Terapevtski potencial aktivacije TLR9

2.3.4.1 Vpliv signalizacije TLR9 na gostiteljev imunski odziv

Po aktivaciji s CpG ODN tipa B cDC in makrofagi pričnejo zoreti, kar se odraža v proizvajanju vnetnih citokinov kot so TNF-α, IL-6 in IL-12 ter povečani ekspresiji molekul PHK razreda II in kostimulatornih molekul (CD-40, B7) (Hemmi in sod., 2003). Nasprotno se pDC na stimulacijo s CpG ODN odzovejo s proizvodnjo IFN tipa I (Liu, 2005), ki deluje neposredno na celice CD8+T (Kolumam in sod., 2005) ter celice CD4+T (Havenar-Daughton in sod., 2006). Poleg tega IFN-α povzroči migracijo preko TLR9 aktiviranih pDC v marginalno cono zunanjega T-celičnega območja limfnega vozla, kjer lahko optimalno stimulirajo pridobljen imunski sistem (Asselin-Paturel in sod., 2005). Celice B in pDC po stimulaciji z agonisti TLR9 povečajo izražanje kostimulatornih molekul, postanejo odporne na apoptozo, zvišajo nivo izražanja kemokinskega receptorja CCR7 ter pričnejo proizvajati citokine in kemokine, ki vodijo v smer Th1 imunskega odziva (Krieg, 2006). Sočasna aktivacija naivnih celic B z antigenom in TLR9 ligandom vodi do diferenciacije v celice plazmatke, ki proizvajajo protitelesa (Jung in sod., 2002). Za aktivacijo spominskih celic B je dovolj že sama stimulacija s TLR9 agonistom (Bernasconi in sod., 2002). CpG ODN je torej zelo močan adjuvans, ki usmerja imunski odziv v smer Th1 (Klinman in sod., 2010). Po stimulaciji TLR9, ki ji sledi interakcija cDC in pDC pride do sproščanja IL-12 (Kuwajima in sod., 2006). Kot odziv na aktivacijo TLR9, cDC pričnejo izražati CD-40 in proizvajati IL-15, ki povzroči povečano izražanje CD-40 liganda na pDC. Nato pride do interakcije med CD-40 na cDC in CD-40 ligandom na pDC, kar vodi do proizvodnje IL-12 (Kuwajima in sod., 2006). Pokazali so, da DC, aktivirane preko TLR9 delujejo na celice NK in tako povzročijo citotoksične celične odzive in proizvodnjo IFN-γ. Slednji citokin povzroči povratno aktivacijo DC in ostalih imunskih celic, kar pomeni, da TLR9 igra osrednjo vlogo v komunikaciji med DC in NK ter tako omogoča aktivacijo učinkovitega imunskega odziva (Kumagai in sod., 2008).

Celice B prav tako izražajo TLR9. Stimulacija s CpG ODN tipa B ali K neposredno povzroči delitev celic B (Krieg in sod., 1995). Prav tako signalizacija TLR9 povzroči proizvodnjo protiteles (Krieg in sod., 1995) in zavre preklop težkih verig z IgM in IgG2a na IgE in IgG1, ki sta tipa protiteles, udeležena v alergijskih reakcijah (Lin in sod., 2004;

Liu in sod., 2003). To pomeni, da TLR9 igra ključno vlogo tudi pri aktivaciji celic B v kontekstu boja proti znotrajceličnim patogenom, saj usmerja imunski odziv v smer Th1 (Kumagai in sod., 2008).

Vpliv stimulacije receptorja TLR9 na imunski odziv je shematsko prikazan na sliki 15.

Slika 15: Vpliv signalizacije TLR9 na gostiteljev imunski odziv (Kumagai in sod., 2008: 4)

2.3.4.2 Odnos med strukturo in aktivnostjo CpG ODN

Optimalni CpG motiv za stimulacijo TLR9 se med vrstami razlikuje in je GACGTT za miš (Krieg in sod., 1995) in GTCGTT za človeka (Hartmann in Krieg, 2000). Poleg heksamernega CpG motiva imunostimulatorno aktivnost ODN določa število CpG motivov (optimalno dva do štiri), razmak med CpG motivi (najmanj dve vmesni bazi, prednostno timina) in narava CpG ODN ogrodja (fosforotioatno ogrodje je stabilnejše od fosfodiesterskega, saj je odporno na razgradnjo z nukleazami) (Krieg, 2006). Poleg tega je pomembno, da je 5' konec CpG ODN prost in nemodificiran, sicer je imunostimulatorni učinek bistveno slabši. To pomeni, da je konjugate s proteini ali peptidi za terapevtske namene potrebno pripravljati s povezavo preko 3' konca ODN, saj je prost 5' konec očitno pomemben za interakcijo z receptorjem (Putta in sod., 2010).

Poznani so trije tipi CpG ODN, ki se razlikujejo tako v strukturi kot v načinu delovanja in vplivu na imunski odziv (slika 16). CpG ODN razreda A (poznan tudi kot tip D) v pDC sproži sproščanje IFN-α, vendar šibko aktivira celice B. Struktura CpG ODN razreda A na 5' ali 3' koncu vsebuje poli-G motiv, kar omogoča, da se monomeri sestavijo v nanodelce.

CpG ODN razreda B (poznan tudi kot tip K) ne tvori višje urejenih struktur in močno aktivira celice B, vendar pa ne sproži intenzivnega sproščanja IFN-α. CpG ODN razreda C ima vmesne imunske lastnosti in močno aktivira celice B, poleg tega sproži sproščanje IFN-α. Biološko funkcijo CpG ODN tipa C pripisujejo posebni palindromni strukturi na 3' koncu, ki naj bi v endosomu omogočala tvorjenje dimera (Krieg, 2006).

Slika 16: Različni razredi CpG ODN (Krieg, 2006: 475)

2.3.4.3 Agonisti TLR9 v terapiji kužnih bolezni

Fiziološka vloga TLR9 je stimulacija imunskega odziva zoper znotrajcelične patogene, zato je bilo pričakovano, da profilaktična ali terapevtska uporaba sintetičnih agonistov TLR9 omogoča zaščito pred znotrajceličnimi okužbami (Krieg, 2006). Študije na miših so pokazale, da aktivacija prirojenega imunskega odziva s CpG ODN lahko nudi zaščito pred širokim spektrom virusnih in bakterijskih okužb, vključno z najnevarnejšimi, kot so Bacillus anthracis, vaccinia virus in virus Ebole (Klinman, 2004).

2.3.4.4 Agonisti TLR9 kot adjuvansi za pripravo cepiv

Aktivacija TLR9 pri številnih živalskih modelih ojača profilaktični ali zaščitni antigensko specifični humoralni in celični odziv na široko paleto različnih antigenov (peptidni in proteinski antigeni, živi oslabljeni ali mrtvi virusi, cepiva na osnovi DC, avtologna celična cepiva in polisaharidni konjugati) (Krieg, 2006). Mehanizem, ki je odgovoren za močno imunostimulatorno aktivnost CpG ODN vključuje sinergijo med BCR in TLR9, ki prednostno stimulira antigensko specifične celice B (Krieg in sod., 1995), inhibicijo apoptoze (Yi in sod., 1998), ojačan HCCS (Liu in sod., 2003) in stimulacijo zorenja in diferenciacije DC, ki se odraža v ojačani aktivaciji celic Th1 in CTL celo ob odsotnosti pomoči celic CD4+T (Sparwasser in sod., 2000). Neposredna konjugacija CpG ODN in antigena ojača vnos antigena in imunski odziv (Tighe in sod., 2000a). CpG ODN kažejo še večjo imunostimulatorno aktivnost, če so pripravljeni v obliki mikrodelcev, nanodelcev, lipidnih emulzij ali podobnih formulacij, kar je še posebej pomembno v primeru, ko je antigen neimunogen (Krieg in Davis, 2001). CpG ODN se je izkazal tudi kot uspešen adjuvans za pripravo mukoznih cepiv (Moldoveanu in sod., 1998). Pri človeku so CpG ODN uporabili kot adjuvans pri pripravi cepiva zoper hepatitis B in pokazali, da ima zelo močno imunostimulatorno aktivnost, tako v kombinaciji z alumom kot tudi sam.

Protitelesa, specifična za površinski antigen hepatitisa B so nastala hitreje in v višjih titrih v primerjavi s kontrolo (Cooper in sod., 2004; Halperin in sod., 2003). Uporaba CpG ODN kot adjuvansa pri miših omogoča znižanje količine antigena za dva velikostna razreda s primerljivim protitelesnim odzivom običajnega cepiva brez CpG ODN (Weeratna in sod., 2003).

2.3.4.5 Agonisti TLR9 v terapiji raka

Ključne težave pri boju zoper rakasta obolenja smo že izpostavili pod točko 2.3.3.3. V številnih mišjih modelih so pokazali, da CpG ODN učinkuje protitumorsko (Krieg, 2004).

V relativno majhnih tumorjih je monoterapija s CpG ODN lahko dovolj za sproženje učinkovitega T-celičnega odziva in imunski nadzor nad tumorjem. Za učinkovitost proti večjim tumorjem je CpG ODN potrebno kombinirati z ostalimi konvencionalnimi terapijami kot so protitelesna terapija, radioterapija, kemoterapija ali operativni posegi (Krieg, 2006). Spodbudni rezultati na mišjih modelih so v letu 2005 privedli do kliničnih študij uporabe CpG ODN za terapijo raka, kjer so pokazali boljši imunski odziv in večjo verjetnost preživetja (Manegold in sod., 2008).

Vloga aktivacije receptorja TLR9 v terapiji raka je shematsko prikazana in opisana na sliki 17.

Slika 17: Učinek aktivacije TLR9 na protitumorski imunski odziv (Krieg, 2006: 479)

Običajno maligni tumorji zavrejo imunske odzive in ustvarijo okolje, ki ohranja toleranco celic T, kar onemogoča razvoj protitumorske imunosti. Aktivacija DC preko TLR9 ustvari Th1 citokinsko/kemokinsko okolje in poveča nivo izražanja kostimulatornih molekul na pDC, kar preusmeri toleranco celic T v močan citotoksičen odziv limfocitov T proti tumorskim antigenom (Krieg, 2006).