjšujejo predvsem dejavniki okolja (svetloba, kisik, temperatura, transport, relativna vlažnost in mikroorganizmi), odvisna pa je tudi od notranjih dejavnikov (ovojnina, medij, pH, pomožne snovi) (25, 26).
V primeru, da pride do sprememb v kemijski istovetnosti in jakosti sestavin, se soočamo s kemično nestabilnostjo. Njene posledice so lahko spremenjen vonj, barva izdelka, upad koncentracije aktivnih spojin, lahko nastanejo tudi toksični razgradni produkti. Spremembe organoleptičnih lastnosti (motnost, ločitev faz, barva, vonj) pa lahko kažejo tudi na mikrobiološko nestabilnost. Najpogostejše oblike fizikalne nestabilnosti so agregacija, ločevanje faz, sedimentacija, odparevanje, zgostitev ali nehomogenost vsebine. Tudi te spremembe lahko vplivajo na spremenjen izgled izdelka (25).
Enotnih, standardnih testov za vrednotenje stabilnosti KI ni. Proizvajalec s pomočjo strokovne ocene in izkušenj postopek testiranja določi sam. Vrednotimo lahko organoleptične (vonj, izgled, barva) in fizikalno-kemijske lastnosti (viskoznost, pH), mikrobiološko stabilnost (učinkovitost konzervansov) ter stabilnost v ovojnini. Za vrednotenje kakovosti in učinkovitosti KI pa je smiselno spremljati tudi vsebnost KAS (26).
Za vrednotenje fizikalne stabilnosti se najpogosteje uporablja t.i. obremenitveni (centrifugalni) test. Izvedemo ga tako, da vzorec segrejemo (50 ℃), potem pa ga centrifugiramo 30 min pri 3000 obratih/min. Vsak znak nestabilnosti na tem nivoju kaže na neustreznost formulacije. Le v primeru, če vzorec ostane nespremenjen, izvedemo teste stabilnosti (26).
Za vrednotenje kemijske stabilnosti KI, pa se v zadnjih letih uveljavlja uporaba stabilnostnih testov po principu farmacevtske industrije, ki vključujejo stresne, pospešene in dolgoročne teste (26, 27):
o Stresni (preliminarni) testi: navadno se izvajajo pri razvoju KI. Vzorec izpostavimo visoki (npr. 50 ℃) in nizki temperaturi (npr. -10 ℃), lahko tudi cikličnemu segrevanju in ohlajanju. Vrednotimo organoleptične in fizikalno-kemijske parametre (25, 26).
o Pospešeni testi: običajno se uporabljajo za napoved roka uporabe (RU). Izvajajo se pri manj ostrih pogojih kot stresni testi, poleg organoleptičnih in fizikalno-kemijskih vrednotimo tudi mikrobiološke lastnosti izdelka (25, 26).
o Dolgoročno testiranje: uporabljamo ga za preverjanje določenega RU. Vzorec izpostavimo normalnim pogojem shranjevanja. Običajno se izvaja na KI, ki so že na trgu, testiranje pa traja do predvidenega RU (25, 26).
8 1.3.1 Stabilnost vitaminov B-kompleksa
V Preglednici I smo navedli dosedanje ugotovitve iz pregleda literature na področju stabilnosti vitaminov B-kompleksa. Razberemo lahko, da je najbolj stabilen vitamin B3 (tudi pri povišani temperaturi, na svetlobi), nato B1 in B12, najmanj stabilen pa je vitamin B9.
Preglednica I: Podatki o stabilnosti vitaminov B-kompleksa.
Vitamin Podatki o stabilnosti Referenca
B1
V alkalnih pogojih slaba stabilnost. 28
Stabilen pod normalnimi pogoji shranjevanja, razgradi se v nevtralnih in alkalnih raztopinah (tudi pri sobni temperaturi (T)). Vitamin B1 v obliki mononitrata je manj higroskopen in zato stabilnejši od klorida. Odlična stabilnost v sadnih pijačah z nizkim pH (vsebnost ze zmanjša za 6 % po 12 mesecih na sobni T). V konzervirani zelenjavi in sadju se razgradi 15 – 25 % po 1 letu pri 26,7 ℃.
5
B2
Nestabilen v alkalnih raztopinah in pod vplivom vidne ali UV svetlobe. V nevtralnih
raztopinah je dokaj T stabilen, če je zaščiten pred svetlobo. 7 B3
Stabilen pri povišani T in na svetlobi. Nekompatibilen z alkalnimi in močno kislimi
snovmi. 9
B5
Dokaj stabilen na zraku in svetlobi, če je zaščiten pred vlago. Občutljiv na kisline, baze in toploto. Hidroliza je najpočasnejša pri pH 4 do 6.
15
Na njegovo stabilnost vpliva povišana temperatura. 29
B6 HCl
Stabilen na zraku, počasi ga razgrajuje sončna svetloba. Termostabilen, stabilen pod večino pogojev procesiranja in shranjevanja hrane in farmacevtskih formulacij.
Izdelki morajo biti zaščiteni pred svetlobo in shranjeni v dobro zaprti ovojni, pri T nižji od 40 ℃ (najbolje 15 – 30 ℃).
30
B7
Suh kristaliničen biotin je dokaj stabilen na zraku, dnevni svetlobi in toploti, vendar ga UV sevanje postopoma razgradi. V šibko kislih ali alkalnih vodnih raztopinah je relativno stabilen. Nestabilen v močno kislih ali alkalnih raztopinah, v prisotnosti oksidantov in pri povišani temperaturi.
19
B9
Vodne raztopine folne kisline so občutljive na toploto in se razgradijo hitro v prisotnosti svetlobe in/ali riboflavina; raztopine morajo biti zaščitene pred svetlobo.
Relativno stabilna v alkalnih raztopinah, manj pa v kislih.
21
V alkalnih pogojih je bolj stabilen kot v kislih. Stabilnejši je v prisotnosti železa in/ali askorbata. Pri obsevanju s svetlobo valovne dolžine 365 nm v nevtralnem pH je v drugi fazi razgradnje nižja koncentracija folne kisline povezana s počasnejšo razgradnjo. Verjetnost fotorazgradnje (v prisotnosti kisika) je večja pri kislem kot pri bazičnem pH. V kislem mediju se po 12 dneh UV obsevanja popolnoma razgradi, ob prisotnosti vitamina C pa le 8 %. Ob prisotnosti tiaminijevega klorida ali vitamina B2 se folna kislina hitro razgradi, ob prisotnosti ostalih vitaminov B-kompleksa pa je razgradnja zanemarljiva. V fosfatnem pufru je razgradnja hitrejša kot v ostalih.
31
B12
Vodne raztopine ali raztopine v 0,9 % NaCl so stabilne in se lahko avtoklavirajo 15
– 20 min pri 121 ℃. Občutljiv je na svetlobo. Največja stabilnost pri pH 4,5 – 5,0. 24
9
1.4 KONTROLA KAKOVOSTI KOZMETIČNIH IZDELKOV
Kakovost kozmetičnega izdelka je odvisna od proizvajalca, saj je on odgovoren za zagotavljanje nadzora kakovosti surovin in končnih izdelkov (32). Proizvodnja, skladiščenje in odprema KI morajo potekati v skladu s smernicami za dobro proizvodnjo prakso (ISO 22716:2007). V njih so navedeni nasveti za obladovanje človeških, tehničnih in administrativnih dejavnikov, ki vplivajo na kakovost proizvodnje (33). Uredba o KI 1229/2009 za doseganje kakovosti, varnosti in istovetnosti predlaga vzorčenje in analize izdelkov npr. za preverjanje vsebnosti prepovedanih snovi in snovi z omejitvami (1).
Kontrola vsebnosti aktivnih sestavin pa v KI ni predpisana (34). Za kontrolo kakovosti proizvajalci KI običajno uporabljajo naslednje teste: senzorično analizo (izgled, barva, vonj, okus, konsistenca, mazljivost), merjenje pH, reoloških lastnosti, rentgensko slikanje (za preverjanje prisotnosti tekočih kristalov), mikrobiološko in stabilnostno testiranje, toksikološke teste in teste kompatibilnosti z ovojnino (32, 35).
Kakovost KI je lahko povezana z njegovo učinkovitostjo, na boljšo učinkovitost pa navadno vpliva večja koncentracija KAS (36). Z rastjo kozmetičnega trga se pojavlja vse več izdelkov, ki navajajo koncentracijo prisotnih KAS. Seznam sestavin se glede na regulativo navede v padajočem vrstnem redu glede na njihov masni delež v KI. Sestavine v koncentracijah, nižjih od 1 % se lahko navedejo v kakršnem koli vrstnem redu za sestavinami v koncentracijah, višjih od 1 % (1). Torej proizvajalci KI koncentracij sestavin niso dolžni navajati, glede na trenutno zakonodajo pa regulatorni organi ne preverjajo navedenih vsebnosti (1). S tem prihaja do zmede na trgu in zavajanja uporabnikov, ki ne morejo vedeti, če je navedena koncentracija KAS resnična. Strokovnjaki na to problematiko že opozarjajo in predlagajo strožjo regulativo ter kontrolo kakovosti aktivnih sestavin z analiznimi metodami, ki jih razvijajo v ta namen (36).
Na področju kontrole kakovosti vitaminov v KI so raziskovalci po smernicah za farmacevtske izdelke (kvalitativno in kvantitativno vrednotenje sestavin) že izvedli raziskave izdelkov, ki so vsebovali lipofilna vitamina A in E ter hidrofilni vitamin C.
Rezultati teh raziskav so pokazali precejšnje odstopanje ugotovljenih vrednosti od navedenih (36, 37). Po pregledu literature pa tovrstne kontrole kakovosti KI, ki vsebujejo vitamine B-kompleksa, ni izvajal še nihče.
10
2. NAMEN DELA
Področje kontrole kakovosti KI je trenutno dokaj zapostavljeno; regulativa med drugim tudi ne zahteva vrednotenja vsebnosti KAS. Zato smo se odločili narediti korak naprej na tem področju. Za vrednotenje lipofilnih vitaminov in vitamina C v KI so bile že izvedene nekatere raziskave, rezultati pa razkrivajo velika odstopanja med ugotovljenimi in navedenimi koncentracijami KAS. Tovrstnih raziskav vrednotenja vsebnosti in stabilnosti vitaminov B-kompleksa v KI še nismo zasledili, pa čeprav se pogosto dodajajo v izdelke kot KAS. Čeprav zaenkrat vsebnosti KAS v kozmetiki ni potrebno preverjati, številni proizvajalci KI navajajo njihove vsebnosti. To pa rezultira v višji ceni tovrstnih KI in lahko privede do zavajanja uporabnikov v primeru promoviranja neustrezne kakovosti.
V diplomski nalogi bomo zato ugotavljali vsebnost in stabilnost vitaminov B-kompleksa, ki jih najdemo v komercialno dostopnih izdelkih na slovenskem trgu. Za vrednotenje vitamina B12 in preverjanje prisotnosti vitamina B7 bomo uporabili predhodno razvito metodo HPLC, medtem ko bomo za sočasno analizo vitaminov B3, B5 in B6 razvili novo, enostavnejšo in hitrejšo metodo (od predhodno razvite). Analizni metodi bomo najprej s pomočjo standardnih raztopin validirali (selektivnost, linearnost, točnost, ponovljivost, stabilnost ter meja zaznave in določitve). Nadalje bomo za ekstrakcijo analitov iz izbranih izdelkov razvili postopke ekstrakcije, ki jih bomo nato preverili s ponovljivostjo priprave vzorca in izkoristka učinkovitosti ekstrakcije. V 37 izdelkih bomo nato preverjali vsebnost vitaminov B3, B5, B6, B7 in B12. Pri 9 izdelkih z navedeno vsebnostjo vitaminov bomo ugotovljeno vsebnost primerjali z oglaševano. Izbrani izdelki dosegajo širok razpon cen, tako da bomo lahko ugotavljali tudi povezavo med ceno izdelka in vsebnostjo vitaminov.
Nato bomo za izbrane izdelke izvedli tudi enomesečno stabilnostno študijo pri pogojih za dolgoročno (20 ℃) in pospešeno (40 ℃) testiranje stabilnosti. S tem bomo posredno dobili vpogled v stabilnost vitaminov B-kompleksa v KI pri normalnih pogojih shranjevanja in o vplivu temperature na njihovo stabilnost. V zaključku bomo preverili še povezavo med stabilnostjo preiskovanih vitaminov v KI in ceno izdelka.
11
3. MATERIALI IN METODE
3.1 MATERIALI 3.1.1 Reagenti in topila
o Acetonitril (ACN), C2H3N, M = 41,05 g/mol, HPLC čistosti, ≥ 99,9 % (Honeywell, Riedel-de Haën™, Nemčija)
o Klorovodikova kislina, HCl, M = 36,46 g/mol, Titrisol® za pripravo 1 M raztopine (Merck, Nemčija)
o Metanol (MeOH), CH3OH, M = 32,04 g/mol, HPLC čistosti, ≥ 99,9 % (Honeywell, Riedel-de Haën™, Nemčija)
o MilliQ voda (MQ), Fakulteta za farmacijo
o Natrijev dihidrogenfosfat monohidrat, NaH2PO4×H2O, M = 137,99 g/mol (Merck, Nemčija)
o n-heksan (HEX), C6H14, M = 86,18 g/mol, HPLC čistost, ≥ 97,0 % (Honeywell, Riedel-de Haën™, Nemčija)
o Pufrne raztopine: pH = 2 (C6H8O7/NaOH/HCl), pH = 4 (C6H8O7/NaOH/HCl) in pH = 7 (Na2HPO4/KH2PO4) (Merck, Nemčija)
3.1.2 Naprave in pribor
o Analitski sistem UHPLC, 1290 Infinity (Agilent Technologies, ZDA): binarna črpalka, avtomatski vzorčevalnik, termostat in DAD detektor
- Programska oprema: OpenLab CDS EZChrom A.04.05
- Kolona: XSelect® CSH™ C18 3,5 μm (150 × 4,6 mm) (Waters, ZDA) - Predkolona: Luna C18 4×3,0 mm (Phenomenex, ZDA)
o Analitska tehtnica Excellence Plus (Mettler Toledo, Švica)
o Avtomatske pipete: 20-200 μL, 100-1000 μL in 500-5000 μL (Eppendorf, Nemčija)
o Brizge: 2 mL in 5 mL (Chirana T. Injecta, Slovaška)
o Centrifuga Centric 322 A (Tehtnica, Slovenija)
o Filtri za pripravo mobilne faze – velikost por 0,20 μm (Sartorius, Nemčija)
o Filtri za pripravo vzorcev Minisart® RC – velikost por 0,45 μm (Sartorius, Nemčija)
o Hladilnik (Gorenje, Slovenija)
o Klimatska temperaturna komora VC 4034 (Vötsch, Nemčija)
o Magnetno mešalo Rotamix 550 MMH (Tehtnica, Slovenija)
o pH meter SevenCompact™ pH/Ion (Mettler Toledo, Švica)
12
o Sistem za pripravo MQ A10 Advantage (Millipore Corporation, ZDA)
o Steklovina: čaše, merilne bučke, zamaški, merilni valji, viale, čolnički za tehtanje
o Stresalnik Vibromix 10 (Tehtnica, Slovenija)
o Ultrazvočni kadički Sonis 4 (Iskra, Slovenija) in Bandelin Sonorex™ (Bandelin electronic, Nemčija)
o Ostali pribor: spatule, centrifugirke, zamaški za viale, nastavki za pipete, magneti za magnetna mešala, plastične kapalke, stojala za epruvete
3.1.3 Standardi
o Dekspantenol (vitamin B5), C9H19NO4, M = 205,25 g/mol, ≥ 98,0 % (Biosynth, Slovaška)
o Niacinamid (vitamin B3), C6H6N2O, M = 122,12 g/mol, ≥ 99,0 % (Sigma-Aldrich, Nemčija)
o Piridoksinijev klorid (vitamin B6), C8H12ClNO3, M = 205,64 g/mol, ≥ 99,0 % (Sigma-Aldrich, Nemčija)
o Cianokobalamin (vitamin B12), C63H88CoN14O14P, M = 1355,36 g/mol, ≥ 98 % (Biosynth, Slovaška)
3.1.4 Kozmetični izdelki z vitamini
3.1.4 Kozmetični izdelki z vitamini