Nastorazepid je 1,5-BDZ antagonist holecistokininskega-2/gastrinskega receptorja z visoko selektivnostjo za CCK2R glede na CCK1R. V primerjavi z ostalimi antagonisti CCK2R ima izboljšano peroralno biološko uporabnost, vodotopnost in jakost (35). Zavira s pentagastrinom stimulirano izločanje želodčne kisline in bi se lahko uporabljal pri terapiji na gastrin občutljivih pankreatičnih tumorjev, saj ima gastrin dokazano vlogo pri nastanku malignih tvorb v GIT (36). Spojina je zaključila fazo II kliničnih testiranj za uporabo kot
9
peroralni antagonist CCK2R v ko-terapiji raka pankreasa, vendar se je pojavilo novo možno področje njene uporabe: kot vektorska molekula v razvoju radiofarmakov (36,37).
V primeru tumorjev, ki prekomerno izražajo CCK2R, se raziskuje uporaba derivatov Z-360 z ustrezno pripetimi radionuklidi (23). Nastorazepid se kot majhna molekula z antagonističnim delovanjem selektivno veže na CCK2R (6).
Uporaba antagonistov namesto agonistov pri izbiri vektorske molekule za razvoj radiofarmaka z delovanjem na CCK2R je bila podkrepljena z obetavnimi rezultati raziskav drugih radiooznačenih antagonistov GPCR (38). Ugotovili so, da v sorodnem sistemu somatostatin/somatostatinski receptor vezava radiooznačenega antagonista kot vektorja predstavlja določene prednosti v primerjavi z agonisti, predvsem povečan privzem v tumor, izboljšanje kontrasta z ozadjem in s tem diagnostične vrednosti (39). To je sprožilo razvoj antagonistov CCK2R, kjer bi poleg potencialno omenjenega izboljšanega privzema v tumor, z uporabo antagonistov zaobšli tudi možne neželene učinke agonistov CCK2R (40).
Izmed znanih spojin z antagonističnim delovanjem na CCK2R, je bil največje pozornosti v okviru razvoja radiofarmakov deležen nastorazepid zaradi svoje selektivnosti in že dokazane uspešne uporabe kot vektorska molekula v pripravi s tehnecijem-99m (99mTc) radiooznačenih spojin (35,41). Primernost Z-360 kot vektorske molekule z obetavnim potencialom je ustvarilo zahtevo po učinkoviti sintezi spojine za namene nadaljnjega razvoja radiofarmakov (29–31).
10
2 Namen dela
V okviru magistrske naloge bomo poskušali optimizirati sintezno pot in pripraviti antagoniste CCK2R 1,5-BDZ tipa. Ta skupina spojin se je izkazala za obetavno v radiodiagnostiki in antitumorni terapiji. Vrste raka, ki prekomerno izražajo CCK2R, predstavljajo heterogeno skupino rakov, pri kateri je kirurško zdravljenje večinoma edina učinkovita metoda zdravljenja, saj klasična kemoterapija ter obsevanje nista učinkovita (42).
Agonisti, ki so primerni za diagnostiko, obstajajo, vendar imajo omejeno uporabo.
Agonistični učinek, ki ga povezujemo s stranskimi učinki podobnim učinkom pentagastrinskega testa, bi lahko omejeval maksimalno količino radiofarmaka, ki ga lahko naenkrat aplicirali pacientu. Posledično bi bila omejena tudi zgornja meja aplicirane radioaktivnosti, kar bi vodilo v manjši terapevtski učinek.
Slika 6: Shematska predstavitev radiofarmaka, ki bi se preko vektorske molekule vezal na prekomerno izražene CCK2R na tumorski celici. Povzeto po sinteznem načrtu.
Kot osnovo za načrtovanje novih spojin bomo uporabili že znane izsledke o antagonistih 1,4-BDZ tipa in njihove strukturne modifikacije poskušali prenesti na 1,5-BDZ. Pri tem se bomo fokusirali predvsem na izboljšanje fizikalno-kemijskih in posledično farmakokinetičnih lastnosti že znanih spojin ter povečanje selektivnosti in izboljšanje afinitete vezave. Lotili se bomo sinteze najbolj obetavne spojine iz tega razreda učinkovin, to je Z-360 ali nastorazepid.
11
Cilj magistrske naloge je na podlagi že znanih postopkov sinteze omenjene spojine optimizirati njeno pripravo s spremembo reakcijskih pogojev in po potrebi z uporabo drugih reagentov. Produkte sinteznih stopenj bomo očistili z uporabo ustreznih izolacijskih postopkov in jih identificirali s tankoplastno kromatografijo (TLC), spektroskopskimi analiznimi metodami, kot so npr. 1H in 13C jedrska magnetna resonanca (NMR), masna spektroskopija (MS) in infrardeča spektroskopija (IR) ter z določanjem temperature tališča.
Slika 7: Načrtovan sintezni postopek do nastanka spojine 9. Reakcijski pogoji: i) NaHCO3, DMF, N2 atm; ii) Pd/C, H2 atm, MeOH; iii) EDC, DMF, 0 °C; iv) NaHCO3, DMF, 50°C; v) Pd/C, H2 atm, EtOH; vi) K2CO3, KI, TBABr; vii) 6 M HCl, nato (COOH)2. Povzeto po (43).
Sintezo bomo začeli iz (R)-3-amino-2-((terc-butoksikarbonil)amino)propanojske kisline (spojina 1) in 1-fluoro-2-nitrobenzena (spojina 2). Oba reagenta sta komercialno dostopna.
V reakciji nukleofilne aromatske substitucije, kjer bo vlogo nukleofila igrala prosta -NH2
skupina spojine 1, bomo dobili spojino 3. V reakciji katalitskega hidrogeniranja bomo reducirali -NO2 skupino do aromatske -NH2 skupine (spojina 4), na kateri bo po uporabi sklopitvenega reagenta potekla intramolekularna ciklizacija s prosto -COOH skupino do nastanka ustreznega 1,5-benzodiazepina (spojina 5). Sintezni postopek do te stopnje so opisali Lauffer in sodelavci (43).
Reakcijo N-alkiliranja na mestu N5 nastalega benzodiazepina bomo izvedli z uporabo 3-bromocikloheksena (spojina 6). Dvojno vez na substituentu na mestu N5 bomo reducirali v postopku katalitskega hidrogeniranja do nastanka spojine 7. Z uporabo 1-kloropinakolona bomo v reakciji nukleofilne substitucije amidnega dušika na mestu N1 tvorili spojino 8.
Odstranitev Boc zaščitne skupine bomo izvedli v kislem do nastanka spojine 9, ki jo bomo uporabili v zadnji reakciji sinteze spojine 13.
12
Spojino 12, ki jo bomo v končni fazi uporabili v sintezi spojine 13, bomo sintetizirali v reakciji nukleofilne substitucije med komercialno dostopno 3-aminobenzojsko kislino (spojina 10) in fenilkloroformatom (spojina 11). V končni stopnji sinteze spojine 13 bomo konvergentno združili spojini 9 in 12 z reakcijo nukleofilne substitucije.
Cilj magistrske naloge je sinteza 1,5-benzodiazepinskega antagonista CCK2R nastorazepida in optimizacija posameznih sinteznih stopenj. Predlagali bomo tudi strukturne modifikacije za izboljšanje fizikalno-kemijskih lastnosti spojine in afinitete vezave. Produkte bomo očistili z uporabo ustreznih izolacijskih postopkov in jih identificirali s tankoplastno kromatografijo (TLC), spektroskopskimi analiznimi metodami, kot so npr. 1H in 13C jedrska magnetna resonanca (NMR), masna spektroskopija (MS), infrardeča spektroskopija (IR), tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) ter z določanjem temperature tališča.
13
3 Materiali in metode 3.1 Materiali
3.1.1 Reagenti in topila
Pri delu v laboratoriju smo uporabljali reagente in topila različnih proizvajalcev (Acros Organics, Aldrich, Apollo Scientific, Carlo Erba, Enamine, Fluka, Merck, Panreac Applichem , Sigma-Aldrich in TCI) brez predpriprave: n-heksan: 95 %, Panreac AppliChem, Nemčija; metanol ACS: ≥ 99,9 %, Carlo Erba, Francija; etil acetat ACS: ≥ 99,9 %, Carlo Erba, Francija; etanol: 96 %, Sigma-Aldrich, Nemčija; brezvodni etanol: Sigma-Aldrich, Nemčija; trietilamin: ≥ 99,0 %, Merck, Nemčija; 1,4-dioksan: ≥ 99,5 %, Merck, Nemčija;
dietileter: ≥ 99,7 %, Merck, Nemčija; brezvodni metanol: SeccoSolv®, ≥ 99,9 %, Merck, Nemčija; diklorometan: ≥ 99,8 %, Merck, Nemčija; paladij na ogljiku: 10 wt. %, Sigma-Aldrich, Nemčija; brezvodni natrijev sulfat: Merck, Nemčija; natrijev hidroksid: TCI, Belgija; kalijev jodid: ≥ 99,0 %, Sigma-Aldrich, Nemčija; kalijev karbonat: Merck, Nemčija;
tetrabutilamonijev bromid: ≥ 98,0 %, Sigma-Aldrich, Nemčija; natrijev karbonat: ≥ 99,9 %, Merck, Nemčija; aceton: ≥ 99,5 %, Merck, Nemčija; natrijev hidrogen karbonat: Merck, Nemčija; ocetna kislina: 100 %, Merck, Nemčija; Boc-Dap-OH: ≥ 98,0 %, Sigma-Alrdich, Nemčija; 1-fluoro-2-nitrobenzen: ≥ 99,0 %, Sigma-Aldrich, Nemčija; N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidroklorid: ≥ 98,0 %, Sigma-Aldrich, Nemčija;
platinin(IV) oksid: Sigma-Aldrich, Nemčija; 3-aminobenzojska kislina: 98 %, Merck, Nemčija; 1-kloropinakolon: 95 %, Merck, Nemčija; cikloheksanon: ≥ 99,0 %, Fluka, Nemčija; N,N-dimetilformamid: ≥ 99,8 %, Carlo Erba, Francija; HCl v ocetni kislini: 1 M, Acros Organics, ZDA; HCl v 1,dioksanu: 4 M, Sigma-Aldrich, Nemčija; 4-(dimetilamino)piridin: ≥ 99,0 %, Sigma-Aldrich, Nemčija; tetrahidrofuran: Merck, Nemčija in ninhidrin: ≥ 99,0 %, Fluka, Nemčija.
3.1.2 Aparature
Pri delu v laboratoriju smo uporabljali standardno laboratorijsko opremo: analitsko tehtnico Sartorius® LP620P, magnetno mešalo IKA® RH basic, Rotavapor Büchi® type R114 z grelno kadičko Büchi® Heating Bath B-490, UV svetilko Camag® UV-cabinet II (λ = 254/366 nm), grelno pištolo Einhell®, vakuumsko črpalko Trivac® D8B, Büchi® Vac V-500 in upravljalnikom Büchi® Vacuum Controller V-850.
14
3.2 Metode
3.2.1 Tankoplastna kromatografija (TLC)
Za spremljanje poteka reakcije, izolacijo produkta in izbiro topil pri kolonski kromatografiji smo uporabljali tankoplastno kromatografijo (TLC). Za stacionarno fazo smo uporabljali silikagel plošče TLC Silica gel 60 F254 z 0,2 mm debelim nanosom silikagela na aluminijastem nosilcu in z dodanim fluorescenčnim indikatorjem, proizvajalec Merck, Nemčija. Za mobilno fazo smo uporabljali organska topila in njihove kombinacije, pretežno DKM, CHCl3 in EtOAc. Za dosego ustreznih retencijskih faktorjev smo mobilni fazi (MF) dodali kapljico Et3N ali AcOH. Identifikacijo lis spojin smo izvajali z UV svetilko pri valovni dolžini λ = 254 nm. Uporabljali smo tudi orositveni reagent ninhidrin za detekcijo in opazovanje spojin z aminsko funkcionalno skupino.
3.2.2 Kolonska kromatografija
Kolonsko kromatografijo smo uporabljali za izolacijo spojin iz zmesi in čiščenje surovih produktov. Mobilno fazo smo predhodno izbrali s pomočjo TLC in so jo predstavljale kombinacije različnih topil v različnih razmerjih, po potrebi z dodatkom AcOH ali Et3N. Za stacionarno fazo smo uporabili silikagel 60, ki ga proizvaja Merck, Nemčija, z velikostjo delcev 0,040 – 0,063 mm. Količino stacionarne faze smo prilagodili glede na količino čiščene zmesi in zahtevnost kromatografske ločbe ter nato izbrali kolono z ustreznim premerom in velikostjo. Pretok mobilne faze smo po potrebi pospešili z zračnim nadtlakom.
3.2.3 1H in 13C jedrska magnetna resonanca (NMR)
1H in 13C NMR spektre smo posneli na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani na spektrometru Bruker Avance III 400 pri 400 MHz in 100 MHz v devteriranih topilih CDCl3
in DMSO-d6. Kot interni standard smo uporabili tetrametilsilan (TMS).
3.2.4 Masna spektrometrija (MS)
Masne spektre smo posneli na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani. Masne spektre visoke ločljivosti (HRMS) pa smo s tehniko ESI posneli na spektrometru VG-Analytical Autospec Q proizvajalca Micromass, tudi na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani.
15 3.2.5 Infrardeča spektroskopija (IR)
IR spektri so bili posneti na spektrometru Perkin Elmer 1600 Series FT-IR na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani. Posnete IR spektre smo obdelali s programom Omnic E.S.P.
5.3 proizvajalca Thermo Fischer Scientific, ZDA.
3.2.6 Določanje temperature tališča
Temperaturo tališča smo določali na Koflerjevem talilnem mikroskopu, proizvajalec Cambridge Instruments, z ogrevalno mizico proizvajalca Leica na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani. Tališča so nekorigirana.
3.2.7 Računalniška programska oprema
NMR spektre smo analizirali z računalniškim programom MestreNova različica 6.0, proizvajalec Mestrelab Research, s katerim smo določili tudi pričakovane premike. V programu ChemDraw Professional 18.0, PerkinElmer Informatics, smo narisali strukturne formule spojin, izračunali njihovo molekulsko maso in določili molekulsko formulo.
16
4 Eksperimentalni del 4.1 Reakcijske sheme
Slike 9, 10 in 11 prikazujejo reakcijske sheme sinteze končne spojine. Na sliki 9 so vidne spremembe načrtovanega sinteznega postopka od slike 8, saj vse stopnje niso potekle kot predvideno.
Slika 8: Sintezna shema 1. Sintezna shema prikazuje sintezo do spojine 8. Reakcijski pogoji: a) NaHCO3, DMF, Ar atm., 70 °C, 24 ur; b) Pd/C, H2 atm., EtOH; c) EDC, DMF, 0 °C, čez noč; d) 1. PtO2, H2 atm, AcOH, 6 ur. 2. EtOAc, akt. oglje, NaOH; e) K2CO3, KI, TBABr, DMF, 60 °C; f) 4 M HCl v 1,4-dioksanu, 1 ura.
Slika 9: Sintezna shema 2. Sintezna shema prikazuje sintezo spojine 12. Reakcijski pogoji: g) 0,5M NaOH, THF.
Slika 10: Sintezna shema 3. Sintezna shema prikazuje sintezo končne spojine 13. Reakcijski pogoji: h) 1. TEA, DMAP, DMF, 65 °C, 2 uri. 2. EtOH, rt., 2 uri. 3. HCl.
17
4.2 Sintezni postopki in analizni rezultati
4.2.1 Sinteza (R)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-((2-nitrofenil)amino)propanojske kisline (44)
Postopek
V 100 mL bučko smo zatehtali spojino 1 (4,906 g, 24 mmol, 1,0 ekv.) in jo raztopili v 50 mL DMF. Mešali smo na magnetnem mešalu, da se je celotna spojina 1 raztopila ter dodali NaHCO3 (4,314 g, 50 mmol, 2 ekv.). Bučko smo opremili z vodnim hladilnikom ter reakcijsko zmes segreli na 70 °C ter reakcijo izvajali v argonovi atmosferi. Po kapljicah smo dodali spojino 2 (2,83mL, 27,5 mmol, 1,1 ekv.) ter pustili mešati čez noč. Potek reakcije in izolacijo smo spremljali s TLC. Po zaključeni reakciji smo reakcijsko zmes ohladili na sobno temperaturo ter ji na oljni črpalki uparili DMF. Zaostanek po uparevanju smo raztopili v 50 mL destilirane vode (VF) ter raztopino prenesli v lij ločnik, kjer smo ekstrahirali 3-krat s po 50 mL EtOAc. VF smo nato nakisali s 3 M HCl (8,3 mL) do pH = 3 ter izvedli ponovno ekstrakcijo s 3-krat po 50 mL EtOAc (OF). VF smo zavrgli, združene OF pa sušili nad Na2SO4, filtrirali, ter jim pod znižanim tlakom odstranili topilo in tako pridobili spojino 3 intenzivno oranžne barve. Istovetnost smo potrdili z NMR in MS. Reakcijo smo izvedli večkrat, vedno z enakim razmerjem reagentov in topila. Začeli smo s 100 mg reagenta 1 in povečali na 1 g, 2 g ter na koncu na 5 g.
Rezultati
Videz: amorf oranžne barve
MS (ESI+): m/z za C14H19N3O6 ([M + H]+): izračunano 326,13; izmerjeno 326,1.
18
Izkoristek: η1 = 34,5 % (0,106 g), η2 = 29 % (0,09 g), η3 = 62,5 % (0,199 g), η4 = 47,2 % (1,28 g), η5 = 65,3 % (1,98 g), η6 = 77,7 % (2,506 g), η7 = 64,4 % (1,023 g), η8 = 69,2 % (5,483 g), η9 = 68,0 % (5,255 g), η10 = 66,4 % (5,251 g), η11 = 71,4 % (5,505 g)
Rf: 0,6 (MF: DKM/MeOH = 3/1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1,35 (s, 9H, CH3); 3,49-3,56 (m, 2H, NH-CH2);
4,21 (m, 1H, NH-CH-COOH); 6,73 (t, 1H, J = 18 Hz, Har); 7,08 (d, 1H, J = 18 Hz, Har); 7,32 (d, 1H, J = 18 Hz, Har); 7,57 (t, 1H, J = 18 Hz, Har); 8,08 (d, 1H, CH-NH-COO); 8,21 (t, 1H, Ar-NH); 12,94 (s, 1H, COOH).
4.2.2 Sinteza (R)-3-((2-aminofenil)amino)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)propanojske kisline (44)
Postopek
V 225 mL brezvodnega EtOH raztopili spojino 3 (5,255 g, 16,2 mmol) ter jo kvantitativno prenesli v 500 mL dvovrato bučko. Dodali smo magnetek za magnetno mešalo in preko ventila s pomočjo vodne črpalke evakuirali hlape topila. Dvovrato bučko smo napolnili z argonovo atmosfero in s plastičnim priborom preko steklenega lija dodali 2 g paladija na ogljiku (Pd/C). Za tem smo še enkrat odstranili hlape topila in dodan argon ter bučko napolnili z H2 atmosfero. Potek reakcije smo spremljali s TLC. Po 4 urah smo reakcijo prekinili. Pd/C smo odfiltrirali ter zaostanek sprali s topilom in brezvodnim EtOH. Filtratu smo uparili topilo in tako pridobili spojino 4. Istovetnost smo potrdili z NMR in MS.
Reakcijo smo izvedli večkrat, vedno z enakim razmerjem reagentov in topila. Produkt smo brez predhodnega čiščenja uporabili v naslednjih sinteznih stopnjah.
Rezultati
Videz: kristali rjave barve
19
MS (ESI+): m/z za C14H21N3O4 ([M + H]+): izračunano 296,15; izmerjeno 296,1.
m/z za C14H21N3O4 ([M + Na]+): izračunano 318,15; izmerjeno 318,1.
MS (ESI-): m/z za C14H21N3O4 ([M - H]-): izračunano 294,15; izmerjeno 294,0.
Izkoristek: η1 = 69,2 % (0,220 g), η2 = 62 % (0,112 g), η3 = 64,1 % (1,835 g), η4 = 59,9
% (1,12 g), η5 = 78,3 % (1,78 g), η6 = 91,3 % (0,847 g), η7 = 76 % (3,801 g), η8 = 92,4 % (4,693 g), η9 = 94,3 % (5,501 g), η10 = 92,3 % (4,563 g)
Rf: 0,75 (MF: DKM/MeOH = 1/1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1,39 (s, 9H, CH3); 3,34 (m, 2H, NH-CH2); 4,19 (m, 1H, NH-CH-COOH); 6,44-6,56 (m, 4H, Har); 6,58 (m, 1H, Ar-NH); 7,18 (d, 1H, J = 20 Hz, CH-NH-COO).
4.2.3 Sinteza terc-butil (R)-(2-okso-2,3,4,5-tetrahidro-1H-benzo[b][1,4]diazepin-3-il)karbamata (44)
Postopek
V 100 mL bučko smo zatehtali spojino 4 (5,501 g, 18.6 mmol, 1 ekv.) in jo raztopili v 45 mL DMF. Reakcijsko zmes smo ohladili na ledeni kopeli. Nato smo dodali sklopitveni reagent EDC v obliki hidroklorida (3,93 g, 20,5 mmol, 1,1 ekv.) in pustili reagirati čez noč.
Potek reakcije smo spremljali s TLC. Po končani reakciji smo reakcijsko zmes v liju ločniku z NaHCO3 naalkalili do pH = 9 ter ekstrahirali s 3-krat po 50 mL EtOAc. OF smo združili, sprali z nasičeno raztopino NaHCO3, nasičeno raztopino NaCl in sušili nad Na2SO4 ter filtrirali. Filtratu smo uparili EtOAc in na oljni črpalki zaostal DMF. Na NMR spektru so bile prisotne nečistote, zato smo produkt čistili s kolonsko kromatografijo (mobilna faza:
EtOAc/Hex = 1/1). Prisotnost produkta v frakcijah smo preverjali s TLC. Združenim frakcijam smo uparili topilo in tako pridobili spojino 5, katere istovetnost smo potrdili z
20
NMR in MS. Čistost produkta in uspešnost čiščenja s kolonsko kromatografijo smo preverili s HPLC. Reakcijo smo ponovili večkrat. Začeli smo z 200 mg spojine 3 in povečali na 1 g, 2 g ter na koncu na 5 g.
Rezultati
Videz: amorf svetlo rumene barve
MS (ESI+): m/z za C14H19N3O3 ([M + H]+): izračunano 278,14; izmerjeno 278,1.
m/z za C14H19N3O3 ([M + Na]+): izračunano 300,14; izmerjeno 300,1.
MS (ESI-): m/z za C14H19N3O3 ([M - H]-): izračunano 276,14; izmerjeno 276,1.
HPLC: tvz. = 13,26 min; AUCt=13,26 min; λ= 214 nm = 82,75 %; čistost pri AUCt=13,26 min; λ=
280 nm = 87,11 %
Izkoristek: η1 = 34,3 % (0,107 g), η2 = 54,8 % (0,944 g), η3 = 73,5 % (2,086 g), η4 = 74,7
% (5,954 g), η5 = 64,1 % (3,314 g), η6 = 61,3 % (3,571 g) Rf: 0,3 (MF: EtOAc/Hex = 1/1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1,37 (s, 9H, CH3); 4,14 (m, 1H, NH-CH-CONH);
5,60 (d, 1H, Ar-NH-CH2); 6,73 (t, 1H, J = 19 Hz, CH-NH-COO); 6,83-6,94 (m, 4H, Har);
9,69 (s, 1H, Ar-NH-CO).
4.2.4 Poskus sinteze terc-butil ((3R)-1-(cikloheks-2-en-1-il)-4-okso-2,3,4,5-tetrahidro-1H-benzo[b][1,4]diazepin-3-il)karbamata (44)
Postopek
V 10 mL bučko smo zatehtali spojino 5 (0,400 g, 1,44 mmol, 1 ekv.) in jo raztopili v 0,7 mL DMF. V bučko smo dodali NaHCO3 (0,214 g, 2,88 mmol, 2 ekv.), jo opremili z magnetim mešalom in vodnim hladilnikom ter reakcijsko zmes segreli na 50 °C. Dodali smo
3-21
bromocikloheks-1-en (0,331 mL, 2,88 mmol, 2 ekv.). Potek reakcije smo spremljali s TLC.
Po dveh urah smo reakcijo ustavili in reakcijsko zmes ohladili na sobno temperaturo. Nastali produkt smo izolirali z ekstrakcijo. Dodali smo 0,7 mL destilirane vode ohlajene na ledu in 1,4 mL DKM. Domneven produkt in mnogi stranski produkti so bili prisotni v OF, zato smo se po uparevanju topil odločili za prekristalizacijo z uporabo diizopropilnega etra. Nastala spojina je bila prisotna tudi v matičnici. Matičnici smo uparili topilo, prekristaliziran produkt pa odnučali z odsesavanjem. Istovetnost produkta v matičnici in prekristaliziranega smo preverili z NMR in ugotovili, da nismo sintetizirali želene spojine 6'.
Rezultati
Videz: amorf bele barve
Izkoristek: ηkrist. = 9,7 % (0,05 g), ηmatičnica = 14,5 % (0,075 g) Rf: 0,5 (MF: EtOAc/Hex = 1/1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): //
4.2.5 Sinteza terc-butil (R)-(1-cikloheksil-4-okso-2,3,4,5-tetrahidro-1H-benzo[b][1,4]diazepin-3-il)karbamata (45)
Postopek
V 30 mL AcOH smo raztopili spojino 5 (3,57 g, 12,9 mmol, 1 ekv.) ter jo kvantitativno prenesli v 100 mL dvovrato bučko. Dodali smo magnetek za magnetno mešalo in cikloheksanon (4,82 mL, 46,6 mmol, 3,5 ekv.). Reakcijsko zmes smo pustili mešati 1 uro.
Preko ventila smo s pomočjo vodne črpalke evakuirali hlape topila. Dvovrato bučko smo napolnili z argonovo atmosfero in s plastičnim priborom preko steklenega lija dodali 0,102 g platinovega (IV) oksida. Za tem smo še enkrat evakuirali hlape topila in argon ter bučko napolnili še z H2 atmosfero in pustili na magnetnem mešalu 6 ur. Po preteklem predpisanem času, smo v dvovrato bučko dodali 14,75 mL EtOAc, 0,060 g aktivnega oglja in 3 M NaOH
22
(170 mL,1 ekv. glede na AcOH). Tako pripravljeno reakcijsko zmes smo pustili mešati še dodatno 1 uro, tako da sta nastali dve fazi. Potek reakcije smo spremljali s TLC. Platinov (IV) oksid in aktivno oglje smo odfiltrirali. V liju ločniku smo ločili OF od VF ter ugotovili, da se produkt nahaja v OF. To smo nato sprali z nasičeno raztopino NaHCO3, nasičeno raztopino NaCl in na koncu sušili nad Na2SO4 ter filtrirali. Na koncu smo OF še uparili EtOAc. Na NMR spektru so bile prisotne nečistote, zato smo produkt čistili s kolonsko kromatografijo (mobilna faza: EtOAc/Hex = 3/7). Prisotnost produkta v frakcijah smo preverjali s TLC. Združenim frakcijam smo uparili topilo in tako izolirali spojino 6. Njeno istovetnost smo potrdili z NMR in MS. Reakcijo smo ponovili večkrat, najprej s 100 mg spojine 5 in povečali na 1 g, 2 g ter na koncu na 3 g.
Rezultati
Videz: amorf bledo rumene barve
MS (ESI+): m/z za C20H29N3O3 ([M + H]+): izračunano 360,22; izmerjeno 360,3.
m/z za C20H29N3O3 ([M + Na]+): izračunano 382,22; izmerjeno 382,3.
Izkoristek: η1 = 15,4 % (0,188 g), η2 = 86,5 % (2,341 g), η3 = 62 % (2,665 g), η4 = 88,8
% (6,861 g), η5 = 88,23 % (4,083 g)
Rf: 0,25 (MF: EtOAc/Hex = 3/7)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1,34 (s, 9H, CH3); 1,11-1,78 (m, 10H, CH2); 1,95 (m, 1H, CH); 4,02 (m, 1H, NH-CH-CONH); 6,96-6,99 (m, 2H, Har); 6,97 (m, 1H, CH-NH-COO); 7,09-7,18 (m, 2H, Har); 9,60 (s, 1H, Ar-NH-CO).
4.2.6 Sinteza terc-butil (R)-(5-cikloheksil-1-(3,3-dimetil-2-oksobutil)-2-okso-2,3,4,5-tetrahidro-1H-benzo[b][1,4]diazepin-3-il)karbamata (45)
23 Postopek
V 100 mL bučko smo zatehtali spojino 6 (2,665 g, 7,41 mmol, 1 ekv.) in jo raztopili v 20 mL DMF. Nato smo dodali K2CO3 (1,07 g, 7,7 mmol, 1 ekv.), KI (0,043 g) ter TBABr (0,05 g). Dodali smo magnetno mešalo in reakcijsko zmes segreli na 60 °C ter dodali 1-kloropinakolona (1,17 mL, 8,9 mmol, 1,2 ekv.), opremili bučko z vodnim hladilnikom in pustili mešati čez noč. Potek reakcije smo spremljali s TLC. Po pretečenih 12 urah smo ugasnili mešalo in pustili, da se reakcijska zmes ohladi na sobno temperaturo. Nato smo v bučko dodali 20 mL ledeno mrzle vode in ekstrahirali s 3-krat po 40 mL EtOAc.OF smo združili, sprali z nasičeno raztopino NaHCO3, nasičeno raztopino NaCl, sušili z Na2SO4 in filtrirali. Uparili smo EtOAc in z oljno črpalko zaostali DMF, ki je bil viden na NMR. Prav tako so na NMR bile vidne nečistote, zato smo se lotili čiščenja s kolonsko kromatografijio (mobilna faza: EtOAc/Hex = 3/7). Prisotnost produkta v frakcijah smo preverjali s TLC.
Združenim frakcijam smo uparili topilo in izolirali spojino 7. Njeno istovetnost smo potrdili z NMR in MS. Reakcijo smo ponovili večkrat, najprej z 200 mg spojine 6 in povečali na 1 g ter 2,5 g.
Rezultati
Videz: amorf bledo rumene barve
MS (ESI+): m/z za C26H39N3O4 ([M + H]+): izračunano 458,29; izmerjeno 458,7.
24 Postopek
V 50 mL bučko smo zatehtali spojino 7 (2,156 g, 4,7 mmol) in odmerili 20 mL 4 M HCl v 1,4-dioksanu ter jo takoj dodali v bučko. Bučko smo opremili z magnetnim mešalom, zaprli s steklenim zamaškom in pustili mešati 1 uro pri sobni temperaturi. Potek reakcije smo spremljali s TLC. Po pretečenem času smo z vodno črpalko uparili odvečno kislino in topilo.
Tako smo izolirali spojino 8 v obliki soli. Njeno istovetnost smo potrdili z NMR in MS ter preverili čistost s HPLC.
Rezultati
Videz: amorf oranžne barve
MS (ESI+): m/z za C21H31N3O2 ([M + H]+): izračunano 357,24; izmerjeno 358,7.
HPLC: tvz. = 23,08 min; AUCt=23,08 min; λ= 214 nm = 94,93 %; AUCt=23,08 min; λ= 214 nm = 94,63 %
Izkoristek: η1 = 133,7 % (1,762 g), η2 = 101,0 % (1,873 g), η3 = 112,7 % (4,631 g), η4 = 105,0 % (2,531 g)
Rf: 0,65 (MF: DKM/MeOH = 9/1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1,18 (s, 9H, CH3); 1,10-1,82 (m, 10H, CH2); 1,99 (m, 1H, CH); 3,88 (m, 1H, J = 15 Hz, NH-CH-CONH); 3,44-3,58 (m, 2H, J = 15 Hz, NR1 -CH2-CH); 7,06 (m, 1H, J = 3 Hz, Har); 7,15 (m, 1H, J = 3 Hz, Har); 7,29 (m, 2H, J = 3 Hz, Har); 8,46 (d, 3H, NH3+).
4.2.8 Sinteza 3-((fenoksikarbonil)amino)benzojske kisline (44)
25 Postopek
V 25 mL bučko smo zatehtali spojino 10 (0,506 g, 3,7 mmol, 1,0 ekv.) in jo raztopili v 8 mL 0,5 M NaOH. Reakcijsko zmes smo z mešanjem na ledeni kopeli ohladili na 10 °C ter hkrati v 10 mL bučki raztopili spojino 11 (0,599 g, 3,8 mmol, 1,05 ekv.) v 2 mL THF. Tako pripravljeno raztopino spojine 11 smo nemudoma dodali k reakcijski zmesi in pustili na magnetnem mešalu 1 uro pri 10 °C. Po pretečenem času smo pustili mešati še 1 uro na sobni temperaturi. Potek reakcije smo spremljali s TLC. Izpadle kristale bele barve smo odnučali, sprali z ledeno vodo in prekristalizirali iz EtOH. Tako smo sintetizirali spojino 12, katere istovetnost smo potrdili z NMR in MS.
Rezultati
Videz: kristali bele barve
MS (ESI+): m/z za C14H11NO4 ([M + H]+): izračunano 258,07; izmerjeno 257,9.
m/z za C14H11NO4 ([M + Na]+): izračunano 280,07; izmerjeno 279,9.
m/z za C14H11NO4 ([M + MeOH + H]+): izračunano 290,10; izmerjeno 289,9.
MS (ESI-): m/z za C14H11NO4 ([M - H]-): izračunano 256,07; izmerjeno 255,8.
Izkoristek: η1 = 84,8 % (0,805 g), η2 = 55,2 % (0,524 g) Rf: 0,70 (MF: DKM/MeOH = 9/1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7,25 (m, 3H, Har); 7,45 (m, 3H, Har); 7,63 (m, 1H, Har); 7,74 (m, 1H, Har); 8,16 (s, 1H, Har); 10,44 (s, 1H, OOC-NH-Ar); 12,99 (s, 1H, COOH).
4.2.9 Sinteza (R)-3-(3-(5-cikloheksil-1-(3,3-dimetil-2-oksobutil)-2-okso-2,3,4,5-tetrahidro-1H-benzo[b][1,4]diazepin-3-il)ureido)benzojske kisline (45)
26 Postopek
V 50 mL bučko smo zatehtali spojino 8 (0,494 g, 1,3 mmol, 1,0 ekv.) in jo raztopili v 7,5 mL DMF. Dodali smo spojino 12 (0,36 g, 1,4 mmol, 1,1 ekv.), TEA (0,55 mL, 3,9 mmol, 3 ekv.) in katalizator DMAP (0,0075 g, 0,05 ekv.). Bučki smo dodali magnetek, jo opremili z vodnim hladilnikom ter segreli na 65 °C. Pri tej temperaturi smo mešali 2 uri. Po pretečenem času smo reakcijsko zmes med mešanjem ohladili na sobno temperaturo in ji dodali 6,25 mL EtOH. Po ponovno pretečenih dveh urah smo odstranili vodni hladilnik in bučko postavili na ledeno kopel. Med mešanjem smo po kapljicah dodali 1 M HCl (16 mL, 4 ekv. glede na TEA) in mešali še dodatno uro, dokler se ni izoboril produkt. Produkt smo odnučali, sprali z EtOH in tako izolirali spojino 13. Potek reakcije smo spremljali s TLC, istovetnost produkta pa potrdili z NMR (1H in 13C), MS, HRMS, HPLC in IR.
Rezultati
Videz: amorf bele barve Ttališče: 139-143 °C
MS (ESI+): m/z za C29H36N4O5 ([M + Na]+): izračunano 543,27; izmerjeno 543,8.
MS (ESI-): m/z za C29H36N4O5 ([M - H]-): izračunano 519,27; izmerjeno 519,8.
HRMS: m/z za C29H36N4O5 ([M + H]+): izračunano 521,2686; izmerjeno 521,27456.
HPLC: tvz. = 24,27 min; AUCt=24,27 min; λ= 214 nm = 96,45 %; AUCt=24,27 min; λ= 280 nm = 94,26 %
tstand.= 24,23 min; AUCt=24,23 min; λ= 214 nm = 97,53 %; AUCt=24,23 min; λ= 214 nm = 93,67 %
Izkoristek: η1 = 60,5 % (0,400 g)
27 Rf: 0,70 (MF: DKM/MeOH = 3/1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1,18 (s, 9H, CH3); 1,10-1,81 (m, 10H, CH2); 2,00 (m, 1H, CH); 3,17-3,28 (m, 2H, R1N-CH2-CH); 4,39 (m, 2H, R2N-CH2-CO); 5,13 (d, 1H, CO-CH-NH); 6,61 (d, 1H, J = 4 Hz, Har); 7,02 (dd, 1H, Har); 7,10 (m, 1H, Har); 7,22-7,36 (m, 3H, Har); 7,45-7,52 (m, 2H, Har); 7,98 (m, 1H, CH-NH-CONH); 9,04 (s, 1H, NHCO-NH- Ar); 12,86 (s, 1H, COOH).
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 26,41; 43,27; 49,78; 54,52; 57,29; 58,94; 118,69;
122,12; 122,67; 122,98; 123,13; 123,88; 127,37; 129,35; 131,73; 138,06; 140,76; 143,34;
154,48; 167,73; 170,86; 209,58.
IR (ATR): ν [cm-1] = 3336, 3111, 2926, 2854, 2602, 1726, 1676, 1643, 1310, 1559, 1495, 1461, 1435, 1384, 1313, 1212, 1107, 1077, 1046, 998, 889, 805, 757, 683, 646.
28
5 Razprava
5.1 Razprava k aromatski nukleofilni substituciji
Ker je komercialno dostopen reagent 1 že imel s terc-butoksikarbonilno skupino (Boc)
Ker je komercialno dostopen reagent 1 že imel s terc-butoksikarbonilno skupino (Boc)