STABILNOST POLI(I:C) V KOMPLEKSIH

Nukleinske kisline so občutljive na razgradnjo z DNK in RNK nukleazami, ki so prisotne tako v serumu kot v celicah. Poli(I:C) je dvRNK molekula, zato je občutljiva na razgradnjo z RNazami, ki so zelo stabilni in povsod prisotni encimi. Zato smo želeli dokazati, da konjugat Tf-PLL omogoča zaščito poli(I:C) pred razgradnjo in na ta način poveča njeno stabilnost.

4.3.1 Spektrofotometrično spremljanje encimske razgradnje poli(I:C) v kompleksih Da bi preverili, ali konjugat Tf-PLL poveča stabilnost poli(I:C), smo naredili poenostavljen model, kjer smo uporabili zgolj PLL, ki je komponenta konjugata, ki veže nukleinske kisline in potencialno pripomore k njihovi stabilnosti. Skušali smo dokazati, da PLL v kompleksu s poli(I:C) prepreči razgradnjo nukleinskih kislin z RNazo. Pri razgradnji dvoverižnih nukleinskih kislin pride do tako imenovanega hiperkromnega efekta.

Nukleotidi, ki se tekom razgradnje sproščajo v raztopino, močneje absorbirajo svetlobo pri 260 nm kot v polimeru, v katerem se baze prekrivajo, in je njihova absorbanca zato nižja.

Zato smo razgradnjo poli(I:C) lahko spremljali spektrofotometrično.

Slika 46 prikazuje 20 minutni potek razgrajevanja PLL/poli(I:C) z RNazo ONE (Promega).

Raztopini poli(I:C) smo dodali različno količino PLL, ki je ustrezala različnim masnim razmerjem poli(I:C): PLL, in sicer 1: 0,025; 1: 0,1; 1: 0,25; 1: 0,5 in 1: 1. Ko masa PLL predstavlja le 2,5 odstotka mase poli(I:C) (tanka prekinjena črta), vidimo, da že po manj kot treh minutah pride do popolne razgradnje poli(I:C). Z naraščanjem količine PLL enakomerno narašča količina nerazgrajene poli(I:C), kar lahko opazujemo z nižanjem nivoja platoja, kjer se absorbanca ustali. Ko masa PLL predstavlja 50 odstotkov mase poli(I:C) (debela neprekinjena črta) vidimo, da je približno pol RNK ostalo nerazgrajene.

Pri enaki masi poli(I:C) in PLL (debela šrafirana črta) je vsa RNK ostala nerazgrajena, saj se absorbanca v 20 minutah skoraj ni zvišala. To pomeni, da PLL uspešno zaščiti poli(I:C) pred razgradnjo z RNazo, in sicer v odvisnosti od masnega razmerja med poli(I:C) in PLL.

Ko je v kompleksih prisotna dovolj velika količina polikationa (masno razmerje 1: 1), se nanj veže vsa RNK, ki je zato zaščitena pred encimsko razgradnjo. V vseh ostalih vzorcih je količina PLL premajhna, da bi imela kapaciteto vezave vse RNK, zato zaščitena ostane le RNK, ki se je povezala s polikationom. Mehanizem zaščite pred razgradnjo verjetno temelji na strukturi poli(I:C), ki je v kompleksih najbrž bolj kompaktno zvita in zato za RNazo nedostopna, saj pride do steričnega oviranja.

Slika 46: Zaščita razgradnje RNK ob dodatku poli-L-lizina v različnih stehiometričnih razmerjih

Tanka prekinjena črta predstavlja graf razgradnje poli(I:C) v kompleksih z 2,5-odstotnim masnim deležem poli-L-lizina (PLL) glede na maso poli(I:C), debela prekinjena z 10-odstotnim deležem, tanka neprekinjena s 25-odstotnim deležem, debela neprekinjena s 50-odstotnim deležem in šrafirana debela s 100-odstotnim deležem. V prvih štirih vzorcih vidimo, da je razgradnja z RNazo zelo hitra, saj se manj kot v treh minutah razgradi vsa prosta poli(I:C). Pri razmerju 1: 1 ne pride do razgradnje poli(I:C), saj je kapaciteta PLL dovolj velika, da veže in s tem zaščiti vso RNK. PLL torej omogoča uspešno zaščito poli(I:C) pred razgradnjo z RNazo, in sicer v odvisnosti od masnega razmerja med poli(I:C) in PLL.

Na sliki 47 smo s histogramom prikazali delež nerazgrajene poli(I:C) v odvisnosti od masnega razmerja med poli(I:C) in PLL. Rezultate smo izračunali na podlagi podatkov iz slike 46, in sicer smo primerjali absorbance posameznih vzorcev pri valovni dolžini 260 nm, ko je bil že dosežen plato ter tako določili delež nerazgrajene poli(I:C) (višja kot je absorbanca, več je razgrajene poli(I:C)). Vidimo, da delež nerazgrajene RNK narašča z večanjem količine PLL. Pri masnem razmerju 1: 1 je poli(I:C) skoraj v celoti zaščitena pred razgradnjo z RNazo. Z rezultati smo pokazali, da PLL iz konjugata Tf-PLL lahko zaščiti RNK pred razgradnjo in tako bistveno poveča njeno stabilnost, in sicer je najmanjše masno razmerje med poli(I:C) in PLL za učinkovito zaščito 1: 1. To je skladno tudi z rezultati zmanjšane mobilnosti na gelu (slika 45), kjer vidimo, da pri tem masnem razmerju kompleksi skoraj več ne potujejo v gel, saj je skoraj celotna poli(I:C) povezana s PLL.

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

0,025 0,1 0,25 0,5 1

Razmerje Poli(I:C): PLL

Delež nerazgrajene Poli(I:C)

Slika 47: Delež nerazgrajene poli(I:C) v kompleksih s poli-L-lizinom v odvisnosti od masnega razmerja poli(I:C): PLL

Številka 0,025 pomeni, da masa poli-L-lizina (PLL) v kompleksih znaša 2,5-odstotka mase poli(I:C).

Vidimo, da delež nerazgrajene RNK narašča z večanjem količine PLL in da pri masnem razmerju 1: 1 pride do skoraj popolne zaščite pred razgradnjo.

4.3.2 Biološka aktivnost poli(I:C) v kompleksih po delovanju RNaze

Da bi preverili ali ima zaščita poli(I:C) pred encimsko razgradnjo tudi biološki pomen, smo testirali sposobnost aktivacije receptorja TLR3 s samo poli(I:C) in poli(I:C) v kompleksih s PLL po inkubaciji z RNazo ONE. Predvidevali smo, da razgrajena poli(I:C) ne more aktivirati receptorja TLR3. Celice HEK293 smo transficirali s plazmidom, ki nosi zapis za človeški TLR3 ter z reporterskima plazmidoma phRL-TK in pIFNβ-FLUC (plazmidi so opisani v preglednici 10), ki so omogočali spremljanje aktivacije TLR3.

Na sliki 48 vidimo, da sama poli(I:C) po 20 minutni inkubaciji z RNazo ne aktivira receptorja TLR3, saj je nivo aktivacije skoraj enak nestimuliranim celicam. To pomeni, da se je poli(I:C) razgradila. Nasprotno je poli(I:C) v kompleksih s PLL in po inkubaciji z RNazo vseeno biološko aktivna, saj je nivo aktivacije receptorja TLR3 več kot 10-krat višji od nestimuliranih celic. To potrjuje poskus iz točke 4.3.1, kjer smo pokazali da PLL zaščiti poli(I:C) pred razgradnjo, saj je le nerazgrajena dvRNK sposobna aktivacije receptorja.

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00

nestimulirane Poli(I:C) + RNaza + PLL Poli(I:C) + PLL + RNaza

RLU

*

*P < 0,005

Slika 48: Aktivacija receptorja TLR3 s poli(I:C) in poli(I:C) v kompleksih s poli-L-lizinom po inkubaciji z RNazo

Prvi stolpec z leve predstavlja nestimulirane celice. Drugi stolpec predstavlja celice, stimulirane s poli(I:C), ki smo jo predinkubirali z RNazo in ji nato dodali poli-L-lizin (PLL). Tretji stolpec predstavlja celice, stimulirane s poli(I:C) v kompleksih s PLL in naknadno inkubacijo z RNazo. Vidimo, da PLL zaščiti poli(I:C) pred razgradnjo, saj je le nerazgrajena dvRNK sposobna aktivacije receptorja TLR3.

4.4 CELIČNI VNOS KOMPLEKSOV IMUNOSTIMULATORNIH NUKLEINSKIH