Vsebnost skupnih flavanonov in dihidroflavonolov v vzorcih cvetnega prahu osmukanca smo določili tako, da smo v 1,5 mL epice odpipetirali 0,10 mL izvlečka in nadaljevali s postopkom za določanje flavanonov in dihidroflavonolov, kot je opisano pri pripravi umeritvene krivulje.
Z uporabo smernega koeficienta premice in izmerjenih A486 smo nato najprej izračunali masno koncentracijo flavanonov in dihidroflavonolov v reakcijski zmesi po naslednji zvezi:
γreakc.zmesi =A486
k ...(13)
γreakc.zmesi – masna koncentracija flavanonov in dihidroflavonolov v reakcijski zmesi (mg/L) A486 – absorbanca pri valovni dolžini 486 nm
k – smerni koeficient premice
Nato smo izračunali masno koncentracijo flavanonov in dihidroflavonolov v izvlečku (v spodnjo zvezo vstavljena zveza za izračun masne koncentracije (γcelotnega razred.izvlečka) v mešanici Vcelotnega razred.izvlečka).
γizvleč. =γreakc.zmesi· Vreakc.zmesi· Vcelotnega supernatanta
V p supernatanta· Vizvleč. ...(14)
γizvleč. – masna koncentracija flavanonov in dihidroflavonolov v izvlečku (mg/L) Vreakc.zmesi – volumen reakcijske zmesi (2,5 mL)
Vcelotnega supernatanta – (Vizvleč. (0,1mL) + volumen raztopine DNPH (0,2 mL) + volumen raztopine KOH (0,7 mL) = 1 mL)
Vp supernatanta – volumen supernatanta, ki ga odpipetiramo (0,18 mL) Vizvleč. – volumen izvlečka (0,1 mL)
Z upoštevanjem celotnega volumna izvlečka pri ekstrakciji smo izračunali maso flavanonov in dihidroflavonolov v celotnem izvlečku.
mv celot.izvleč. = γizvleč.· Vcelot.izvleč. ...(15)
mv celot.izvleč. – masa flavanonov in dihidroflavonolov v celotnem izvlečku Vcelot.izvleč. – volumen celotnega izvlečka pri ekstrakciji
Masa flavanonov in dihidroflavonolov v celotnem izvlečku je enaka njihovi masi v zatehti cvetnega prahu osmukanca. Zato smo maso flavanonov in dihidroflavonolov na g cvetnega prahu izračunali z naslednjo zvezo:
mna g cvetnega prahu= mv celot.izvleč.
mcv.prahu ...(16)
mna g cvetnega prahu – masa flavanonov in dihidroflavonolov na g cvetnega prahu (mg/g)
mcv.prahu – masa cvetnega prahu (g)
Vsebnost flavanonov in dihidroflavonolov smo v vzorcih cvetnega prahu osmukanca izrazili v ekvivalentih naringenina kot mg naringenina na gram suhe snovi (mg NA/gs.s.).
3.2.8 Določanje sposobnosti lovljenja radikala DPPH•
AOP vzorcev cvetnega prahu osmukanca smo določali z uporabo radikala 1,1’-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH•) po metodi, ki so jo opisali Brand-Williams in sod. (1995) z določenimi modifikacijami. Metoda temelji na reakciji med prostim radikalom DPPH• in antioksidantom. Radikal DPPH• prejme vodikov atom antioksidanta in s tem preide v nereaktivno obliko (iz vijolične v rumeno barvo), kar vpliva na manjšo absorpcijo svetlobe.
Priprava reagentov:
Raztopino DPPH• smo pripravili tako, da smo v plastično ladjico natehtali 7,88 mg DPPH•, kvantitativno prenesli v 200 mL čašo, ovito v aluminijasto folijo in dobro raztopili na magnetnem mešalu. Nato smo raztopino kvantitativno prenesli v 200 mL bučko in dopolnili do oznake s 96 % etanolom.
Za določitev sposobnosti lovljenja radikala DPPH• izvlečkov cvetnega prahu osmukanca smo pripravili po štiri različne razredčitve vsakega izvlečka v 96 % etanolu, vsako v treh paralelkah. Steklene epruvete smo ovili v aluminijasto folijo in vanje odpipetirali 0,1 mL ustrezno razredčenega izvlečka, dodali 2,9 mL raztopine DPPH• ter začeli meriti čas.
Mešanico smo dobro premešali na vrtinčniku. Po 30 min od dodatka raztopine DPPH• smo vzorce prelili v kivete in pomerili absorbanco pri valovni dolžini 517 nm (Av517). Kontrolne vzorce smo pripravili po enakem postopku, le namesto vzorca smo dodali 96 % etanol.
Absorbanco kontrolnega vzorca (Ak517) smo pomerili pred in po vsakem sklopu meritev.
Spektrofotometer smo predhodno umerili na slepi vzorec, za katerega smo uporabili 96 % etanol.
Pri izračunu sposobnosti lovljenja radikala DPPH smo si pomagali z naslednjimi zvezami.
Najprej smo izračunali delež DPPH• (wpreostalega DPPH (%)), ki po inkubaciji preostane v reakcijski zmesi:
wpreostalega DPPH= Av517
Ak517· 100 % ...(17) Av517 – absorbanca vzorca pri valovni dolžini 517 nm
Ak517 – absorbanca kontrolnega vzorca pri valovni dolžini 517 nm
Nato smo za vsak izvleček cvetnega prahu izrisali diagram wpreostalega DPPH v odvisnosti od koncentracije skupnih fenolnih spojin v reakcijski zmesi (γreakc.zmesi). Z uporabo linearne regresijske analize smo nato določili k premice.
wpreostalegaDPPH= k · γreakc.zmesi ...(18)
γreakc.zmesi – masna koncentracija fenolnih spojin v reakcijski zmesi (mg/L) k – smerni koeficient premice
Vrednost EC50, s katero izrazimo sposobnost antioksidantov za lovljenje DPPH•, smo izračunali po naslednji zvezi:
EC50= − 50 %
k ...(19)
EC50 – koncentracija antioksidantov, ki je potrebna, da se začetna količina DPPH• zmanjša za 50 %
Manjša vrednost EC50 pomeni večji AOP.
Sposobnost antioksidantov za lovljenje radikala DPPH• lahko izrazimo tudi kot delež radikala DPPH• (wulovljenega DPPH (%)), ki so ga antioksidanti pretvorili v neaktivno obliko;
izračunamo pa ga po naslednji zvezi:
wulovljenegaDPPH= 100 % − wpreostalegaDPPH ...(20)
3.2.9 Določanje sposobnosti lovljenja radikala O2•
Pri izvedbi analize se ustvari pogoje za tvorbo O2•radikala z uporabo sistema nikotinamid adenin dinukleotid/fenazin metasulfat (NADH/PMS). Nastali radikal reducira reagent nitrotetrazol modro (NBT), reducirana oblika reagenta (modro obarvani formazan) pa absorbira svetlobo. Določitev je spektrofotometrična. Manjša absorbanca vzorca pomeni manjšo vsebnost reducirane molekule NBT, katera nastane zaradi delovanja O2• radikala, kar pa kaže na večjo sposobnost antioksidantov za lovljenje tega radikala (Abramovič, 2011).
Priprava reagentov:
Fosfatni pufer smo pripravili tako, da smo v čaši zatehtali 3,38 g KH2PO4 in 3,53 g Na2HPO4 in vsebini raztopili v manjši količini destilirane vode, kvantitativno prenesli v 1 L čašo in z destilirano vodo dopolnili do 900 mL. Nato smo z dodajanjem 10 M NaOH dvignili pH mešanice na vrednost 7,4, prelili v 1 L bučko in z destilirano vodo dopolnili do oznake.
Raztopino NBT (10 μM) smo pripravili tako, da smo eno tableto NBT raztopili v 81,529 mL fosfatnega pufra.
Za pripravo raztopine NADH (468 μM) smo zatehtali 16,60 mg NADH na plastično ladjico, vsebino kvantitativno prenesli v 50 mL bučko in dopolnili do oznake s fosfatnim pufrom.
Raztopino PMS (60 μM) smo pripravili tako, da smo na plastično ladjico zatehtali 1,84 mg PMS, kvantitativno prenesli v 100 mL bučko in dopolnili do oznake s fosfatnim pufrom.
Vsi reagenti so bili pripravljeni sveži (dnevno) in med analizo hranjeni na ledu.
Za določitev sposobnosti lovljenja radikala O2• smo v epruveto odpipetirali 50 μL izvlečka cvetnega prahu in mu dodali 96 % etanol do skupnega volumna 0,5 mL. Nato smo razredčenemu izvlečku dodali 0,5 mL raztopine NBT, 0,5 mL raztopine NADH in nato še 0,5 mL raztopine PMS. 5 min po dodatku zadnjega reagenta (PMS) smo izmerili absorbanco vzorca pri valovni dolžini 560 nm (Av560). Absorbanco vzorca smo pomerili proti slepemu vzorcu, ki smo ga pripravili na enak način, le da smo namesto reagenta PMS dodali 0,5 mL fosfatnega pufra. Vzporedno smo pripravili tudi kontrolni vzorec, katerega smo pomerili na začetku in ob koncu vsakega sklopa meritev. Kontrolni vzorec smo pripravili tako kot vzorec, le da smo namesto razredčenega izvlečka dodali 0,5 mL 96 % etanola. Absorbanco kontrolnega vzorca (Ak560) smo pomerili proti slepemu vzorcu, ki je bil pripravljen na enak način kot kontrolni vzorec, le namesto reagenta PMS je vseboval 0,5 mL fosfatnega pufra.
Sposobnost antioksidantov za lovljenje radikala O2• smo izrazili kot koeficient sposobnosti lovljenja radikala O2• (KSA (%)). Izračunali smo ga iz naslednje zveze:
KSA =1 − Av560
Ak560 · 100 %
...(21)
Av560 – absorbanca vzorca pri valovni dolžini 560 nm
Ak560 – absorbanca kontrolnega vzorca pri valovni dolžini 560 nm Večja vrednost KSA pomeni večji AOP.
3.3 STATISTIČNA ANALIZA
Rezultate opravljenih analiz smo zbrali in statistično obdelali z računalniškima programoma Microsoft Excel 2006 in IBM SPSS Statistics 22.0. Dobljene rezultate smo podali kot povprečje treh paralelk ± standardni odklon (sd). Razlike med posameznimi vzorci smo testirali s programom analize variance (ANOVA) in testi mnogoterih primerjav. Nato smo med testiranimi parametri določili povezavo tako, da smo jim z regresijsko analizo določili Pearsonov korelacijski koeficient.
4 REZULTATI Z RAZPRAVO
4.1 VSEBNOST SKUPNIH FENOLIH SPOJIN, FLAVONOIDOV IN AOP V SVEŽEM CVETNEM PRAHU OSMUKANCU
Analize smo opravljali na šestih vzorcih svežega cvetnega prahu osmukanca, ki smo ga dobili iz Čebelarske zveze Slovenije. Cvetni prah je bil zbran v spomladanskih mesecih leta 2019 na različnih geografskih območjih Slovenije, kot je prikazano v preglednici 1. V pripravljenih etanolnih izvlečkih svežega cvetnega prahu smo določili vsebnost skupnih fenolnih spojin, flavonoidov, flavonov in flavonolov, flavanonov in dihidroflavonolov ter sposobnost lovljenja radikalov DPPH• in O2•.
4.1.1 Vsebnost skupnih fenolnih spojin v svežem cvetnem prahu
Vsebnost skupnih fenolnih spojin v svežem cvetnem prahu osmukancu smo določali spektrofotometrično s Folin-Ciocalteu reagentom. Vsebnosti na sliki 12 so podane na gram suhe snovi in izražene v ekvivalentih galne kisline (kot mg GA/gs.s.).
Kot vidimo na sliki 12, se vsebnosti skupnih fenolnih spojin v svežih vzorcih cvetnega prahu letnik 2019 med seboj statistično značilno razlikujejo. Najmanjšo vsebnost skupnih fenolnih spojin smo določili v cvetnem prahu CP7, ki je bil zbran na geografskem območju osrednje Slovenije in sicer (5,7 ± 0,2) mg GA/gs.s.. Temu sledi vzorec, ki je bil zbran na območju jugovzhodne Slovenije in vzorec zbran v Zasavju. Nekoliko več fenolnih spojin vsebujeta oba vzorca cvetnega prahu z Gorenjske. Največjo vsebnost skupnih fenolnih spojin smo določili v cvetnem prahu CP12, to je (12,4 ± 0,2) mg GA/gs.s., ki je bil zbran na geografskem območju Primorska.
Podobne vsebnosti skupnih fenolnih spojin je v okviru magistrske naloge v vzorcih spomladanskega cvetnega prahu, ki je bil zbran leta 2017 na različnih geografskih območjih Slovenije, določila tudi Angelova (2018). Cvetni prah je tako kot mi, dobila iz ČZS.
Vsebnosti skupnih fenolnih spojin v njenih vzorcih so se gibale od 6,5 do 13,1 mg GA/gs.s..
Slika 12: Vsebnost skupnih fenolnih spojin v svežem cvetnem prahu osmukancu; različne nadpisane črke