17
4.2 Sintezni postopki in analizni rezultati
4.2.1 Sinteza (R)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-((2-nitrofenil)amino)propanojske kisline (44)
Postopek
V 100 mL bučko smo zatehtali spojino 1 (4,906 g, 24 mmol, 1,0 ekv.) in jo raztopili v 50 mL DMF. Mešali smo na magnetnem mešalu, da se je celotna spojina 1 raztopila ter dodali NaHCO3 (4,314 g, 50 mmol, 2 ekv.). Bučko smo opremili z vodnim hladilnikom ter reakcijsko zmes segreli na 70 °C ter reakcijo izvajali v argonovi atmosferi. Po kapljicah smo dodali spojino 2 (2,83mL, 27,5 mmol, 1,1 ekv.) ter pustili mešati čez noč. Potek reakcije in izolacijo smo spremljali s TLC. Po zaključeni reakciji smo reakcijsko zmes ohladili na sobno temperaturo ter ji na oljni črpalki uparili DMF. Zaostanek po uparevanju smo raztopili v 50 mL destilirane vode (VF) ter raztopino prenesli v lij ločnik, kjer smo ekstrahirali 3-krat s po 50 mL EtOAc. VF smo nato nakisali s 3 M HCl (8,3 mL) do pH = 3 ter izvedli ponovno ekstrakcijo s 3-krat po 50 mL EtOAc (OF). VF smo zavrgli, združene OF pa sušili nad Na2SO4, filtrirali, ter jim pod znižanim tlakom odstranili topilo in tako pridobili spojino 3 intenzivno oranžne barve. Istovetnost smo potrdili z NMR in MS. Reakcijo smo izvedli večkrat, vedno z enakim razmerjem reagentov in topila. Začeli smo s 100 mg reagenta 1 in povečali na 1 g, 2 g ter na koncu na 5 g.
Rezultati
Videz: amorf oranžne barve
MS (ESI+): m/z za C14H19N3O6 ([M + H]+): izračunano 326,13; izmerjeno 326,1.
18
Izkoristek: η1 = 34,5 % (0,106 g), η2 = 29 % (0,09 g), η3 = 62,5 % (0,199 g), η4 = 47,2 % (1,28 g), η5 = 65,3 % (1,98 g), η6 = 77,7 % (2,506 g), η7 = 64,4 % (1,023 g), η8 = 69,2 % (5,483 g), η9 = 68,0 % (5,255 g), η10 = 66,4 % (5,251 g), η11 = 71,4 % (5,505 g)
Rf: 0,6 (MF: DKM/MeOH = 3/1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1,35 (s, 9H, CH3); 3,49-3,56 (m, 2H, NH-CH2);
4,21 (m, 1H, NH-CH-COOH); 6,73 (t, 1H, J = 18 Hz, Har); 7,08 (d, 1H, J = 18 Hz, Har); 7,32 (d, 1H, J = 18 Hz, Har); 7,57 (t, 1H, J = 18 Hz, Har); 8,08 (d, 1H, CH-NH-COO); 8,21 (t, 1H, Ar-NH); 12,94 (s, 1H, COOH).
4.2.2 Sinteza (R)-3-((2-aminofenil)amino)-2-((terc-butoksikarbonil)amino)propanojske kisline (44)
Postopek
V 225 mL brezvodnega EtOH raztopili spojino 3 (5,255 g, 16,2 mmol) ter jo kvantitativno prenesli v 500 mL dvovrato bučko. Dodali smo magnetek za magnetno mešalo in preko ventila s pomočjo vodne črpalke evakuirali hlape topila. Dvovrato bučko smo napolnili z argonovo atmosfero in s plastičnim priborom preko steklenega lija dodali 2 g paladija na ogljiku (Pd/C). Za tem smo še enkrat odstranili hlape topila in dodan argon ter bučko napolnili z H2 atmosfero. Potek reakcije smo spremljali s TLC. Po 4 urah smo reakcijo prekinili. Pd/C smo odfiltrirali ter zaostanek sprali s topilom in brezvodnim EtOH. Filtratu smo uparili topilo in tako pridobili spojino 4. Istovetnost smo potrdili z NMR in MS.
Reakcijo smo izvedli večkrat, vedno z enakim razmerjem reagentov in topila. Produkt smo brez predhodnega čiščenja uporabili v naslednjih sinteznih stopnjah.
Rezultati
Videz: kristali rjave barve
19
MS (ESI+): m/z za C14H21N3O4 ([M + H]+): izračunano 296,15; izmerjeno 296,1.
m/z za C14H21N3O4 ([M + Na]+): izračunano 318,15; izmerjeno 318,1.
MS (ESI-): m/z za C14H21N3O4 ([M - H]-): izračunano 294,15; izmerjeno 294,0.
Izkoristek: η1 = 69,2 % (0,220 g), η2 = 62 % (0,112 g), η3 = 64,1 % (1,835 g), η4 = 59,9
% (1,12 g), η5 = 78,3 % (1,78 g), η6 = 91,3 % (0,847 g), η7 = 76 % (3,801 g), η8 = 92,4 % (4,693 g), η9 = 94,3 % (5,501 g), η10 = 92,3 % (4,563 g)
Rf: 0,75 (MF: DKM/MeOH = 1/1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1,39 (s, 9H, CH3); 3,34 (m, 2H, NH-CH2); 4,19 (m, 1H, NH-CH-COOH); 6,44-6,56 (m, 4H, Har); 6,58 (m, 1H, Ar-NH); 7,18 (d, 1H, J = 20 Hz, CH-NH-COO).
4.2.3 Sinteza terc-butil (R)-(2-okso-2,3,4,5-tetrahidro-1H-benzo[b][1,4]diazepin-3-il)karbamata (44)
Postopek
V 100 mL bučko smo zatehtali spojino 4 (5,501 g, 18.6 mmol, 1 ekv.) in jo raztopili v 45 mL DMF. Reakcijsko zmes smo ohladili na ledeni kopeli. Nato smo dodali sklopitveni reagent EDC v obliki hidroklorida (3,93 g, 20,5 mmol, 1,1 ekv.) in pustili reagirati čez noč.
Potek reakcije smo spremljali s TLC. Po končani reakciji smo reakcijsko zmes v liju ločniku z NaHCO3 naalkalili do pH = 9 ter ekstrahirali s 3-krat po 50 mL EtOAc. OF smo združili, sprali z nasičeno raztopino NaHCO3, nasičeno raztopino NaCl in sušili nad Na2SO4 ter filtrirali. Filtratu smo uparili EtOAc in na oljni črpalki zaostal DMF. Na NMR spektru so bile prisotne nečistote, zato smo produkt čistili s kolonsko kromatografijo (mobilna faza:
EtOAc/Hex = 1/1). Prisotnost produkta v frakcijah smo preverjali s TLC. Združenim frakcijam smo uparili topilo in tako pridobili spojino 5, katere istovetnost smo potrdili z
20
NMR in MS. Čistost produkta in uspešnost čiščenja s kolonsko kromatografijo smo preverili s HPLC. Reakcijo smo ponovili večkrat. Začeli smo z 200 mg spojine 3 in povečali na 1 g, 2 g ter na koncu na 5 g.
Rezultati
Videz: amorf svetlo rumene barve
MS (ESI+): m/z za C14H19N3O3 ([M + H]+): izračunano 278,14; izmerjeno 278,1.
m/z za C14H19N3O3 ([M + Na]+): izračunano 300,14; izmerjeno 300,1.
MS (ESI-): m/z za C14H19N3O3 ([M - H]-): izračunano 276,14; izmerjeno 276,1.
HPLC: tvz. = 13,26 min; AUCt=13,26 min; λ= 214 nm = 82,75 %; čistost pri AUCt=13,26 min; λ=
280 nm = 87,11 %
Izkoristek: η1 = 34,3 % (0,107 g), η2 = 54,8 % (0,944 g), η3 = 73,5 % (2,086 g), η4 = 74,7
% (5,954 g), η5 = 64,1 % (3,314 g), η6 = 61,3 % (3,571 g) Rf: 0,3 (MF: EtOAc/Hex = 1/1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1,37 (s, 9H, CH3); 4,14 (m, 1H, NH-CH-CONH);
5,60 (d, 1H, Ar-NH-CH2); 6,73 (t, 1H, J = 19 Hz, CH-NH-COO); 6,83-6,94 (m, 4H, Har);
9,69 (s, 1H, Ar-NH-CO).
4.2.4 Poskus sinteze terc-butil ((3R)-1-(cikloheks-2-en-1-il)-4-okso-2,3,4,5-tetrahidro-1H-benzo[b][1,4]diazepin-3-il)karbamata (44)
Postopek
V 10 mL bučko smo zatehtali spojino 5 (0,400 g, 1,44 mmol, 1 ekv.) in jo raztopili v 0,7 mL DMF. V bučko smo dodali NaHCO3 (0,214 g, 2,88 mmol, 2 ekv.), jo opremili z magnetim mešalom in vodnim hladilnikom ter reakcijsko zmes segreli na 50 °C. Dodali smo
3-21
bromocikloheks-1-en (0,331 mL, 2,88 mmol, 2 ekv.). Potek reakcije smo spremljali s TLC.
Po dveh urah smo reakcijo ustavili in reakcijsko zmes ohladili na sobno temperaturo. Nastali produkt smo izolirali z ekstrakcijo. Dodali smo 0,7 mL destilirane vode ohlajene na ledu in 1,4 mL DKM. Domneven produkt in mnogi stranski produkti so bili prisotni v OF, zato smo se po uparevanju topil odločili za prekristalizacijo z uporabo diizopropilnega etra. Nastala spojina je bila prisotna tudi v matičnici. Matičnici smo uparili topilo, prekristaliziran produkt pa odnučali z odsesavanjem. Istovetnost produkta v matičnici in prekristaliziranega smo preverili z NMR in ugotovili, da nismo sintetizirali želene spojine 6'.
Rezultati
Videz: amorf bele barve
Izkoristek: ηkrist. = 9,7 % (0,05 g), ηmatičnica = 14,5 % (0,075 g) Rf: 0,5 (MF: EtOAc/Hex = 1/1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): //
4.2.5 Sinteza terc-butil (R)-(1-cikloheksil-4-okso-2,3,4,5-tetrahidro-1H-benzo[b][1,4]diazepin-3-il)karbamata (45)
Postopek
V 30 mL AcOH smo raztopili spojino 5 (3,57 g, 12,9 mmol, 1 ekv.) ter jo kvantitativno prenesli v 100 mL dvovrato bučko. Dodali smo magnetek za magnetno mešalo in cikloheksanon (4,82 mL, 46,6 mmol, 3,5 ekv.). Reakcijsko zmes smo pustili mešati 1 uro.
Preko ventila smo s pomočjo vodne črpalke evakuirali hlape topila. Dvovrato bučko smo napolnili z argonovo atmosfero in s plastičnim priborom preko steklenega lija dodali 0,102 g platinovega (IV) oksida. Za tem smo še enkrat evakuirali hlape topila in argon ter bučko napolnili še z H2 atmosfero in pustili na magnetnem mešalu 6 ur. Po preteklem predpisanem času, smo v dvovrato bučko dodali 14,75 mL EtOAc, 0,060 g aktivnega oglja in 3 M NaOH
22
(170 mL,1 ekv. glede na AcOH). Tako pripravljeno reakcijsko zmes smo pustili mešati še dodatno 1 uro, tako da sta nastali dve fazi. Potek reakcije smo spremljali s TLC. Platinov (IV) oksid in aktivno oglje smo odfiltrirali. V liju ločniku smo ločili OF od VF ter ugotovili, da se produkt nahaja v OF. To smo nato sprali z nasičeno raztopino NaHCO3, nasičeno raztopino NaCl in na koncu sušili nad Na2SO4 ter filtrirali. Na koncu smo OF še uparili EtOAc. Na NMR spektru so bile prisotne nečistote, zato smo produkt čistili s kolonsko kromatografijo (mobilna faza: EtOAc/Hex = 3/7). Prisotnost produkta v frakcijah smo preverjali s TLC. Združenim frakcijam smo uparili topilo in tako izolirali spojino 6. Njeno istovetnost smo potrdili z NMR in MS. Reakcijo smo ponovili večkrat, najprej s 100 mg spojine 5 in povečali na 1 g, 2 g ter na koncu na 3 g.
Rezultati
Videz: amorf bledo rumene barve
MS (ESI+): m/z za C20H29N3O3 ([M + H]+): izračunano 360,22; izmerjeno 360,3.
m/z za C20H29N3O3 ([M + Na]+): izračunano 382,22; izmerjeno 382,3.
Izkoristek: η1 = 15,4 % (0,188 g), η2 = 86,5 % (2,341 g), η3 = 62 % (2,665 g), η4 = 88,8
% (6,861 g), η5 = 88,23 % (4,083 g)
Rf: 0,25 (MF: EtOAc/Hex = 3/7)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1,34 (s, 9H, CH3); 1,11-1,78 (m, 10H, CH2); 1,95 (m, 1H, CH); 4,02 (m, 1H, NH-CH-CONH); 6,96-6,99 (m, 2H, Har); 6,97 (m, 1H, CH-NH-COO); 7,09-7,18 (m, 2H, Har); 9,60 (s, 1H, Ar-NH-CO).
4.2.6 Sinteza terc-butil (R)-(5-cikloheksil-1-(3,3-dimetil-2-oksobutil)-2-okso-2,3,4,5-tetrahidro-1H-benzo[b][1,4]diazepin-3-il)karbamata (45)
23 Postopek
V 100 mL bučko smo zatehtali spojino 6 (2,665 g, 7,41 mmol, 1 ekv.) in jo raztopili v 20 mL DMF. Nato smo dodali K2CO3 (1,07 g, 7,7 mmol, 1 ekv.), KI (0,043 g) ter TBABr (0,05 g). Dodali smo magnetno mešalo in reakcijsko zmes segreli na 60 °C ter dodali 1-kloropinakolona (1,17 mL, 8,9 mmol, 1,2 ekv.), opremili bučko z vodnim hladilnikom in pustili mešati čez noč. Potek reakcije smo spremljali s TLC. Po pretečenih 12 urah smo ugasnili mešalo in pustili, da se reakcijska zmes ohladi na sobno temperaturo. Nato smo v bučko dodali 20 mL ledeno mrzle vode in ekstrahirali s 3-krat po 40 mL EtOAc.OF smo združili, sprali z nasičeno raztopino NaHCO3, nasičeno raztopino NaCl, sušili z Na2SO4 in filtrirali. Uparili smo EtOAc in z oljno črpalko zaostali DMF, ki je bil viden na NMR. Prav tako so na NMR bile vidne nečistote, zato smo se lotili čiščenja s kolonsko kromatografijio (mobilna faza: EtOAc/Hex = 3/7). Prisotnost produkta v frakcijah smo preverjali s TLC.
Združenim frakcijam smo uparili topilo in izolirali spojino 7. Njeno istovetnost smo potrdili z NMR in MS. Reakcijo smo ponovili večkrat, najprej z 200 mg spojine 6 in povečali na 1 g ter 2,5 g.
Rezultati
Videz: amorf bledo rumene barve
MS (ESI+): m/z za C26H39N3O4 ([M + H]+): izračunano 458,29; izmerjeno 458,7.
24 Postopek
V 50 mL bučko smo zatehtali spojino 7 (2,156 g, 4,7 mmol) in odmerili 20 mL 4 M HCl v 1,4-dioksanu ter jo takoj dodali v bučko. Bučko smo opremili z magnetnim mešalom, zaprli s steklenim zamaškom in pustili mešati 1 uro pri sobni temperaturi. Potek reakcije smo spremljali s TLC. Po pretečenem času smo z vodno črpalko uparili odvečno kislino in topilo.
Tako smo izolirali spojino 8 v obliki soli. Njeno istovetnost smo potrdili z NMR in MS ter preverili čistost s HPLC.
Rezultati
Videz: amorf oranžne barve
MS (ESI+): m/z za C21H31N3O2 ([M + H]+): izračunano 357,24; izmerjeno 358,7.
HPLC: tvz. = 23,08 min; AUCt=23,08 min; λ= 214 nm = 94,93 %; AUCt=23,08 min; λ= 214 nm = 94,63 %
Izkoristek: η1 = 133,7 % (1,762 g), η2 = 101,0 % (1,873 g), η3 = 112,7 % (4,631 g), η4 = 105,0 % (2,531 g)
Rf: 0,65 (MF: DKM/MeOH = 9/1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1,18 (s, 9H, CH3); 1,10-1,82 (m, 10H, CH2); 1,99 (m, 1H, CH); 3,88 (m, 1H, J = 15 Hz, NH-CH-CONH); 3,44-3,58 (m, 2H, J = 15 Hz, NR1 -CH2-CH); 7,06 (m, 1H, J = 3 Hz, Har); 7,15 (m, 1H, J = 3 Hz, Har); 7,29 (m, 2H, J = 3 Hz, Har); 8,46 (d, 3H, NH3+).
4.2.8 Sinteza 3-((fenoksikarbonil)amino)benzojske kisline (44)
25 Postopek
V 25 mL bučko smo zatehtali spojino 10 (0,506 g, 3,7 mmol, 1,0 ekv.) in jo raztopili v 8 mL 0,5 M NaOH. Reakcijsko zmes smo z mešanjem na ledeni kopeli ohladili na 10 °C ter hkrati v 10 mL bučki raztopili spojino 11 (0,599 g, 3,8 mmol, 1,05 ekv.) v 2 mL THF. Tako pripravljeno raztopino spojine 11 smo nemudoma dodali k reakcijski zmesi in pustili na magnetnem mešalu 1 uro pri 10 °C. Po pretečenem času smo pustili mešati še 1 uro na sobni temperaturi. Potek reakcije smo spremljali s TLC. Izpadle kristale bele barve smo odnučali, sprali z ledeno vodo in prekristalizirali iz EtOH. Tako smo sintetizirali spojino 12, katere istovetnost smo potrdili z NMR in MS.
Rezultati
Videz: kristali bele barve
MS (ESI+): m/z za C14H11NO4 ([M + H]+): izračunano 258,07; izmerjeno 257,9.
m/z za C14H11NO4 ([M + Na]+): izračunano 280,07; izmerjeno 279,9.
m/z za C14H11NO4 ([M + MeOH + H]+): izračunano 290,10; izmerjeno 289,9.
MS (ESI-): m/z za C14H11NO4 ([M - H]-): izračunano 256,07; izmerjeno 255,8.
Izkoristek: η1 = 84,8 % (0,805 g), η2 = 55,2 % (0,524 g) Rf: 0,70 (MF: DKM/MeOH = 9/1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 7,25 (m, 3H, Har); 7,45 (m, 3H, Har); 7,63 (m, 1H, Har); 7,74 (m, 1H, Har); 8,16 (s, 1H, Har); 10,44 (s, 1H, OOC-NH-Ar); 12,99 (s, 1H, COOH).
4.2.9 Sinteza (R)-3-(3-(5-cikloheksil-1-(3,3-dimetil-2-oksobutil)-2-okso-2,3,4,5-tetrahidro-1H-benzo[b][1,4]diazepin-3-il)ureido)benzojske kisline (45)
26 Postopek
V 50 mL bučko smo zatehtali spojino 8 (0,494 g, 1,3 mmol, 1,0 ekv.) in jo raztopili v 7,5 mL DMF. Dodali smo spojino 12 (0,36 g, 1,4 mmol, 1,1 ekv.), TEA (0,55 mL, 3,9 mmol, 3 ekv.) in katalizator DMAP (0,0075 g, 0,05 ekv.). Bučki smo dodali magnetek, jo opremili z vodnim hladilnikom ter segreli na 65 °C. Pri tej temperaturi smo mešali 2 uri. Po pretečenem času smo reakcijsko zmes med mešanjem ohladili na sobno temperaturo in ji dodali 6,25 mL EtOH. Po ponovno pretečenih dveh urah smo odstranili vodni hladilnik in bučko postavili na ledeno kopel. Med mešanjem smo po kapljicah dodali 1 M HCl (16 mL, 4 ekv. glede na TEA) in mešali še dodatno uro, dokler se ni izoboril produkt. Produkt smo odnučali, sprali z EtOH in tako izolirali spojino 13. Potek reakcije smo spremljali s TLC, istovetnost produkta pa potrdili z NMR (1H in 13C), MS, HRMS, HPLC in IR.
Rezultati
Videz: amorf bele barve Ttališče: 139-143 °C
MS (ESI+): m/z za C29H36N4O5 ([M + Na]+): izračunano 543,27; izmerjeno 543,8.
MS (ESI-): m/z za C29H36N4O5 ([M - H]-): izračunano 519,27; izmerjeno 519,8.
HRMS: m/z za C29H36N4O5 ([M + H]+): izračunano 521,2686; izmerjeno 521,27456.
HPLC: tvz. = 24,27 min; AUCt=24,27 min; λ= 214 nm = 96,45 %; AUCt=24,27 min; λ= 280 nm = 94,26 %
tstand.= 24,23 min; AUCt=24,23 min; λ= 214 nm = 97,53 %; AUCt=24,23 min; λ= 214 nm = 93,67 %
Izkoristek: η1 = 60,5 % (0,400 g)
27 Rf: 0,70 (MF: DKM/MeOH = 3/1)
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1,18 (s, 9H, CH3); 1,10-1,81 (m, 10H, CH2); 2,00 (m, 1H, CH); 3,17-3,28 (m, 2H, R1N-CH2-CH); 4,39 (m, 2H, R2N-CH2-CO); 5,13 (d, 1H, CO-CH-NH); 6,61 (d, 1H, J = 4 Hz, Har); 7,02 (dd, 1H, Har); 7,10 (m, 1H, Har); 7,22-7,36 (m, 3H, Har); 7,45-7,52 (m, 2H, Har); 7,98 (m, 1H, CH-NH-CONH); 9,04 (s, 1H, NHCO-NH- Ar); 12,86 (s, 1H, COOH).
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 26,41; 43,27; 49,78; 54,52; 57,29; 58,94; 118,69;
122,12; 122,67; 122,98; 123,13; 123,88; 127,37; 129,35; 131,73; 138,06; 140,76; 143,34;
154,48; 167,73; 170,86; 209,58.
IR (ATR): ν [cm-1] = 3336, 3111, 2926, 2854, 2602, 1726, 1676, 1643, 1310, 1559, 1495, 1461, 1435, 1384, 1313, 1212, 1107, 1077, 1046, 998, 889, 805, 757, 683, 646.
28
5 Razprava
5.1 Razprava k aromatski nukleofilni substituciji
Ker je komercialno dostopen reagent 1 že imel s terc-butoksikarbonilno skupino (Boc) zaščiteno eno od obeh amino skupin, uvedba zaščitne skupine ni bila potrebna. Za izbiro reagenta z Boc zaščitno skupino izmed širokega nabora drugih možnosti smo se odločili, saj je Boc pogosto uporabljen zaradi svoje dobre stabilnosti v prisotnosti drugih reagentov in pod mnogimi reakcijskimi pogoji, še vedno pa je njegova odstranitev preprosta pod relativno močnimi kislimi pogoji (46). Z uvedeno zaščitne skupine na drugo amino skupino je posledično ta izgubila na svoji nukleofilnosti in nam tako zagotovila želen mehanizem nukleofilne substitucije. DMF se je izkazal za primerno topilo, saj je zagotovil ustrezno topnost izhodnih reagentov, dober stik reagentov in posledično potek reakcije, zato smo reakcijo izvajali v njem.
V prvem koraku reakcije je prosta amino skupina spojine 1 napadla z elektroni osiromašeno pozicijo ob halogenu, vezanem na aromatski obroč. Nitro skupina na aromatskem obroču dodatno nase pritegne elektronsko gostoto aromatskega sistema in tako pomaga pri poteku želenega mehanizma. Pri tem se iz obroča odcepi fluoridni ion, ki veže vodikov proton na aminskem dušiku. Nastane fluorovodikova kislina (HF), ki bi brez posredovanja protonirala še nezreagirane nukleofilne centre na spojini 1 in tako ustavila potek reakcije. Temu se izognemo z dodatkom natrijevega hidrogen karbonata (NaHCO3), ki nevtralizira nastalo HF in vzdržuje nevtralen pH. Podroben mehanizem reakcije prikazuje slika 11.