S fluorescenčno konfokalno mikroskopijo smo opazovali vezavo fluorescenčno označenih proteinov na orjaške unilamelarne vezikle – GUV-e. Zanimala nas je vezava različic v primerjavi z divjim tipom PFO. Zaradi svoje velikosti, ki sega od 1 µm pa vse do 100 µm, GUV-i predstavljajo odličen modelni celični sistem in se uporabljajo pri študijah procesov, ki vključujejo lipidne membrane (Bhatia in sod., 2015). Pozitivna lastnost GUV-ov je tudi v tem, da lahko zelo natančno definiramo njihovo sestavo.
Pripravili smo jih po metodi elektroformacije. Za testiranje vezave proteinov smo uporabljali GUV-e z oz. brez holesterola. V nadaljevanju so prikazane slike konfokalne fluorescenčne mikroskopije GUV-ov pripravljenih iz POPCin iz POPC in 50 mol. % holesterola po dodatku proteinov.
Slika 28: Vezava in delovanje eGFP_PFO_WT na GUV-ih. Končna koncentracija proteina je 100 nM. Slike so zajete po 5 – 10 min inkubacije.POPC – i iz 100 % POPC, POPC:Hol – GUV-i GUV-iz POPC GUV-in 50 mol. % holesterola. SlGUV-ike na levGUV-i – rdeč sGUV-ignal rodamGUV-ina, slGUV-ike na sredGUV-inGUV-i – zelen signal eGFP-ja, slike na desni – združeni sliki rdečega in zelenega signala. Velikostno merilo na slikah predstavlja 50 µm.
57
Slika 2918: Vezava in delovanje eGFP_PFO_32 na GUV-ih. Končna koncentracija proteina je 100 nM. Slike so zajete po 5 – 10 min inkubacije.POPC – GUV-i iz 100 % POPC, POPC:Hol – GUV-i iz POPC in 30 mol. % holesterola.Slike na levi – rdeč signal rodamina, slike na sredini – zelen signal eGFP-ja, slike na desni – združeni sliki rdečega in zelenega signala. Velikostno merilo na slikah predstavlja 50 µm.
58
Slika 30: Vezava in delovanje eGFP_PFO_33 na GUV-ih. Končna koncentracija proteina je 100 nM. Slike so zajete po 5 – 10 min inkubacije.POPC – i iz 100 % POPC, POPC:Hol – GUV-i GUV-iz POPC GUV-in 30 mol. % holesterola.Slike na levi – rdeč signal rodamina, slike na sredini – zelen signal eGFP-ja, slike na desni – združeni sliki rdečega in zelenega signala. Velikostno merilo na slikah predstavlja 50 µm.
Na slikah 28, 29 in 30 lahko opazimo, da se število GUV-ov pripravljenih iz POPC in holesterola po dodatku divjega tipa in različic PFO občutno zmanjša, kar lahko interpretiramo kot posledico vezave proteinov in permeabilizacije GUV-ov. Ker smo želeli zajeti sliko, na kateri je vidna vezava proteinov na membrano, smo poskus ponovili z bolj stabilnimi vezikli iz arhejskih lipidov – arheosomov. Arheosomi so liposomi, ki v lipidni sestavi vsebujejo arhejske lipide. Le-ti so sestavljeni iz nasičenih izoprenoidnih verig, ki so z etrsko vezjo vezani s sn-2,3 mestom na glicerol, ki je veliko stabilnejša kot estrska vez pri bakterijah in evkariontih. Pripravili smo arheosome s 30 mol. % holesterola. Za pripravo veziklov iz arhejskih lipidov smo uporabili lipide iz termofilne arheje Aeropyrum pernix K1. Na GUV-ih iz arhejskih lipidov smo za začetek opazovali vezavo divjega tipa PFO v fuziji z eGFP (slika 31).
59
Slika 31: Delovanje eGFP_PFO_WT na arheosomih. Zgornje 3 slike predstavljajo GUV-e iz arhejskih lipidov s 30 mol. % holesterola brez dodanega proteina, spodnje 3 pa z dodanim proteinom v končni koncentraciji 100 nM. Slike na levi – rdeč signal rodamina, slike na sredini – zelen signal eGFP-ja, slike na desni – združeni sliki rdečega in zelenega signala. Velikostno merilo na slikah predstavlja 50 µm.
Na sliki 31 je jasno razvidno, da GUV-i iz arhejskih lipidov po dodatku divjega tipa PFO kljub večji stabilnosti praktično izginejo. Ker nam zaradi agresivnega delovanja različic celega proteina PFO ni uspelo zajeti slike vezave na veziklih, smo pripravili izolate posameznih D4 divjega tipa oz. različic v fuziji z eGFP in mCherry. Ker je za prepoznavo in vezavo na holesterol-vsebujoče membrane odgovorna le D4, smo ob odsotnosti domen 1, 2 in 3, ki so potrebne za vsidranje v membrano in permeabilizacijo, pričakovali obstoj GUV-ov ter vidno vezavo proteinov na njih. V nadaljevanju so prikazane slike konfokalne fluorescenčne mikroskopije GUV-ov iz POPC oz. 50 mol. % holesterola po dodatku proteinov, očiščenih z Ni-NTA afinitetno in kromatografijk z ločevanjem po velikosti (slika 32 – 35).
60
Slika 32: Vezava in delovanje eGFP_D4_WT na GUV-ih. Končna koncentracija proteina je 400 nM. Slike so zajete po ~10 min od dodatka proteina k veziklom.POPC – GUV-i iz 100 % POPC, POPC:Hol – GUV-i iz POPC in 50 mol. % holesterola. Slike na levi – rdeč signal rodamina, slike na sredini – zelen signal eGFP-ja, slike na desni – združeni sliki rdečega in zelenega signala.
Velikostno merilo na slikah predstavlja 50 µm.
61
Slika 3319: Vezava in delovanje eGFP_D4_32 na GUV-ih. Končna koncentracija proteina je 400 nM. Slike so zajete po ~10 min od dodatka proteina k veziklom.POPC – GUV-i iz 100 % POPC, POPC:Hol – GUV-i iz POPC in 50 mol. % holesterola. Slike na levi – rdeč signal rodamina, slike na sredini – zelen signal eGFP-ja, slike na desni – združeni sliki rdečega in zelenega signala.
Velikostno merilo na slikah predstavlja 50 µm.
62
Slika 3420: Vezava in delovanje eGFP_D4_33 na GUV-ih. Končna koncentracija proteina je 400 nM. Slike so zajete po ~10 min od dodatka proteina k veziklom.POPC – GUV-i iz 100 % POPC, POPC:Hol – GUV-i iz POPC in 50 mol. % holesterola. Slike na levi – rdeč signal rodamina, slike na sredini – zelen signal eGFP-ja, slike na desni – združeni sliki rdečega in zelenega signala.
Velikostno merilo na slikah predstavlja 50 µm.
63
Slika 35: Vezava in delovanje eGFP_D4_50 na GUV-ih. Končna koncentracija proteina je 400 nM. Slike so zajete po ~10 min od dodatka proteina k veziklom.POPC – GUV-i iz 100 % POPC, POPC:Hol – GUV-i iz POPC in 30 mol. % holesterola. Slike na levi – rdeč signal rodamina, slike na sredini – zelen signal eGFP-ja, slike na desni – združeni sliki rdečega in zelenega signala.
Velikostno merilo na slikah predstavlja 50 µm.
S konfokalno mikroskopijo z divjim tipom D4 ter različicami presenetljivo nismo videli vezave na GUV-ih s holesterolom, kar je v neskladju z rezultati testov vezave na MLV-je (sedimentacijski test), kMLV-jer so se proteini vezali na vezikle s holesterolom. Pri sedimentacijskih testih smo uporabljali proteine očiščene samo z Ni-NTA afinitetno kromatografijo, zato smo jih tudi lahko dodali v višji koncentraciji (2 – 3 µM). Dodaten korak čiščenja proteinov je znatno znižal njihove koncentracije, saj je najvišja koncentracija, pri kateri smo očiščene proteine lahko dodali GUV-om, bila skoraj 1000- krat nižja (400 nM). Zato smo se pri nadaljnjih eksperimentih mikroskopiranja odločili uporabiti proteine, pridobljene po Ni-NTA afinitetni kromatografiji, brez dodatnega koraka čiščenja. V nadaljevanju so prikazane slike konfokalne fluorescenčne mikroskopije GUV-ov iz POPC oz. 50 mol. % holesterola po dodatku proteinov, očiščenih z Ni-NTA afinitetno kromatografijo.
64
Slika 36: Vezava in delovanje eGFP_D4_WT na GUV-ih. Končna koncentracija proteina je 1 µM. Slike so zajete po ~5 min od dodatka proteina k veziklom.POPC – GUV-i iz 100 % POPC, POPC:Hol – GUV-i iz POPC in 50 mol. % holesterola. Slike na levi – rdeč signal rodamina, slike na sredini – zelen signal eGFP-ja, slike na desni – združeni sliki rdečega in zelenega signala.
Velikostno merilo na slikah predstavlja 50 µm.
65
Slika 37: Vezava in delovanje eGFP_D4_32 na GUV-ih. Končna koncentracija proteina je 3 µM (srednja vrstica) oz. 8 µM (zadnja vrstica). Slike so zajete po ~5 min od dodatka proteina k veziklom.POPC – GUV-i iz 100 % POPC, POPC:Hol – GUV-i iz POPC in 50 mol. % holesterola.
Slike na levi – rdeč signal rodamina, slike na sredini – zelen signal eGFP-ja, slike na desni – združeni sliki rdečega in zelenega signala. Velikostno merilo na slikah predstavlja 50 µm.
66
Slika 38: Vezava in delovanje eGFP_D4_33 na GUV-ih. Končna koncentracija proteina je 3 µM.
Slike so zajete po ~5 min od dodatka proteina k veziklom. POPC – GUV-i iz 100 % POPC, POPC:Hol – GUV-i iz POPC in 50 mol. % holesterola. Slike na levi – rdeč signal rodamina, slike na sredini – zelen signal eGFP-ja, slike na desni – združeni sliki rdečega in zelenega signala.
Velikostno merilo na slikah predstavlja 50 µm.
67
Slika 39: Vezava in delovanje eGFP_D4_50 na GUV-ih. Končna koncentracija proteina je 3 µM.
Slike so zajete po ~5 min od dodatka proteina k veziklom. POPC – GUV-i iz 100 % POPC, POPC:Hol – GUV-i iz POPC in 50 mol. % holesterola. Slike na levi – rdeč signal rodamina, slike na sredini – zelen signal eGFP-ja, slike na desni – združeni sliki rdečega in zelenega signala.
Velikostno merilo na slikah predstavlja 50 µm.
Na slikah 36, 37, 38 in 39 lahko vidimo, da so se na GUV-e vezali tako divji tip kot tudi vse različice D4, a z opazno razliko v načinu vezave. Pri divjem tipu (slika 36) lahko vidimo, da se je protein enakomerno vezal po celotni membrani vezikla, saj na zelenem kanalu (srednja slika POPC:Hol) celotna membrana GUV-ov enakomerno fluorescira zeleno. Nasprotno opazimo pri različicah, kjer nekateri deli membrane po dodatku proteina fluorescirajo zeleno močneje kot drugi. Najizrazitejšo razliko v vezavi opazimo pri različici 32 (slika 37, c = 3 μM), kjer so GUV-i s holesterolom po dodatku proteina
»zlepljeni« skupaj, vezava proteina po membrani pa neenakomerna. Slednje lahko še bolj izrazito opazimo pri višji koncentraciji (slika 35, c = 8 μM), a zanimivo vezikli pri tej koncentraciji niso »zlepljeni«. To je lahko tudi posledica manjšega števila GUV-ov s holesterolom v začetnem vzorcu. Na GUV-e se je v najmanjši meri vezala različica 33, a kljub temu je še vedno opaziti vezavo na GUV-e, saj na zelenem kanalu nekateri deli membrane fluorescirajo zeleno (slika 38). Pri testih vezave na MLV-je, kjer je koncentracija holesterola bila 50 mol. %, se različica 33 ni nič manj opazno vezala na MLV-je s holesterolom kot ostale različice (poglavje 4.6, slika 25). Pri sedimentacijskem testu je inkubacijski čas trajal 30 min, pri mikroskopiranju pa le 5 min, zato sklepamo, da različica 33 za vezavo morda potrebuje dlje časa ali pa višjo koncentracijo holesterola.
68
Pri različici 50 vidimo podobno neenakomerno vezavo na membrano kot pri različici 32 (slika 39). Rezultati so konsistentni s testi hemolize, saj se je najbolj hemolitično aktivna različica 32 tudi opazno največ vezala na GUV-e, pri hemolitično najmanj aktivni različici 33 pa opazimo najslabšo vezavo na GUV-e.
Zanimalo nas je tudi, ali imajo različice PFO oz. različice D4 prednost pri vezavi na membrane s holesterolom v primerjavi z divjim tipom. Zato smo v naslednjem eksperimentu vezave proteinov na GUV-e uporabili različice, označene z različnimi fluorescenčnimi proteini, in sicer eGFP in mCherry. V ločeni mikrocentrifugirki smo homogeno zmešali vzorca dveh različnih proteinov ter zmes po krajši inkubaciji dodali h GUV-om. Pri mešanicah proteinov smo vsakič uporabili divji tip D4, označen z mCherry, h kateremu smo dodali različico, označeno z eGFP. Z merjenjem rdečega (mCherry) oz.
zelenega (eGFP) signala smo opazovali vezavo proteinov na membrano GUV-ov.
Različice 33 pri tem eksperimentu nismo opazovali, saj so predhodni eksperimenti pokazali najslabšo vezavo glede na ostale različice. V nadaljevanju so prikazane slike konfokalne fluorescenčne mikroskopije GUV-ov s 50 mol. % holesterola po dodatku mešanice dveh proteinov (divji tip + različica), očiščenih z Ni-NTA afinitetno kromatografijo (slike 40 – 42).
Slika 40: Vezava in delovanje mCherry_D4_WT in eGFP_D4_WT na GUV-ih. Končna koncentracija obeh proteinov je 1 µM. Slike so zajete po ~5 min od dodatka proteinov k veziklom.
Vezikli so iz POPC in holestrerola v razmerju 1:1. Leva slika predstavlja rdeč signal mCherry-ja, slika na sredini predstavlja zelen signal eGFP-mCherry-ja, desna slika predstavlja združeni sliki.
Velikostno merilo na slikah predstavlja 50 µm.
69
Slika 41: Vezava in delovanje mCherry_D4_WT in eGFP_D4_32 na GUV-ih. Končna koncentracija divjega tipa je 1 µM, različice 32 pa 3 µM. Slike so zajete po ~5 min od dodatka proteinov k veziklom. Vezikli so iz POPC in holesterola 1:1. Leva slika predstavlja rdeč signal mCherry-ja, slika na sredini predstavlja zelen signal eGFP-ja, desna slika predstavlja združeni sliki. Velikostno merilo na slikah predstavlja 50 µm.
Slika 42: Vezava in delovanje mCherry_D4_WT in eGFP_D4_50 na GUV-e iz 50 mol. % holesterola. Končna koncentracija divjega tipa je 1 µM, različice 50 pa 3 µM. Slike so zajete po
~5 min od dodatka proteinov k veziklom. Vezikli so iz POPC in holesterola v razmerju 1:1. Leva slika predstavlja rdeč signal mCherry-ja, slika na sredini predstavlja zelen signal eGFP-ja, desna slika predstavlja združeni sliki. Velikostno merilo na slikah predstavlja 50 µm.
70
Z dodatkom dveh različno označenih različic D4 smo pod mikroskopom lahko opazovali vezavo obeh proteinov na membrano GUV-ov. V primeru dveh različno označenih divjih tipov opazimo, da se oba proteina enako vežeta na GUV-e, kar se lepo vidi na GUV-u, označenim s puščico (slika 40). Membrana GUV-ov enakomerno fluorescira tako na rdečem kot na zelenem kanalu, kar ni presenetljivo, saj gre za enak protein, ki je le označen z drugim fuzijskim partnerjem. V primeru dodatka različno označenih različic D4, pa lahko opazimo razliko v vezavi. V naslednjem poskusu smo veziklom dodali divji tip D4, označen z mCherry ter različico 32, označeno z eGFP. Na sliki 41 lahko opazimo karakteristično »zlepljene« vezikle, kar smo pri različici 32 opazili že v prejšnjih poskusih (slika 37). Kot zanimivo razliko v vezavi lahko vidimo, da ravno stiki membran dveh združenih veziklov fluorescirajo zeleno na zelenem kanalu (obkroženo v belem okvirju), na rdečem pa ne. Po drugi strani pa na isti sliki lahko opazimo osamljen GUV, ki enakomerno fluorescira na rdečem kanalu. Podobno enakomerno vezavo divjega tipa opazimo na GUV-ih spodnje slike (označeni s puščico). Nazadnje smo veziklom zraven divjega tipa dodali še različico 50. Na sliki 42 lahko opazimo bolj izrazit rdeč signal na membrani GUV-ov kot zelen, kar kaže, da ima divji tip prednost pri vezavi oz. se močneje veže na membrano.
S konfokalno mikroskopijo smo lahko podrobneje opazovali način vezave preučevanih proteinov na vezikle s holesterolom. Opazili smo razliko v vezavi med divjim tipom D4 in različicami, in sicer se divji tip za razliko od različic na vezikle veže precej enakomerno. To je še posebej izrazito pri različici 32, kjer so vezikli videti »zlepljeni«
skupaj.
71
5 Sklepi
V raziskovalnem delu smo uspešno pripravili genske konstrukte z zapisi za izbrane različice PFO in različice posameznih D4, označenih s fluorescenčnimi proteini. Vse izbrane različice so imele aminokislinske zamenjave v UDP, zanki L2 ter v holesterol-prepoznavnem motivu (CRM) v zanki L1. Rekombinantne proteine PFO smo uspešno pripravili z izražanjem v bakterijskem ekspresijskem sistemu E. coli in jih nato očistili z Ni-NTA afinitetno kromatografijo ter kromatografijo z ločevanjem po velikosti.
Z različicami celega toksina PFO smo izvajali teste hemolize, kjer smo dobili rezultate o vplivu aminokislinskih zamenjav na hemolitično aktivnost preučevanih proteinov.
Pokazali smo, da so vse različice, kljub aminokislinskim zamenjavam v take, ki imajo popolnoma drugačne biokemijske lastnosti, še vedno hemolitično aktivne. Ena izmed preučevanih različic, z zamenjavami v bolj hidrofobne aminokislinske ostanke v CRM (T490I, L491W), je celo bolj hemolitično aktivna od divjega tipa. S tem smo delno ovrgli hipotezo, da zamenjave evolucijsko ohranjenih aminokislinskih ostankov v D4 zmanjšajo hemolitično aktivnost preučevanih proteinov, saj je to veljalo za vse razen ene različice.
Z različicami posameznih D4 smo preučevali vezavo na vezikle s holesterolom. S testom vezave proteinov na multilamelarne vezikle s 50 mol. % holesterola smo pokazali, da se kljub zamenjavi aminokislinskih ostankov v CRM ohrani specifičnost vezave na holesterol. Razlike v količini vezave med različicami s to metodo nismo opazili. Z opazovanjem vezave proteinov na orjaške unilamelarne vezikle s 50 mol. % holesterola s pomočjo konfokalne mikroskopije smo poleg razlike v količini vezave opazili tudi razliko v načinu vezave med divjim tipom in različicami. Najizrazitejšo razliko smo opazili pri različici, ki je bila tudi najbolj hemolitično aktivna. Delno smo ovrgli hipotezo, da zamenjave evolucijsko ohranjenih aminokislinskih ostankov v D4 zmanjšajo vezavo na lipidne vezikle s holesterolom, saj je glede na rezultate konfokalne mikroskopije to veljalo za vse razen ene različice.
Pokazali smo, da se kljub aminokislinskim zamenjavam v domnevnem CRM pri različicah ohrani specifičnost vezave na holsterol-vsebujoče membrane in hemolitična aktivnost. Ker pa vse različice vsebujejo aminokislinske zamenjave na različnih mestih v zgradbi proteina, ne moremo izključiti medsebojnega vpliva posameznih mutacij.
73
6 Viri
Bakrač, B., Gutiérrez-Aguirre, I., Podlesek, Z., Sonnen, A. F. P., Gilbert, R. J. C., Maček, P., Lakey, J. H., & Anderluh, G. (2008). Molecular determinants of sphingomyelin specificity of a eukaryotic pore-forming toxin. Journal of Biological Chemistry, 283(27), 18665–18677. https://doi.org/10.1074/jbc.M708747200
Bavdek, A., Gekara, N. O., Priselac, D., Aguirre, I. G., Darji, A., Chakraborty, T., Maček, P., Lakey, J. H., Weisse, S., & Anderluh, G. (2007). Sterol and pH interdependence in the binding, oligomerization, and pore formation of listeriolysin O. Biochemistry, 46(14), 4425–4437. https://doi.org/10.1021/bi602497g
Beecher, D. J., & Wong, A. C. L. (1997). Tripartite hemolysin BL from Bacillus cereus.
Hemolytic analysis of component interactions and a model for its characteristic paradoxical zone phenomenon. Journal of Biological Chemistry, 272(1), 233–239.
https://doi.org/10.1074/jbc.272.1.233
Bhatia, T., Husen, P., Brewer, J., Bagatolli, L. A., Hansen, P. L., Ipsen, J. H., &
Mouritsen, O. G. (2015). Preparing giant unilamellar vesicles (GUVs) of complex lipid mixtures on demand: Mixing small unilamellar vesicles of compositionally heterogeneous mixtures. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes, 1848(12), 3175–3180. https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2015.09.020
Bischofberger, M., Iacovache, I., & Gisou Van Der Goot, F. (2012). Pathogenic pore-forming proteins: Function and host response. Cell Host and Microbe, 12(3), 266–
275. https://doi.org/10.1016/j.chom.2012.08.005
Cho, W., & Stahelin, R. V. (2005). Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, 34, 119–151. https://doi.org/10.1146/annurev.biophys.33.110502.133337
Cinelli, R. A. G., Ferrari, A., Pellegrini, V., Tyagi, M., Giacca, M., & Beltram, F. (2000).
The Enhanced Green Fluorescent Protein as a Tool for the Analysis of Protein Dynamics and Localization: Local Fluorescence Study at the Single-molecule Level.
Photochemistry and Photobiology, 71(6), 771. https://doi.org/10.1562/0031-8655(2000)071<0771:tegfpa>2.0.co;2
Dimitrov, D. S. (1986). Liposome Electro formation. 303–311.
Dowd, K. J., & Tweten, R. K. (2012). The cholesterol-dependent cytolysin signature motif: A critical element in the allosteric pathway that couples membrane binding to
pore assembly. PLoS Pathogens, 8(7), 44.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002787
Epand, R. M. (2006). Cholesterol and the interaction of proteins with membrane domains.
Progress in Lipid Research, 45(4), 279–294.
https://doi.org/10.1016/j.plipres.2006.02.001
Farrand, A. J., LaChapelle, S., Hotze, E. M., Johnson, A. E., & Tweten, R. K. (2010).
Only two amino acids are essential for cytolytic toxin recognition of cholesterol at the membrane surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, 107(9), 4341–4346.
https://doi.org/10.1073/pnas.0911581107
Fernández-Pérez, E. J., Sepúlveda, F. J., Peters, C., Bascuñán, D., Riffo-Lepe, N. O., González-Sanmiguel, J., Sánchez, S. A., Peoples, R. W., Vicente, B., & Aguayo, L.
G. (2018). Effect of cholesterol on membrane fluidity and association of Aβ oligomers and subsequent neuronal damage: A Double-Edged Sword. Frontiers in Aging Neuroscience, 10(AUG), 1–14. https://doi.org/10.3389/fnagi.2018.00226 Flanagan, J. J., Tweten, R. K., Johnson, A. E., & Heuck, A. P. (2009). Cholesterol
exposure at the membrane surface is necessary and sufficient to trigger perfringolysin O binding. Biochemistry, 48(18), 3977–3987.
https://doi.org/10.1021/bi9002309
Gilbert, R. J. C. (2010). Cholesterol-dependent cytolysins. Advances in Experimental Medicine and Biology, 677, 56–66. https://doi.org/10.1007/978-1-4419-6327-7_5 Goñi, F. M., Alonso, A., Bagatolli, L. A., Brown, R. E., Marsh, D., Prieto, M., & Thewalt,
J. L. (2008). Phase diagrams of lipid mixtures relevant to the study of membrane rafts. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids, 1781(11–12), 665–684. https://doi.org/10.1016/j.bbalip.2008.09.002
Goyon, A., Fekete, S., Beck, A., Veuthey, J. L., & Guillarme, D. (2018). Unraveling the mysteries of modern size exclusion chromatography - the way to achieve confident characterization of therapeutic proteins. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 1092, 368–378.
https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2018.06.029
Harris, J. R. (1988). Electron microscopy of cholesterol. Micron And Microscopica Acta, 19(1), 19–32. https://doi.org/10.1016/0739-6260(88)90037-8
Hayashi, T., & Su, T. (2010). Cholesterol Binding and Cholesterol Transport Proteins:
Cholesterol Binding and Cholesterol Transport …, 51, 381–398.
https://doi.org/10.1007/978-90-481-8622-8
Heuck, A. P., Hotze, E. M., Tweten, R. K., & Johnson, A. E. (2000). Mechanism of membrane insertion of a multimeric β-barrel protein: Perfringolysin O creates a pore using ordered and coupled conformational changes. Molecular Cell, 6(5), 1233–
1242. https://doi.org/10.1016/S1097-2765(00)00119-2
Heuck, A. P., Moe, P. C., & Johnson, B. B. (2010). The cholesterol-dependent cytolysin
75
family of gram-positive bacterial toxins. Sub-Cellular Biochemistry, 51(July), 551–
577. https://doi.org/10.1007/978-90-481-8622-8_20
Heuck, A. P., Savva, C. G., Holzenburg, A., & Johnson, A. E. (2007). Conformational changes that effect oligomerization and initiate pore formation are triggered throughout perfringolysin O upon binding to cholesterol. Journal of Biological Chemistry, 282(31), 22629–22637. https://doi.org/10.1074/jbc.M703207200
Hochuli, E., Bannwarth, W., Dobeli, H., Gentzi, R., & Stuber, D. (1988). Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent. Bio/Technology, 6(11), 1321–1325. https://doi.org/10.1038/nbt1188-1321
Hotze, E. M., Heuck, A. P., Czajkowsky, D. M., Shao, Z., Johnson, A. E., & Tweten, R.
K. (2002). Monomer-monomer interactions drive the prepore to pore conversion of
K. (2002). Monomer-monomer interactions drive the prepore to pore conversion of