3. MATERIALI IN METODE
3.2 ANALIZNE METODE
3.2.1 Razvoj in optimizacija analizne metodologije
Za analizo vzorcev smo uporabili dve različni metodi UHPLC. Analizo vitaminov B7 in B12
smo izvedli po metodi z gradientnim izpiranjem, povzeti po magistrski nalogi Andreje Horvat (kromatografski pogoji so predstavljeni v Preglednici II) (38). Vitamine B3, B5 in B6, pa smo analizirali po izokratski metodi, ki smo jo vpeljali na novo. Med razvojem nove metode smo preizkusili različne deleže organskega modifikatorja v mobilni fazi – MeOH (10 % in 15 %) in čase analize. Ostali kromatografski parametri (kolona, T kolone, mobilna faza A in pretok) pa so bili enaki kot v izhodiščni metodi. Končni kromatografski pogoji, uporabljeni v naši raziskavi, so podani v Preglednici II.
13 3.2.2 Kromatografski pogoji
V Preglednici II so predstavljeni kromatografski pogoji uporabljenih analiznih metod.
Preglednica II: Kromatografski pogoji metod 1 in 2.
Metoda 1 Metoda 2
Analiti Vitamini B3, B5, B6 Vitamina B7, B12
Mobilna faza A: 25 mM NaH2PO4 × H2O; B: MeOH
A : B = 90 : 10 (v/v) gradientno izpiranje (Preglednica III)
Pretok 1 mL/min
Volumen injiciranja 1-10 μL (glede na posamezen vzorec)
Predkolona Luna C18 4×3,0 mm
Kolona XSelect® CSH™ C18, 150 × 4,6 mm, 3,5 μm
Temperatura kolone 40 ℃
Valovna dolžina detekcije [nm] 210, 260, 287 210, 260, 287, 362
Čas analize [min] 8,5 15
Gradientni program mobilne faze pri metodi 2 je predstavljen v Preglednici III.
Preglednica III: Gradientni program mobilne faze pri metodi 2.
Čas [min] A [%] B [%]
V Preglednici IV pa so predstavljeni retencijski časi (tr) analitov in valovne dolžine (𝜆) pri katerih smo jih detektirali.
Preglednica IV: Valovne dolžine detekcije in retencijski časi analitov.
Analit 𝜆 [nm] tr [min]
*analiziran po metodi 2; ªpodatka povzeta iz magistrske naloge Andreje Horvat (38)
14 3.3 PRIPRAVA RAZTOPIN
3.3.1 Priprava mobilne faze A
Natehtali smo 3,45 g NaH2PO4 × H2O in ga raztopili v približno 900 mL MQ. Pripravljeni raztopini smo nato uravnali pH na 4,0 z 0,1 M HCl in jo kvantitativno prenesli v 1 L merilno bučko. Ko smo z MQ dopolnili do oznake, smo ponovno izmerili pH, ki se ni spremenil.
Raztopino smo nato prefiltrirali (velikost por 0,2 μm) in s tem odstranili morebitne neraztopljene delce. Tako pripravljeno raztopino smo sonicirali 15 min, da smo odstranili morebitne zračne mehurčke.
3.3.2 Priprava standardnih raztopin za vrednotenje metod
Za pripravo osnovnih raztopin (OR) smo natehtali izbrano maso standardov, jo prenesli v ustrezne merilne bučke in z MQ dopolnili do oznake (Preglednica V). Z redčenjem smo dobili raztopine, iz katerih smo pridobili najvišje točke umeritvene premice za vitamine B3, B5 in B6. OR za vitamin B12 pa smo za pripravo najvišje točke umeritvene premice še dodatno redčili z MQ. Z redčenjem teh raztopin smo nato dobili koncentracije, ki ustrezajo vzorcem umeritvene premice in kontrolnim vzorcem (Preglednica VI). Kontrolnih vzorcev (KV) nismo uporabili za pripravo umeritvene premice, ampak smo z njihovo pomočjo vrednotili točnost in ponovljivost metode.
Preglednica V: Priprava osnovnih standardnih raztopin.
Vitamin Natehtana masa standarda [mg]
Volumen raztopine
[mL] Faktor redčenja Koncentracija standarda v OR [mg/L]
B3 5 5 3,33 300
B5 5 10 3,33 150
B6 3 10 10 30
B12 3 50 40 1,5
Preglednica VI: Koncentracije vzorcev za pripravo umertivene premice in kontrolnih vzorcev.
% ORª Koncentracija [mg/L]
15
KV3 75 225 113 22,5 0,34
ªprocent OR v celotni raztopini; *pripadajoči % OR od zgoraj navzdol: 2,5; 6,25; 12,5; 20; 25; 7,5; 15; 22,5
3.4 VALIDACIJA ANALIZNIH METOD
Metodi smo validirali v skladu s smernicami ICH (ang. International Conference on Harmonisation – Mednarodna konferenca o harmonizaciji). Preverjali smo selektivnost, linearnost, točnost in ponovljivost, stabilnost kontrolnih vzorcev ter določili meji določitve in zaznave (39).
3.4.1 Selektivnost
Za vrednotenje selektivnosti smo primerjali kromatograme standardov s kromatogrami topil (MeOH, MQ). Pozorni smo bili na to, ali se vrhovi posameznih standardov ločijo med seboj ter, ali so v topilih prisotne nečistote, ki se eluirajo pri enakih retencijskih časih kot analiti in bi lahko motile vrednotenje vitaminov. Dodatno smo selektivnost preverili še s pregledom kromatogramov vseh analiziranih izdelkov. Pri tem smo preverjali ločbo kromatografskih vrhov obravnavanih analitov od kromatografskih vrhov ostalih sestavin KI.
3.4.2 Linearnost
Linearnost analizne metode je njena zmožnost, da znotraj določenega obsega vrne rezultate, ki so sorazmerni s koncentracijo analita v vzorcu (39). Linearnost metode smo vrednotili z vzorci za pripravo umeritvene premice, ki smo jih pripravili po postopku 3.3.2. Za vsak analit smo podali enačbo umeritvene premice (odvisnost odziva od koncentracije analita) in determinacijski koeficient (R2). Mejo za sprejemljivo linearnost smo določili kot R2 ≥ 0,999.
3.4.3 Točnost in ponovljivost
Vrednotenje točnosti in ponovljivosti smo izvedli s pomočjo kontrolnih vzorcev treh različnih koncentracij (v treh paralelkah), ki pokrivajo celotno linearno območje odziva analita v odvisnosti od njegove koncentracije (nizka, srednja in visoka). Natančen postopek priprave vzorcev je opisan v poglavju 3.3.2. Koncentracijo analita v vzorcu smo izračunali s pomočjo enačbe umeritvene premice ter vrednost primerjali z dejansko koncentracijo (izračunano iz postopka priprave vzorcev) in tako določili točnost metode (Enačba 1). Mejo sprejemljivosti za točnost smo definirali kot 100 ± 5 %.
𝑡𝑜č𝑛𝑜𝑠𝑡 [%] = 𝑐𝑖𝑧𝑚𝑒𝑟𝑗𝑒𝑛𝑎
𝑐𝑑𝑒𝑗𝑎𝑛𝑠𝑘𝑎 × 100 Enačba 1
𝑐𝑖𝑧𝑚𝑒𝑟𝑗𝑒𝑛𝑎 = koncentracija analita izračunana z enačbo umeritvene premice
𝑐𝑑𝑒𝑗𝑎𝑛𝑠𝑘𝑎 = dejanska koncentracija analita v vzorcu (izračunana iz postopka priprave vzorcev)
16
Za znotraj-dnevno ponovljivost smo uporabili vse tri ponovitve vsakega od KV vzorcev in vrednotili njihovo ujemanje. To smo ponovili tri dni zapored. Ponovljivost oziroma ujemanje rezultatov med paralelami KV smo izrazili z relativnim standardnim odklonom (RSD), mejo spremenljivosti pa postavili na < 5 %. Vrednotili smo tudi ponovljivost injiciranja pri vitaminih B3, B5 in B6, in sicer tako, da smo tri KV vzorce (KV1, KV2 in KV3) injicirali šestkrat in z RSD vrednotili njihovo ujemanje. Mejo sprejemljivosti za ponovljivost smo definirali na RSD < 1 %.
3.4.4 Stabilnost KV vzorcev
Kontrolne vzorce, ki smo jih uporabili za znotraj-dnevno ponovljivost prvi dan validacije (pripravljene po postopku 3.3.2), smo v avtomatskem vzorčevalniku shranili še dva dni pri 20 ℃. Analizirali smo jih po 24 in 48 urah, nato pa dobljene odzive delili s tistimi, dobljenimi ob začetni časovni točki ter pomnožili s 100 %. Za interval stabilnosti analita smo postavili 90 – 110 % glede na njegovo koncentracijo v začetni časovni točki.
3.4.5 Meja zaznave in meja določitve
Za mejo zaznave (LOD) velja najmanjša koločina analita v vzorcu, ki jo je mogoče zaznati in ne nujno določiti kot točno vrednost. Meja določitve (LOQ) pa je najmanjša količina analita v vzorcu, ki ga je mogoče določiti s primerno natančnostjo in točnostjo (39). Meji zaznave in določitve smo izračunali po Enačbah 2 in 3.
𝐿𝑂𝐷 = 3,3 × 𝑆𝐷
𝑘 Enačba 2
𝐿𝑂𝑄 = 10 × 𝑆𝐷
𝑘 Enačba 3
𝑆𝐷 = standardni odklon odsekov na ordinati treh umeritvenih premic 𝑘 = povprečna vrednost naklona umeritvenih premice
3.4.6 Vrednotenje analiznega postopka 3.4.6.1 Izkoristek ekstrakcije
Učinkovitost ekstrakcije vitaminov B3, B5 in B12 iz izbranih izdelkov smo preverjali s tremi raztopinami. Raztopino izdelka, raztopino s približno enako količino standarda in raztopino izdelka, ki smo ji dodali približno enako količino standarda kot v raztopini samo s standardom. Vse tri raztopine smo za posamezen izdelek pripravili na enak način: za izdelek BEP1 (okrajšave so navedene v prilogi, Preglednica PI) po postopku v poglavju 3.5.3 in za KI REXN ter MISS (Priloga, Preglednica PI) po postopku v poglavju 3.5.2. Izkoristek ekstrakcije smo izračunali po Enačbi 4. Za mejo sprejemljivosti izkoristka smo postavili interval 95 – 105 %.
17 𝐼𝑧𝑘𝑜𝑟𝑖𝑠𝑡𝑒𝑘 [%] = 𝐴𝑈𝑋𝑣𝑧+𝑠𝑡− 𝐴𝑈𝑋𝑣𝑧
𝐴𝑈𝑋𝑠𝑡 × 100 Enačba 4 𝐴𝑈𝑋𝑣𝑧+𝑠𝑡 = odziv analita v raztopini izdelka z dodanim standardom
𝐴𝑈𝑋𝑣𝑧 = odziv analita v raztopini izdelka 𝐴𝑈𝑋𝑠𝑡 = odziv analita v raztopini standarda
3.4.6.2 Ponovljivost priprave vzorca
Vsak vzorec za analizo izdelkov smo pripravili in analizirali v treh paralelah, po postopku 3.5.2 ali 3.5.3. Iz rezultatov analize smo izračunali RSD odzivov in na podlagi tega podatka vrednotili ponovljivost priprave vzorcev. Kot mejo sprejemljivega odstopanja smo postavili RSD < 5 %.
3.5 VSEBNOST VITAMINOV B-KOMPLEKSA
3.5.1 Razvoj ekstrakcijskega postopka
Pri ekstrakcijskem postopku smo izhajali iz predhodno razvitih postopkov za ekstrakcijo vitamina C (37) in lipofilnih vitaminov iz KI (36). Nadalje smo postopek razvili sami, tako da smo preizkusili različna topila in različne deleže topil, možnost predhodnega vorteksiranja izdelka v ovojnini, količino natehtanega izdelka. Različna topila in deleže topil (MQ, MQ : MeOH = 75 : 25 / 50 : 50 / 25 : 75 (v/v), MeOH, HEX : MQ = 2 : 10 (v/v), HEX : MeOH = 2 : 10 (v/v), ACN, ACN : MeOH = 50 : 50 (v/v), ACN : MQ = 50 : 50 (v/v)) smo preverjali na izbranih izdelkih, in sicer BEP1, FRE, RIL (oznake so navedene v prilogi, Preglednica PI). Razliko med topiloma MeOH in MQ pa smo dodatno preverili na širšem naboru izdelkov. Na KI G&G smo poizkusili še predhodno vorteksiranje izdelka v ovojnini.
Različno količino natehtanega izdelka (10 – 25 mg) smo preverili na KI PCN, AFRT, THEO, REXN, MABX in G&G. Vzorce smo pripravili tako, da smo v centrifugirke natehtali maso izdelka (50 mg, razen FRE – 100 mg, PCN, AFRT, THEO, REXN, MABX, G&G in BEP1 25 mg), dodali topilo, stresali 3 min na vorteksu, sonicirali 15 min v ultrazvočni kadički, ponovno vorteksirali 2 min, centrifugirali 10 min pri 3000 obratih/min in po potrebi filtrirali skozi filter z velikostjo por 0,45 μm. V primeru, ko smo za ekstrakcijo uporabili zmes heksana in MQ, ali heksana in MeOH, smo k izdelku v centrifugirki najprej dodali heksan, 3 min vorteksirali, sonicirali 15 min v ultrazvočni kadički in šele nato dodali MQ oz. MeOH, 3 min vorteksirali, ponovno 15 min sonicirali, potem pa centrifugirali in filtrirali. Vzorce smo nato analizirali s HPLC metodo 1. Uporabljena ekstrakcijska topila so prikazana v prilogi (Preglednica PII).
18 3.5.2 Priprava vzorcev tekočih KI
Za pripravo vzorcev tekočih KI smo v centrifugirko natehtali določeno maso KI (Preglednica VII), dodali 10 oz. 5 mL MQ in vorteksirali 3 min. Nato smo vzorce 15 min sonicirali in ponovno vorteksirali 2 min. Po stresanju smo vzorce centrifugirali pri 3000 obratih/min, 10 min. Raztopino smo nato (po potrebi) filtrirali skozi 0,45 μm filter in prenesli v viale. Vse vzorce smo nato analizirali s HPLC metodo 1, razen KI MISS, ki smo ga analizirali s HPLC metodo 2. Volumen injiciranja se je med posameznimi KI razlikoval (1 – 10 μL).
Preglednica VII: Natehtana masa KI, volumen dodanega topila in volumen injiciranja za posamezni KI.
Okrajšava KI Masa KI [mg] Volumen MQ [mL] Volumen injiciranja [μL]
REXN* 40 10 2
3.5.3 Priprava vzorcev poltrdnih KI
Vzorce poltrdnih izdelkov smo pripravili tako, da smo v centrifugirke natehtali ustrezne mase izdelkov (Preglednica VIII) in dodali 10 mL MeOH oz. MQ v primeru izdelka Reconval B6. Nato smo, enako kot pri tekočih KI, vzorce 3 min vorteksirali, 15 min sonicirali, ponovno 2 min vorteksirali in 10 min centrifugirali pri 3000 obratih/min.
Supernatant smo nato (po potrebi) filtrirali skozi filtre z velikostjo por 0,45 μm in prenesli v viale. Vse vzorce smo nato analizirali s HPLC metodo 1, volumen injiciranja pa je bil odvisen od izdelka in je znašal od 1 do 5 μL.
Preglednica VIII: Natehtana masa KI, volumen dodanega topila in volumen injiciranja za posamezni KI.
Okrajšava KI Masa KI [mg] Volumen MeOH [mL] Volumen injiciranja [μL]
LRPLi*, LRPTO, LRPT, DUCR*,
19
SKINT 50 10 3
RB6* 50 10** 2
* izbrani izdelki za stabilnostno študijo; **dodatek MQ namesto MeOH
3.5.4 Izračun količine analita v vzorcu
Iz odzivov analitov v posameznem vzorcu izdelka smo s pomočjo enačbe umeritvene premice izračunali koncentracijo analita v vzorcu (Enačba 5). Iz koncentracije analita v analiziranem vzorcu smo nato z upoštevanjem redčitev in izbranega volumna injiciranja po Enačbi 6 izračunali vsebnost (m/m %) analita v KI. Rezultat vsebnosti smo podali kot povprečje treh paralelk ± standardni odklon (SD).
𝑐 [𝑚𝑔/𝐿] = 𝐴𝑈𝑋−𝑛
𝑘 Enačba 5
𝐴𝑈𝑋 = odziv analita v vzorcu
𝑛 = odsek na ordinati umeritvene premice 𝑘 = naklon umeritvene premice
𝑐 = koncentracija v mg/L izračunana po Enačbi 5 𝑉𝑡𝑜𝑝𝑖𝑙𝑎 = volumen topila v L
𝑉𝑖𝑛𝑗. = volumen injiciranja vzorca v μL 𝑚 = točna zatehta izdelka v mg
3.6 STABILNOSTNA ŠTUDIJA
Izbrane izdelke (razvidno iz Preglednic VII in VIII) smo izpostavili pogojem za dolgoročno in pospešeno testiranje stabilnosti. Dolgoročno testiranje smo izvedli na izdelkih, ki smo jih v njihovi originalni ovojnini shranjevali pri 20 ℃. Pospešeno testiranje pa smo izvajali za vzorce, ki smo jih pred začetkom stabilnostne študije v osemnajstih paralelkah natehtali v centrifugirke, ki so bile tekom študije zaprte. Natehtane mase izdelkov so prikazane v Preglednicah VII in VIII. Centrifugirke z vzorci izdelkov smo shranili v klimatski komori s temperaturo 40 ℃. Vzorce za analizo smo pripravili v treh paralelkah, po postopkih 3.5.2 in 3.5.3 in jih v vsaki časovni točki (ob času 0, po 1 tednu, po 2 tednih, po 3 tednih in po 4 tednih) analizirali s HPLC metodo 1 ali 2. Po postopku 3.5.4 smo izračunali povprečno vsebnost analita v vzorcu (% (m/m), n = 3) in stabilnost podali kot delež vsebnosti analita v določeni časovni točki glede na začetno časovno točko, izraženo v odstotkih.
20
4. REZULTATI IN RAZPRAVA
4.1 IZBIRA ANALITOV TER RAZVOJ IN OPTIMIZACIJA ANALIZNIH METOD
Glavni namen diplomske naloge je bil vrednotenje vsebnosti in stabilnosti vitaminov B-kompleksa v KI za kar pa so osnova ustrezne analizne metode. Po pregledu KI na slovenskem trgu smo ugotovili, da sta glavna predstavnika v KI vitamina B3 in B5, redkeje pa najdemo vitamina B6 in B12. Ostalih vitaminov B-kompleksa, kljub njihovim pozitivnim učinkom na kožo, v KI na slovenskem trgu nismo našli oz. se najdejo zelo redko (B7 in B9).
Posledično so bili tudi vitamini v našem naboru izdelkov podobno zastopani – v večini izdelkov sta prisotna vitamina B3 in B5 ter v enem izdelku vitamini B6, B7 in B12). Osnova za analitsko vrednotenje vitaminov je bila metoda UHPLC, razvita v okviru magistrske naloge Andreje Horvat (38) (kromatografski pogoji so podrobneje predstavljeni v poglavju 3.2.2), ki smo jo uporabili za vrednotenje vitamina B12 in preverjanje prisotnosti vitamina B7 v KI. Ker v KI najpogosteje najdemo enega ali dva od naslednjih vitaminov B3, B5 in B6, smo za njihovo vrednotenje obstoječo analizno metodo ustrezno prilagodili, da smo skrajšali čas analize. V primerjavi z vitaminom B12 so vitamini B3, B5 in B6 bolj polarni in imajo posledično krajše retencijske čase, zato smo s spremembo deležov topil v mobilni fazi in načina izpiranja kolone (izokratsko namesto gradientno) razvili enostavnejšo metodo (metoda 1), ki omogoča sočasno analizo vitaminov B3, B5 in B6 v krajšem času. S tem smo pri metodi 1 skrajšali čas analize na 8,5 min iz začetnih 15 min (metoda 2). Končni kromatografski pogoji metode 1 pa so podani v poglavju 3.2.2.
4.2 VALIDACIJA ANALIZNIH METOD
Vpeljano analizno metodo za vrednotenje vitaminov B3, B5 in B6 smo ustrezno ovrednotili v skladu s smernico ICH za validacijo analiznih metod (39). Metodo 2 (Preglednica II) smo validirali za vrednotenje vitamina B12.
4.2.1 Selektivnost
Selektivnost metod smo najprej vrednotili s primerjavo kromatogramov uporabljenih topil (MQ, MeOH) s kromatogrami standardov analiziranih vitaminov, saj topila lahko vsebujejo nečistote, ki se eluirajo pri tr analitov in zato lahko motijo analizo. Iz kromatogramov, prikazanih v prilogi na Slikah P1, P2, P3, P4 in P5, je razvidno, da pri tr analitov ni prisotnih drugih vrhov, ki bi lahko motili analizo. Vrhovi analitov so simetrični in lepo ločeni eden od drugega. Selektivnost metode smo potrdili tudi z vizualnim pregledom kromatogramov vseh
21
testiranih izdelkov. V prilogi na Slikah P6 in P7 sta prikazana kromatograma dveh KI iz katerih je razvidna odsotnost kromatografskih vrhov ostalih sestavin oz. ustrezna ločba analitov od le-teh.
4.2.2 Linearnost
Linearnost metod smo vrednotili s pomočjo vzorcev za pripravo umeritvene premice, pripravljenih po postopku 3.3.2. Ker je bil R2 pri vseh vitaminih > 0,999 (Preglednica IX), smo linearnost metod potrdili za vse štiri analite.
Preglednica IX: Območje linearnosti, enačba umeritvene premice in R2 za posamezen analit.
Analit Območje linearnosti [mg/L] Enačba umeritvene premice R2
B3 7,50 – 300 y = 5554591x – 1427758 1,0000
B5 4,69 – 150 y = 1638216x + 503287 0,9999
B6 0,75 – 30,0 y = 7772388x – 285158 1,0000
B12 0,09 – 0,38 y = 2527043x + 30947 0,9997
4.2.3 Točnost in ponovljivost
Znotraj-dnevno točnost in ponovljivost smo preverjali s pomočjo KV vzorcev, pripravljenih po postopku 3.3.2. Kot je razvidno iz Preglednice X, smo točnost metode potrdili za vse analite, na vseh treh koncentracijskih območjih, saj so rezultati znotraj mej sprejemljivosti odstopanja (100 ± 5 % dejanske vrednosti). Potrdili pa smo tudi ponovljivost metode, saj RSD-ji priprave vzorcev za vse analite znašajo manj kot 5 %.
Preverjali smo tudi ponovljivost injiciranja, in sicer tako, da smo tri KV vzorce (iz treh različnih koncentracijskih območij), pripravljene po postopku 3.3.2, injicirali šestkrat zaporedoma. Ker povprečni RSD odzivov med ponovitvami pri nobenem analitu ni bil večji od 1 %, smo potrdili ponovljivost injiciranja (Preglednica X).
Preglednica X: Rezultati točnosti in ponovljivosti metod podani v % in s povprečnim RSD (levo). Rezultati ponovljivosti injiciranja, podani kot povprečni RSD (desno).
Analit % ORª Točnost
22 analizirali ob času 0, po 24 in 48 urah. Rezultati, ki so podani v Preglednici XI, predstavljajo upad oz. porast odziva, glede na začetni odziv (100 %). Ker vsi rezultati ustrezajo intervalu stabilnosti 90 – 110 % (večina rezultatov – za B3, B5 in B12 je celo znotraj intervala 95 – 105
%), smo potrdili stabilnost kontrolnih vzorcev, shranjenih v avtomatskem vzorčevalniku pri 20 ℃, 48 ur.
Preglednica XI: Rezultati stabilnosti KV vzorcev po 24 in 48 urah, predstavljeni kot % glede na časovno točko 0.
Analit Čas [h] 0 24 48
4.2.5 Meja zaznave in meja določitve
Meji zaznave in določitve smo izračunali po enačbah iz poglavja 3.4.5. Rezultati so prikazani v Preglednici XII.
Preglednica XII: Meja zaznave in meja določitve analitov.
Analit B3 B5 B6 B12 standardnega dodatka in tako preverili, ali iz vzorca izdelka ekstrahiramo celoten analit
23
(postopek 3.4.6.1). Ker so vsi rezultati izkoristkov ekstrakcij (Preglednica XIII) znotraj mej sprejemljivosti (95 – 105 %), smo potrdili ustreznost metode za predviden namen uporabe.
Preglednica XIII: Izkoristek ekstrakcije za vitamine B3, B5 in B12.
4.2.6.2 Ponovljivost priprave vzorcev
Vse vzorce testiranih izdelkov smo pripravili v treh paralelah, izračunali povprečni odziv in SD, ponovljivost priprave vzorcev pa smo podali z RSD. V Preglednici XIV so predstavljeni reprezentativni primeri proučevanih vitaminov v izbranih KI. Ker je RSD pri vseh vzorcih
< 5 %, lahko zaključimo, da je postopek priprave vzorcev ponovljiv. Ponovljivost vseh testiranih vzorcev KI kot SD pa je razvidna iz Preglednice PIII (Priloga).
Preglednica XIV: Rezultati ponovljivosti priprave izbranih vzorcev KI, podani kot RSD, n=3.
Okrajšava KI Povprečni odziv SD RSD [%]
Pri pregledu trga smo ugotovili, da so vitamini B-kompleksa zelo pogosto zastopani v t.i.
aktivni kozmetiki, torej kozmetiki, ki ima na koži učinkovito delovanje. Da KAS lahko delujejo, morajo prodreti v kožo, kar pa je pogojeno tudi z dolžino izpostavitve KI. Zatorej smo izbor KI zožili na izdelke, ki po nanosu ostanejo na koži. V aktivni kozmetiki sta najpogosteje zastopana vitamina B3 in B5, občasno pa se najdeta tudi vitamina B6 in B12, zato so vsi ti vitamini (v podobno pogosti pojavnosti kot na trgu), zastopani tudi v naboru izdelkov (Preglednica PI, Priloga). Izbrali smo tudi nekaj izdelkov z deklarirano vsebnostjo vitaminov, da smo lahko primerjali ugotovljeno vsebnost z navedeno vsebnostjo (G&G, BEP, BEP1, THEO, REXN, LRPCS, REV, MABX, PCN) (vse okrajšave izdelkov so podane v prilogi, v Preglednici I). V izboru izdelkov so tako predstavniki poltrdnih kot tekočih izdelkov. Vključili smo tudi izdelke s pretečenim rokom uporabe (EUC, BEP, BEPD, EUB),
Povprečni odziv
B3 metoda 1 B5 metoda 1 B12 metoda 2
Standard 612381078 135911337 410320
Vzorec 1040147648 193809952 289676
Vzorec + standard 1647014940 333846726 680454
Izkoristek [%] 99,1 104,5 95,2
24
izdelke različnih proizvajalcev in več izdelkov istega proizvajalca (LRPLi, LRPTO, LRPT, LRPC, LRPCS, LRPCG, LRPHS, LRPHY; REXN, REXR; AFRS, AFRT, AFYP; PCAA, PCN; CIE24, CIEQ10; BALQ10, BALV; BEP, BEP1, BEPD; SKINS, SKINT; DARH, DARI). Ker smo želeli preveriti, če obstaja povezava med ceno KI in vsebnostjo vitaminov B-kompleksa, smo z izborom izdelkov pokrili širok razpon cen (od 0,5 do 120€/50 mL KI).
4.3.2 Razvoj ekstrakcijskega postopka
Pri razvoju ekstrakcijskega postopka (postopek opisan v poglavju 3.5.1) smo najprej preverjali vpliv različnih topil in njihovih zmesi v različnih razmerjih na ekstrakcijo proučevanih vitaminov iz izbranih poltrdnih izdelkov. Rezultati, podani relativno glede na uporabo MeOH kot ekstrakcijskega topila (odziv vzorca v MeOH predstavlja 100 %), so predstavljeni v Preglednici XV. Na osnovi pridobljenih rezultatov lahko ugotovimo, da z uporabo topil MQ ali MeOH dosežemo najboljšo ekstracijo. Zmes heksana in vode smo izločili, saj so rezultati primerljivi ali slabši v primerjavi z MQ in MeOH, sam ekstrakcijski postopek pa je kompleksnejši in časovno bolj zamuden. ACN posamezno, ali v kombinaciji z MQ ali MeOH, je tudi manj ustrezen. Z uporabo ekstrakcijskih topil, ki vsebujejo ACN, ne dosežemo popolne ekstrakcije proučevanih vitaminov, poleg tega je ACN neustrezen tudi s kromatografskega vidika, saj se ob tr analitov pojavijo interference v kromatogramih (priloga, Slika P8).
Preglednica XV: Rezultati uporabe različnih topil pri razvoju ekstrakcijskega postopka za poltrdne izdelke, podani relativno (%) glede na topilo MeOH. Z zeleno barvo sta označeni topili, ki smo ju izbrali za nadaljnjo proučevanje na širšem naboru izdelkov.
*v kromatogramu so bile prisotne interference
Na osnovi zgornjih rezultatov smo ugotovili, da sta najustreznejši topili MQ in MeOH, zato smo nadalje za vsak izdelek izbrali enega od obeh ekstrakcijskih topil. Primerjavo med MQ
25
in MeOH smo pri tekočih KI izvedli še na izdelku G&G, kjer so bili rezultati primerljivi (razlika v izkoristku 0,7 %) (Preglednica XVI). Zato smo se pri tekočih izdelkih odločili, da je za njih primerno topilo MQ, glede na to, da vsebujejo velik delež vode. Obe izbrani topili smo nato preverili tudi na večjem številu ostalih poltrdnih izdelkov, pri čemer smo topilo za večino izdelkov izbrali individualno. Pri izdelkih iste znamke in podobne sestave pa smo uporabili topilo, ki se je prej izkazalo kot optimalno. Kot je razvidno iz Preglednice XVI, je MeOH boljša izbira za vse izdelke, razen za KI RB6.
Pri tekočih izdelkih smo opazili težave s ponovljivostjo priprave vzorcev, zato smo vzorce KI PCN, AFRT, THEO, REXN, MABX in G&G najprej pripravili z natehtano maso 10 mg, potem pa še s 25 mg. Iz Preglednice XVI je razvidno, da je pri vseh preizkušenih izdelkih ponovljivost boljša pri večji zatehani masi, zato smo to v nadaljevanju uporabili. Vzorec KI G&G smo pripravili tudi z/brez predhodnega vorteksiranja izdelka v ovojnini. Rezultati v Preglednici XVI kažejo, da predhodno vorteksiranje KI ne zagotavlja boljše ponovljivosti, ampak jo celo poslabša. Ker je ekstrakcija analita primerljiva, predhodnega vorteksiranja nadalje nismo izvajali. Končni postopek priprave vzorcev je opisan v poglavjih 3.5.2 in 3.5.3.
Preglednica XVI: Primerjava ponovljivosti priprave vzorca pri tekočih KI z natehtanima dvema različnima masama (levo) in učinkovitosti predhodnega vorteksiranja KI ter primerjava MeOH in MQ kot ekstrakcijskih topil (odziv, kjer je
Preglednica XVI: Primerjava ponovljivosti priprave vzorca pri tekočih KI z natehtanima dvema različnima masama (levo) in učinkovitosti predhodnega vorteksiranja KI ter primerjava MeOH in MQ kot ekstrakcijskih topil (odziv, kjer je