Vrednotenje dermalne absorpcije parabenov in vitro

Številne raziskave poročajo o hitri dermalni absorpciji parabenov in njihovem nalaganju v koži. Zaradi razlik v fizikalno-kemijskih lastnostih parabenov se posamezni parabeni različno absorbirajo. Zaradi amfifilnih lastnosti so topni v vodni fazi izdelka, kjer delujejo kot konzervansi, obenem so prisotni tudi v lipofilni fazi izdelka, iz katere absorpcija v kožo poteka hitreje, zato je za njihovo prehajanje pomembna tudi njihova porazdelitev med vodno in oljno fazo izdelka (20). Poleg intrinzičnih lastnosti snovi je absorpcija močno odvisna še od površine in mesta nanosa, stanja kože in starosti (8, 21).

Da parabeni prehajajo v in skozi kožo, je znano že od samega odkritja, saj so kmalu po pričetku uporabe že poročali o prvih alergijskih reakcijah. Že leta 1979 so proučevali, kako različne snovi, kot so polisorbat 80, propilenglikol in polietilenglikol 400, vplivajo na penetracijo parabenov v kožo (21).

Ključno o dermalni absorpciji smo izvedeli že v raziskavi iz leta 1996, ki so jo opravili Pozzo in sod. kjer so in vitro na človeški koži testirali penetracijo parabenov iz različnih formulacij.

S pomočjo difuzijske celice so merili permeabilnostne konstante in maksimalni pretok parabenov skozi kožo. Kot akceptorski medij v difuzijski celici so uporabili fiziološko raztopino z raztopljenim albuminom, da bi čim bolj posnemali in vivo pogoje. Najprej so permeacijo testirali v enostavnih nasičenih raztopinah. Pozitivno korelacijo med permeabilnostjo in lipofilnostjo parabenov so ugotovili, ko so bili raztopljeni v vodnem mediju. Z daljšanjem alkilne verige se jim veča lipofilnost, zato postanejo manj topni v vodnem mediju in bolj topni v roženi plasti, zato se njihova permeabilnost veča. Po dodatku propilenglikola ali polietilenglikola 400 v vodo se je povečala topnost parabenov v mediju in posledično je bila permeabilnost manjša v primerjavi z vodno raztopino brez dodatkov.

Nasprotno od vodnega medija so ugotovili, ko so bili raztopljeni v lipofilnem mediju, in sicer v tekočem parafinu ali raztopini parabenov v acetonu. Medij je postal bolj učinkovito topilo kot rožena plast, zato se je njihova permeabilnost manjšala z dolžino verige. Ugotovili so, da je dermalna absorpcija odvisna od formulacije, kar potrjuje tudi prej omenjena raziskava iz leta 1979 (20).

Kakorkoli, korelacija med logP in permeacijo v omenjenih enostavnih formulacijah ne more napovedati dermalne absorpcije iz kompleksnejših formulacij, kot so kozmetični izdelki, saj le-ti vsebujejo številne komponente, ki med seboj lahko tvorijo različne interakcije. V ta namen so v omenjeni raziskavi pripravili tri različne kompleksne formulacije – dve emulziji tipa O/V in eno tipa V/O. Vse so vsebovale parabene v koncentraciji 0,7 % (m/m), kar je za MP in EP znotraj dovoljenih koncentracij glede na Uredbo (ES) št. 1223/2009 Evropskega Parlamenta in Sveta o kozmetičnih izdelkih, za PP in BP pa ne. Prišli so do pričakovanih ugotovitev, da iz emulzij O/V, kjer je voda zunanja faza, penetrirajo bolje kot iz emulzij V/O, kjer je olje zunanja faza. To pomeni, da imajo parabeni večjo afiniteto do rožene plasti kot do zunanje faze v emulzijah O/V ter večjo afiniteto do zunanje faze kot do rožene plasti pri emulzijah V/O. Poleg tega je bila permeacija iz O/V višja kot so pričakovali po rezultatih iz nasičene vodne raztopine. To potrjuje, da različne komponente v formulaciji vplivajo na penetracijo parabenov. Pri vseh emulzijah so ugotovili, da permeacija upada z lipofilnostjo.

Ugotovili so tudi, da je pretok parabenov v kožo večji iz O/V emulzij kot iz V/O emulzij.

Nadalje so ugotovili, da je absorpcija parabenov višja iz sveže pripravljenih kozmetičnih emulzij in postopoma upada v prvih treh mesecih, nakar se ustali približno tri mesece po izdelavi izdelka (20).

Podobno je leta 1997 je Kitagawa s svojo skupino in vitro potrdil na koži morskega prašička, in sicer, da parabeni prehajajo roženo plast po intercelularni poti skozi lamelarno plast lipidov, prikazano na Sliki 3 z modro puščico. To je potrdil z ugotovitvijo, da permeabilnostni koeficient (Kp) parabenov korelira s porazdelitvenim koeficientom oktanol/voda, in sicer, da se z večanjem logPo/v, kar hkrati pomeni večanje lipofilnosti, veča Kp. Dodatno so to potrdili z odstranitvijo lipidov iz kože in ugotovili, da se Kp metilparabena, ki je najbolj hidrofilen med parabeni, poveča do 20-krat, medtem ko se Kp butilparabenu, ki je najbolj lipofilen med testiranimi parabeni, bistveno ne spremeni (22).

Slika 3: Shema različnih plasti kože in intercelularne poti po kateri parabeni prehajajo skozi kožo – prikazano z modro puščico (23)

à ROŽENA PLAST (mrtvi del epidermisa)

à VIABILNI DEL EPIDERMISA

à DERMIS

Do ugotovitve, da v emulzijah permeacija parabenov upada z večanjem njihove lipofilnosti, so prišli tudi Esposito in sod., kljub temu da so bile drugače formulirane kot emulzije iz raziskave, ki so jo opravili Pozzo in sod. Testirali so tudi dva hidrofilna gela, kjer se je permeabilnost večala z lipofilnostjo parabenov (24). To se ujema z ugotovitvami iz raziskave, ki so jo opravili Pozzo in sod.

Romonchuk in sod. so v raziskavi leta 2006 ovrgli domnevo, da parabeni prehajajo kožo le iz tekočih formulacij, ne pa tudi iz praškov. Raziskavo so izvedli na umetni membrani in človeški koži, kjer so potrdili, da parabeni prehajajo v kožo tudi v odsotnosti tekočine, nujno je le, da je snov v neposrednem stiku s kožo oz. membrano (25).

V raziskavah so preiskovali tudi vpliv različnih fizikalnih parametrov, kot sta vlažnost in temperatura, na penetracijo parabenov, in sicer MP in BP. Ugotovili so, da se z višanjem temperature in vlažnosti poveča njuna permeacija v kožo, hkrati se poveča tudi njun pretok skozi kožo (26, 27).

V nekaj raziskavah so ugotovili, da ima med parabeni MP najvišji pretok (Js) skozi kožo, kateri se z daljšanjem alkilne verige manjša. Ker je pretok odvisen od koncentracije snovi, parabeni pa so različno topni v določenem mediju, to predstavlja metodološko težavo.

Akomeah in sod. so v prvi raziskavi (26) primerjali pretok MP in BP skozi kožo tako, da so pripravili nasičene vodne raztopine, v drugi raziskavi (4) pa nasičene raztopine v fosfatnem pufru. Težava te metode je, da sta MP in BP različno topna, posledično njuna koncentracija v raztopinah ni bila enaka, zato je primerljivost pretokov vprašljiva. Caon in sod. so sicer uporabili enake koncentracije MP, EP, PP in BP (18), vendar so posledično v medij morali dodati etanol, ki kot sotopilo izboljša topnost parabenov, hkrati pa je tudi pospeševalec penetracije, kar predstavlja težavo v tem poizkusu. V prej omenjeni raziskavi, ki so jo opravili Pozzo in sod., so v vseh pripravljenih formulacijah opazili, da ima MP najvišji pretok skozi kožo, ki se je z dolžino verige nižal (20). Pri nasičenih vodnih raztopinah je v rezultatih lepo vidno, da nasičena koncentracija z dolžino alkilne verige parabena upada. Iz teh koncentracij in eksperimentalno izmerjenih pretokov so lahko izračunali navidezni permeabilnostni koeficient in ugotovili, da ima MP v vseh formulacijah najvišjega. Ta način izvedbe merjenja pretokov oz. obsega penetracije skozi kožo je bil med vsemi najbolj zanesljiv.

Pri merjenju pretoka skozi kožo je zaradi različne topnosti težko ohraniti primerljivost med spojinami, saj je pretok odvisen od koncentracije snovi, zato rezultati raziskav, v katerih so uporabili različne koncentracije, niso preprosto primerljivi. Kljub metodološki težavi, moramo poudariti, da pretok lahko približno napovemo na podlagi porazdelitvenega koeficienta med vehiklom in roženo plastjo, ki pa korelira z logPo/v (20). Vendar pa so to le nizko zanesljive napovedi, zato bi bilo potrebno izboljšati metodološki pristop, da bi bili rezultati bolj verodostojni.

El Hussein in sod. so opravili in vitro raziskavo na človeškem epidermisu, na katerega so aplicirali komercialni losjon z 0,1 % MP, 0,08 % EP, 0,2 % PP in 0,15 % BP ter merili nalaganje omenjenih komponent v koži po enkratni in trikratni aplikaciji v roku 24 ur. Po enkratni aplikaciji losjona so ugotovili, da se bolj lipofilni parabeni dlje zadržujejo v koži.

Po trikratni aplikaciji losjona so rezultati pokazali, da parabeni po večkratni aplikaciji prehajajo skozi kožo v večji meri v primerjavi z enkratno aplikacijo. To lahko razložimo z nasičenjem rožene plasti, ki deluje kot zaloga nanešenih snovi, čemur sledi pospešeno prehajanje apliciranih komponent. Take pogoje lahko dosežemo tudi in vivo, bodisi z večkratno aplikacijo izdelka, ki vsebuje parabene, ali z uporabo več različnih izdelkov, ki vsebujejo parabene tekom dneva (28). In vivo bi to lahko rezultiralo v višji sistemski koncentraciji parabenov v obliki izhodne spojine.

Caon in sod. so v raziskavi opazovali zadrževanje parabenov v koži in podatke primerjali z že objavljeno literaturo. Ugotovili so, da dermis, ki je bolj hidrofilen od epidermisa, pri transdermalni permeaciji bolj lipofilnih parabenov predstavlja veliko oviro (29). Epidermis namreč vsebuje roženo plast, ki je bogata z lipidi, do katere imajo parabeni večjo afiniteto in se v njem bolj zadržujejo (30). Difuzija parabenov skozi kožo je odvisna od njihovih interakcij z intercelularnimi lipidi in molekulske mase. V splošnem difuzijo zmanjšajo močne interakcije z lipidi, katere se večajo z lipofilnostjo molekule. Po drugi strani se v bolj hidrofilnem dermisu zadržujejo manj. Opazili so, da sta se MP in EP v večji meri zadrževala v epidermisu, medtem ko sta imela PP in BP podoben profil zadrževanja v obeh plasteh (29).

Tudi Pedersen in sod. so v raziskavi ugotovili, da se parabeni v večji meri zadržujejo v epidermisu. Nadalje so ugotovili, da tudi sestava formulacije vpliva na zadrževanje parabenov v koži (30).

Ugotovili smo, da so o parabenih opravili številne raziskave na in vitro nivoju, kjer so uporabili različne testne materiale, kot so človeška, prašičja, zajčja, podganja, mišja koža in koža morskega prašička ter različne umetne membrane. Parabene so uporabili v različnih koncentracijah, od koncentracij, ki so znotraj dovoljenih vrednosti po Uredbi (ES) št.

1223/2009 Evropskega Parlamenta in Sveta o kozmetičnih izdelkih do nasičenih raztopin.

Uporabili so jih bodisi v enostavnih formulacijah z enim topilom bodisi v kompleksnejših formulacijah, kot so emulzije in hidrogeli. Pomembnejše in vitro raziskave o dermalni absorpciji so povzete v Preglednicah VI in VII. Glavne ugotovitve v zvezi z dermalno absorpcijo so:

• permeacija parabenov je odvisna od njihovih fizikalno-kemijskih lastnosti, kot so topnost, molekulska masa in lipofilnost (30);

• permeacija parabenov je odvisna od formulacije, in sicer (20):

o iz vodnih formulacij se permeacija veča z dolžino alkilne verige parabenov, o iz lipofilnih formulacij permeacija upada z dolžino alkilne verige parabenov, o iz emulzij permeacija upada z dolžino alkilne verige parabenov,

o določene snovi v formulaciji lahko povečajo ali zmanjšajo (npr.

nikotinamid (29)) permeacijo,

o topnost v formulaciji in njena lipofilnost vplivata na penetracijo parabenov bolj kot pa sama koncentracija le-teh v formulaciji;

• dejavniki, ki pospešijo penetracijo, so: višja temperatura, večja vlažnost kože, pospeševalci penetracije (npr. etanol, urea, določene površinsko aktivne snovi), tanjša koža (npr. pod očmi), mikropoškodbe (26, 27);

• MP ima v vseh formulacijah najvišji pretok skozi kožo, sledijo EP, PP in BP;

• po večkratni aplikaciji parabenov pride do nasičenja rožene plasti in pospešene permeacije osnovne spojine skozi kožo (28);

• parabeni se v večji meri zadržujejo v bolj lipofilnem epidermisu, saj imajo veliko afiniteto do intercelularnih lipidov, s katerimi tvorijo interakcije, in manj v bolj hidrofilnem dermisu (29, 30).

Po tem delu pregleda literature smo zaključili, da koža kot difuzijska bariera sicer omejuje absorpcijo parabenov, vendar ne v tolikšni meri, da bi to lahko preprečilo njihovo sistemsko absorpcijo. To smo ugotovili tudi v raziskavah in vivo, ki so predstavljene v nadaljevanju.

Preglednica VI: Izsledki in vitro raziskav o dermalni absorpciji parabenov

Rezultati, ugotovitve permeacija odvisna od formulacije, Kp korelira z logP(o/v) parabeni penetrirajo roženo plast po intercelularni poti, Kp korelira z logP(o/v) v emulzijah permeabilnost upada z lipofilnostjo parabena, v hidrogelih se permeabilnost viša z lipofilnostjo parabena permeabilnost in zadžrevanje v koži se s temperaturo večata, BP se zadržuje v večji meri kot MP MP penetrira tako iz praškov kot iz tekočih formulacij

Vrsta parabena in uporabljena koncentracija MP, EP, PP, BP, HP, OP; nasičene raztopine in 0,7 % (m/m) MP, EP, PP, BP; neznana konc. MP, EP, PP; vsakega 0,5 % (m/m) nasičene vodne raztopine MP in BP nasičena raztopina MP

Testni material človeška koža s trebuha koža s hrbta morskega prašička sintezna membrana človeški epidermis in umetna membrana človeška koža in umetna homogena silikonska membrana

Namen raziskave ugotoviti vpliv formulacije na penetracijo ugotoviti razmerje med logP(o/v)/Kp in vpliv pospeševalcev penetracije ugotoviti vpliv formulacije na penetracijo ugotoviti vpliv temperature na dermalno absorpcijo parabenov in njihovo zadrževanje v koži ugotoviti permeacijo iz praškov in tekočih formulacij

Referenca (prvi avtor, letnica) Pozzo, 1996 Kitagawa, 1997 Esposito, 2003 Akomeah, 2004 Romonchuk, 2006

Preglednica VII: Izsledki in vitro raziskav o dermalni absorpciji parabenov (nadaljevanje)

Rezultati, ugotovitve v kombinacji boljša penetracija obeh spojin permeacija upada z dolžino verige; kombinaciji MP+EP in MP+PP najmanj penetrirata; bolj lipofilni imajo manjši pretok (BP = PP < EP < MP) pretok MP > BP; pretok čez različne membrane zelo podoben - razlike v permeaciji posledica intrinzičnih razlik v kožni barieri permeacija MP > PP > BP; Kp približno isti ne glede na koncentracijo v formulaciji povišani T in vlažnost povečata penetracijo MP

Vrsta parabena in uporabljena koncentracija nasičena raztopina MP MP, EP, PP, BP; 0,1 % v raztopini etanola in fosfatnega pufra MP, BP v 1 % (m/v) v fosfatnem pufru MP, PP in BP; O/V kreme z 0,1 %, 0,4 % in 2,0 % nasičena vodna raztopina MP

Testni material človeški epidermis koža prašičjega uhlja človeški epidermis različnih donorjev mišja koža in človeški epidermis prašičja koža

Namen raziskave ugotovoti permeacijo MP (sam v raztopini in v kombinaciji z1 4-CP) transdermalna permeacija parabenov penetracija različnih komponent skozi kožo različnih donorjev dermalna absorpcija iz različnih formulacij ugotoviti vpliv temperature in vlažnosti na permeacijo

Referenca (prvi avtor, letnica) Romonchu, 2010(31) Caon, 2010 Akomeah, 2010 Seo, 2016 (32) Iikura, 2019

14-CP = 4-cianofenol