Reagenti/kemikalije Proizvajalec oziroma sestava kemikalije
Tekoči dušik Messer Slovenija, d.o.o., Ljubljana,
Slovenija / Istrabenz plini d.o.o., Koper, Slovenija
Dulbecco fiziološka raztopina s fosfatnim pufrom (angl. Dulbecco's phosphate buffered saline, DPBS)
Sigma-Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
0,25 % raztopina tripsina-EDTA (angl. Trypsin – EDTA)
Sigma-Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
Medij RPMI-1640 Sigma-Aldrich®, Merck KGaA,
Darmstadt, Nemčija
Fetalni goveji serum (angl. FBS) Sigma-Aldrich®, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
Antibiotik/antimikotik (penicilin, streptomicin/amfotericin B)
Gibco®, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, Ma, ZDA
GlutaMAX™-I (100x) Gibco®, Thermo Fisher Scientific
Inc. Waltham, Ma, ZDA
Človeški gastrin I Bachem AG, Bubendorf, Švica
Medij DMEM/F12 (DF-041-B) Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
Inzulin Sigma-Aldrich®, Merck KGaA,
Darmstadt, Nemčija Rekombinantni človeški epidermalni rastni faktor
(angl. Epidermal growth factor, EGF) (PHG0314)
Gibco®, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, Ma, ZDA
11 1 % goveji serumski albumin/DPBS (angl. bovine serum albumine/Dulbecco's phosphate buffered Tripansko modrilo 0,4 % (angl. Trypan Blue
Stain)
Ultračista voda (qH2O) (angl. Ultra Pure™
Distilled water, DNA/RNA free)
Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, Ma, ZDA
Standardi za določanje koncentracije proteinov:
goveji serumski albumin (angl. Protein Assay BSA Set)
Etanol, 70 % Itrij d.o.o., Kropa, Slovenija
20 % saharoza (20 g saharoza/100 mL DPBS) Sigma-Aldrich® by Merck KGaA, Darmstadt, Nemčija
Barvilo Ponceau rdeče 0,1 % Ponceau rdeče, 5 % etanojska kislina
Barvilo Comassie modro 0,1 % Comassie modro, 50 %
metanol, 10 % etanojska kislina
Pico-reagent za detekcijo Pt na membrani (angl.
SuperSignal™ West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate)
Thermo Fisher Scientific Inc.
Waltham, Ma, ZDA Femto-reagent za detekcijo Pt na membrani (angl.
Supersignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate)
Thermo Fisher Scientific Inc.
Waltham, Ma, ZDA
Ditiotreitol (angl. DTT), D1532 Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, Ma, ZDA
1-kratni lizirni pufer RIPA 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 0.5 % Na-deoksiholat (DOC), 0.1 % SDS, 50 mM Tris, pH=8.0
BD Horizon™ Karboksiflurescein sukcinimidil ester (BD Horizon™-CFSE)
BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA
12
3.1.3. MATERIALI IN LABORATORIJSKA OPREMA Preglednica II: Seznam materialov in laboratorijske opreme
Material/oprema Proizvajalec
Zamrzovalnik -20 ºC /
Zamrzovalnik -80 ºC /
Centrifuga MPW-260 MPW® Med. Instruments, Varšava, Poljska
Centrifuga 5910R Eppendorf Eppendorf, Hamburg, Nemčija
Centrifuga 5418R Eppendorf, Hamburg, Nemčija
Centrifuga Megafuge 16R, HERAEUS Thermo Scientific Inc. Waltham, MA, ZDA
Ultracentrifuga Optima XFN-80 Beckman Coulter®, Brea, CA, ZDA Mikrocentrifugirke z navojem za
zamrzovanje Crio-vial 2 mL
TPP®, Trasadingen, Švica Koničaste centrifugirke z navojem 15 mL,
50 mL
TPP®, Trasadingen, Švica Mikrocentrifugirke Protein LoBind® 1,5
mL
Avtomatski pipetor S1 Pipet Filler Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham, MA, ZDA
Serološki pipetni nastavki 10 mL, 25 mL TPP®, Trasadingen, Švica Aspiracijska pipeta 2 mL TPP®, Trasadingen, Švica Svetlobni mikroskop AE2000 Motic, Wetzlar, Nemčija
Inkubator HERAcel 150i (37 ºC, 5 % CO2) Thermo Scientific Inc. Waltham, MA, ZDA
Inkubator z vodno kopeljo (37ºC) GFL®, Burgwedel, Nemčija Komora z laminarnim pretokom zraka
Esco Class ⅡBSC, Airstream DUO
Esco, Singapur
Gojilne posode 150 TPP®, Trasadingen, Švica Gojilne posode z nagnjenim vratom T25,
T75, T300
TPP®, Trasadingen, Švica
Komora za štetje celic Countess Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc.
Waltham, MA, ZDA
Naprava za štetje celic Coutness Ⅱ Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc.
Waltham, MA, ZDA Ultrafiltracijske membrane Ultracel® -
100kDA
Merck Millipore Ltd., Merck KGaA, Darmstadt, Germany
13
Filtri PALL® Membrane PES 0,2 µm Pall Laboratory, MA, ZDA
Inkubator/stresalnik C24 Incubator Shaker New Brunswick Scientific Inc. Edison, NJ, ZDA
Mikrotitrska plošča 96F s 96 luknjicami TPP®, Trasadingen, Švica Mikrotitrska plošča 24 s 24 luknjicami TPP®, Trasadingen, Švica Vstavki za migracijske teste No. 80209 Ibidi GmBH Gräfelfing, Nemčija
Sterilna pinceta /
Mikroskop Incellis cell imager s kamero za slikanje mikrotitrskih ploščic
Bertin INSTRUMENTS, Montigny-le-Bretonneux, Francija
Čitalec mikrotitrskih plošč Synergy H4 BioTek™, Winooski, VT, ZDA Naprava za suho segrevanje/hlajenje
vzorcev v mikrocentrifugirkah CH-100
BIOSAN, Riga, Latvia
Spektrofotometer LAS4000 Fujifilm Life Science, NY, ZDA Polistirenske epruvete FALCON® 5mL Corning, NY, ZDA
BD FACSCanto™ Citometer BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA Velikostno kalibrirane fluorescentne
kroglice (fluorosfere), 2 µm in 3 µm (angl.
FluoSpheres™ Carboxylate-Modified
BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA Citokrom 18 konjugiran s fikoeritrinom
3.1.4. MEDIJI ZA GOJENJE CELIČNIH KULTUR
i. V sterilnih posodah smo namešali vse sestavine, podane v preglednicah III in IV, vsebino premešali in medija shranili pri 4 °C.
Preglednica III: Medij za celično linijo MKN45
Sestavina Končna koncentracija v mediju
Medij RPMI-1640 /
FBS 10 %
Antibiotik/antimikotik 1 %
glutaMAX 1 %
14
ii. Preglednica IV: Medij brez seruma (FBS) za celice MKN45
Sestavina Končna koncentracija v mediju
Medij RPMI-1640 /
Antibiotik/antimikotik 1 %
glutaMAX 1 %
iii. Medij za izolacijo zunajceličnih veziklov za celice MKN45
Medij za izolacijo zunajceličnih veziklov smo pripravili podobno kot osnovni hranilni medij, s to razliko, da smo raztopini FBS predhodno odstranili vezikle, tako da smo jo 24 ur centrifugirali pri 100 000 x g, pri 4 °C v ultracentrifugi. Po centrifugiranju smo raztopino prefiltrirali skozi filter z velikostjo por 0,2 µm. Opisani medij smo uporabili za gojenje celic, ki so nam služile kot kontrola. Za izločanje zunajceličnih veziklov, spodbujenih z gastrinom, smo mediju dodali še gastrin s končno koncentracijo 10 nM.
iv. Medij za celično linijo MCF-10A
Medij za celično linijo MCF-10A smo pripravili tako, da smo 100 µg EGF v prahu dodali 1 % BSA/DPBS in premešali na mešalu. Mediju DMEM/F12 smo dodali inzulin, raztopino EGF v 1 % BSA/DPBS in hidrokortizon ter vsebino prefiltrirali skozi filter z velikostjo por 0,2 µm. Nato smo dodali še raztopino FBS in antibiotik/antimikotik (preglednica Ⅴ).
Pripravljen medij smo shranili pri 4 °C.
Preglednica V: Medij za celično linijo MCF-10A
Sestavina Končna koncentracija v mediju
Medij DMEM/F12 /
Inzulin 10 mg/mL
EGF 100 µg/mL
hidrokortizon 1 mg/mL
FBS 5 %
Antibiotik/antimikotik 1 %
3.1.5. PROTITELESA ZA PRENOS WESTERN
Za metodo prenos Western, s katerim smo določili proteinsko sestavo zunajceličnih veziklov, smo uporabili protitelesa za proteine, ki so značilni za zunajcelične vezikle in so navedeni v preglednici Ⅵ.
15
Preglednica VI: Seznam uporabljenih protiteles za prenos Western
Primarno mišje monoklono protitelo razreda IgG
Proizvajalec Končna redčitev
Alix (sc-53540) Santa Cruz Biotechnology Inc, Dallas, Tx, ZDA
1:1000 v 5 % mleku HSC 70 (sc-7298) Santa Cruz Biotechnology
Inc, Dallas, Tx, ZDA
1:500 v 5 % mleku Tsg 101 (sc-7964) Santa Cruz Biotechnology
Inc, Dallas, Tx, ZDA
1:1000 v 5 % mleku Citokeratin 18 (sc-32329) Santa Cruz Biotechnology
Inc, Dallas, Tx, ZDA
1:1000 v 5 % mleku CD 9 (sc-13118) Santa Cruz Biotechnology
Inc, Dallas, Tx, ZDA
1:500 v 5 % mleku Citokrom C (sc-13156) Santa Cruz Biotechnology
Inc, Dallas, Tx, ZDA
1:500 v 5 % mleku Sekundarno protitelo Proizvajalec Končna redčitev Proti-mišje (sc-525409) Santa Cruz Biotechnology
Inc, Dallas, Tx, ZDA
1:4000 v 5 % mleku
3.1.6. PUFRI IN RAZTOPINE ZA ELEKTROFOREZO IN PRENOS WESTERN
Za izvedbo metode prenos Western smo pripravili pufre in raztopine navedene v preglednici Ⅶ.
Preglednica VII: Seznam uporabljenih raztopin in njihova sestava
Pufri in raztopine Priprava
20 % saharoza 20 g saharoza/100 mL DPBS
20 % natrijev dodecilsulfat (angl.SDS) 20 g SDS/100 mL DPBS 5 % mleko za blokiranje membrane (50 mL) 2,5 g mleka v prahu
do 50 mL 1-kratni pufer TBS-Tween
10-kratni pufer TBS (1L) 24 g Tris
88 g NaCl dH2O
uravnati pH na 7,6 dodati dH2O do 1L
1-kratni pufer TBS-Tween (1L) 100 mL 10-kratni pufer TBS 900 mL dH2O
1 mL Tween 10-kratni pufer za izvedbo ELISE (1L)
(angl. running buffer)
30,275 g Tris 144 g glicin 50 mL 20 % SDS
16
dodati dH2O do 1L
redčimo z dH2O do 1-kratnega pufra 10-kratni pufer za prenos proteinov (1L)
(angl. transfer buffer)
30,275 g Tris 144 g glicin dodati dH2O do 1L 1-kratni pufer za prenos proteinov (1L)
(angl. transfer buffer)
100 mL10-kratni pufer za prenos proteinov
200 mL metanol 700 mL dH2O Nanašalni pufer za pripravo vzorcev za
prenos Western (angl. loading buffer) Blag pufer za odstranjevanje protiteles iz
membrane (1L) Pufer za umerjanje pH metra (pH=7,00) Na₂HPO₄*2H₂O/K₂HPO₄ Pufer za umerjanje pH metra (pH=4,00) Citronska kislina/NaOH/HCl Pufer za umerjanje pH metra (pH=10,00) H3BO3/KCl/NaOH
3.1.7. PRIPRAVA GELA ZA POLIAKRILAMIDNO GELSKO ELEKTROFOREZO
Pomemben je vrstni red dodajanja raztopin, kot je naveden v preglednici VIII. APS in TEMED smo dodali v komori z laminarnim pretokom zraka. V originalnem predpisu navajajo 10 % SDS in 30 % akrilamid. V laboratoriju MCMB smo imeli 20 % SDS in 37,5
% akrilamid, zato smo prilagodili predpis tako, da smo upoštevali redčenje z destilirano vodo.
Preglednica VIII: Ločitveni (A.) in koncentracijski gel (B.) za poliakrilamidno gelsko elektroforezo in prenos Western
17 B.
Koncentracijski gel, SDS PAGE, 12 % Količina za 2 gela (V=10 mL)
H2O 6,21 mL
Tris (pH= 6,8) 2,5 mL
10 % SDS 50 µL 20 % SDS + 50 µL H2O
37,5 % akrilamid 1,08 mL
APS 100 µl
TEMED 10 µl
3.2. METODE
3.2.1. PRIPRAVA CELIČNIH LINIJ (ODMRZOVANJE IN NASAJANJE CELIC)
Celice MKN45 (približno 3 milijone celic) so bile shranjene v mikrocentrifugirkah z navojem v raztopini FBS in DMSO v razmerju 9:1 in zmrznjene v tekočem dušiku.
Vsebino mikrocentrifugirke smo prenesli v centrifugirko z gojitvenim medijem RPMI-1640, tako da smo raztopino celic počasi nadplastili v medij. Raztopino celic v mediju smo centrifugirali 5 minut pri 1000 x g pri sobni temperaturi, da smo odstranili DMSO. Po centrifugiranju smo odstranili supernatant in celice resuspendirali v 1 mL medija za celično linijo MKN45. Ustrezen volumen celic smo prenesli v gojilne posode T25, v katere smo predhodno dodali 5 mL medija. Celice smo inkubirali v inkubatorju pri 37 °C in v atmosferi s 5 % CO2. Enak postopek smo uporabili za celice MCF-10A, s to razliko, da smo uporabili gojitveni medij DMEM/F12.
3.2.2. GOJENJE CELIČNIH LINIJ MKN45 IN MCF-10A
Celice MKN45 in MCF-10A smo presadili, ko so dosegle 80 % preraščenost (konfluentnost). Običajno so to stopnjo dosegle po treh dneh gojenja pri 37 °C in v atmosferi s 5 % CO2. Medij za gojenje celic smo odpipetirali v centrifugirko, pritrjene celice sprali z raztopino DPBS in jim dodali raztopino tripsin-EDTA. Ko so se celice odlepile s površine, smo jih prestavili v centrifugirko z medijem za gojenje in centrifugirali 5 minut pri 1000 x g pri sobni temperaturi. Po centrifugiranju smo odstranili supernatant z aspiracijsko pipeto in celicam dodali 1 mL gojitvenega medija. Ustrezen volumen celic smo nasadili v gojitvene posode T75 ali gojitvene plošče 150 cm2, v katere smo dodali ustrezen medij za gojenje celic. Celice smo inkubirali v inkubatorju pri 37 °C in v atmosferi s 5 % CO2.
18 3.2.3. ŠTETJE CELIC
Štetje celic smo izvedli po centrifugiranju, ko smo jih ponovno resuspendirali v mediju ali DPBS. S serološko pipeto smo izmerili končni volumen resuspendiranih celic. Del zmesi celic v suspenziji smo odpipetirali v mikrocentrifugirko in jim dodali barvilo tripansko modrilo v razmerju 1:1. V komoro za štetje celic Countess smo odpipetirali 10 L te zmesi. Naprava za štetje celic Countess Ⅱ nam je podala celokupno koncentracijo celic v komori, pri čemer je bilo že upoštevano redčenje zaradi barvila, ter odstotek živih in mrtvih celic. Končno celokupno koncentracijo živih celic smo izračunali tako, da smo podatek o koncentraciji živih celic pomnožili s končnim volumnom, ki smo ga prej izmerili. Na podlagi tega podatka smo po potrebi redčili zmes celic.
3.2.4. TRETIRANJE CELIČNE LINIJE MKN45 Z GASTRINOM
Za pripravo poizkusa z gastrinom smo celično linijo MKN45 nasadili v gojišče za izolacijo zunajceličnih veziklov in dodali gastrin. Komercialni gastrin je v obliki prahu, zato smo ga raztopili v DPBS. V epruveto z gastrinom smo dodali raztopino DPBS, da se je gastrin raztopil in pazili, da pri dodajanju DPBS-a niso nastajali skupki. Nato smo tako raztopljeno zmes gastrina in DPBS še 5-krat redčili z DPBS do končne koncentracije 60 µM.
Raztopino gastrina v DPBS smo alikvotirali po 100 µL v mikrocentrifugirke in jih zamrznili pri -80 ºC. Mikrocentrifugirke, ki smo jih potrebovali za eksperiment, smo odtajali v ledeni kopeli.
Celice MKN45 smo najprej za 24 ur izpostavili mediju brez seruma (FBS). Nato smo z aspiracijsko pipeto odstranili gojišče brez seruma. Večina celic je bila pritrjenih na površino, prisotnih pa je bilo nekaj prosto plavajočih celic. Celic nismo spirali in celicam nismo dodajali tripsina, temveč smo v gojilne posode 150 cm2 dodali gojišče za izolacijo zunajceličnih veziklov in gastrin do končne koncentracije 10 nM. Za kontrolo smo pripravili celice MKN45, ki smo jih gojili v 16 mL gojišča za izolacijo zunajceličnih veziklov, brez dodatka raztopine gastrina. Celice smo inkubirali 48 ur pri 37 ºC v atmosferi s 5 % CO2, da so se v medij lahko izločili zunajcelični vezikli.
3.2.5. IZOLACIJA ZUNAJCELIČNIH VEZIKLOV
Medij z izločenimi zunajceličnimi vezikli smo prestavili v ustrezno označene centrifugirke in jih centrifugirali 5 minut pri 1000 x g pri sobni temperaturi, da smo odstranili celice in/ali celične ostanke. Supernatant z zunajceličnimi vezikli smo prestavili v nove, ustrezno
19
označene centrifugirke. Celice na ploščah smo sprali z DPBS in jim dodali raztopino tripsin-EDTA, da so se odlepile od podlage. Nato smo celice prešteli.
i. IZOLACIJA ONKOSOMOV
Centrifugirke z zunajceličnimi vezikli smo centrifugirali 10 minut pri 2800 x g pri 20 ºC.
Tako smo zagotovili, da so se na dno centrifugirke najprej posedli večji zunajcelični vezikli in onkosomi. Supernatant smo prenesli v nove centrifugirke za nadaljnje ločevanje zunajceličnih veziklov z ultracentrifugiranjem. Usedlini večjih zunajceličnih veziklov oziroma onkosomov smo dodali raztopino DPBS, ki smo jo predhodno prefiltrirali skozi filter s porami velikosti 0,2 µm. Nato smo celotno vsebino prenesli v mikrocentrifugirke, ki na stene ne vežejo proteinov. Mikrocentrifugirke smo centrifugirali 10 minut pri 2800 x g pri 20 ºC. Po centrifugiranju smo usedlino zunajceličnih veziklov na zunanji strani mikrocentrifugirke označili in previdno odstranili ves supernatant. Usedlini smo dodali 50 µL filtrirane raztopine DPBS in vzorce shranili pri -80 ºC.
ii. IZOLACIJA MIKROVEZIKLOV
Centrifugirke s supernatantom, ki smo ga pridobili po prvem centrifugiranju raztopine zunajceličnih veziklov, smo centrifugirali v ultracentrifugi 30 minut pri 10 000 x g pri 4 ºC. Po centrifugiranju smo označili položaj usedline mikroveziklov na zunanji strani mikrocentrifugirke in hitro prenesli večino supernatanta v nove centrifugirke. Iz centrifugirke z usedlino mikroveziklov smo previdno odstranili ves preostali supernatant.
Nato smo tej usedlini dodali 50 µL filtrirane raztopine DPBS in centrifugirke shranili v ledeni kopeli. Z mešanjem s pipeto smo razbili skupke mikroveziklov in vzorce prenesli v mikrocentrifugirke, ki na stene ne vežejo proteinov, in jih shranili pri -80 ºC.
iii. IZOLACIJA EKSOSOMOV
Za izolacijo eksosomov smo najprej pripravili ultracentrifugirke s 5,6 mL raztopine 20 % saharoze. Supernatant z eksosomi, ki smo ga pridobili po drugem centrifugiranju raztopine zunajceličnih veziklov, smo najprej prefiltrirali, da smo se znebili možnih nečistoč in večjih veziklov, in nato še koncentrirali vzorce pri 4000 x g in 20 ºC do končnega volumna okoli 20 mL. Nato smo počasi dodali vzorce v ultracentrifugirke s predpripravljeno raztopino 20 % saharoze tako, da se raztopini supernatanta z eksosomi in saharoze nista zmešali. Centrifugiranje smo izvedli v ultracentrifugi, v vakuumu pri 100 000 x g in 4 ºC.
Čas centrifugiranja je bil 2h in 15 minut. Usedlino eksosomov smo označili na zunanji strani centrifugirke in z aspiracijsko pipeto odstranili ves supernatant. Dodatno smo
20
odrezali vrhove ultracentrifugirk, zato da smo s papirnato brisačo previdno obrisali odvečno gojišče, nato smo odrezane ultracentrifugirke položili v posodo z ledom. Usedlini eksosomov smo dodali 50 µL filtrirane raztopine DPBS in mešanico inkubirali v posodi z ledom 30 minut. Med inkubacijo smo mešanico večkrat premešali s pipeto. Po 30 minutah smo raztopine eksosomov prestavili v mikrocentrifugirke, ki na stene ne vežejo proteinov, in jih shranili pri -80 ºC.
Slika 5: Shema celotne izvedbe poizkusa (ZV-zunajcelični vezikli, gastrin-označuje celice, z dodanim gastrinom v gojišču).
3.2.6. MERJENJE KONCENTRACIJE PROTEINOV
Za merjenje koncentracije proteinov smo uporabili predhodno pripravljene reagente za določanje koncentracije proteinov (angl. BCA protein assay kit). Za pripravo umeritvene krivulje smo izbrali standardne raztopine s koncentracijami 2000 µg/mL, 1500 µg/mL, 750 µg/mL, 500 µg/mL in 125 µg/mL. Reagenta A in B, ki sta del kompleta reagentov za določanje koncentracije proteinov (angl. BCA protein assay kit), smo zmešali v razmerju 50:1. Nato smo v luknjice 96-mestne mikrotitrske ploščice prenesli po 200 µL mešanice reagentov A in B. Mikrocentrifugirke z vzorci zunajceličnih veziklov smo pred nanosom v mikrotitrsko ploščico za kratek čas centrifugirali pri 4 ºC, da smo se znebili skupkov veziklov. Nato smo v mikrotitrsko ploščo dodali po 5 µL standardih raztopin z znanimi koncentracijami proteina, po 5 µL qH2O, DPBS in pufra RIPA, ki so služile kot negativne kontrole. Nato smo nanesli po 5 µL raztopin vzorcev zunajceličnih veziklov, raztopljenih v DPBS, za določanje koncentracije zunajceličnih veziklov za migracijske teste, in po 5 µL raztopin vzorcev zunajceličnih veziklov, raztopljenih v pufru RIPA, za določanje
21
koncentracije zunajceličnih veziklov za prenos Western. Mikrotitrsko ploščo smo zavili v aluminijasto folijo in jo 30 minut inkubirali pri 37 ºC. Po inkubaciji smo v spektrofotometru Synergy H4 izmerili absorbance v vidnem spektru pri valovni dolžini 562 nm. Iz podatkov o izmerjeni absorbanci, smo izračunali mase in koncentracije proteinov na površini veziklov po enačbi: y=ax+b, kjer x predstavlja maso proteinov.
Koncentracijo proteinov [µg/µL] smo izračunali tako, da smo maso proteinov delili z volumnom vzorca v luknjici. Končne volumne vzorcev veziklov smo izmerili s pipeto, saj smo ta podatek potrebovali za izračun koncentracije.
3.2.7. PRENOS WESTERN
Prenos Western je semi-kvantitativna metoda za določanje in opredelitev velikosti specifičnih proteinov. Prvi korak je izločanje proteinov iz zunajceličnih veziklov s pomočjo lizirnega pufra RIPA in priprava gela. Sledi nanos vzorcev na gel, elektroforezna ločba proteinov, prenos proteinov na nitrocelulozno membrano. Pri prenosu proteinov gre za zrcalno migracijo proteinov z gela na nitrocelulozno membrano, pod mokrimi pogoji.
Zadnji korak je kemiluminiscentna detekcija proteinov s specifičnimi primarnimi in sekundarnimi protitelesi.
Najprej smo pripravili ločitveni in koncentracijski gel po zgoraj opisanem postopku (preglednica ⅤⅢ), nato pa smo pripravili vzorce. V mikrocentrifugirke, ki na stene ne vežejo proteinov, smo za en vzorec napipetirali 5 µL nanašalnega pufra (angl. loading buffer), 14 µL vzorca in 1 µL DTT, v tem vrstnem redu, ter vsebino hitro premešali na mešalu za epruvete in pripravljene vzorce 10 minut segrevali pri 70 °C. V luknjice v gelu smo nanesli 2,5 µL vzorca proteinske velikostne lestvice in po 20 µg vzorca.
Poliakrilamidno gelsko elektroforezo smo izvajali 10 min pri 150 V v pufru za elektroforezo (angl. running buffer). Nato smo izvedli prenos proteinov na membrano v 1-kratnem pufru za prenos proteinov (angl. transfer buffer). Postopek smo izvajali pri 100 V, 1 uro in 15 min.
3.2.8. DETEKCIJA PROTEINOV PO PRENOSU WESTERN
Po prenosu proteinov smo odstranili gel in membrano. Membrano smo barvali s Ponceau rdečim barvilom približno 10 minut, nato smo jo spirali z destilirano vodo. Ko smo odstranili barvilo, smo membrano potopili v 5 % mleko in jo nežno stresali na stresalniku za 1 uro. Membrano smo razrezali in na različne dele dodali različna primarna mišja protitelesa, ter membrano stresali 24 ur pri 4 °C. Membrano oziroma dele membran smo
22
odstranili iz raztopine primarnih protiteles in jo/jih spirali z 1-kratnim pufrom TBS-Tween približno 30 minut. Na vsak del membrane smo dodali sekundarno proti-mišje protitelo in jih stresali 2 uri. Po koncu smo odstranili sekundarno protitelo, dele membran spirali z 1-kratnim pufrom TBS-Tween približno 30 minut in nato s kemiluminiscenco detektirali proteine na membrani s kompletom reagentov Pico ali Femto.
3.2.9. OPTIČNO SLEDENJE POSAMEZNEMU DELCU (ANGL. NTA)
S to metodo analiziramo delce v suspenziji, glede na analizo Brownovega gibanja, v realnem času. Metoda je primerna za delce velikosti od 50 do 1000 nm. V primeru, da imamo znan tudi volumen vzorca, lahko določimo še koncentracijo delcev. S posebnim računalniškim algoritmom hkrati sledimo gibanju posameznih delcev v realnem času tako, da snemamo video približno v 30 sekundnih intervalih. S programsko opremo nato določimo velikost posameznega delca. Za določanje koncentracije izvedemo kalibracijo, s setom standardov znanih velikosti in koncentracij, in na podlagi volumna vzorcev, ki smo jih vnesli v napravo, izračunamo še koncentracijo (79).
Z napravo Nanosight NS300TM smo izvedli analizo mikroveziklov in eksosomov. V mikrocentrifugirko, ki na stene ne veže proteinov, smo napipetirali 5 µL vzorca in ga redčili v 995 µL filtriranega DPBS ter vsebino premešali na mešalu. Najprej smo posneli video za filtriran DPBS, nato pa smo še za vsak vzorec posneli 5 videov; vsak je bil dolg 60 s. Vse meritve smo izvedli s kamero na nivoju 14, s pragom 5, pri temperaturi 25 °C.
Detekcijo in analizo vzorcev smo izvedli s programom NTA 3.4 – Sample Assistant Build 3.4.4-SA.
3.2.10. PRETOČNA CITOMETRIJA
Pretočna citometrija je tehnika, s katero analiziramo lastnosti posameznih delcev, v suspenziji, ki drug za drugim prehajajo ozek snop laserske svetlobe (80). Količina prejete svetlobe na fotodetektorju FSC (angl. forward scatter) in fotodetektorju SSC (angl. side scatter) je sorazmerna z velikostjo in granuliranostjo (kompleksnostjo) delca. Delce lahko dodatno označimo s fluorescenčnimi barvili in tako pridobimo dodatne informacije o delcih. Podatke prikažemo s točkovnim diagramom (81). Za določanje značilnosti naših vzorcev smo izbrali karboksifluorescein sukcinimidil ester (CFSE) (521 nm), ki sveti zeleno in protitelo CK18, ki je konjugirano s fikoeritrinom (PE) (576 nm) in sveti oranžno (82). Lastnost CFSE, da pasivno difundira skozi membrano, tam pa se hidrolizira z
23
znotrajcelično esterazo in tako postane fluorescenten, smo izkoristili za jasno razlikovanje zunajceličnih veziklov z intaktno membrano od celičnega drobirja (83).
S pretočnim citometrom lahko dobro ovrednotimo delce večjih velikosti, zato smo s to metodo analizirali onkosome in mikrovezikle, ne pa eksosomov. Najprej smo naredili optimizacijo protokola in ugotovili, da se tako onkosomi kot tudi mikrovezikli lepo barvajo
S pretočnim citometrom lahko dobro ovrednotimo delce večjih velikosti, zato smo s to metodo analizirali onkosome in mikrovezikle, ne pa eksosomov. Najprej smo naredili optimizacijo protokola in ugotovili, da se tako onkosomi kot tudi mikrovezikli lepo barvajo