velika v primerjavi s proteini. V prvem primeru je fizična interakcija proteinov naključna, v drugem primeru pa se posamezni proteini v zaporedju reakcij razporedijo na različna ogrodja, kar tudi zmanjša učinkovitost sistema.
V naših eksperimentih je bila programska DNA prisotna na plazmidu v velikem številu kopij (sl. 40 in 73). V plazmid je bilo vključenih 16 kopij programske DNA, kar pomeni med 1600 in 4800 vezalnih mest za posamezni fuzijski protein (če predpostavimo, da veliko število kopij pomeni 100–300 kopij). Zaznali smo povečano produkcijo obeh spojin (likopena in β-karotena), zato sklepamo, da je bilo razmerje med encimi in vezalnimi mesti v sistemu blizu optimalne (sl. 91).
5.1.3.8 Primerjava programske DNA z ostalimi sinteznobiološkimi pristopi za prostorsko usmerjeno kopičenje encimov
Direktna fuzija encimov lahko vodi v nepravilno zvitje le-teh in/ali proteolizo. Možnost za takšne težave je večja, če je v fuzijo vključenih več encimov. Proteinska ogrodja encimov ne uredijo v predvidljivo orientirane skupke, prav tako je število dimerizacijskih domen omejeno. Načrtovanje RNA ogrodij za prostorsko urejeno kopičenje več kot dveh encimov je kompleksno, število primernih aptamer vezavnih domen pa omejeno. Obema je skupno, da se njuna zvitje in stabilnost spreminjata od enega dizajna do drugega. Iz omenjenih dejstev sledi, da proteinska in RNA ogrodja verjetno niso primerna za kopičenje encimov kompleksnejših, večencimskih biosinteznih poti. Programska DNA uspešno naslavlja vse naštete težave. DNA ima zelo predvidljivo lokalno strukturo, kar pomeni, da je končna struktura ogrodja neodvisna od dizajna. DNA ogrodje je tudi zelo stabilno in vivo, v veliki meri neodvisno od DNA zaporedja. Omogoča fino uravnavanje stehiometrije vezalnih mest, števila ponovitev programske DNA, arhitekture vezave DiCP s spreminjanjem dolžine vmesnika med njimi, položaja vezalnih mest na plazmidu, števila kopij plazmida ...
Vse našteto so prostostne stopnje, s katerimi lahko razpolagamo pri optimizacji sistema.
Kljub vsemu ima programska DNA nekaj slabosti. Prvi problem predstavlja superzvitje plazmidne DNA v celici, kar bi lahko vplivalo na dostopnost vezalnih mest za fuzijske proteine. Tega problema ne bi rešili niti z vključitvijo programske DNA v kromosom E.
coli, saj je le-ta prav tako superzvit. Integracija programske DNA v genom bi prav tako otežila ohranjanje vseh prostostnih stopenj, ki jih ponuja plazmid. Vsekakor pa s tem omogočimo njeno stabilnejše prenašanje v hčerinske celice. Drugi problem izhaja iz ponavljajočih se DNA zaporedij pri večkratni ponovitvi programske DNA na plazmidu.
Takšna zaporedja so zelo nestabilna in občutljiva na rekombinacijo (Bzymek in Lovett, 2001), kar lahko delno rešimo z uporabo sevov z izbitim genom za RecA rekombinazo (obstajajo namreč tudi od RecA neodvisni mehanizmi reorganizacije ponavljajočih se DNA zaporedij).
5.2 SKLEPI
Fuzijski proteini cCFP-HivC, Gli1-nCFP, cYFP-Zif268 in PBSII-nYFP kolokalizirajo v jedru HEK293 celic, kjer se rekonstituirajo v funkcionalna fluorescenčna proteina mCerulean in mCitrine.
Z metodo bledenja akceptorja (FRET AB) smo zaznali FRET med rekonstituiranima fluorescenčnima proteinoma, kar je verjetno posledica vezave na programsko DNA.
Menimo, da bi sistem lahko optimizirali.
Maltoza vezalni protein (MBP) izboljša topnost proteinov, ki vsebujejo DiCP.
S funkcionalnimi testi smo pokazali, da bi proteina MBP-mCitrine-AZPA4-8xHis in MBP-RLuc-2C7-8xHis lahko uporabili za funkcionalizacijo DNA origamija.
o MBP-mCitrine-AZPA4-8xHis:
spletno programsko orodje K2d je na osnovi eksperimentalnih vrednosti cirkularnega dikroizma proteina podalo nezanesljivo oceno deležev sekundarnih struktur v njem
z DLS smo pokazali, da je hidrodinamski radij proteina okoli 30 nm, kar je več od pričakovanega in je verjetno posledica agregacije proteina
s testom zamika elektroforezne mobilnosti (EMSA) smo pokazali vezavo proteina na vse tri vezalne oligonukleotide, ki smo jih predvideli za vključitev v DNA origami ploščico
vezava je bila specifična, saj se protein ni vezal na oligonukleotid z vezalnim mestom za ortogonalno DiCP 6F6
afiniteta vezave (v µM območju) je bila manjša od že poročane (sub-pM)
protein je fluoresciral
o MBP-RLuc-2C7-8xHis
RLuc je ohranila encimsko aktivnost – po dodatku substrata koelenterazina v supernatant s proteinom smo zaznali bioluminiscenco
Fuzija encimov karotenoidne biosintezne poti iz bakterije Pantoea ananatis z DiCP ne vpliva na njihovo funkcionalnost.
Z vnosom operonov z ustrezno kombinacijo genov za heterologne encime CrtE, CrtB, CrtI, CrtY in CrtZ s pripadajočimi DiCP v dva različna seva E. coli (DH5α in BW27783) smo pokazali produkcijo treh karotenoidov, od tega dveh karotenov (likopena in β-karotena) in enega ksantofila (zeaksantina).
Identiteto spojin smo določili in dokazali z oceno barve produkcijskih kultur, celičnih peletov in ekstraktov, spektrofotometrično ter s pomočjo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti (HPLC). Slednjo smo uporabili tudi za kvantifikacijo likopena in β-karotena v ekstraktih.
Čistota likopena in β-karotena sta bili primerljivi s čistoto standardov obeh spojin.
V prisotnosti 16 ponovitev programske DNA z 2 bp vmesnikom je nastalo približno 4-krat več likopena in 3,5-4-krat več β-karotena kot v prisotnosti kontrolnega plazmida brez vezalnih mest za DiCP.
Dolžina vmesnika vpliva na produkcijo heterologne spojine. 2 bp vmesnik zagotavlja optimalno arhitekturo vezave fuzijskih proteinov na programsko DNA – encimi se kopičijo na isti strani molekule DNA. Ta učinek smo pokazali na primeru biosinteze β-karotena. Izkazalo se je, da 4 bp vmesnik (pri 16 ponovitvah programske DNA) zmanjša povečanje produkcije, pri 8 bp vmesniku pa je bila produkcija primerljiva s kontrolo.
5.3 POGLED V PRIHODNOST
Mei in sod. (2011) poročajo o stabilnosti DNA origamija v celičnem lizatu, Pinheiro in sod. (2011) pa o njegovi uporabi za prostorsko organizacijo biosinteznih reakcij in vivo.
Čeravno je opažanje Mei in sod. pomembno za izvedbo idej Pinheiro in sod., pa je trenutno bistveno vprašanje naslednje: na kakšen način doseči stabilno podvajanje takšnih DNA nanostruktur v celici? Ali je to sploh izvedljivo? Lin in sod. (2008) so sicer s pomočjo virusov že uspeli podvajati enostavne Hollidayeve križne strukture, a je to še daleč od kompleksnosti struktur, ki jih lahko pripravimo na osnovi tehnike DNA origami.
Slika 92: DNA nanostrukture kot biomimetični sistemi in vivo (Pinheiro in sod., 2011: 5). Podvajanje