Materiali

3.1.1 Laboratorijska oprema in naprave

 Avtomatska pipeta accu-jet® pro (Brand, Nemčija)

 Brizge Becton Dickinson 10 mL (Sigma-Aldrich, Nemčija)

 Centrifuga Avanti J-E Centrifuge (Beckman Coulter, ZDA)

 Centrifuga Eppendorf Centrifuge 5415 R (Eppendorf, Nemčija)

 Centrifuga Heraeus Biofuge 28 RS (ThermoScientific, ZDA)

 Centrifuga Mikro 200R (Hettich, Nemčija)

 Centrifuga Rotina 35 R (Hettich, Nemčija)

 Centrifuga Sorvall Lynx 4000 Centrifuge (ThermoScientific, ZDA)

 Čitalnik mikrotitrskih plošč SynergyMX (BioTek, ZDA)

 Corning® Costar® Stripette® (Sigma Aldrich, ZDA)

 Dializne kasete Slide-A-LyzerTM Dialysis Cassette, 3–12 mL, 10.000 MWCO (Thermo Scientific, ZDA)

 Elektroforezni gel NuPAGE® Novex Bis-Tris Mini Gel 4–12 % (Life Technologies, ZDA)

 Elektroforezni sistem PowerPac™ 3000 (Bio-Rad, ZDA)

 Elektroforezni sistem Xcell SureLockTM Mini-Cell (Life Technologies, ZDA)

 Filtri za brizge Chromafil ® Xtra 0,22 in 0,45 μm (Millipore, Irska)

 Igle za brizge BD Precisionglide® (Sigma-Aldrich, Nemčija)

 Inkubator (Kambič, Slovenija)

 Kadičke za izvedbo agarozne gelske elektroforeze Wide Mini-Sub Cell GT (Bio-Rad, ZDA)

 Koncentrator AmiconUltra 15 mL Centrifugal Filters, 10K (Millipore, ZDA)

 Konfokalni laserski mikroskop DMI6000 CS Leica TCS SP5 (Leica Microsystems GmbH, Nemčija)

 Kromatografska kolona Ni-NTA superflow (Qiagen, Nemčija)

 Kromatografska kolona Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare, Velika Britanija)

 Kromatografski sistem Äkta HPLC (Amersham Biosciences, ZDA)

 Magnetno mešalo Rotamix 550 MMH (Tehtnica, Slovenija)

16

 Mikrotitrske plošče za hemolizo Tissue Culture Testplate 96F (TPP, Švica)

 Mikrovalovna pečica (LG, Južna Koreja)

 Namizni stresalnik Vibromix 314 EVT (Tehtnica, Slovenija)

 Naprava za elektroforezo proteinski: invitrogen life technologies,

 Naprava za elektroformacijo GUV-ov Vescile Prep Pro® (Nanion, Nemčija)

 Naprava za merjenje celične gostote (OD600) Ultraspec 10 (Amersham Biosciences, ZDA)

 Osmometer Osmomat 3000 (Gonotec, Nemčija)

 Pipete (Gilson, ZDA)

 Pipete, multikanalne (Biohit, Nemčija)

 Pipette Transferpette® S Pipette (Brand, Nemčija)

 Polipropilenska kolona za Ni-NTA (Bio-Rad, ZDA)

 Rotavapor R-300 (Büchi, Švica)

 Sistem za slikanje gelov iBright 1500 (Thermo Fischer Scientific, ZDA)

 Sonikator Ultrasonic Processor (Cole-Parmer, ZDA)

 Spektrofotometer 8453 UV-Vis (Agilent Technologies, ZDA)

 Spektrofotometer NanoDrop One (Thermo Scientific, ZDA)

 Stresalnik IS-200K, ISF-1-W (Kambič, Slovenija)

 Stresalnik ISF-1-V (AdolfKuhner Ag, Švica)

 Tehtnica 0,01 mg – 220g (Mettler Toledo, Švica)

 Tehtnica PEJ 0,001 g – 420 g (Kern, Nemčija)

 Termoblok CH-100 (Biosan, Latvija)

 UV transiluminator Benchtop Variable Transilluminator (UVP, Združeno kraljestvo)

 Vakuumska črpalka za filtracijo VacuumPump XF54 230 50 (Merck Millipore, ZDA)

 Vakuumski koncentrator Concentrator Plus (Eppendorf, Nemčija)

 Vodna kopel 2219 Multitemp II (LKB Bromma, Švedska)

 Vodna kopel TW12 (Julabo, Nemčija)

3.1.2 Kemikalije

 Agar (Biolife, Italija)

 Agaroza (Bio-Rad, ZDA)

 Ampicilin (Sigma, ZDA)

 Barvilo SimplyBlue™ SafeStain (Life technologies, ZDA)

17

 DNA standard 2-Log DNA Ladder (New England Biolabs, Velika Britanija)

 DNA standard Lambda DNA/HindIII (Odsek za molekularno biologijo in nanobiotehnologijo, Kemijski inštitut, Slovenija)

 DTT (Sigma, ZDA)

 EDTA (Merck, Nemčija)

 Eelektroforezni pufer NuPAGE® MES SDS Running Buffer (Life technologies, ZDA)

 Etanol (absolutni) (J. T. Baker, ZDA)

 Etidijev bromid (EtBr) (Sigma, ZDA)

 Glicerol, redestiliran (Kemika, Hrvaška)

 Glukoza (Sigma, ZDA)

 Goveja kri (Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani Slovenija)

 Goveji serumski albumin (BSA) (Sigma, ZDA)

 HCl (Merck, Nemčija)

 HEPES (Goldbio, ZDA)

 Holesterol (iz ovčje volne) (Hol) (Avanti polar lipids, ZDA)

 Imidazol (Sigma, ZDA)

 IPTG (GBT)

 Kloramfenikol (Sigma, ZDA)

 Kloroform (Merck, Nemčija)

 Kvasni ekstrakt (Bacto™ Yeast Extract) (BD, ZDA)

 NaCl (Merck, Nemčija)

 Nanašalni pufer pri NaDS-PAGE NuPAGE® LDS Sample Buffer (4x) (Life technologies, ZDA)

 Nanašalni pufer za AGE Gel Loading Dye Purple (6x) (New England Biolabs, Velika Britanija)

 NaOH (Sigma, ZDA)

 Natrijev fosfat (NaH2PO4 x 2H2O) (Merck, Nemčija)

 NBD-PE (Sigma, ZDA)

 Ni-NTA agaroza (Thermo Scientific, ZDA)

 Nikljev sulfat (NiSO4 x 2H2O) EMSURE ® (Sigma, ZDA)

 Ocetna kislina (Merck, Nemčija)

 POPC (Avanti Polar Lipids, ZDA)

 Proteinski standard Novex® Sharp Unstained Protein Standard (Life technologies, ZDA)

 Pufer CutSmart® (10X) (New England Biolabs, Velika Britanija)

18

 Rodamin DHPE (ThemoFischer Scientific, ZDA)

 Saharoza (Sigma, ZDA)

 T4 DNA ligacijski pufer (10x) (Sigma, ZDA)

 Tripton (Bacto™ Tryptone) (BD, ZDA)

 Tris (Sigma, ZDA)

 Urea (Sigma, ZDA)

3.1.3 Računalniška oprema

 Gen5.1 (Biotek, ZDA)

 iBright Analysis Software (Thermo Fischer Scientific, ZDA)

 Microsoft Office Excel 2016 (Microsoft, ZDA)

 OriginPro 8.5 (OriginLab, ZDA)

 Unicorn 7.0 (Cytiva, ZDA)

 Vector NTI (Thermo Fischer Scientific, ZDA)

3.1.4 Pufri in gojišča

Pufre smo pripravili z ultračisto vodo Mili-Q (MQ) in jih prefiltrirali skozi filter s porami velikosti 0,22 µm. Gojišče za bakterije smo pripravili z demineralizirano vodo (dH2O) in nato sterilizirali v avtoklavu z vlažno toploto (20 min, 121 °C, 1,2 bar). Pred uporabo smo gojišču dodali ustrezen antibiotik (ampicilin v končni koncentraciji 100 µg/mL, kloramfenikol v končni koncentraciji 34 µg/mL). Seznam gojišč in uporabljenih pufrov z njihovo sestavo je prikazan v tabeli 2.

Tabela 2: Pufri in gojišča s njihovo sestavo.

Pufri in gojišča Sestava

Gojišče Luria-Bertani (LB) tripton 10 g/L, kvasni ekstrakt 5 g/L, NaCl 10 g/L;

za trdo gojišče dodatno še agar (15 g/L)

Pufer za lizo 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM

19

Pufer za Ni-NTA agarozo 0,5 M NiSO4, pH 7,4

Pufer za proteine 50 mM Tris-acetat, 150 mM NaCl, pH 7,4

Pufer za proteine z glicerolom 50 mM Tris-acetat, 150 mM NaCl, 5 V/V % glicerol, pH 7,4

Pufer za resuspendiranje usedline 50 mM Tris-acetat, 150 mM NaCl, 8 M urea, pH 7,4

Pufer za eritrocite 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,4

TBE 100 mM Tris, 100 mM borova kislina, 20 mM

EDTA, pH 8,3

Saharozni pufer za GUV-e 300 mM saharoza, 1 mM HEPES, pH 7,4 Glukozni pufer za GUV-e 300 mM glukoza, 1 mM HEPES, pH 7,4

3.1.5 Komercialno dostopni kompleti kemikalij

 Monarch Plasmid Miniprep Kit (New England Biolabs, Velika Britanija)

 Monarch DNA Gel Extraction Kit (New England Biolabs, Velika Britanija)

3.1.6 Encimi

 AvrII New (New England Biolabs, Velika Britanija)

 BstBI New (New England Biolabs, Velika Britanija)

 MluI New (New England Biolabs, Velika Britanija)

 T4 DNA ligaza (Thermo Scientific, ZDA)

 XhoI New (New England Biolabs, Velika Britanija)

3.1.7 Kemijsko kompetentne celice

Tabela 3: Kemijsko kompetentne celice, ki smo jih uproabljali, namen uporabe in njihove značilnosti.

Bakterijski sev Namen Rezistenca na antibiotik

E. coli DH5α Namnoževanje plazmidov.

E. coli BL21(DE3) pLysS Izražanje gena za protein. Kloramfenikol

20

3.1.8 Plazmidi in proteini

V okviru raziskovalnega dela smo izolirali rekombinantne proteine, ki sodijo v 4 skupine:

1) različice celega toksina PFO, 2) različice celega toksina PFO v fuziji z fluorescenčnim proteinom eGFP, 3) različice D4 v fuziji s fluorescenčnim proteinom eGFP in 4) različice D4 v fuziji s fluorescenčnim proteinom mCherry. Ojačan zeleni fluorescirajoči protein eGFP (angl. enhanced green fluorescent protein) je derivat zelenega fluorescenčnega proteina iz meduze Aequoera victoria, ki ima dve aminokislinski zamenjavi, in sicer F64L in S65T. Le-ti mu omogočata višjo intenziteto fluorescence ter večjo fotostabilnost (Cinelli in sod., 2000). mCherry je član družine monomernih rdečih fluorescenčnih proteinov mFruits. Je derivat rdečega fluorescenčnega proteina iz morskih vetrnic iz rodu Discosoma (Shaner in sod., 2004). Proteini s pripradajočimi plazmidnimi vektorji so navedeni v tabeli 4. Aminokislinske zamenjave se pri vseh različicah nahajajo v D4.

Zaradi večje preglednosti smo različice z istim setom mutacij arbitrarno poimenovali z oznakami 32, 33 in 50, ki so opisane v tabeli 5. Divji tip proteina je označen kot WT (angl. wild type)

Tabela 4: Proteini, ki smo jih izolirali, in pripadajoči plazmidni vektorji, ki nosijo zapise za tarčne proteine.

Tarčni protein Plazmidni vektor z zapisom za protein

PFO_WT pHT_PFO_WT

21

Tabela 5: Oznake za proteine z istim setom aminokislinskih zamenjav. Nad zaporedno številko aminokislin so navedena še značilna mesta v strukturi proteina, na katerih se te aminokisline

3.2.1 Priprava plazmidnih vektorjev z zapisom za različice perfringolizina O

Plazmidni vektorji, ki smo jih uporabljali za izražanje proteinov, so z glavnimi lastnostmi grafično prikazani na sliki 3. Izražanje zapisa za preučevani protein je pod kontrolo promotorja za T7 polimerazo RNA, katere prepis sproži IPTG. Za promotorjem se nahaja zapis za heksahistidinski podaljšek (His-tag) ter zapis za prepoznavno mesto za proteazo TEV. V primeru fluorescenčno označenih različic, se za tem nahaja zapis za fluorescirajoči protein eGFP oz. mCherry, na koncu katerega je dodan aminokislinski povezovalec sestavljen iz aminokislin glicin in serin (GS). Nato sledi zapis za preučevani protein (različica PFO oz. njegove D4). Na plazmidu se prav tako nahaja mesto začetka podvajanja (pBR322 ori) in zapis za β-laktamazo, ki omogoča odpornost proti ampicilinu (Amp^R).

Plazmidne vektorje za različice proteina PFO oz. D4 smo pripravili z izrezovanjem zapisa za D4 (oz. njeno različico) in ligacijo v pripravljen vektor. Na začetek zapisa za D4 je v vseh konstruktih vstavljena tiha mutacija, ki privede do nastanka prepoznavnega mesta za restrikcijski encim BstBI, na koncu zapisa za D4 pa se nahaja prepoznavno mesto za restrikcijski encim MluI. S pomočjo teh dveh restrikcijskih encimov smo pripravili plazmidne vektorje z zapisom za proteinske različice.

In document Marina Filipović (Strani 33-39)