Stopnje topnosti kot so navedene v Evropski farmakopeji (24)

Stopnja topnosti Volumen topila, potreben za raztopitev 1,0 g vzorca

Zelo lahko topno < 1 mL

Lahko topno 1–10 mL

Topno 10–30 mL

Zmerno topno 30–100 mL

Težko topno 100–1000 mL

Zelo težko topno 1000–10000 mL

Praktično netopno > 10000 mL

1.4.3 Načini določanja topnosti

Obstaja več načinov določanja topnosti substanc. Najpogosteje se uporabljata termodinamska in kinetična metoda.

Termodinamska shake-flask metoda je zlati standard pri določanju topnosti. Temelji na vzpostavitvi ravnotežja med nasičeno raztopino in neraztopljenim trdnim topljencem. Poleg ostalih omenjenih dejavnikov je ta topnost odvisna tudi od časa za vzpostavitev ravnotežja, pogojev mešanja, polimorfizma, čistote substance in oblike ter velikosti trdnih delcev (25).

Postopek določanja je sledeč: topljenec damo v topilo in ga raztapljamo do vzpostavitve ravnotežnega stanja (slika 2). Sledi ločitev trdnega topljenca od nasičene raztopine. Nato analiziramo nasičeno raztopino in izračunamo topnost. Pri pripravi vzorca je pomembno, da topilu dodamo presežno količino topljenca. Ni pa nujno zatehtati maso topljenca, ker ravnotežna topnost načeloma ni odvisna od mase dodanega topljenca (26). Ravnotežje pri tej metodi je doseženo, ko je topnost v različnih časovnih točkah enaka. Z dobrim mešanjem je ravnotežje pogosto doseženo v 24 h. Kljub temu pri nekaterih substancah to traja tudi od 48 h do 2 tednov, še posebej pri z. u., ki so slabo topne (25).

Čas za vzpostavitev ravnotežja je možno skrajšati z intenzivnim mešanjem z uporabo vorteks naprave oz. ultrazvočne kadičke. Pri separaciji trdnega zaostanka od nasičene raztopine je možno uporabiti sedimentacijo, centrifugiranje in filtracijo.

Slabost filtracije je sorpcija na filter v primeru slabo topnih in hidrofobnih substanc. To je še posebej problematično pri filtraciji majhnih volumnov suspenzij. Nasičene raztopine primerno redčimo in analiziramo spektrofotometrično, s HPLC metodo ali z drugimi primernimi metodami za merjenje koncentracij. Shake-flask metoda je zanesljiva, a časovno potratna. Poleg tega za njeno izvedbo potrebujemo tudi relativno veliko količino substance (25). Omenjene pomanjkljivosti so raziskovalce spodbudile k razvoju hitrejših miniaturnih različic te metode.

Slika 2. Na sliki je prikazan princip določanja ravnotežne topnosti. Topilu je dodana presežna količina topljenca, ki se le deloma raztopi.

Miniaturizirana shake-flask metoda omogoča natančno določanje topnosti z uporabo minimalne količine učinkovine. Vsebuje vse korake navadne shake-flask metode, le da je izvedena v manjšem obsegu (po navadi z 2 mL topila). Metoda je preprosta in poceni, vendar je manj zanesljiva pri ionizirajočih topljencih. Ni primerna za rešetanje visokih zmogljivosti (High-Throughput Screening), ker z njo lahko določimo le topnost za približno 20 substanc na teden. Kljub temu je njena prednost visoka kakovost pridobljenih rezultatov (25).

Shake-flask metoda v majhnem merilu (ang. Small Scale Shake-Flask Method) omogoča določanje topnosti v majhnih volumnih topila (50–1000 µL). Uporaba majhnih volumnov topila pa ne vpliva na točnost rezultatov. Pri tem je možno določiti topnost z uporabo le nekaj mikrogramov topljenca. Metodo je možno avtomatizirati in omogoča rešetanje visokih zmogljivosti (ovrednotenje topnosti velikega števila na novo odkritih substanc) (25, 27).

Kinetično topnost navadno določamo v zgodnjih fazah razvoja z. u.. Omogoča testiranje velikega števila učinkovin. Razlog je enostavno in hitro določanje. Poleg tega potrebujemo nizko maso učinkovine (1 mg). Pogosto jo merimo tako, da pripravimo koncentrirano osnovno raztopino učinkovine v organskem topilu (navadno v DMSO). To raztopino nato v majhnih volumnih dodajamo določenemu volumnu vode, dokler prvič ne opazimo oborine. Takrat je dosežena kinetična topnost. V končni raztopini naj ne bi bilo več kot 1 % DMSO, ker poveča topnost topljenca v vodi. Zato mora biti osnovna raztopina topljenca v DMSO dovolj koncentrirana.

Kinetična topnost je višja od termodinamske topnosti za isti topljenec zaradi supersaturacije, ki je prisotna pred obarjanjem. Zaradi variabilnih pogojev določanja ni možno med seboj primerjati rezultatov kinetične topnosti. Vseeno pa so rezultati nedvomno uporabni pri ovrednotenju topnosti velikega števila substanc (28, 29, 30).

1.4.4 Računalniški modeli

Pri zelo slabo topnih učinkovinah je težko dobiti ponovljive rezultate topnosti. Poleg tega so eksperimentalne metode tudi časovno potratne. Določanje topnosti omejuje tudi kemijska nestabilnost preiskovanih spojin. Zaradi tega se za oceno topnosti v vodnih sistemih pogosto uporabljajo in silico metode. Obstaja mnogo modelov, ki omogočajo napoved topnosti, vendar se med seboj razlikujejo glede na nabor parametrov, ki jih zajemajo. Kot eno prvih meril za oceno topnosti se je uveljavila molska masa učinkovine. Kasneje so raziskovalci dodali še porazdelitveni koeficient oktanol-voda (polarnost), temperaturo tališča, sposobnost tvorbe vodikovih vezi, doprinos posameznih atomov in funkcionalnih skupin, itd. Metode se razlikujejo po kompleksnosti in številu upoštevanih kriterijev. Pri tem večja kompleksnost ne pomeni nujno večje točnosti ocene. Te metode še niso povsem zanesljive in jih je potrebno izboljšati (31, 32).

1.5 Hitrost raztapljanja

Hitrost raztapljanja je hitrost prehoda posameznih molekul substance iz trdnih delcev v raztopino (slika 3). Odvisna je od enakih parametrov kot topnost (temperatura, tlak, lastnosti topljenca in topila), poleg tega pa še od površine topljenca, izpostavljenega topilu, omočenja, viskoznosti topila in mehanskih vplivov (npr. mešanje). Hitrost raztapljanja je višja pri povečani površini topljenca, izpostavljenega topilu. Poveča se tudi ob dvigu temperature, saj s tem upade viskoznost topil. Opisuje jo Noyes-Whitneyeva enačba (Enačba 1), pri tem je dC/dt hitrost raztapljanja, D difuzijski koeficient substance, S površina izpostavljenega dela topljenca, V volumen raztopine, h debelina difuznega sloja. C je koncentracija raztopljene substance ob danem času, Cs je absolutna topnost substance (33, 34).

𝑑𝐶

𝑑𝑡

=

^𝐷×𝑆

ℎ×𝑉

× (𝐶𝑠 − C)

Enačba 1

Slika 3. Skica raztapljanja trdnega delca. Pri raztapljanju je prisoten difuzni sloj, v katerem je prisoten koncentracijski gradient topljenca od nasičene topnosti do koncentracije raztopine izven difuznega sloja.

1.6 Stabilnost CBD

V raziskavi (Kosović et al., 2021) se je 99,9% CBD v prahu izkazal za stabilnega 270 dni pri temperaturi 25 °C in relativni vlagi 60 %. CBD raztopljen v sončničnem olju je izkazal stabilnost vsaj 180 dni (T = 25 °C, RH = 60 %). V 1 letu je koncentracija CBD v raztopini v sončničnem olju upadla za 42 % (pri T = 25 °C, RH = 60 %). Poskusi so bili izvedeni v temnih komorah (35).

Fraguas-Sánchez in sodelavci so izvedli stabilnostne analize in dobili naslednje rezultate:

Etanolna raztopina CBD je bila na sobni temperaturi stabilna 117 dni (t95 = 117 dni). Pri shranjevanju na 5 °C je bila enaka raztopina stabilna vsaj 1 leto. CBD etanolna raztopina je bila zelo občutljiva na oksidacijske pogoje (prisotnost H2O2), t95 = 1,8 dni. Občutljiva je bila tudi na svetlobo, za katero se zdi, da je pospešila potek oksidacijske reakcije. CBD je bil bolj stabilen v etanolu kot v vodnem mediju, v katerem se je 10 % CBD razgradilo v 24 h (pri T = 37 °C in pH = 7,4) (36).

Stabilnost je velik izziv pri peroralnih kapljicah s CBD, v katerih je CBD raztopljen v različnih oljih. Glede na raziskavo, ki so jo izvedli Pavlovic in sod., je kar 9 od 14 izdelkov, ki so jih kupili preko interneta v EU, vsebovalo manj CBD od 90 % deklarirane vsebnosti. Poleg tega so pri nekaterih izdelkih proizvajalci vsebnost CBD navajali kot vsoto CBD in CBDA, kar ni smiselno, ker CBDA ob peroralni uporabi nima farmakološkega učinka. Tako so nekatere peroralne kapljice vsebovale večjo količino CBDA kot CBD (37).

CBD, ki je raztopljen v MCT olju, je precej manj občutljiv za oksidacijo kot CBD, ki je raztopljen v olivnem olju ali olju konopljinih semen. To je morda povezano s tem, da olivno in konopljino olje vsebujeta nenasičene maščobne kisline, ki so bolj dovzetne za oksidacijo kot nasičene maščobne kisline MCT olja (38).

Julija Hrastnik je v svoji magistrski nalogi pripravila in primerjala različne ekstrakte konoplje in dognala, da je CBD stabilnejši v obliki heksanskega kot etanolnega ekstrakta. CBD je bil pri vseh razmerah shranjevanja veliko bolj stabilen kot Δ⁹-THC. CBD je bil v obliki etanolnega in heksanskega ekstrakta stabilen pri 40 °C vsaj 4 mesece (39).

Peter Sebanc je v svojem magistrskem delu preučeval stabilnost CBD in z rezultati potrdil, da je CBD vsaj 99 dni stabilen v obliki raztopine v olju konopljinih semen, kakavovem maslu, MCT olju in kokosovem olju (1).

1.7 Olja, ki so vehikli za CBD kapljice

MCT olje (Medium-chain triglycerides oil) je sestavljeno iz trigliceridov, ki vsebujejo maščobne kisline s 6–12 ogljikovimi atomi. Kokosovo olje vsebuje približno 60–70 % MCT.

Dober vir MCT je tudi palmovo olje. Pogosto se MCT olje uporablja pri bolnikih s podhranjenostjo ali malabsorpcijskimi sindromi, ker za absorpcijo ni potrebne dodatne energije.

Nekatere študije kažejo tudi na to, da MCT olje znižuje telesno maso in količino uskladiščene maščobe pri debelosti (40). MCT olje se hitreje absorbira in izkoristi od olj dolgoverižnih maščobnih kislin. Večinoma se MCT olje oksidira v jetrih, kjer predstavlja vir energije.

Zato je delovanje MCT olja bolj podobno glukozi kot maščobam. Užitna MCT olja po navadi pridobivamo z lipidno frakcionacijo, taka olja vsebujejo večinoma trigliceride oktanojske in dekanojske kisline v razmerju od 1 : 1 do 4 : 1 (41).

Olje konopljinih semen se pridobiva s stiskanjem ali ekstrakcijo iz semen navadne konoplje.

Vsebuje 55 % linolne kisline, ki spada med omega-6 maščobne kisline. Nadalje vsebuje 20 % α-linolenske kisline, ki spada med omega-3 maščobne kisline. Na tretjem mestu po vsebnosti je γ-linolenska kislina, katere delež je 1–4 %. Skoraj nobeno drugo naravno živilo ne vsebuje toliko esencialnih maščobnih kislin. Ker vsebuje trigliceride s polinenasičenimi maščobnimi kislinami, je olje konopljinih semen precej nestabilno, zato ga je treba shranjevati pri čim nižji temperaturi in zaščititi pred svetlobo. Večina pridelovalcev tega olja je manjših podjetij, ker je olje slabo stabilno in zato manj zanimivo za večja podjetja (42).

Olivno olje se pridobiva s stiskanjem oliv. Obstaja preko 260 sort oljk, kar je razlog, da se lahko posamezna olivna olja v sestavi precej razlikujejo. V olivnem olju lahko razlikujemo med oljno in ne-oljno frakcijo. Oljna predstavlja 98–99 % delež in je sestavljena iz trigliceridov, ki vsebujejo 55–85 % mononenasičenih maščobnih kislin. Glavna izmed njih je oleinska kislina.

Ne-oljna frakcija olivnega olja predstavlja le 1–1,5 % celotnega olja, vsebuje terpene (npr.

skvalen), karotene, pigmente (npr. klorofil), tokoferole (npr. vitamin E) in sterole. Slednji znižujejo krvni holesterol z zaviranjem absorpcije holesterola v tankem črevesu.

Značilni vonj in okus olju dajejo nekateri alkoholi, ketoni, estri, etri in furani. Olivno olje je bistven del mediteranske prehrane, ki je povezana z nižjim tveganjem za srčno-žilne zaplete (43).

Čijevo olje je olje pridobljeno iz semen oljne kadulje (Salvia hispanica). Izhaja iz Mehike in Gvatemale. Vsebuje 54–67 % α-linolenske kisline in 12–21 % linolne kisline. Zaradi velike vsebnosti polinenasičenih maščobnih kislin je tudi to olje podvrženo lipidni peroksidaciji in slabo stabilno (44). Olje konopljinih semen, olivno olje in čijevo olje spadajo med LCT olja.

1.8 Najnovejši pristopi k izdelavi formulacij s CBD

Topnost CBD v vodi je 0,01 mg/mL, kljub temu se z uporabo γ-ciklodekstrinov lahko poveča do 5,3 mg/mL (4, 45). Izgelov in sodelavci so pripravili tudi samo-mikroemulgirajoči dostavni sistem s CBD, ki omogoča predvidljivejši farmakokinetični profil ob peroralni aplikaciji.

Pri tem so formulacijo pripravili tako, da so sezamovemu olju dodali emulgatorje in sotopilo (etanol) ter to vgradili v mehke želatinske kapsule. Pri raztapljanju v vodnem okolju formulacija spontano tvori O/V emulzijo. S tem se poveča topnost CBD v vodnem okolju v GIT in olajša njegova absorpcija v enterocite (14).

1.9 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC)

Tekočinska kromatografija je separacijska tehnika, pri kateri se komponente, ki jih ločujemo, porazdeljujejo med mobilno in stacionarno fazo (SF). Mobilna faza (MF) je tekoča in se premika v določeni smeri. Komponente vzorca se skupaj z MF premikajo mimo SF. Analiti po navadi tvorijo različne interakcije s SF in MF. Ker je SF fiksirana, se analiti, ki z njo tvorijo interakcije, premikajo počasneje. Analiti, ki s SF ne tvorijo interakcij, se premikajo najhitreje.

Interakcije analita s fazama določajo čas, ki je potreben, da prepotuje kromatografsko kolono.

Po prehodu kolone naprava analit zazna s pomočjo detektorja. Rezultati so predstavljeni v obliki kromatogramov.

Čas, ki ga analit potrebuje, da prepotuje kolono od injektorja do detektorja, se imenuje retencijski čas. Čas potovanja mobilne faze od injektorja do detektorja se imenuje mrtvi čas (46).

HPLC je napredna oblika tekočinske kromatografije, ki se uporablja za ločevanje spojin znotraj kompleksnih kemijskih in bioloških vzorcev. Z njo lahko določeno komponento zmesi separiramo, identificiramo in kvantificiramo (47).

1.9.1 Reverznofazna HPLC (RP-HPLC)

Pri reverznofazni kromatografiji je MF bolj polarna od SF, kar je ravno obratno kot pri normalnofazni kromatografiji. Med elucijo se najhitreje eluirajo najbolj polarne spojine.

Mobilna faza je po navadi mešanica metanola ali acetonitrila z vodo. Metoda omogoča analizo polarnih, srednjepolarnih in nekaterih nepolarnih analitov. Je najpopularnejša oblika tekočinske kromatografije zaradi njene široke uporabnosti (48).

2 NAMEN DELA

CBD je med ljudmi vedno bolj priljubljen zaradi različnih dokazanih, potencialnih in domnevnih pozitivnih učinkov na zdravje. V literaturi je malo podatkov o njegovi topnosti v različnih topilih. Redki podatki, ki so dostopni, se med seboj precej razlikujejo. Več podatkov najdemo v varnostnih listih brez navedenih referenc, zelo malo pa v znanstveni literaturi. Dobro poznavanje topnosti CBD v nosilnih topilih za izdelavo formulacij bi koristilo proizvajalcem pri načrtovanju formulacij produktov. Topnost je pomemben faktor tudi pri ekstrakciji CBD iz rastlinskega materiala. Namen našega dela je določiti topnost CBD v topilih, ki so pomembna za rokovanje s CBD.

3 MATERIALI IN METODE

3.1 Materiali

3.1.1 Standard CBD

Kot standard CBD smo uporabili (-)-kanabidiol v prahu od proizvajalca Dr. Ehrenstorfer. Ta prašek smo uporabili kot standard za izdelavo umeritvene premice in tudi za določanje topnosti v različnih topilih. Na embalaži je bilo navedeno, da je vsebnost CBD 98,62 % mase standarda.

Da ne bi prišlo do razpada, smo ga hranili pri temperaturi 4–8 °C. Država porekla: Nemčija, CAS: 13956-29-1.

3.1.2 Reagenti in topila

Topila, v katerih smo določali topnost CBD

 96% etanol farmakopejske kakovosti (CARLO ERBA REAGENTS, Francija, CAS: 64-17-5). Vsebuje 92,6–95,2 % (w/w) etanola in 7,4–4,8 % vode (w/w).

 metanol (CARLO ERBA REAGENTS, Francija, CAS: 67-56-1),

 DMSO (Sigma Aldrich, Francija, CAS: 67-68-5),

 aceton (CARLO ERBA REAGENTS, Francija, CAS: 67-64-1),

 izopropanol (CARLO ERBA REAGENTS, Francija, CAS: 67-63-0),

 1-butanol (EMSURE® (Merck), Nemčija, CAS: 71-36-3),

 izooktan (CARLO ERBA Reagents, Francija, CAS: 540-84-1),

 dietileter (CARLO ERBA Reagents, Francija, CAS: 60-29-7),

 N,N-dimetilformamid (Sigma, Nemčija, CAS: 68-12-2),

 cikloheksan (CARLO ERBA Reagents, Francija, CAS: 110-82-7),

 diklorometan (J. T. Baker, Francija, CAS: 75-09-2),

 rastlinski glicerol (Tovarna Organika, Slovenija, CAS: 56-81-5),

 trietil citrat (Alexmo cosmetics, Nemčija, CAS: 77-93-0),

 propilenglikol (Natural Loti, Slovenija, CAS: 57-55-6),

 triacetin (Sigma Aldrich, ZDA, CAS: 102-76-1),

 olivno olje (Lekarna Ljubljana, Slovenija, CAS: 8001-25-0),

 čijevo olje (Tovarna Organika, Slovenija, CAS: 93384-40-8),

 MCT olje (Aliacura, Nemčija, CAS: 73398-61-5),

 olje konopljinih semen (KEFO, Slovenija, CAS: 89958-21-4),

 deionizirana voda s pipe.

Topila in reagenti za HPLC

 prečiščena voda za HPLC (J. T. Baker, Poljska, CAS: 7732-18-5),

 acetonitril za HPLC (J. T. Baker, ZDA, CAS: 75-05-8),

 trifluoroocetna kislina (Fisher Scientific U. K., Združeno kraljestvo, CAS: 76-05-1).

3.1.3 Aparature

 Analitska tehtnica (Mettler Toledo, XS205, Greinfensee, Švica),

 avtomatski pipetor (Dispensette S, Brand, Nemčija),

 vorteks mešalnik (Vibromix 10, Domel, Slovenija),

 stresalnik (Tehtnica Vibromix, Domel, Slovenija).

3.1.4 HPLC analiza (slika 4)

 Razplinjevalec: DGU-20As (Shimadu, Kyoto, Japonska),

 črpalka: LC-20AD XR (Shimadu, Kyoto, Japonska),

 avtomatski vzorčevalnik: SIL-20AC XR (Shimadu, Kyoto, Japonska),

 prostor za kolono: CTO-20AC (Shimadu, Kyoto, Japonska),

 detektor: SPD-M20A (Shimadu, Kyoto, Japonska),

 kromatografska kolona: Phenomenex Kinetex C18 (Medical Products UK Ltd, Aldershot, Hants, Združeno Kraljestvo).

18 Slika 4. HPLC naprava, ki smo jo uporabili pri našem delu.

3.1.5 Računalniški programi

 Lab Solutions (Shimadzu, Kyoto, Japonska),

 Excel (Microsoft Corporation).

3.1.6 Ostala laboratorijska oprema

 Čaše (10 mL, 25 mL, 50 mL, 100 mL),

 injekcijske brizge,

 injekcijske igle,

 filter HPLC (0,20 μm; Frisenette, Danska),

 temne viale za HPLC analizo s pokrovčki,

 centrifugirke,

 pribor za tehtanje,

 stojalo za epruvete,

 3 mL plastične pipete (Pasteur pipeta),

 steklene pipete,

 žogica za pipetiranje.

3.2 Metode dela in priprava vzorcev

3.2.1 Izbira topil za analizo

Topnost CBD je pomemben parameter pri pridobivanju CBD iz rastlinskega materiala in pri pripravi formulacij, ki vsebujejo to učinkovino. Na spletu smo poiskali podatke o tem, katera topila so najpomembnejša za različne procese ravnanja s kanabidiolom.

 Ekstrakcijska topila

Proizvajalci CBD največkrat ekstrahirajo iz rastlinskega materiala s superkritičnim CO2, z etanolom, metanolom, heksanom, etilacetatom in mešanicami teh topil z drugimi topili (npr.

10% kloroform v metanolu) (49). Ker smo imeli v laboratoriju na voljo tudi nekatera topila, ki se pri ekstrakcijah redkeje uporabljajo, smo določili topnost CBD tudi v njih.

 Topila za izdelavo farmacevtskih oblik

Na trgu se CBD pojavlja v različnih farmacevtskih oblikah (dermatološke kreme, kapljice, pršila, bonboni in podobno). Za vgradnjo v formulacije je pomembna topnost CBD v vehiklu, ki je fiziološko sprejemljiv. Da bi določili topnost CBD v vehiklih, ki se najpogosteje uporabljajo, smo raziskali ponudbo CBD kapljic in pršil na internetnih straneh. Ločeno smo iskali zadetke v slovenščini z iskalnima nizoma: »CBD kapljice« in »CBD pršilo«. Nato smo na spletu iskali še v angleščini z iskalnima nizoma »CBD drops« in »CBD spray«.

Pregledali smo spletne strani, ki smo jih dobili z iskalnimi nizi in si izpisali ime podjetja, farmacevtsko obliko, vrsto vehikla, volumen izdelka, vsebnost CBD (w/V %), ceno izdelka in spletno stran. Pri posameznem proizvajalcu smo izpisali le 1 izdelek, če je oglaševal več različnih izdelkov z enakim nosilnim topilom. Pregled trga smo izvedli 28. 6. 2021, s tem smo ugotovili, katera topila se najpogosteje uporabljajo v kapljicah in pršilih s CBD. Rezultate raziskave trga smo objavili v poglavju 4 Rezultati, razpredelnici z izpisanimi podatki pa smo dali med priloge.

3.2.2 Priprava HPLC mobilne faze

Mobilna faza A: Z merilnim valjem smo v posodo nalili 5 L dodatno prečiščene vode, nato 102 mL acetonitrila in nato smo s pomočjo steklene pipete dodali še 5 mL TFA. Nastalo zmes smo mešali 5 min.

Mobilna faza B: Z merilnim valjem smo v posodo nalili 5 L acetonitrila, nato 102 mL dodatno prečiščene vode in nato smo s pomočjo steklene pipete dodali še 5 mL TFA. Nastalo zmes smo mešali 5 min.

3.2.3 Modifikacija HPLC metode

Kot metodo za določanje koncentracije CBD smo uporabili HPLC metodo, opisano v diplomski nalogi Matevža Štefančiča z naslovom: Validacija HPLC metode za selektivno določanje kanabinoidov. Slednja omogoča selektivno določanje več različnih kanabinoidov. Pri valovni dolžini 220 nm lahko z metodo določamo kanabidivarinsko kislino, kanabidivarin, CBDA, CBD, kanabigerolno kislino in Δ⁹-THC. Pri valovni dolžini 280 nm pa lahko z metodo določamo kanabigerol, kanabinol, tetrahidrokanabinolno kislino inkanabikromen. Izvedba ene analize po metodi je trajala 60 min, retencijski čas CBD pri tem je bil 18,3 min. Ker smo pri naši nalogi v raztopinah določali le CBD in v naših vzorcih nismo zaznali vrhov, ki bi motili kvantifikacijo CBD, smo se odločili metodo skrajšati. Da smo to dosegli, smo spremenili gradient in čas trajanja posamezne analize skrajšali na 12 min (50).

3.2.4 Izdelava umeritvene krivulje CBD

Ker smo modificirali HPLC metodo za določanje CBD, smo še enkrat izdelali umeritveno krivuljo. To smo naredili tako, da smo standard CBD zatehtali na analitski tehtnici in ga redčili s 96% etanolom. S tem smo pripravili osnovno raztopino s koncentracijo 1 mg/mL oz. 1,2 mg CBD/g raztopine.

Osnovno raztopino smo nato redčili tako, da smo pridobili 10 standardnih raztopin CBD z naslednjimi koncentracijami:

 0,005 mg/mL oz. 0,0058 mg CBD/g raztopine,

 0,01 mg/mL oz. 0,012 mg CBD/g raztopine,

 0,02 mg/mL oz. 0,024 mg CBD/g raztopine,

 0,048 mg/mL oz. 0,057 mg CBD/g raztopine,

 0,066 mg/mL oz. 0,079 mg CBD/g raztopine,

 0,092 mg/mL oz. 0,11 mg CBD/g raztopine,

 0,13 mg/mL oz. 0,16 mg CBD/g raztopine,

 0,17 mg/mL oz. 0,20mg CBD/g raztopine,

 0,20 mg/mL oz. 0,25 mg CBD/g raztopine,

 0,23 mg/mL oz. 0,28 mg CBD/g raztopine.

Za izdelavo umeritvene krivulje v enotah mg/mL smo alikvote osnovne raztopine in dodane volumne etanola merili z avtomatskimi pipetami. Hkrati smo ob pipetiranju alikvote tudi tehtali na analitski tehtnici in tehtali maso dodanega 96% etanola. To nam je omogočilo, da smo določili umeritveno premico v enotah mg CBD/g raztopine. Pripravljene standardne raztopine smo prefiltrirali v temne viale in jih analizirali s HPLC napravo.

3.2.5 Priprava vzorcev

V strokovni literaturi in v varnostnih listih smo poiskali obstoječe literaturne podatke o topnosti CBD v različnih topilih. Izpisani podatki so predstavljeni v poglavju 4 Rezultati.

Pri vsakem topilu smo začeli topnost določati tako, da smo najprej zatehtali določeno količino CBD v centrifugirko. Nato smo tehtnico tarirali in tehtali topilo, ki smo ga počasi dodajali, dokler ni izginil še zadnji kristal.

S tem smo določili približno koncentracijo nasičene raztopine. Nato smo pri naslednjih poskusih dodali 15–30 % večjo maso CBD in enako količino topila.

S tem smo pripravili suspenzije CBD v poljubnem topilu (slika 5). Suspenzije smo nato 10 min mešali na vorteks napravi, da se je raztopila večina CBD. Nadalje smo centrifugirke na stojalu dali na stresalnik, ki jih je stresal 48 h.

Slika 5. Centrifugirke s suspenzijami CBD v olju konopljinih semen, MCT olju in čijevem olju tik pred stresanjem na stresalniku.

Filtracija vzorca in priprava za analizo

In document SANDI KRALJ MAGISTRSKA NALOGA ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJ FARMACIJA (Strani 16-33)