Slika 17: Grafični prikaz optimizacije migracijskega testa celic MKN45 pri najvišji koncentraciji [10*105 celic/mL], v časovnih obdobjih 0 h, 24 h, 48 h in 54 h.
Pri začetni koncentraciji celic MCF-10A 6*105/ml po 24 h celice niso tvorile monosloja.
Odločili smo se, da bomo za boljšo oceno preraščanja celic, pred nanosom zunajceličnih veziklov, celice pogledali pod faznokontrastnim mikroskopom. Celice so migrirale druga proti drugi, a brez očitne linije kot pri celicah MKN45, saj celice MCF-10A migrirajo posamezno in v vse smeri (slika18). Glede na rezultate smo se odločili, da bomo za teste
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00
6 h 24 h 30 h 48 h 54 h
% migracije
Čas [h]
Celična linija MKN45
35
migracije nacepili celice MCF-10A v koncentraciji 10*105 celic/mL, in da jih bomo, po potrebi, pustili rasti 48 h, da bodo tvorile monosloj. Ugotovili smo tudi, da program ImageJ ni primeren za analizo celic MCF-10A, saj celice niso migrirale kot fronta in smo težko izračunali površino reže. Namesto tega smo se odločili, da bomo analizo raje opravili z merjenjem preraščenosti z napravo Incellis cell imager.
Slika 18: Prikaz optimizacije migracijskega testa celic MCF-10A pri najvišji koncentraciji celic, v časovnih obdobjih 0 h, 24 h, 48 h in 54 h.
4.6. ANALIZA CELIČNE MIGRACIJE ZA CELIČNO LINIJO MKN45
Vpliv veziklov na migracijo rakavih celic smo preverili tako, da smo zunajcelične vezikle, izolirane iz celic MKN45, spodbujenih z gastrinom, in kontrolne vezikle, dodali naivnim rakavim celicam MKN45 (celice niso bile spodbujene z gastrinom). Vzorce smo nanašali v duplikatu.
Slika 19: Prikazi migracije naivnih celic MKN45, pridobljeni 0 h, 6 h, 24 h, 30 h, 48 h po dodatku zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic MKN45 (ONKO-onkosomi, MV-mikrovezikli, EKSO-eksosomi, K-kontrolni vzorci).
36
Slika 20: Prikazi migracije celic MKN45, ob 0 h, 6 h, 24 h, 30 h in 48 h po dodatku zunajceličnih veziklov, ki so bili izolirani iz celic MKN45, spodbujenih z gastrinom. (ONKO-onkosomi, MV-mikrovezikli, EKSO-eksosomi, G-označuje dodatek zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic MKN45, spodbujenih z gastrinom).
Na slikah 19 in 20 so prikazane slike analize migracije celic MKN45, po dodatku zunajceličnih veziklov in zunajceličnih veziklov, spodbujenih z gastrinom, v različnih časovnih točkah. Opazili smo, da so celice večinoma migrirale kot fronta. DPBS smo uporabili kot negativno kontrolo in kot kontrolo ponovljivosti. Primerjali smo migriranje naivnih celic MKN45 po dodatku veziklov iz celic, ki so bile spodbujene z gastrinom, z migriranjem celic MKN45 po dodatku veziklov, ki smo jih izolirali iz celic, ki niso bile spodbujene z gastrinom. Surove podatke smo prikazali v preglednici ⅩⅡ (priloga), izračunane vrednosti so prikazane v spodnjih preglednicah (ⅩⅡ A-C).
Preglednica XII: A. Povprečne vrednosti zapiranja reže med celicami MKN45 po dodatku onkosomov, B. Povprečne vrednosti zapiranja reže med celicami MKN45 po dodatku mikroveziklov, C. Povprečne vrednosti zapiranja reže med celicami MKN45 po dodatku eksosomov.
A. ONKOSOMI
Časovno obdobje [h] Hitrost zapiranja reže-Kontrola [%]
Hitrost zapiranja reže-Gastrin [%]
0 100 100
6 98,1 98,9
24 84,7 89,2
30 81,7 85,5
48 68,2 68,1
37 B. MIKROVEZIKLI
Časovno obdobje [h] Hitrost zapiranja reže-Kontrola [%]
Časovno obdobje [h] Hitrost zapiranja reže-Kontrola [%]
Iz povprečnih meritev zapiranja reže med celicami MKN45 (priloga, preglednica ⅩⅡ) smo izrisali grafe širine reže v časovnih obdobjih, za vsako populacijo zunajceličnih veziklov posebej (slika 21).
38 B.
C.
Slika 21: Grafični prikazi hitrosti zapiranja reže med celicami MKN45 po dodatku onkosomov (A.), mikroveziklov (B.) ali eksosomov (C.), v časovnih obdobjih. Naklon premice predstavlja hitrost migracije celic MKN45.
Iz podatkov v preglednicah ⅩⅡ A, B in C smo izračunali še razmerje hitrosti zapiranja reže in jih predstavili grafično na sliki 22.
y = -0,8437x + 102,64
39
Slika 22: Grafični prikaz hitrosti migracije celic MKN45 po dodatku zunajceličnih veziklov. (ONKO-onkosomi, MV-mikrovezikli, EKSO-eksosomi, gastrin-označuje dodatek zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic MKN45, spodbujenih z gastrinom).
Na sliki 21, A-C je prikazano zapiranje reže med celicami, inkubiranimi z zunajceličnimi vezikli, spodbujenimi z gastrinom in celicami, inkubiranimi z nespodbujenimi zunajceličnimi vezikli (kontrola). Iz naklonov premic smo pridobili hitrost zapiranja reže (86). Na sliki 22 je prikazana hitrost migracije celic MKN45 za vse populacije zunajceličnih veziklov. Onkosomi in mikrovezikli, izolirani iz celic, spodbujenih z gastrinom, ne vplivajo na migracijo naivnih rakavih celic MKN45, v primerjavi s kontrolo.
Celice, ki so jim bili dodani eksosomi, izolirani iz celic, spodbujenih z gastrinom, pa migrirajo za 12 % počasneje v primerjavi s kontrolo. Nekatere vrednosti med obema biološkima ponovitvama so se precej razlikovale, zato bi za zanesljive rezultate bile potrebne dodatne ponovitve.
4.7. ANALIZA CELIČNE MIGRACIJE ZA CELIČNO LINIJO MCF-10A
Vpliv veziklov na migracijo normalnih celic smo preverili tako, da smo zunajcelične vezikle, izolirane iz rakavih celic MKN45, spodbujenih z gastrinom, dodali naivnim normalnim celicam MCF-10A (celice niso bile spodbujene z gastrinom). Vzorce smo nanašali v duplikatu. Za negativno kontrolo smo celicam dodali DPBS namesto veziklov.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
ONKO MV EKSO
Hitrost migriranja [% zapiranja reže/h]
Populacije zunajceličnih veziklov
Migracija celic MKN45
gastrin kontrola
40
Slika 23: Prikazi migracije celic MCF-10A, pridobljeni 0 h, 6 h, 24 h, 30 h, 48 h po dodatku zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic MKN45 (ONKO-onkosomi, MV-mikrovezikli, EKSO-eksosomi, K-kontrolni vzorci)
Slika 24: Prikazi migracije celic MCF-10A, pridobljeni 0 h, 6 h, 24 h, 30 h, 48 h po dodatku zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic MKN45, spodbujenih z gastrinom. (ONKO-onkosomi, MV-mikrovezikli, EKSO-eksosomi, G-označuje dodatek zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic MKN45, spodbujenih z gastrinom).
Na slikah 23 in 24 so prikazane slike analize migracije celic MCF-10A po dodatku zunajceličnih veziklov. Po 6 h so migrirale le posamezne celice, zato je bil rob reže še vedno dobro viden. Po 24 h pa smo v vseh vzorcih opazili velik vpliv onkosomov, mikroveziklov in eksosomov na migracijo celic MCF-10A. Reža med slojema celic je bila že močno zaprta, vendar je bilo med posameznimi celicami še nekaj praznega prostora.
Celice niso migrirale kot fronta, temveč posamično in v različnih smereh. Opazili smo, da celice niso bile orientirane v isto smer kot celice, ki so bile prej namnožene v monosloju.
41
Po 48 h je bila reža skoraj popolnoma zaprta, tako pri negativni kontroli kot pri vseh celicah, ki smo jim dodali vezikle. Surove podatke smo prikazali v preglednici ⅩⅢ (priloga), izračunane vrednosti so prikazane v spodnjih preglednicah (ⅩⅢ A-C).
Preglednica XIII: A. Povprečne vrednosti zapiranja reže med celicami MCF-10A po dodatku onkosomov, B. Povprečne vrednosti zapiranja reže med celicami MCF-10A po dodatku mikroveziklov, C. Povprečne vrednosti zapiranja reže med celicami MCF-10A po dodatku eksosomov.
A. ONKOSOMI
Časovno obdobje [h] Hitrost zapiranja reže-Kontrola [%]
Časovno obdobje [h] Hitrost zapiranja reže-Kontrola [%]
Časovno obdobje [h] Hitrost zapiranja reže-Kontrola [%]
42 A.
B.
C.
Slika 25: Grafični prikazi hitrosti zapiranja reže med celicami MCF-10A po dodatku onkosomov (A.), mikroveziklov (B.) ali eksosomov (C.), v časovnih obdobjih. Naklon premice predstavlja hitrost migracije celic MCF-10A.
Iz podatkov v preglednici ⅩⅢ (priloga) smo izračunali še razmerje hitrosti zapiranja reže in jih predstavili grafično na sliki 26.
y = -0,5411x + 99,108
43
Slika 26: Grafični prikaz hitrosti migracije celic MCF-10A po dodatku zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic MKN45, ki so bile tretirane z gastrinom, v primerjavi s celicami MCF-10A po dodatku zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic MKN45, ki niso bile izpostavljene gastrinu. (ONKO-onkosomi, MV-mikrovezikli, EKSO-eksosomi, gastrin-označuje dodatek zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic MKN45, spodbujenih z gastrinom).
Na sliki 25, A-C je prikazano zapiranje reže (zapolnjevanje prostora med celicami) v vzorcih s celicami MCF-10A inkubiranimi z zunajceličnimi vezikli, spodbujenimi z gastrinom in celicami inkubiranimi z nespodbujenimi zunajceličnimi vezikli. Iz naklonov premic smo pridobili hitrost zapiranja reže. Na sliki 26 je prikazana hitrost migracije celic MCF-10A za vse populacije zunajceličnih veziklov. Onkosomi, mikrovezikli in eksosomi, izolirani iz celic, spodbujenih z gastrinom, ne vplivajo na migracijo naivnih normalnih celic MCF-10A, v primerjavi s kontrolo. Nekatere vrednosti med obema biološkima ponovitvama so se precej razlikovale, zato bi za zanesljive rezultate bile potrebne dodatne ponovitve.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
ONKO MV EKSO
Hitrost migriranja [% zapiranja reže/h]
Populacije zunajceličnih veziklov
Migracija celic MCF-10A
gastrin kontrola
44
5. RAZPRAVA
Pri razvoju raka so pomembni različni celični procesi, kot so zmanjšana apoptoza, povečano razmnoževanje celic, angiogeneza in migracija celic v okoljska tkiva (25, 27, 72). Študije so pokazale, da na procese nastanka in napredovanja rakov vplivajo tudi zunajcelični vezikli, ki jih izločajo predrakave in rakave celice ter celice tumorske strome.
Ti sodelujejo pri zapleteni medcelični komunikaciji, saj vsebujejo različne molekule, ki delujejo na tarčne celice (36-39, 66, 77). Različni dodatki celičnim kulturam spodbudijo izločanje zunajceličnih veziklov, ki vplivajo na različne lastnosti celic, med drugim na avtofagijo, proliferacijo in migracijo celic. Zunajcelični vezikli, izolirani iz celic raka dojke in kolorektalnega raka, vsebujejo ligande za epidermalni rastni faktor, kot je amfiregulin.
Vezikli, ki vsebujejo amfiregulin, povečajo invazivnost prejemnih celic raka dojke 4-krat bolj kot vezikli, ki vsebujejo druge ligande za epidermalni rastni faktor (TGFα, HB-EGF) (87). Celice raka dojke (MCF-7 in T47D) so po dodatku 17β-estradiola, povečano tvorile velike zunajcelične vezilke (do 42 µm). Izločanje teh veziklov je naraščalo s koncentracijo 17β-estradiola (88). Norepinefrin poveča migracijo in invazivnost človeških celic raka jajčnikov (89), prav tako pa poviša izražanje žilnega endotelijskega rastnega faktorja pri melanomskih celicah (90). Zaradi teh študij, ki preučujejo vpliv hormonov, na izločanje zunajceličnih veziklov in njihovo vlogo pri razvoju raka, smo v magistrski nalogi želeli preveriti ali tudi hormon gastrin vpliva na izločanje zunajceličnih veziklov iz celic raka želodca in njihovo vlogo pri napredovanju raka.
Celice smo inkubirali z gastrinom, tako da smo najprej celice gojili 24 h v gojišču brez seruma, saj je to njihov podvojitveni čas. Tako se je večina celic v kulturi ustavila v fazi G0/G1 celičnega cikla. S tem smo želeli doseči enako izhodišče za vse celice in enako izhodišče pri vseh ponovitvah. Poleg tega je učinek gastrina bolj izražen, če so vse ali vsaj večina celic v kulturi v isti fazi celičnega cikla. Celice v tej fazi celičnega cikla mirujejo ali pa se pripravljajo na delitev celice. S 3-D histokulturo celic MKN45 so ugotovili, da je večina invazivnih celic v fazi G0/G1 (84,3 % invazivnih celic). Celice v tej fazi so reagirale s sosednjimi celicami in so migrirale dlje, ter tudi hitreje, kot celice v fazi S/G2/M (91).
Celice smo nato gojili 48 h v gojišču za izolacijo zunajceličnih veziklov. Za izolacijo veziklov smo izbrali centrifugiranje in gradientno ultracentrifugiranje, saj se s to metodo znebimo največjega deleža nečistoč, vezikle koncentriramo in jih ločimo glede na velikost, je relativno poceni in enostavna za uporabo (92). S centrifugiranjem smo se najprej znebili
45
celičnega drobirja in drugih nečistoč iz celičnega medija in pridobili populacijo veziklov, obogateno z onkosomi. V naslednjih stopnjah pa smo izolirali še populacijo, obogateno z mikrovezikli, in populacijo, obogateno z eksosomi. Po vsaki stopnji centrifugiranja oziroma ultracentrifugiranja smo dodali filtriran DPBS, da smo se znebili nečistoč, ki bi nas motile pri nadaljnji analizi zunajceličnih veziklov. Za določanje koncentracije proteinov s spektrofotometrom je bilo še posebej pomembno, da smo odstranili vse gojišče, saj bi albumin, ki je najbolj zastopan protein v FBS-u, motil naše meritve (93, 94).
i. PRENOS WESTERN
Posamezne populacije veziklov smo analizirali s prenosom Western in s tem potrdili čistost izoliranih frakcij in obogatenost s specifičnimi skupinami zunajceličnih veziklov ter s tem primernost uporabljene metode za izolacijo zunajceličnih veziklov (95). Pri večini veziklov smo zaznali enako močne signale pri kontrolnih vzorcih in vzorcih spodbujenih z gastrinom, kar je pričakovano, saj smo pri nanosu uporabili enake proteinske mase veziklov. Pri analizi označevalcev CD9 in Tsg101 v populaciji mikroveziklov so bile opazne majhne razlike v intenziteti signala med kontrolnim in gastrinskim vzorcem. To razliko lahko razložimo na podlagi dejstva, da sta izolacija zunajceličnih veziklov in prenos Western tehnično zahtevna, da delamo z majhnimi volumni vzorca, pri čemer hitro pride do izgub in da smo lahko del vzorca izgubili pri odstranjevanju supernatanta po centrifugiranju, če se je odlepil skupek posedenih veziklov. Metoda prenosa Western je torej primerna za kvalitativno oceno, ne pa tudi za kvantitativno oceno zunajceličnih veziklov, kar se sklada s podatki iz literature (95). Signali pri označevalcu HSC70 so bili nekoliko močnejši, kot smo pričakovali, kar je lahko pomenilo, da sta se združila dva nespecifična signala, saj ima podobno velikost, 70 kDa, tudi protein albumin (96). Ta protein bi lahko ostal v populaciji veziklov, če nismo uspeli dovolj dobro odstraniti gojišča. Druga, bolj verjetna razlaga je, da je bilo v celični linij, ki smo jo uporabili za poizkuse, prisotnega veliko HSC70 na površini eksosomov.
ii. OPTIČNO SLEDENJE POSAMEZNEMU DELCU (ANGL. NTA)
Z optičnim sledenjem posameznemu delcu smo določili povprečno velikost, koncentracijo veziklov in velikostno porazdelitev veziklov. V teoriji je metoda primerna za analizo delcev velikosti od 50 do 1000 nm (97). Optimalno delovanje naprave je v rangu 100 nm,
46
torej je metoda zelo primerna za določanje lastnosti eksosomov (98). Za dobre rezultate so zaželeni čim bolj homogeni vzorci, kar se tiče velikosti. To sovpada z izsledki, da je metoda najbolj primerna za določanje eksosomov, saj so si ti po velikosti bolj podobni, kot mikrovezikli, za katere so značilni večji velikostni razponi. Rezultati naših meritev so pokazali, da so eksosomi večji od mikroveziklov, kar nasprotuje izsledkom o velikosti zunajceličnih veziklov (40, 42, 58). Do tega je lahko prišlo, ker je metoda bolj primerna za detekcijo eksosomov, in ne za mikrovezikle. Pri mikroveziklih se v vzorcu nahajajo večji delci, ki lahko zmotijo detekcijo manjših delcev, poleg tega pa ta metoda, na podlagi naših izkušenj, niti ne zazna delcev večje velikosti (> 400 nm). Največ veziklov smo zaznali pri velikosti 200 nm (slika 12). Zaznali smo tudi 10-krat manjšo koncentracijo mikroveziklov kot eksosomov. Ti rezultati niso nujno odraz realnega stanja, saj metoda ni najbolj primerna za določanje lastnosti mikroveziklov. Zato smo za določanje lastnosti mikroveziklov, naredili še analizo s pretočno citometrijo, kjer bolj natančno določamo velikost mikroveziklov v rangu od 500 do 1000 nm (99). Za določanje velikosti veziklov bi lahko izbrali tudi metodo dinamičnega sipanja svetlobe (angl. DLS), ki ima zelo širok velikostni razpon (1 nm do 6 µm) (100).
iii. PRETOČNA CITOMETRIJA
Pretočna citometrija se uporablja za določanje večjih veziklov (>500 nm) (99). Problem pretočne citometrije je, da težko ločuje vezikle od drugih nečistoč, kot so agregati in skupki fluorescentnega barvila. Ta problem odpravimo z uporabo dvojnega barvanja veziklov, z barvilom, ki je specifičen za proteine (CFSE) in s protitelesom, specifičnim za določen protein (CK18) (101). Za določanje onkosomov smo za referenco uporabili velikostne kroglice s premerom 3 µm, saj smo takšno velikost onkosomov določili s fluorescentno mikroskopijo (neobjavljeni rezultati). Signali za mikrovezikle so na točkovnem diagramu FSC/SSC bolj razpotegnjeni, medtem ko so signali za onkosome bolj zgoščeni. Analizirali smo dve biološki ponovitvi vzorcev onkosomov (kontrolni vzorci in vzorci iz celic, spodbujenih z gastrinom) in tri biološke ponovitve vzorcev mikroveziklov.
Pri mikroveziklih smo dokazali, da gastrin spodbudi izločanje mikroveziklov iz celic MKN45. Dve biološki ponovitvi vzorcev onkosomov sta bili premalo, da bi lahko govorili o vplivu gastrina na izločanje onkosomov iz celic MKN45, saj so se rezultati teh dveh meritev zelo razlikovali in nismo zaznali trenda. Potrebne bi bile dodatne preiskave na večjem številu vzorcev.
47 iv. ANALIZA CELIČNE MIGRACIJE
Določanje invazivnih celic je ključno za preprečevanje metastaz (91). Tumorske celice migrirajo v okoljsko tkivo, vstopajo v limfni ter krvni sistem in se tako razširijo v druge organe. Migracija celic je pomembna za tvorbo žilja in metastaziranje, zato z migracijskimi testi lahko ocenimo sposobnost zasevanja tumorskih celic (102). V nalogi smo se osredotočili na migracijo celic. Želeli smo preučiti vpliv zunajceličnih veziklov, pridobljenih iz rakavih celic spodbujenih z gastrinom, na migracijo rakavih celic in na migracijo zdravih epitelnih celic. Izločanje zunajceličnih veziklov smo spodbudili z gastrinom, saj je hipergastrinemija povezana z nastankom raka želodca (23). Gastrin uravnava proliferacijo želodčnih mukoznih celic. Z vezavo na receptor CCK-2 stimulira proliferacijo tumorja pri celični kulturi raka želodca SGC7901 in MGC-803 in spodbudi metastaziranje raka želodca (103-105). Povečane vrednosti gastrina pospešijo migracijo celic raka želodca, kar je bilo dokazano s poizkusi na celični liniji AGS. Hitrost migracije je odvisna od koncentracije gastrina (14). Gastrin vpliva na migracijo celic preko uravnavanja izražanja specifičnih mRNA in miRNA (npr. miR-19b, miR-21, miR-10b-5p), ki se lahko prenašajo v sosednje celice z zunajceličnimi vezikli in tako vplivajo na njihovo migracijo (85, 106, 107).
Pred izvedbo eksperimenta smo optimizirali protokol za analizo celične migracije. V objavljeni literaturi pogosto uporabijo mikrotitrske plošče s 6 ali 12 luknjicami, zato temu prilagodijo tudi število nasajenih celic. Najpogosteje navajajo 1*105 MKN45 celic/mL ali 2,5*104 MCF-10A celic/mL pri nasajanju celic v mikrotitrsko ploščo z 12-imi luknjicami (108, 109). V nalogi smo uporabili vstavke za migracijske teste Ibidi, ki standardizirajo velikost reže med slojema celic. Ti vstavki so primerni za mikrotitrsko ploščo s 24 luknjicami, zato smo uporabili te. Temu primerno smo prilagodili število celic, saj je zelo pomembno, da celice rastejo v monosloju (poglavje 4.5). Za opazovanje vpliva veziklov, izoliranih iz rakavih celic, na zdrave epitelne celice smo izbrali normalne epitelne celice dojke MCF-10A. Rocha et al. so ugotovili, da epitelne celice dojke dovolj dobro posnemajo obnašanje epitelnih celic želodca (78). Zaradi tega so celice MCF-10A dovolj dober model za namen našega poizkusa.
Celice smo pred dodatkom veziklov gojili do monosloja, kar se je zgodilo po 48 h. Po odstranitvi vstavkov Ibidi smo celice večkrat sprali z gojiščem brez FBS in ne z raztopino
48
DPBS, da smo odstranili vse celice iz reže. Gojišče smo uporabili, ker je po sestavi bolj podobno fiziološkim pogojem kot DPBS in predstavlja manjši stres za celice. Gojišče smo vedno odstranili s pipeto, saj bi aspiracijska pipeta in vakuumsko pipetiranje lahko poškodovala monosloj in bi celice migrirale druga proti drugi in ne le proti zapiranju reže.
Količino veziklov, ki smo jih dodali na celice in časovne točke za opazovanje migracije celic, smo izbrali glede na objavljeno literaturo (78, 108). Ugotovili smo, da po 6 h ni opaznih sprememb pri nobeni celični liniji, največje razlike v migraciji so opazne po 48 h.
Celice MKN45 bi lahko opazovali še do 54 h, saj so še imele nekaj prostora, kamor bi migrirale, a ker nas je zanimalo le, ali vezikli spodbujajo ali zavirajo migracijo, ni bilo potrebno, da se reža med slojema celic popolnoma zapre. Če so celice dolgo časa v gojišču, jim začne zmanjkovati hranil. V tem času se tudi razmnožujejo, kar lahko vpliva na rezultate migracije. Celice MCF-10A so večje, zato so hitreje zapolnile režo med celicami, in so skoraj popolno preraščenost dosegle v 48 h. V literaturi je navedeno, da se za analiziranje slik migracije celic pogosto uporablja program ImageJ. Program ima svoje pomanjkljivosti, saj so izračuni površin odvisni od nastavitev, ki jih določimo sami (npr.
odstranimo ozadje, izberemo velikost okoli celic, ki jo program upošteva, težko osamimo posamezne celice, ki so migrirale). Program ImageJ ni bil uporaben za ocenjevanje migracije celic MCF-10A, saj te celice niso migrirale kot ena fronta in ni bilo mogoče narisati meje med obema slojema (sliki 23, 24). Problem smo poskušali rešiti z ročnim postavljanjem mej okoli posameznih celic, vendar smo ugotovili, da to v višjih časovnih točkah, ko je migriralo več celic, ni bilo mogoče. Namesto tega smo za določanje migracije uporabili merjenje preraščenosti (konfluence) z napravo Incellis cell imager. Ta metoda je veliko bolj primerna, še vedno pa ni optimalna, saj mikroskop zajame nekoliko večjo površino od celice, vendar smo to zanemarili, saj je enako površino upošteval pri vseh ponovitvah, v vseh časovnih enotah. Razlik v učinku onkosomov in mikroveziklov, izoliranih iz celic, spodbujenih z gastrinom, v primerjavi s kontrolnimi vezikli na migracijo tumorskih celic MKN45 nismo opazili. Eksosomi, izolirani iz celic, spodbujenih z gastrinom, pa so zmanjšali migracijo celic MKN45 za 12 % v primerjavi s kontrolo. To je v nasprotju z našimi pričakovanji, saj naj bi gastrin spodbudil karcinogenezo (14, 17, 21).
Vendar je bila dvojna vloga gastrina v literaturi že večkrat predstavljena (110-112). Razlik v migraciji celic MCF-10A nismo opazili med nobeno populacijo zunajceličnih veziklov, izoliranih iz celic, spodbujenih z gastrinom, v primerjavi s kontrolo. Podobne raziskave o vplivu tumorskih zunajceličnih veziklov na migriranje rakavih celic so izvedli tudi Arita et
49
al (113), ki so ugotovili, da zunajcelični vezikli izolirani iz celične linije MKN45 in KATO
al (113), ki so ugotovili, da zunajcelični vezikli izolirani iz celične linije MKN45 in KATO