Okviren potek izdelave in testiranja izdelanih vektorjev je prikazan na Sliki 4.
Slika 4: Shema izdelave in testiranja vektorja z dvema poročevalcema
3.2.1 Načrtovanje vektorja
Naĉrtovanje vektorja z dvema poroĉevalcema, digitalna restrikcija in manipulacija vseh uporabljenih sekvenc so bili opravljeni s prosto dostopnim programom NEBcutter, http://tools.neb.com/NEBcutter2/ (NEBCutter…, 2011), spletno stranjo Sequence Manipulation Suite, http://www.bioinformatics.org/sms2/ (Sequence…, 2011) in programom Microsoft Office Word.
3.2.2 Priprava LB gojišča
LB gojišĉe smo uporabljali za pomnoţevanje bakterij E. coli. 25 g LB gojišĉa v prahu smo raztopili v 1 l dH2O in 15 min avtoklavirali pri 121 °C. Do uporabe smo LB gojišĉe hranili na sobni temperaturi.
3.2.3 Priprava selektivnih LB agar plošč
Selektivna gojišĉa smo uporabljali za selekcijo uspešno transformiranih E. coli. 40 g LB agar praška smo raztopili v 1 l dH2O, dobro premešali in zavreli v mikrovalovni peĉici, da se je agar raztopil. Gojišĉe smo 15 min avtoklavirali pri 121 °C in nato termostatirali eno uro v kopeli pri 56 °C. Dodali smo antibiotik in dobro premešali. Uporabljali smo
kanamicin (50 µg/ml) in ampicilin (100 µg/ml), odvisno od plazmida, s katerim so bile transformirane E. coli. Gojišĉe smo vlili v plošĉe in poĉakali, da se je agar strdil. Plošĉe smo do uporabe shranili v hladilniku na 4 °C.
3.2.4 Transformacija kompetentnih E. coli s plazmidom
Za pomnoţevanje plazmidov smo uporabili kompetentne bakterije E. coli (One Shot TOP 10 Competent Cells, Invitrogen). Mikrocentrifugirko bakterij smo odtalili na ledu, dodali 0,3 µl plazmida (koncentracije cca: 0,5 µg/µl) in inkubirali na ledu 15 min. Sledil je toplotni šok 60 s v vodni kopeli pri 42 °C. Dodali smo 250 µl SOC gojišĉa in 45 min stresali na 290 vrt./min pri 37 °C. Tako tretirane bakterije smo razmazali na dve selektivni plošĉi z antibiotikom. Na prvo plošĉo smo razmazali 20 µl suspenzije E. coli in jo oznaĉili z LOW, na drugo pa 100 µl suspenzije in jo oznaĉili z HIGH. To je omogoĉilo, da smo vedno dobili posamezne dobro loĉene kolonije, ki jih je bilo nato moĉ klonirati. Plošĉi smo ĉez noĉ inkubirali na 37 °C.
3.2.5 Pomnoţevanje bakterij E. coli s plazmidom
Delo je potekalo aseptiĉno ob gorilniku. 20 ml LB gojišĉa smo prelili v 50-ml centrifugirko in mu dodali antibiotik (kanamicin 50 µg/ml in ampicilin 100 µg/ml), na katerega rezistenco je nosil izbrani plazmid. Gojišĉe smo dobro premešali in razdelili v štiri 15-ml centrifugirke, po 5 ml v vsako. S sterilnim zobotrebcem smo izbrano kolonijo na plošĉi prenesli v 15-ml centrifugirko s 5 ml LB gojišĉa z antibiotikom. Inokulirane centrifugirke smo ĉez noĉ stresali na 290 vrt./min pri 37 °C.
3.2.6 Izolacija plazmidne DNA I.
Ĉe smo izolacijo plazmidov opravljali po inokulaciji bakterij z ligacijskim produktom, smo uporabili naslednji postopek, ki ne vkljuĉuje uporabe kompleta za ĉišĉenje. Po pomnoţevanju bakterij E. coli s plazmidom smo inokulirane centrifugirke 30 min centrifugirali na 3500 vrt./min, odlili supernatant in pelet resuspendirali v 250 µl pufra Al1. Suspenzijo bakterij smo prenesli v 1,5-ml centrifugirko, dodali 250 µl pufra A2, premešali in 5 min inkubirali na sobni temperaturi. Delovanje pufra Al2 smo inhibirali z dodatkom 300 µl pufra Al3. Centrifugirke smo premešali z obraĉanjem in jih nato 5 min centrifugirali pri 11000 x g. Supernatant smo prenesli v novo 1,5-ml centrifugirko, pelet smo zavrgli. Ponovili smo 5 min centrifugiranje pri 11000 x g in ponovno prenesli supernatant v novo 1,5-ml centrifugirko. Pelet smo zavrgli. Supernatantu smo dodali 1 ml 100 % izopropanola in inkubirali 30–60 min pri –20 °C. Sledilo je 10 min centrifugiranje pri 14000 x g pri 4 °C. Odstranili smo supernatant, peletu dodali 1 ml 70 % etanola in vorteksirali. Suspenzijo smo ponovno 10 min centrifugirali pri 14000 x g pri 4 °C.
Supernatant smo odlili in pelet posušili na zraku v 15–20 min. Posušen pelet smo raztopili v 42 µl H2O.
Sestavine pufrov:
Al1 – pufer za alkalno lizo 1 50 mM glukoze
25 mM Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM EDTA (pH 8,0) Al2 – pufer za alkalno lizo 2
0,2 N NaOH 1 % (m/v) SDS Al3 – pufer za alkalno lizo 3
5 M kalijev acetat 60,0 ml ledocetna kilsina 11,5 ml H2O 28,5 ml II.
Za izolacijo plazmida iz bakterij E. coli smo uporabili komplet NucleoSpin® Plasmid podjetja Macherey-Nagel po priloţenem protokolu.
Inokulirane centrifugirke po koraku pomnoţevanja bakterij E. coli s plazmidom smo 30 min centrifugirali na 3500 vrt./min, odlili supernatant in pelet resuspendirali v 250 µl pufra A1. Suspenzijo bakterij smo prenesli v 1,5-ml centrifugirko, dodali 250 µl pufra A2, premešali in 5 min inkubirali na sobni temperaturi. Delovanje pufra A2 smo inhibirali z dodatkom 300 µl pufra A3. Centrifugirke smo premešali z obraĉanjem in jih nato 5 min centrifugirali pri 11000 x g. Supernatant smo prenesli na NucleoSpin® Plasmid kolono in 1 min centrifugirali pri 11000 x g. Eluat smo zavrgli in kolono sprali z 600 µl pufra A4 pri 11000 x g za 1 min. Eluat smo ponovno zavrgli. Kolono smo posušili s 5 min centrifugiranjem pri 11000 x g. Plazmidno DNA smo 5 min eluirali v 42 µl tople H2O pri 11000 x g. Na napravi NanoDrop smo izmerili koncentracijo plazmidne DNA, nato pa jo do uporabe shranili pri –20 °C.
Glede na protokol v knjiţici smo spremenili samo zadnji korak (elucija DNA), saj smo namesto predlaganega AE pufra uporabili H2O kakovosti PCR, segreto na 50 °C.
3.2.7 Restrikcijska razgradnja plazmidne DNA
V 0,2-ml mikrocentrifugirki smo zamešali naslednje reakcijske komponente: plazmidno DNA, restrikcijski pufer, restrikcijski encim (pogosto smo dodali dva razliĉna encima hkrati), BSA, nato smo s H2O zapolnili do ţelenega volumna. Koliĉine posameznih komponent so bile od reakcije do reakcije razliĉne, saj so odvisne od koncentracije in mase plazmidne DNA, koncentracije in aktivnosti encimov. Reakcijsko mešanico smo inkubirali 1,5 h pri 37 °C. Primer reakcije prikazuje Preglednica 9.
Preglednica 9: Primer reakcije z dvema restrikcijskima encimoma Plazmidna DNA (pAcGFP1-N1; c = 0,403 µg/µl) 25,0 µl
Encim BamHI 2,0 µl
Encim NotI 4,0 µl
Restrikcijski pufer 10X NEBuffer 3 5,0 µl
100 X BSA 2,0 µl
H2O ĉistote PCR 12,0 µl
Skupni volumen 50,0 µl
3.2.8 Priprava 1 % agaroznega gela za elektroforezo
1 g agaroze smo raztopili v 100 ml TAE pufra in veĉkrat zavreli v mikrovalovki, da se je agaroza popolnoma raztopila. Raztopino smo nekoliko ohladili, dodali 5 µl EtBr in jo vlili v kad z glavniĉkom, ki doloĉa število in velikost ţepkov v gelu. Ko se je gel strdil, smo ga namoĉili v TAE pufer v elektroforezni kadi in izvlekli glavniĉek. Gel je bil tako pripravljen za uporabo.
3.2.9 Nanašanje vzorcev na agarozni gel
Pred nanosom vzorcev z DNA (po restrikciji in korakih, ki modificirajo konce DNA) smo vzorcem dodali nanašalni pufer (1/6 skupnega volumna). Na gel smo – glede na namen – nanašali od 5 µl do 50 µl vzorcev. V prvi ţepek na gelu smo vedno dodali 2log DNA lestev, ki nam je sluţila kot oznaĉevalec velikosti z restrikcijo dobljenih DNA fragmentov.
3.2.10 Zapolnjevanje lepljivih 5´ koncev DNA
Po konĉani restrikcijski razgradnji smo v mikrocentrifugirko dodali 10 X restrikcijski pufer (do konĉne koncentracije 1 X), mešanico dNTP-jev (do konĉne koncentracije 33 µM), DNA polimerazo I, nato smo s H2O ĉistote PCR zapolnili do ţelenega volumna. Mešanico smo inkubirali toĉno 15 min na sobni temperaturi. Sledil je korak deaktivacije aktivnosti DNA polimeraze I z dodatkom EDTA (do konĉne koncentracije 10 mM) in inkubacijo za 20 min pri 75 °C. DNA smo oĉistili s kompletom ragentov NucleoSpin® Extract II.
3.2.11 Odstranjevanje 5´ lepljivih koncev DNA
Ker smo odstranjevanje 5´ lepljivih koncev uporabljali samo po restrikcijskih reakcijah, ki so potekale v restrikcisjkih pufrih NEBuffer 1, 2 ali 4, ĉišĉenje DNA ni bilo potrebno. Po konĉani restrikcijski razgradnji smo v mikrocentrifugirko dodali 10 X restrikcijski pufer (do konĉne koncentracije 1 X), Mung Bean nukleazo in toliko H2O ĉistote PCR, da je bila konĉna koncentracija DNA enaka ali manjša od 0,1 µg/µl. Mešanico smo inkubirali 30 min pri 30 °C. Aktivnost Mung Bean nukleaze smo inhibirali z dodatkom SDS do konĉne avtoligacijo veĉjega fragmenta DNA. Odstranjevanje konĉnih fosfatov smo izvedli takoj po restrikciji oziroma po zapolnjevanju oziroma odstranjevanju 5´ lepljivih koncev DNA.
Ĉišĉenje DNA ni bilo potrebno, ĉe je restrikcija, po kateri smo odstranjevali konĉne fosfate, potekala v restrikcijskih pufrih NEBuffer 2, 3 ali 4. Ĉe je restrikcija potekala v NEBuffer 1 smo pred odstranjevanjem konĉnih fosfatov opravili korak ĉišĉenja plazmidne DNA. V mikrocentrifugirko, v kateri je potekala restrikcija, smo dodali 1 µl fosfataze iz teleĉjega ţelodca (CIP) in inkubirali 1 h pri 37 °C.
3.2.13 Izrezovanje DNA fragmentov iz agaroznega gela
Gel smo pred razrezom fotografirali z napravo Kodak Image Station. V zatemnjenem prostoru smo si pod luĉjo s kratkimi UV valovi gel ogledali, da smo doloĉili poloţaj izbranih DNA fragmentov. S sterilno britvico smo izrezali pas z ţelenim fragmentom DNA. Izpostavitev DNA UV ţarkom smo poskušali ĉim bolj zmanjšati, zato smo luĉ med potezami z britvico ugašali. Izrezani košĉek gela smo do ĉišĉenja spravili v 1,5-ml centrifugirki.
3.2.14 Čiščenje plazmidne DNA
DNA smo med koraki, ki so to zahtevali, oĉistili s kompletom reagentov NucleoSpin®
Extract II podjetja Macherey-Nagel, po dveh protokolih:
Po izrezovanju iz agaroznega gela smo košĉek gela z izbranim DNA fragmentom stehtali in mu dodali 200 µl NT pufra na 100 mg gela. Gel smo raztopili v pufru tako, da smo mikrocentrifugirko s pufrom in gelom 5–10 min inkubirali na 50 °C in jo obĉasno pretresli.
Raztopino smo nanesli na NucleoSpin® Exctract II kolono in centrifugirali 1 min pri 11000 x g. Eluat smo zavrgli, kolono sprali s 700 µl NT3 pufra in 1 min centrifugirali pri 11000 x g. Eluat smo zopet zavrgli. Kolono smo posušili s 5 min centrifugiranjem pri
11000 x g. Plazmidno DNA smo 5 min eluirali v 15–42 µl tople H2O pri 11000 x g. Na napravi NanoDrop smo izmerili koncentracijo plazmidne DNA, nato pa jo do uporabe shranili pri –20 °C.
Po vseh ostalih korakih pa smo vzorcu dodali NT pufer (dvakratni volumen vzorca).
Raztopino smo nanesli na NucleoSpin® Exctract II kolono in centrifugirali 1 min pri 11000 x g. Eluat smo zavrgli, kolono sprali z 700 µl NT3 pufra in centrifugirali 1 min pri 11000 x g. Eluat smo zopet zavrgli. Kolono smo posušili s 5 min centrifugiranjem pri 11000 x g. Plazmidno DNA smo 5 min eluirali v 15–42 µl tople H2O pri 11000 x g. Na napravi NanoDrop smo izmerili koncentracijo plazmidne DNA, nato pa jo do uporabe shranili pri –20 °C.
3.2.15 Ligacija
Prvi korak je bil izraĉun molarnih razmerij vektorja (veĉjega fragmenta, ki nosi zapis za rezistenco na antibiotik) in inserta (manjši fragment, ki ga ţelimo vgraditi v vektor). Enote velikosti posameznih DNA fragmentov so bazni pari (bp). Izraĉunali smo, kolikokrat je vektor veĉji od inserta, in tako dobili faktor X. Maso uporabljenega vektorja smo nato delili z faktorjem X. Vedno smo uporabili 20 ng vektorja. Kvocient nam je povedal maso inserta, ĉe bi ţeleli imeti molarno razmerje med vektorjem in insertom 1 : 1. Ker smo ţeleli, da je molarno razmerje med vektorjem in insertom 1 : 3, smo kvocient pomnoţili s 3 in tako dobili maso inserta v ng, ki smo jo nato uporabili v ligaciji. V Preglednici 10 je
Vedno smo poleg ligacijske reakcije nastavili še slepo reakcijo. V tej v reakcijski mešanici ni bilo inserta. Slepa ligacija je sluţila za oceno samoligacije vektorja.
Mešanici (ligacija in slepa ligacija) smo inkubirali na sobni temperaturi ĉez noĉ.
3.2.16 Transformacija kompetentnih E. coli s produktom ligacije
Na ledu smo odtalili vialo kompetentnih E. coli, dodali 5 µl ligacijske reakcije/slepe ligacije (po konĉani inkubaciji) in inkubirali na ledu 15–30 min. Sledil je toplonti šok, 60 s inkubacija pri 42 °C. Takoj zatem smo vialo ohladili na ledu in dodali 250 µl SOC gojišĉa.
Od tu naprej je bil postopek enak transformaciji kompetentnih E. coli z plazmidom.
3.2.17 Merjenje koncentracij DNA ali RNA
Za merjenje koncentracije nukleinskih kislin smo uporabljali spektrofotometer NanoDrop® 2000, proizvajalca Thermo Scientific.
3.2.18 Fotografiranje agaroznih gelov
Za zajem in vizualizacijo DNA fragmentov, loĉenih po velikosti z elektroforezo, smo uporabljali KODAK Image Station 4000 in program KODAK Molecular Imaging Software, Version 4.0.
3.3 POSTOPKI UPORABJENI ZA OCENO FUNKCIONALNOSTI VEKTORJEV