Hemoliza je liza eritrocitov, tj. prekinitev celične membrane in izlitje celične vsebine v zunajcelično okolico. Perfringolizin O tvori pore na eritrocitih, saj le-ti vsebujejo holesterol v membrani, zato je hemolitično aktiven protein. Zanimal nas je vpliv aminokislinskih zamenjav na hemolitično aktivnost izbranih različic v primerjavi z divjim tipom PFO. Testi hemolize slonijo na dejstvu, da se absorbanca suspenzije eritrocitov pri valovni dolžini 630 nm (A630) zniža v primeru, kadar poteče liza eritrocitov (Beecher in Wong, 1997). Hemolitično aktivnost proteinov smo merili posredno preko merjenja turbidance suspenzije govejih eritrocitov po dodatku proteinov pri 630 nm (pH 7,4, 25
°C).
47
Slika 21: Kinetika hemolitične aktivnosti PFO_WT in izbranih različic. Grafi predstavljajo A630
v odvisnosti od časa prvih 10 minut po začetku meritve pri štirih izbranih koncentracijah, in sicer A) 250 nM, B) 62,5 nM, C) 15,6 nM in D) 3,9 nM. Modra krivulja predstavlja kinetiko proteina PFO_WT, oranžna krivulja PFO_32 siva krivulja PFO_33 in rumena krivulja PFO_50.
Na sliki 21 so prikazani grafi kinetike hemolitične aktivnosti divjega tipa PFO in njegovih različic pri štirih izbranih koncentracijah. Prikazana je A630 v odvisnosti od časa. Pri najvišji koncentraciji (250 nM, slika 21, A) lahko vidimo, da sta različici 32 in 50 celo bolj aktivni od divjega tipa, saj A630 hitreje pada. Različica 33 je pri tej koncentraciji podobno aktivna kot divji tip, saj krivulji skoraj sovpadata. Pri nižji koncentraciji (62,5 nM, slika 21, B) pa vidimo, da aktivnost različice 33 najhitreje pojenja, medtem ko je različica 32 še vedno bolj aktivna od divjega tipa. Aktivnost različice 50 se je pri tej koncentraciji prav tako zmanjšala, in sicer sedaj skoraj sovpada s krivuljo divjega tipa.
Pri še nižji koncentraciji (15,6 nM, slika 21, C) vidimo, da različica 33 sploh ni več aktivna, saj se vse točke krivulje nahajajo okoli vrednosti 0,5, na katero je bila umerjena suspenzija eritrocitov. Aktivnost preostalih dveh različic pa prav tako pojenja, in sicer je sedaj divji tip najbolj aktiven protein. Pri najnižji prikazani koncentraciji na grafu vidimo, da so praktično vse različice izgubile aktivnost, medtem ko je divji tip še vedno aktiven.
48
Iz teh rezultatov lahko zaključimo, da je pri višjih koncentracijah najaktivnejša različica 32 in to celo bolj od divjega tipa, vendar z nižanjem koncentracije začne izgubljati aktivnost, medtem ko je divji tip aktiven tudi pri zelo nizkih koncentracijah. Prav tako je pri višjih koncentracijah zelo aktivna različica 50, vendar tudi njena aktivnost pri nižjih koncentracijah začne upadati. Kot najmanj aktivna se je pokazala različica 33, katera začne izgubljati aktivnost pri najvišjih koncentracijah glede na ostale preučevane proteine.
Slika 22: Na grafu je prikazana maksimalna hitrost hemolize (Vmax) v odvisnosti od koncentracije proteina. Vmax je podana kot A630 na minuto in preračunana v programu Gen5 iz treh točk s pomočjo linearne regresije. Modra krivulja predstavlja kinetiko proteina PFO_WT, oranžna krivulja PFO_32, siva krivulja PFO_33 in rumena krivulja PFO_50.
Kinetiko hemolitične aktivnosti smo prikazali še kot odvisnost maksimalne hitrosti hemolize (Vmax) od koncentracije proteina (slika 22). Hemoliza je učinkovitejša kadar je maksimalna hitrost dosežena pri nižjih koncentracijah. Višja kot je maksimalna hitrost, tem aktivnejši je protein. Vmax je podana kot A630 na minuto in je preračunana v programu Gen5.1 iz treh točk s pomočjo liearne regresije. Prikazani rezultati so povprečje treh neodvisnih meritev. Povprečja in standardni odkloni teh meritev so prikazani v tabelah 13 – 16.
49 Tabela 13: Vmax/c za protein PFO_WT.
c [nM] Vmax
Tabela 14: Vmax/c za protein PFO_32.
c [nM] Vmax
Tabela 15: Vmax/c za protein PFO_33.
c [nM] Vmax
Tabela 16: Vmax/c za protein PFO_50.
c [nM] Vmax
50
Divji tip PFO je pri nižjih koncentracijah hemolitično aktivnejši od različic (slika 22).
Maksimalna hitrost različic 32 in 50 pa je višja od le-te divjega tipa pri višjih koncentracijah, pri čemer se je različica 32 znova pokazala kot najbolj aktivna. Prav tako je hemolitična aktivnost različice 33 tudi v tem primeru najnižja. Pri različicah 32 in 50 na grafu opazimo, da pride do nasičenja signala – Vmax je pri višjih koncentracijah nižja, kot pri nižjih koncentracijah. Slednje pomeni, da je hemoliza potekala hitreje, kot je metoda merjenja bila sposobna zaznati. Nasičenje signala bi v idealnem primeru doseglo plato, v našem primeru pa se krivulja obrne navzdol, zato pri analizi različic 32 in 50 zaradi nasičenja signala nismo upoštevali točke pri najvišji koncentraciji.
Krivulje odvisnosti maksimalne hitrosti hemolize od koncentracije proteina(slika 22) smo analizirali v programu OriginPro 8.5 in jim prilegali logistično funkcijo tako, da smo dobili podatek o koncentraciji proteina, pri kateri je hitrost hemolize polovična (vrednost c50). Recipročne vrednosti c50 predstavljajo relativno aktivnost glede na PFO WT in so prikazane v tabeli 17.
Tabela 17: Preračunane c50 proteinov PFO_WT in njegovih različic ter delež hemolitične aktivnosti glede na PFO_WT.
OZNAKA PROTEINA c50 [nM] Delež aktivnosti PFO_WT
PFO_WT 25,1 ± 6,3 100 %
PFO_32 22,3 ± 5,2 112,6 %
PFO_33 164,0 ± 43,1 15,3 %
PFO_50 34,7 ± 6,1 72,3 %
Z analizo rezultatov hemolitične aktivnosti smo prišli do zanimivih in pomembnih ugotovitev, saj lahko iz rezultatov vidimo, da so vse različice ohranile hemolitično aktivnost. Pri različicah se ena izmed aminokislinskih zamenjav nahaja v ohranjenem UDP-ju. Iz prejšnjih raziskav je znano, da UDP pri začetni interakciji z tarčno membrano nima bistvenega vpliva, temveč je pomemben pri alosteričnem sklapljanju vezave na membrano in nadaljnjem nastanku kompleksa pore (Soltani in sod., 2007). Zamenjava aminokislinskega ostanka R468 v prejšnjih študijah je pokazala zmanjšanje hemolitične aktivnost proteinske različice za približno 100-krat (Dowd in Tweten, 2012). V našem primeru so proteinske različice imele aminokislinsko zamenjavo v UDP-ju na mestu 458, in sicer iz glutaminske kisline v Ala ali Val, vendar ne moremo izključiti vpliva drugih zamenjav. Vse izmed različic so imele aminokislinsko zamenjavo v zanki L2 na mestu 401, in sicer iz Ala v Trp, ki je velik hidrofobni ostanek. L2 se skupaj z L3, po prepoznavi
51
holesterola preko CRM v L1, vstavi v membrano ter stabilizira vezavo tako, da se monomer PFO orientira pravokotno na membrano. Pri aktinoporinih je začetna vezava na membrano odvisna od interakcij hidrofobnih aminokislinskih ostankov (Bakrač in sod., 2008), iz česar lahko sklepamo, da bi lahko v našem primeru zamenjava Ala v Trp omogočila lažjo vezavo PFO na membrano. Na ta način bi se lahko zanka L2 pri različicah PFO z zamenjavami A401W bistveno lažje vstavila v membrano.
Še posebej zanimiva ugotovitev je, da so vse različice kljub aminokislinskim zamenjavam v predlaganem CRM (T490/L491, PDB ID: 1PFO) ohranile hemolitično aktivnost, še več; ena izmed različic je bila celo bolj aktivna od divjega tipa. CRM je vključen v začetno interakcijo PFO s holesterolom v tarčni membrani in je ohranjen pri pripadnikih družine CDC (Farrand in sod., 2010). Dosedanje študije so pokazale, da niti zamenjave aminokislinskih ostankov v take, ki imajo podobne biokemijske lastnosti (T490S, L491I in L491V), močno zmanjšajo hemolitično aktivnost PFO (Farrand in sod., 2010). V našem primeru imajo različice v CRM zamenjave aminokislinskih ostankov v take, ki imajo popolnoma drugačne biokemijske lastnosti. Različica PFO_32 ima na mestu 490 namesto polarne hidrofobno aminokislino (T490I) ter na mestu 491 hidrofobno aminokislino z indolnim aromatskim obročem namesto izobutilne stranske verige (L491W). Ta kombinacija zamenjav aminokislin bistveno vpliva na hemolitično aktivnost; rezultati meritev hemolize pri tej različici so pokazale 112,6 % aktivnosti glede na aktivnost divjega tipa PFO. Druga najbolj aktivna različica je bila PFO_50 z 72,3 % aktivnosti divjega tipa PFO. V tem primeru gre prav tako za zamenjavo polarne aminokisline s hidrofobno (T490A) ter zamenjavo aminokisline z razvejano stransko skupino za aminokislino s ciklično stransko skupino (L491F). Za najmanj aktivno se je izkazala različica PFO_33, z le 15,3 % aktivnosti divjega tipa PFO. Pri slednji je v CRM zamenjava polarne za hidrofobno aminokislino (T490V) ter zamenjava aminokisline z razvejano stransko skupino za aminokislino, ki ima za stransko skupino pirolidinski obroč (L491P). Ker sta se različici z bolj hidrofobnimi aminokislinskimi ostanki v CRM izkazali za bolj aktivni (32 in 50), lahko sklepamo, da bolj hidrofobne aminokisline v CRM na nek način olajšajo bodisi vezavo na membrano, bodisi vgradnjo proteina v lipidni dvosloj. Najbolj aktivna različica PFO_32 je prav tako edina, ki ima v UDP na mestu 458 Ala namesto Val (kot imata različici 33 in 50). Iz slednega bi lahko sklepali, da je ta aminokislinska zamenjava najbolj ugodna za vezavo na membrano ob spremembi konformacijskega stanja proteina PFO.
52