Test vezave proteinov na MLV-je (imenovan tudi sedimentacijski test) temelji na posedanju lipidnih veziklov in nanje vezanih proteinov pri visoki hitrosti centrifugiranja (Zhao in Lappalainen, 2012). Uporabili smo MLV-je iz 100 % POPC (negativna kontrola) ter POPC:Hol v molarnem razmerju 1:1. Preverjali smo vezavo D4 v fuziji z eGFP, katere smo v nadaljnih poskusih opazovali tudi pod konfokalnim mikroskopom. D4 divjega tipa smo uporabili kot pozitivno kontrolo. Protein, inkubiran brez veziklov, a tretiran enako kot ostali vzorci, je služil kot kontrola morebitne izgube proteina med centrifugiranjem in spiranjem. Na NaDS-PAGE gel smo nanesli vzorce supernatanta in usedline; če se je pod jamico na gelu, kjer smo nanesli vzorec usedline, pojavila izrazita lisa velikosti, ki ustreza tarčnemu proteinu, se je le-ta vezal na vezikle. S programom iBright Analysis Software smo z analizo lis vzorcev supernatanta in usedline preračunali delež nevezanih ter vezanih proteinov. Rezultati so podani kot povprečje treh neodvisnih ponovitev, zraven pa je podana absolutna napaka.
Tabela 18: Delež proteina eGFP_D4_WT po sedimentacijskem testu. Unstained, 1: netretiran protein, 2: supernatant po tretiranju proteina brez MLV-jev, 3: usedlina po tretiranju proteina brez MLV-jev, 4: supernatant po tretiranju proteina z vezikli brez holesterola (100 % POPC), 5: usedlina po tretiranju proteina z vezikli brez holesterola (100 % POPC), 6: supernatant po tretiranju proteina z vezikli s 50 % holesterola (POPC:Hol = 1:1), 7:
usedlina po tretiranju proteina s 50 % holesterola (POPC:Hol = 1:1). V prvo jamico na vsakem gelu smo dodali vzorec netretiranega proteina. Široke lise, ki se nahajajo na dnu gelov predstavljajo vezikle.
53
Tabela 19: Delež proteina eGFP_D4_32 v
supernatantu in usedlini po sedimentacijskem testu.
Slika 24: Test vezave eGFP_D4_32 na MLV-je. S: proteinski standard Novex Sharp Unstained, 1: netretiran protein, 2: supernatant po tretiranju proteina brez MLV-jev, 3: usedlina po tretiranju proteina brez MLV-jev, 4: supernatant po tretiranju proteina z vezikli brez holesterola (100 % POPC), 5: usedlina po tretiranju proteina z vezikli brez holesterola (100 % POPC), 6: supernatant po tretiranju proteina z vezikli s 50 % holesterola (POPC:Hol = 1:1), 7: usedlina po tretiranju proteina z vezikli s 50 % holesterola (POPC:Hol = 1:1). V prvo jamico na vsakem gelu smo dodali vzorec netretiranega proteina. Široke lise, ki se nahajajo na dnu gelov predstavljajo vezikle.
Tabela 20: Delež proteina eGFP_D4_33 v
supernatantu in usedlini po sedimentacijskem testu.
MLV SUPERNATANT PELET
Slika 25: Test vezave eGFP_D4_33 na MLV-je. S: proteinski standard Novex Sharp Unstained, 1: netretiran protein, 2: supernatant po tretiranju proteina brez MLV-jev, 3: usedlina po tretiranju proteina brez MLV-jev, 4: supernatant po tretiranju proteina z vezikli brez holesterola (100 % POPC), 5: usedlina po tretiranju proteina z vezikli brez holesterola (100 % POPC), 6: supernatant po tretiranju proteina z vezikli s 50 % holesterola (POPC:Hol = 1:1), 7: usedlina po tretiranju proteina z vezikli s 50 % holesterola (POPC:Hol = 1:1). V prvo jamico na vsakem gelu smo dodali vzorec netretiranega proteina. Široke lise, ki se nahajajo na dnu gelov predstavljajo vezikle.
54
Tabela 21: Delež proteina eGFP_D4_50 v
supernatantu in usedlini po sedimentacijskem testu.
MLV SUPERNATANT PELET
Slika 26: Test vezave eGFP_D4_50 na MLV-je. S: proteinski standard Novex Sharp Unstained, 1: netretiran protein, 2: supernatant po tretiranju proteina brez MLV-jev, 3: usedlina po tretiranju proteina brez MLV-jev, 4: supernatant po tretiranju proteina z vezikli brez holesterola (100 % POPC), 5: usedlina po tretiranju proteina z vezikli brez holesterola (100 % POPC), 6: supernatant po tretiranju proteina z vezikli s 50 % holesterola (POPC:Hol = 1:1), 7: usedlina po tretiranju proteina z vezikli s 50 % holesterola (POPC:Hol = 1:1). V prvo jamico na vsakem gelu smo dodali vzorec netretiranega proteina. Široke lise, ki se nahajajo na dnu gelov predstavljajo vezikle.
Na slikah 23, 24, 25 in 26 so prikazani primeri NaDS-PAGE gelov, na katerih so vzorci supernatantov in usedlin po končanem sedimentacijskem testu z MLV-ji iz 100 % POPC in POPC:Hol v molarnem razmerju 1:1. Preračunani deleži proteinov v vzorcih supernatantana vezikle vezani in nevezani frakciji so podani v tabelah zraven slik NaDS-PAGE. Pri izračunih smo izhajali iz povprečja treh neodvisnih ponovitev.
Iz NaDS-PAGE (slika 23) jasno vidimo vezavo divjega tipa D4 na vezikle s 50 mol. % Hol, saj se lisa velikosti proteina (44 kDa) nahaja v žepku, kjer smo nanesli vzorec usedline po centrifugiranju. To smo tudi pričakovali, saj so glede na podatke iz literature za ugodno vezavo PFO preko njegove D4 na membrano, sestavljeno iz fosfolipidov in holesterola, potrebne znatne koncentracije holesterola (> 30 mol. %), kar je bistvenega pomena za nadaljnjo oligomerizacijo PFO (Flanagan in sod., 2009). Iz rezultatov vidimo, da so se na vezikle s holesterolom prav tako vezale različice D4 (slike 24, 25 in 26). Pri vseh proteinskih različicah lahko potrdimo, da se na MLV-je iz 100 % POPC ni vezalo nič proteina, saj se skoraj enaka količina proteina nahaja tudi v vzorcih usedline pri negativni kontroli. Lahko predpostavimo, da se majhen delež proteinov pojavi v vzorcu usedline negativne kontrole zaradi obarjanja ali nespecifične vezave na površino mikrocentrifugirke. Pri grafičnem prikazu deleža proteinov na sliki 27 smo zato od
55
pogojev z vezikli odšteli ozadje, ki se pojavi v kontroli (proteini v usedlini v pogojih brez veziklov). Iz rezultatov prav tako vidimo, da se pri vseh različicah na MLV-je iz 50 mol.
% Hol veže približno polovica proteinov. V deležu vezave med različicami in divjim tipom ni bilo večjih razlik. Iz NaDS-PAGE lahko prav tako potrdimo, da nečistote, ki se nahajajo v vzorcih, ne interagirajo z vezikli, saj se lise, ki po velikosti ustrezajo nečistotam (~33 kDa) ne pojavljajo v jamicah, kjer smo nanesli vzorec usedline.
Slika 27: Grafični prikaz deleža proteinov v vzorcih supernatanta oz. usedline po sedimentacijskem testu. Od pogojev z vezikli smo odšteli ozadje, ki se pojavi pri kontroli. Modri stolpci predstavljajo delež proteinov v vzorcih supernatanta, rdeči stolpci prikazujejo delež proteinov v vzorcih usedline. Brez veziklov – vzorci, kamor nismo dodali MLV-jev, a smo jih tretirali enako kot vzorce z MLV-ji, 100 % POPC – vzorci, kamor smo dodali MLV iz 100 % POPC, 50 % Hol – vzorci, kamor smo dodali MLV iz POPC in holesterola v molarnem razmerju 1:1.
S testom vezave proteinov na MLV-je smo lahko le grobo ocenili delež vezave različic D4 PFO. Na podlagi dobljenih rezultatov pa smo ugotovili, da zamenjava aminokislinskih ostankov T490 in L491 v zanki L1 ne vpliva na prepoznavo in vezavo D4 na holesterol.
Še več, pokazali smo, da se zaradi izbranih mutacij pri različicah 32, 33 in 50 ohrani specifičnost do holesterola v veziklih s 50 mol. % holesterola. Vezavo izbranih različic na vezikle s holesterolom smo si natančneje ogledali s pomočjo konfokalne mikroskopije.
56