nato (COOH)2. Povzeto po (43).
Sintezo bomo začeli iz (R)-3-amino-2-((terc-butoksikarbonil)amino)propanojske kisline (spojina 1) in 1-fluoro-2-nitrobenzena (spojina 2). Oba reagenta sta komercialno dostopna.
V reakciji nukleofilne aromatske substitucije, kjer bo vlogo nukleofila igrala prosta -NH2
skupina spojine 1, bomo dobili spojino 3. V reakciji katalitskega hidrogeniranja bomo reducirali -NO2 skupino do aromatske -NH2 skupine (spojina 4), na kateri bo po uporabi sklopitvenega reagenta potekla intramolekularna ciklizacija s prosto -COOH skupino do nastanka ustreznega 1,5-benzodiazepina (spojina 5). Sintezni postopek do te stopnje so opisali Lauffer in sodelavci (43).
Reakcijo N-alkiliranja na mestu N5 nastalega benzodiazepina bomo izvedli z uporabo 3-bromocikloheksena (spojina 6). Dvojno vez na substituentu na mestu N5 bomo reducirali v postopku katalitskega hidrogeniranja do nastanka spojine 7. Z uporabo 1-kloropinakolona bomo v reakciji nukleofilne substitucije amidnega dušika na mestu N1 tvorili spojino 8.
Odstranitev Boc zaščitne skupine bomo izvedli v kislem do nastanka spojine 9, ki jo bomo uporabili v zadnji reakciji sinteze spojine 13.
12
Spojino 12, ki jo bomo v končni fazi uporabili v sintezi spojine 13, bomo sintetizirali v reakciji nukleofilne substitucije med komercialno dostopno 3-aminobenzojsko kislino (spojina 10) in fenilkloroformatom (spojina 11). V končni stopnji sinteze spojine 13 bomo konvergentno združili spojini 9 in 12 z reakcijo nukleofilne substitucije.
Cilj magistrske naloge je sinteza 1,5-benzodiazepinskega antagonista CCK2R nastorazepida in optimizacija posameznih sinteznih stopenj. Predlagali bomo tudi strukturne modifikacije za izboljšanje fizikalno-kemijskih lastnosti spojine in afinitete vezave. Produkte bomo očistili z uporabo ustreznih izolacijskih postopkov in jih identificirali s tankoplastno kromatografijo (TLC), spektroskopskimi analiznimi metodami, kot so npr. 1H in 13C jedrska magnetna resonanca (NMR), masna spektroskopija (MS), infrardeča spektroskopija (IR), tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) ter z določanjem temperature tališča.
13
3 Materiali in metode 3.1 Materiali
3.1.1 Reagenti in topila
Pri delu v laboratoriju smo uporabljali reagente in topila različnih proizvajalcev (Acros Organics, Aldrich, Apollo Scientific, Carlo Erba, Enamine, Fluka, Merck, Panreac Applichem , Sigma-Aldrich in TCI) brez predpriprave: n-heksan: 95 %, Panreac AppliChem, Nemčija; metanol ACS: ≥ 99,9 %, Carlo Erba, Francija; etil acetat ACS: ≥ 99,9 %, Carlo Erba, Francija; etanol: 96 %, Sigma-Aldrich, Nemčija; brezvodni etanol: Sigma-Aldrich, Nemčija; trietilamin: ≥ 99,0 %, Merck, Nemčija; 1,4-dioksan: ≥ 99,5 %, Merck, Nemčija;
dietileter: ≥ 99,7 %, Merck, Nemčija; brezvodni metanol: SeccoSolv®, ≥ 99,9 %, Merck, Nemčija; diklorometan: ≥ 99,8 %, Merck, Nemčija; paladij na ogljiku: 10 wt. %, Sigma-Aldrich, Nemčija; brezvodni natrijev sulfat: Merck, Nemčija; natrijev hidroksid: TCI, Belgija; kalijev jodid: ≥ 99,0 %, Sigma-Aldrich, Nemčija; kalijev karbonat: Merck, Nemčija;
tetrabutilamonijev bromid: ≥ 98,0 %, Sigma-Aldrich, Nemčija; natrijev karbonat: ≥ 99,9 %, Merck, Nemčija; aceton: ≥ 99,5 %, Merck, Nemčija; natrijev hidrogen karbonat: Merck, Nemčija; ocetna kislina: 100 %, Merck, Nemčija; Boc-Dap-OH: ≥ 98,0 %, Sigma-Alrdich, Nemčija; 1-fluoro-2-nitrobenzen: ≥ 99,0 %, Sigma-Aldrich, Nemčija; N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidroklorid: ≥ 98,0 %, Sigma-Aldrich, Nemčija;
platinin(IV) oksid: Sigma-Aldrich, Nemčija; 3-aminobenzojska kislina: 98 %, Merck, Nemčija; 1-kloropinakolon: 95 %, Merck, Nemčija; cikloheksanon: ≥ 99,0 %, Fluka, Nemčija; N,N-dimetilformamid: ≥ 99,8 %, Carlo Erba, Francija; HCl v ocetni kislini: 1 M, Acros Organics, ZDA; HCl v 1,dioksanu: 4 M, Sigma-Aldrich, Nemčija; 4-(dimetilamino)piridin: ≥ 99,0 %, Sigma-Aldrich, Nemčija; tetrahidrofuran: Merck, Nemčija in ninhidrin: ≥ 99,0 %, Fluka, Nemčija.
3.1.2 Aparature
Pri delu v laboratoriju smo uporabljali standardno laboratorijsko opremo: analitsko tehtnico Sartorius® LP620P, magnetno mešalo IKA® RH basic, Rotavapor Büchi® type R114 z grelno kadičko Büchi® Heating Bath B-490, UV svetilko Camag® UV-cabinet II (λ = 254/366 nm), grelno pištolo Einhell®, vakuumsko črpalko Trivac® D8B, Büchi® Vac V-500 in upravljalnikom Büchi® Vacuum Controller V-850.
14
3.2 Metode
3.2.1 Tankoplastna kromatografija (TLC)
Za spremljanje poteka reakcije, izolacijo produkta in izbiro topil pri kolonski kromatografiji smo uporabljali tankoplastno kromatografijo (TLC). Za stacionarno fazo smo uporabljali silikagel plošče TLC Silica gel 60 F254 z 0,2 mm debelim nanosom silikagela na aluminijastem nosilcu in z dodanim fluorescenčnim indikatorjem, proizvajalec Merck, Nemčija. Za mobilno fazo smo uporabljali organska topila in njihove kombinacije, pretežno DKM, CHCl3 in EtOAc. Za dosego ustreznih retencijskih faktorjev smo mobilni fazi (MF) dodali kapljico Et3N ali AcOH. Identifikacijo lis spojin smo izvajali z UV svetilko pri valovni dolžini λ = 254 nm. Uporabljali smo tudi orositveni reagent ninhidrin za detekcijo in opazovanje spojin z aminsko funkcionalno skupino.
3.2.2 Kolonska kromatografija
Kolonsko kromatografijo smo uporabljali za izolacijo spojin iz zmesi in čiščenje surovih produktov. Mobilno fazo smo predhodno izbrali s pomočjo TLC in so jo predstavljale kombinacije različnih topil v različnih razmerjih, po potrebi z dodatkom AcOH ali Et3N. Za stacionarno fazo smo uporabili silikagel 60, ki ga proizvaja Merck, Nemčija, z velikostjo delcev 0,040 – 0,063 mm. Količino stacionarne faze smo prilagodili glede na količino čiščene zmesi in zahtevnost kromatografske ločbe ter nato izbrali kolono z ustreznim premerom in velikostjo. Pretok mobilne faze smo po potrebi pospešili z zračnim nadtlakom.
3.2.3 1H in 13C jedrska magnetna resonanca (NMR)
1H in 13C NMR spektre smo posneli na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani na spektrometru Bruker Avance III 400 pri 400 MHz in 100 MHz v devteriranih topilih CDCl3
in DMSO-d6. Kot interni standard smo uporabili tetrametilsilan (TMS).
3.2.4 Masna spektrometrija (MS)
Masne spektre smo posneli na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani. Masne spektre visoke ločljivosti (HRMS) pa smo s tehniko ESI posneli na spektrometru VG-Analytical Autospec Q proizvajalca Micromass, tudi na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani.
15 3.2.5 Infrardeča spektroskopija (IR)
IR spektri so bili posneti na spektrometru Perkin Elmer 1600 Series FT-IR na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani. Posnete IR spektre smo obdelali s programom Omnic E.S.P.
5.3 proizvajalca Thermo Fischer Scientific, ZDA.
3.2.6 Določanje temperature tališča
Temperaturo tališča smo določali na Koflerjevem talilnem mikroskopu, proizvajalec Cambridge Instruments, z ogrevalno mizico proizvajalca Leica na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani. Tališča so nekorigirana.
3.2.7 Računalniška programska oprema
NMR spektre smo analizirali z računalniškim programom MestreNova različica 6.0, proizvajalec Mestrelab Research, s katerim smo določili tudi pričakovane premike. V programu ChemDraw Professional 18.0, PerkinElmer Informatics, smo narisali strukturne formule spojin, izračunali njihovo molekulsko maso in določili molekulsko formulo.
16
4 Eksperimentalni del 4.1 Reakcijske sheme
Slike 9, 10 in 11 prikazujejo reakcijske sheme sinteze končne spojine. Na sliki 9 so vidne spremembe načrtovanega sinteznega postopka od slike 8, saj vse stopnje niso potekle kot predvideno.
Slika 8: Sintezna shema 1. Sintezna shema prikazuje sintezo do spojine 8. Reakcijski pogoji: a) NaHCO3, DMF, Ar atm.,