Ni-NTA afinitetna kromatografija

Za namen izolacije smo proteine izražali v sevu E. coli BL21(DE3) pLysS, ter jih po ultrazvočnem razbijanju iz celičnega lizata očistili z nikelj-afinitetno (Ni-NTA) kromatografijo, ki je namenjena čiščenju proteinov s heksahistidinsko oznako. Čiščenje smo izvajali z gravitacijsko metodo ter uporabili polipropilenske kolonice Bio-Rad.

Vzorce za analizo na NaDS-PAGE gelu smo odvzeli v različnih korakih izolacije proteinov. Analizirali smo topno in netopno frakcijo, nevezana frakcija, sprana frakcija, elucijska frakcija po NiNTA-afinitetni kromatografiji ter vzorec po prekonočni dializi.

Morebitno obarjanje proteinov smo analizirali z nanosom na gel supernatant in usedlino po centrifugiranju sveže izoliranih proteinov po prekonočni dializi. Na slikah 7, 8, 9 in 10 so prikazani vzorci iz različnih stopenj izolacije proteinov. Proteine smo zaradi obsežne uporabe izolirali večkrat, na slikah so prikazani le posamezni primeri izolacij.

34

Slika 7: Primeri izolacije različic proteina PFO. Velikost PFO in različic je 55,7 kDa (označeno s puščico). S – proteinski standard Novex Sharp Unstained, SN – supernatant po centrifugiranju celičnega lizata (topna frakcija), P – usedlina po centrifugiranju celičnega lizata, resuspendirana v pufru z ureo (netopna frakcija), N – nevezana frakcija po NiNTA afinitetni kromatografiji, W – sprana frakcija po NiNTA afinitetni kromatografiji, E – elucija po NiNTA afinitetni kromatografiji, SN* – supernatant po centrifugiranju svežih izolatov po prekonočni dializi, P* – usedlina po centrifugiranju svežih izolatov po prekonočni dializi.

Slika 8: Primeri izolacije različic proteina PFO v fuziji z eGFP. Velikost PFO v fuziji z eGFP je 83 kDa (označeno s puščico). S – proteinski standard Novex Sharp Unstained, SN – supernatant po centrifugiranju celičnega lizata (topna frakcija), P – usedlina po centrifugiranju celičnega lizata, resuspendiran v pufru z ureo (netopna frakcija), N – nevezana frakcija po NiNTA afinitetni kromatografiji, W – sprana frakcija po NiNTA afinitetni kromatografiji, E – elucija po NiNTA afinitetni kromatografiji, SN* – supernatant po centrifugiranju svežih izolatov po prekonočni dializi, P* – usedlina po centrifugiranju svežih izolatov po prekonočni dializi.

35

Slika 9: Primeri izolacije D4 različic proteina PFO v fuziji z eGFP. Velikost D4 v fuziji z eGFP je 44 kDa (označeno s puščico). S: proteinski standard Novex Sharp Unstained, SN – supernatant po centrifugiranju celičnega lizata (topna frakcija), P – usedlina po centrifugiranju celičnega lizata, resuspendirana v pufru z ureo (netopna frakcija), N – nevezana frakcija po NiNTA afinitetni kromatografiji, W – sprana frakcija po NiNTA afinitetni kromatografiji, E – elucija po NiNTA afinitetni kromatografiji, SN* – supernatant po centrifugiranju svežih izolatov po prekonočni dializi, P* – usedlina po centrifugiranju svežih izolatov po prekonočni dializi.

Slika 10: Primeri izolacije D4 različic proteina PFO v fuziji z mCherry. Velikost D4 v fuziji z mCherry je 44 kDa (označeno s puščico). S – proteinski standard Novex Sharp Unstained, SN – supernatant po centrifugiranju celičnega lizata (topna frakcija), P – usedlina po centrifugiranju celičnega lizata, resuspendirana v pufru z ureo (netopna frakcija), N – nevezana frakcija po NiNTA afinitetni kromatografiji, W – sprana frakcija po NiNTA afinitetni kromatografiji, E – elucija po NiNTA afinitetni kromatografiji, SN* – supernatant po centrifugiranju svežih izolatov po prekonočni dializi, P* – usedlina po centrifugiranju svežih izolatov po prekonočni dializi.

Izolacija vseh proteinov je bila uspešna saj je v elucijski frakciji videti močno liso pričakovane velikosti, in sicer ~56 kDa za proteinske različice PFO (slika 7), ~83 kDa za proteinske različice PFO v fuziji z eGFP (slika 8), ter ~44 kDa za proteinske različice D4 PFO v fuziji z eGFP (slika 9) oz. mCherry (slika 10). Na gelih lahko vidimo, da so se vsi proteini po soniciranju bakterijskih celic nahajali tako v topni frakciji (vzorec S) kot v netopni frakciji (vzorec P). V netopni frakciji je bilo še posebej veliko proteinskih različic

36

eGFP_D4 (slika 9, vzorci P). Pojav proteina v celični usedlini je lahko posledica nepopolne ločitve supernatanta od usedline, lahko pa je tudi posledica nastanka inkluzijskih telesc. Iz vzorcev po nikelj-afinitetni kromatografiji vidimo, da je precej ciljnega proteina ostalo v nevezani frakciji, a kljub temu na gelu vidimo močno liso v elucijski frakciji. Po centrifugiranju svežih izolatov po prekonočni dializi smo opazili, da se določen delež očiščenega proteina pri vseh različicah PFO obori (vzorec P* na sliki 4 B in D), kar smo videli že s prostim očesom ter potrdili z NaDS-PAGE. To smo glede na večje število hidrofobnih ostankov v primerjavi z divjim tipom tudi pričakovali. Prisotnih je bilo tudi nekaj nečistot, ki smo jim pozneje tudi določili delež (po postopku 3.2.9). Po velikosti nečistot sklepamo, da gre v primeru fuzij za odcepljen fuzijski protein, saj lisa na gelu po velikosti ustreza eGFP (slika 8 in 9, vzorci E in SN*) oz. mCherry (slika 10, vzorci E in SN*). To predpostavko lahko podkrepi tudi prisotnost zelenega oz. rdečega ozadja, pri opazovanju proteinov pod konfokalnim mikroskopom (primer – poglavje 4.7, slika 38). Kot zanimivost smo opazili, da se je samo pri fuzijah z mCherry pojavila nečistota, ki po velikosti ustreza D4 (~11kDa) (slika 10, vzorci E in SN*). V skoraj vseh primerih je bil izkoristek izolacije divjega tipa slabši kot pri različicah (manjše razmerje želen protein : nečistote), kar nakazuje, da so le-te bolj stabilne od divjega tipa.

4.3.2 Čiščenje proteinov s kromatografijo z ločevanjem po velikosti

Zaradi prisotnosti nečistot po niklej-afinitetni kromatografiji smo se odločili za dodaten korak čiščenja proteinov s kromatografijo z ločevanjem po velikosti, pri čemer se, kot ime nakazuje, molekule ločujejo glede na velikost, saj se manjše molekule dlje zadržijo na gelskem nosilcu in se s kolone izločijo kasneje. S čiščenjem smo začeli z različicami D4 v fuziji z eGFP oz. mCherry in nadaljevali z različicami PFO. Čiščenje smo izvajali na 120 mL koloni polnjeni z gelskim nosilcem Superdex® 75, ki je kombinacija prečno premreženega dekstrana (Sephadex) in prečno premrežene agaroze. NaDS-PAGE z vzorci iz izbranih frakcij s pripadajočimi kromatogrami se nahajajo na slikah 11 – 15.

37

Slika 11: Kromatografija z ločevanjem po velikosti proteina eGFP_D4_WT. A) NaDS-PAGE vzorcev pred (vzorec P) in po izvedbi kromatografije (izbrane frakcije A2 – C13). B) Kromatogram po izvedbi kromatografije. Modra krivulja na kromatogramu predstavlja A280, na spodnji osi so z rdečimi črkami označene frakcije. Frakcije v modrem okvirčku na gelu in kromatogramu predstavljajo prvi vrh, v vijoličnem okvirčku pa drugi vrh.

Slika 12: Kromatografija z ločevanjem po velikosti proteina eGFP_D4_32. A) NaDS-PAGE vzorcev pred (vzorec P) in po izvedbi kromatografije (izbrane frakcije A3 – D14). B) Kromatogram po izvedbi kromatografije. Modra krivulja na kromatogramu predstavlja A280, na spodnji osi so z rdečimi črkami označene frakcije. Frakcije v rumenem okvirčku na gelu in kromatogramu predstavljajo prvi vrh, v zelenem okvirčku pa drugi vrh.

38

Slika 13: Kromatografija z ločevanjem po velikosti proteina eGFP_D4_50. A) NaDS-PAGE vzorcev pred (vzorec P) in po izvedbi kromatografije (izbrane frakcije A2 – A7). B) Kromatogram po izvedbi kromatografije. Modra krivulja na kromatogramu predstavlja A280, na spodnji osi so z rdečimi črkami označene frakcije. Frakcije v vijoličnem okvirčku na gelu in kromatogramu predstavljajo prvi vrh, v oranžnem okvirčku pa drugi vrh.

Slika 14: Kromatografija z ločevanjem po velikosti proteina mCherry_D4_WT. A) NaDS-PAGE vzorcev pred (vzorec P) in po izvedbi kromatografije (izbrane frakcije A3 – D15). B) Kromatogram po izvedbi kromatografije. Modra krivulja na kromatogramu predstavlja A280, na spodnji osi so z rdečimi črkami označene frakcije. Frakcije v vijoličnem okvirčku na gelu in kromatogramu predstavljajo prvi vrh, v zelenem okvirčku pa drugi vrh.

39

Slika 15: Kromatografija z ločevanjem po velikosti proteina PFO_32. A) NaDS-PAGE vzorcev pred (vzorec P) in po izvedbi kromatografije (izbrane frakcije A1 – C10). B) Kromatogram po izvedbi kromatografije. Modra krivulja na kromatogramu predstavlja A280, na spodnji osi so z rdečimi črkami označene frakcije. Frakcije v roza okvirčku na gelu in kromatogramu predstavljajo prvi vrh, v zelenem okvirčku pa drugi vrh.

Iz rezultatov je razvidno, da sta se v vseh primerih na kromatogramu pojavila dva izrazita vrhova. Frakcije pripadajočih vrhov smo analizirali na NaDS-PAGE, in sicer smo za nanos na gel izbrali frakcije, ki predstavljajo začetek, sredino in konec vrha. Na vsak gel smo za primerjavo v prvo jamico nanesli še vzorec proteina pred čiščenjem z gelsko kromatografijo. V vseh primerih je prvi vrh predstavljal tarčni protein in drugi vrh nečistote, saj so le te manjše po velikosti in se pozneje izločijo iz kolone. V primeru vseh vzorcev lahko pri vrhu, ki predstavlja tarčni protein, opazimo repičenje na desni strani vrha. Na NaDS-PAGE gelu so se v jamicah, kjer smo nanesli vzorce frakcij, ki predstavljajo rep vrha, pojavile lise velikosti, ki ustrezajo tarčnemu proteinu (44 kDa za fuzije D4 z eGFP oz. mCherry). Repičenje vrhov je lahko posledica sekundarnih interakcij z gelskim nosilcem, ki ne temeljijo le na izključitvi molekul po velikosti. Nabite močno polarne oz. hidrofobne molekule lahko interagirajo z gelskim nosilcem preko sekundarnih elektrostatskih, hidrofilnih ali hidrofobnih interakcij. V tem primeru ločevanje vključuje dva mehanizma, in sicer izključitev po velikosti ter sekundarne elektrostatske, hidrofilne ali hidrofobne interakcije. Kadar pride do tega, se na kromatogramu pojavi repičenje vrhov, ker je število adsorpcijskih mest, na katerih lahko pride do sekundarnih interakcij, omejeno (Goyon in sod., 2018). Ker so naši tarčni proteini močno hidrofobni, bi lahko prišlo do nastanka nespecifičnih hidrofobnih interakcij med tračnimi proteini in molekulami gelskega nosilca v koloni. Nastanek

40

sekundarnih interakcij bi lahko preprečili z uporabo pufra z večjo ionsko močjo oz. nižjim pH, pri čemer bi zagotovili popolno protonacijo stranskih skupin molekul gelskega nosilca. Po končani kromatografiji smo združili najbolj čiste frakcije in jih skoncentrirali z uporabo koncentratorja AmiconUltra.

Drugi vrh na vseh kromatogramih predstavlja nečistote v vzorcu. Pri proteinu eGFP_D4_WT na gelu (slika 12, A) vidimo, da so lise, ki predstavljajo vzorce iz frakcij nečistot bolj izrazite, kot lise tarčnega proteina. Prav tako je vrh na kromatogramu (slika 12, B), ki predstavlja nečistote, višji od vrha, ki predstavlja tarčni protein. Slednje pomeni, da je koncentracija nečistot v vzorcu bila veliko višja kot koncentracija tarčnega proteina, kar potrjujejo tudi rezultati kvantifikacije (poglavje 4.4, tabela 10). V jamicah, kjer smo nanesli frakcije prvega vrha, poleg lis pri velikosti tarčnega proteina (44 kDa) opazimo tudi nekaj lis pri večjih velikostih (~70 kDa). Na gelu opazimo tudi šibko liso velikosti tarčnega proteina v jamicah, kjer smo nanesli frakcije z nečistotami iz česa je razvidno, da ločba ni bila popolna. Po končani kromatografiji smo združili najbolj čiste frakcije in jih skoncentrirali z uporabo koncentratorja AmiconUltra.

Bolj popolno ločbo smo dosegli pri čiščenju različic eGFP_D4_32 in eGFP_D4_50 (sliki 11 in 12), saj sta le-ta vzorca bila bolj čista v primerjavi z divjim tipom že po Ni-NTA afinitetni kromatografiji. V teh dveh primerih je vrh na kromatogramu, ki predstavlja tarčni protein, višji od vrha, ki predstavlja nečistote. Koncentracija tarčnega proteina v vzorcih je bila višja od koncentracije nečistot, kar potrjujejo tudi rezulati kvantifikacije (poglavje 4.4, tabela 10). Na NaDS-PAGE je razvidno, da smo se popolnoma znebili spodnje lise pri velikosti ~33 kDa. V frakcijah tarčnega proteina so v obeh primerih videti blage, komaj opazne lise pri večjih velikostih, kot pri divjem tipu. Pri različici eGFP_D4_32 se je na kromatogramu med obema vrhovoma pojavil še majhen tretji vrh.

Po analizi na NaDS-PAGE smo ugotovili, da le-ta še vedno predstavlja tarčni protein (slika 11 A, vzorec C3). Lahko predpostavimo, da je na koloni prišlo do sekundarnih hidrofobnih interakcij z molekulami nosilca, zaradi česar se je nekaj proteina izločilo z zamikom. Po končani kromatografiji smo združili najbolj čiste frakcije in jih skoncentrirali z uporabo koncentratorja AmiconUltra.

Pri različici mCherry_D4_WT je v frakcijah prvega vrha, kjer se nahaja tarčni protein, še vedno opaziti nekaj nečistot – na gelu so zaznavne lise pri velikosti ~33 kDa (za katere sklepamo, da gre za odcepljen fuzijski partner) in ~11 kDa, vendar smo glede na začetni vzorec protein zadovoljivo očistili. Na kromatogramu je drugi vrh (nečistote) višji od prvega, kar lahko potrdimo tudi s kvantifikacijo proteina v poglavju 4.4 (tabela 11), saj je nečistot v vzorcu napram tarčnemu proteinu precej več. Na NaDS-PAGE opazimo tudi,

41

da se nekaj tarčnega proteina nahaja tudi v frakcijah med nečistotami, kar prav tako nakazuje, da nismo dosegli popolne ločbe. Po končani kromatografiji smo združili najbolj čiste frakcije in jih skoncentrirali z uporabo koncentratorja AmiconUltra.

Pri različici PFO_32, kjer gre za različico celega proteina PFO, na NaDS-PAGE po čiščenju z gelsko kromatografijo presenetljivo ni videti nobenih lis tarčnega proteina.

Opazna je le ena lisa v vzorcu frakcije drugega vrha (slika 14 A, vzorec C1), ter blage lise večjih velikosti, pri katerih gre za nečistote. Na kromatogramu lahko vidimo dva nizka vrhova, vendar je koncentracija proteinov po čiščenju bila tako nizka, da jih ne moremo videti na NaDS-PAGE. Ker smo ugotovili, da so se različice celega proteina PFO obarjale takoj po izolaciji, predvidevamo, da se je protein oboril pri potovanju skozi kolono ter kot oborina ostal na koloni. Do tega bi lahko prišlo zaradi povečane lokalne koncentracije proteina med ločevanjem. Zaradi povečanega števila hidrofobnih aminokislinskih ostankov so naši tarčni proteini še toliko bolj podvrženi agregaciji.

Zaradi takšnega rezultata nismo nadaljevali s čiščenjem ostalih različic celega proteina PFO.

42

4.4 Kvantifikacija izoliranih proteinov ter določanje njihove