Vrednotenje metabolizma parabenov in vitro

Kot že prej omenjeno, predstavlja koža z zunanjo roženo plastjo bariero za vdor različnih snovi in kemikalij. V grobem jo lahko razdelimo na neživo roženo plast in živo plast, ki je sestavljena iz živega dela epidermisa in dermisa (36), v katerih poteka tudi metabolizem.

Snovi, ki prodrejo skozi roženo plast, se lahko metabolizirajo v koži že med absorpcijo v sistemski krvni obtok, vendar je in vivo zelo težko ločiti med tem metabolizmom in metabolizmom v jetrih (37). Poleg tega je v koži precej manj metabolno aktivnih encimov kot v jetrih. Najdemo predvsem karboksilesteraze, glutationtransferaze, acetiltransferaze, glukuroniltransferaze in sulfotransferaze, zato je lokalni metabolizem v koži pomemben predvsem za substrate teh encimov, saj lahko to pomembno vpliva na sistemsko koncentracijo aplicirane snovi. Ker je in vivo težko določiti obseg metabolizma v koži, obstajajo in vitro metode, ki med drugim uporabljajo celične frakcije, kot so mikrosomi, in živalsko kožo ali kožo različnih donorjev, kar omogoča raziskovanje metabolizma v koži med absorpcijo (37). Pri metabolizmu sta pomembna predvsem hitrost penetracije in pretok parabenov skozi kožo, kar smo predstavili v poglavju Absorpcija. Počasni pretok lahko omogoči obsežnejši in bolj učinkovit lokalni metabolizem (38).

Celične frakcije pridobijo s centrifugiranjem homogenatov različnih tkiv (39), predvsem iz jeter, lahko pa tudi iz ledvic, možganov, črevesja, kože idr. Poznamo frakcije S9, ki jih konvencionalno pripravijo s homogenizacijo tkiva in ločevanjem s centrifugiranjem pri 9000 g. Ta frakcija vsebuje tako mikrosome kot citosol. Mikrosomi vsebujejo predvsem encime prve faze metabolizma, citosol pa encime druge faze metabolizma. Ti dve frakciji lahko nadalje ločimo z ultracentrifugiranjem pri 100 000 g. Frakcija S9 je bolj primerna za

proučevanje hidrolize estrov kot ločeni frakciji mikrosomov in citosola, saj vsebuje encime citosola in endoplazmatskega retikuluma (38).

Človeška koža vsebuje številne esteraze, ki so sposobne cepiti različne ksenobiotične estre (40). Esteraze so encimi, ki jih uvrščamo v skupino hidrolaz, večina jih spada v družino karboksilesteraz (npr. človeška karboksilesteraza, hCE) (41). To so serinske hidrolaze, ki s hidrolizo cepijo estre na karboksilno kislino in alkohol, kar v primeru parabenov pomeni na PHBA in pripadajoči alkohol. Ker sta nastala produkta bolj vodotopna kot izhodna spojina in se lažje izločata, je ta reakcija velikokrat razstrupljajoča. Reakcija je shematsko prikazana na Sliki 4 (2). Pri ljudeh sta najpogostejši dve izoobliki hCE, in sicer hCE1, ki prevladuje v jetrih, in hCE2, ki prevladuje v koži, pretežno v bazalni plasti epidermisa, in v tankem črevesju (8). Njuna substratna specifičnost se tudi iz vidika metabolizma parabenov razlikuje, saj hCE1 prednostno hidrolizira MP in EP, hCE2 pa PP, BP in BeP. V manjši meri parabene hidrolizirajo tudi acetilholinesteraze (42).

Hidroliza parabenov, prikazana na Sliki 4, spada med reakcije prve faze metabolizma, nadalje pa vstopajo v reakcije druge faze, kot so konjugacija z glukuronidom, sulfatom ali glicinom. Konjugacija lahko poteče tudi neposredno na parabenu, brez predhodnje hidrolize.

Konjugacija poveča hidrofilnost snovi, da se lažje izloči iz telesa. Pot izpostavitve parabenom močno vpliva na njihov metabolizem (43).

Slika 4: Hidroliza parabenov z encimom esteraza do PHBA in pripadajočega alkohola (prva faza metabolizma)

Glukuronidacijo katalizira skupina encimov UDP-glukuronoziltransferaze (UGT). UGT katalizirajo vezavo glukuronske kisline iz UDP-𝛼-D-glukuronske kisline na nukleofilno skupino PHBA oz. parabena. S tem nastanejo hidrofilne molekule 𝛽-glukuronidi, ki se izločajo z urinom in žolčem (43). Konjugacijo s sulfatom katalizirajo sulfotransferaze (SULT), in sicer katalizirajo prenos sulfatne skupine iz donorske molekule 3'-fosfoadenozin-5'-fosfosulfata (PAPS) na PHBA oz. paraben (44). N-acetiltransferaze (NAT) katalizirajo konjugacijo PHBA ali parabena (45) z glicinom. Metabolne poti so shematsko prikazane na Sliki 5.

Slika 5: Metabolne poti parabenov pri ljudeh (prirejeno po Abbas in sod., 2010) (43)

Lobemeier in sod. so v in vitro raziskavi na homogenatu različnih delov kože in transformiranih keratinocitih (HaCaT celična linija) ugotovili, da človeška koža vsebuje vsaj štiri različne karboksilesteraze, sposobne cepiti parabene. Vse so aktivne pri rahlo bazičnem pH medija. Dve izmed esteraz so dokazali v homogenatu podkožnega maščevja, in sicer esterazo I (hCE1), ki prednostno cepi MP, njena afiniteta za parabene pa z dolžino njihove alkilne verige upada, ter esterazo II (hCE2), ki prednostno cepi BP. Esterazo III (hCE2) so identificirali v transformiranih keratinocitih in preferenčno cepi BP, njena afiniteta za parabene pa s krajšanjem njihove alkilne verige upada. Našli so tudi esterazo IV, ki se načeloma nahaja v krvi, in je v raziskavi predstavljala kontaminacijo preiskovanih vzorcev, zato je niso nadalje okarakterizirali in opisali njene morebitne afinitete do parabenov.

Zaključili so, da je esteraza III dovolj aktivna, da v celoti cepi parabene, ki so se absorbirali iz dermalno nanešenih pripravkov. To bi lahko predstavljalo tudi pot detoksifikacije parabenov (40).

Da hCE1 preferenčno cepi MP in EP, hCE2 pa PP, BP in BeP, so ugotovili tudi Jewell in sod. z uporabo loperamida, specifičnega zaviralca hCE2, na celičnih frakcijah človeških kožnih mikrosomov in citosola. Ugotovili so tudi, da se med absorpcijo skozi kožo MP v koži metabolizira v večji meri kot ostali parabeni (46).

Bando in sod. so na kožnem modelu ugotovili, da metabolizem v koži vpliva na penetracijo lipofilnih snovi. To so potrdili tudi in vitro na podganji koži z uporabo ireverzibilnega holinesteraznega zaviralca diizopropilfluorofosfata (DFP). Brez aplikacije DFP na kožo se je približno 96 % BP, ki je penetriral v kožo, metaboliziralo v PHBA, hkrati so v akceptorski tekočini zaznali 30 % nespremenjenega PP. Po aplikaciji DFP, metabolizirane PHBA niso zaznali v akceptorski tekočini, penetracija nespremenjene oblike pa se je upočasnila. Z diferenčno dinamično kalorimetrijo so potrdili, da DFP ni vplival na permeabilnost kože, medtem ko je značilno zmanjšal skupno penetracijo BP, na penetracijo PP pa ni pomembno vplival (47). To potrjuje prej omenjeno trditev, da metabolizem v koži vpliva na penetracijo lipofilnih snovi, kar so ugotovili tudi v raziskavi Seko in sod. Opazili so povezavo med hitrostjo metabolizma in penetracijo, in sicer se s hitrostjo metabolizma zmanjša penetracija izhodne oblike in poveča penetracija metabolitov, skupna penetracija obeh oblik pa se z lipofilnostjo snovi veča (36).

Williams in sod. so opravili raziskavo na HaCaT celični liniji in človeški koži ter rezultate primerjali z rezultati že objavljenih raziskav, opravljenih na celičnih frakcijah. Opazovali so

obseg lokalnega metabolizma v koži med absorpcijo. Testne materiale so pripravili kot HaCaT celično kulturo ter človeško kožo v difuzijski celici, kjer so kot akceptorsko tekočino uporabili celično kulturo v tekočem gojišču, da so ohranili viabilnost kože. Hitrost metabolizma je namreč odvisna od kapacitete encimov za metabolizem in pretoka snovi skozi kožo. V splošnem velja, da se snovi z manjšim pretokom lažje metabolizirajo kot snovi z večjim pretokom. Opazili so, da se parabeni v celični kulturi v veliki meri metabolizirajo, medtem ko je metabolizem v difuzijski celici, kjer je pretok večji, manj obsežen. Slednja in vitro metoda se je izkazala kot dobra napoved obnašanja parabenov in vivo, zato so zaključili, da kljub sposobnosti lokalnega metabolizma parabenov v koži, to verjetno bistveno ne spremeni sistemske koncentracije in vivo, hkrati pa je jetrni metabolizem bolj obsežen kot metabolizem v koži (37).

Harville in sod. so v človeških in podganjih celičnih frakcijah primerjali hidrolizo štirih najpogosteje uporabljenih parabenov. Uporabili so podganje jetrne mikrosome (RLM, ang.

rat liver microsomes) in citosol (RLC, ang. rat liver cytosol), človeške jetrne mikrosome (HLM, ang. human liver microsomes) in citosol (HLC, ang. human liver cytosol), podganje kožne mikrosome (RSM, ang. rat skin microsomes) in citosol (RSC, ang. rat skin cytosol) ter človeške kožne mikrosome (HSM, ang. human skin microsomes) in citosol (HSC, ang.

human skin cytosol). Ugotovili so, da se parabeni v HLM približno 10-krat hitreje metabolizirajo kot v HLC. Hkrati je bil metabolizem v HLM od 300- do 500-krat hitrejši kot v HSM. Razlika med HLC in HSC ter HSM in HSC ni bila tako izrazita. Nadalje so ugotovili, da je bila hitrost metabolizma v človeških celičnih frakcijah obratno sorazmerna z dolžino alkilne verige parabenov. Pričakovano so ugotovili, da jetrne frakcije metabolizirajo parabene bolj učinkovito kot kožne frakcije. Hidroliza parabenov je bila hitrejša v podganjih celičnih frakcijah kot v človeških, kar kaže, da podganje celične frakcije niso najbolj primeren model za napoved metabolizma v človeški koži in vivo, ker lahko napačno ocenijo dejansko stanje (42). Dodatno so z uporabo selektivnih zaviralcev razločili med encimi, ki hidrolizirajo BP v dotičnih celičnih frakcijah. Uporabili so neostigmin, ki zavira acetilholinesteraze, bis-(p-nitrofenil)-fosfat (BNPP), ki zavira karboksilesteraze in fenilmetilsulfonilfluorid (PMSF), ki zavira številne hidrolaze, med drugim proteaze in esteraze. PMSF in BNPP sta zavirala hidrolizo parabenov v vseh frakcijah, majhen delež hidrolize je potekel le v HSC. Neostigmin ni bistveno zmanjšal metabolizma parabenov.

Zaključili so, da so karboksilesteraze odgovorne za večino hidrolize substrata (42).

Abbas in sod. so in vitro v človeškem serumu in jetrnih mikrosomih raziskovali hidrolizo in glukuronidacijo parabenov, ki sta eni izmed glavnih presnovnih poti parabenov pri ljudeh.

Ugotovili so, da se parabeni v veliki meri metabolizirajo v jetrnih mikrosomih z esterazami in UGT za katere so identificirali najbolj aktivne izooblike. Po drugi strani so bili parabeni v plazmi precej stabilni, predvsem MP in EP, ostali so se po 24 urah hidrolizirali v približno 50 %. Zaključili so, da je zaradi obširnega metabolizma majhna verjetnost kopičenja parabenov pri ljudeh, zatorej je majhna možnost njihovega toksičnega delovanja (43). Ta zaključek je izjemno pomemben in bi lahko ključno prispeval k reševanju dileme o toksičnem delovanju parabenov.

Genies in sod. so po nanosu PP na rekonstruiran epidermalni kožni model EpisSkin™ S9 in človeško kožo, identificirali nastale metabolite po kratki inkubaciji, tj. 2–4 ure na EpiSkin™

oz. 2 uri na človeški koži in dolgi inkubaciji, tj. 18 in 24 ur na človeški koži. Po kratki inkubaciji se je v koži metaboliziralo 72–99 % PP, po dolgi pa 100 %. Pretežno je nastala PHBA in nekaj PP-sulfata ter neznanega metabolita, za katerega so sumili, da je PP-glukuronid. V vseh časovnih točkah je bilo teh metabolitov največ, ostali metaboliti, ki so nastali po dolgi inkubaciji, so predstavljali le 2,8 % od apliciranega odmerka. To bi lahko kazalo na obsežen lokalni metabolizem, vendar je potrebno te rezultate interpretirati skupaj z drugimi parametri, kot sta dermalna absorpcija in pretok, podobno kot so to interpretirali Williams in sod. (37). Po kratki inkubaciji se je v EpisSkin™ metaboliziralo le 33 % PP, prav tako sta pretežno nastala PHBA in PP-sulfat (48).

Obringer in sod. so v raziskavi iz leta 2021 uporabili frakcije S9 za opazovanje metabolizma parabenov, saj tako mikrosomi kot citosol vsebujejo hCE, hidroliza pa je pri njihovem metabolizmu prevladujoča reakcija. Ugotovili so, da v jetrni frakciji S9, kjer prevladuje hCE1, hidroliza upada z dolžino alkilne verige parabenov. V kožni frakciji S9, kjer prevladuje hCE2, se je hidroliza večala z dolžino alkilne verige parabenov. To se sklada s podatki iz prejšnjih raziskav. Ugotovili so, da je metabolizem najbolj obsežen v jetrih, potem v koži in nazadnje v serumu. Nadalje so testirali razvejane parabene in ugotovili, da večja kot je sterična ovira na parabenu, manjši je metabolizem v jetrih. V koži to ni bilo tako izrazito. Pri PeP so ugotovili, da se precej bolje hidrolizira kot alkilni parabeni. Ti podatki kažejo na to, da ni pomembna le dolžina alkoholne verige, temveč tudi vrsta stranske skupine. Zaključili so, da je aromatski fenol boljša izstopajoča skupina kot alifatski alkoholi (38).

Lester in sod. so med drugim v raziskavi leta 2021 v jetrni frakciji S9 identificirali nastale metabolite parabenov. Ugotovili so, da pri vseh testiranih parabenih v > 90 % nastaneta PHBA in pripadajoči alkohol. Prav tako sta pri vseh nastala metabolita parabensulfat in hidroksisulfat. Parabenglukuronid je nastal pri EP, PP in BP, le BP je tvoril hidroksiglukuronid. Ugotovili so tudi, da sta hitrost metabolizma in nastanek ostalih metabolitov tkivno specifična ter odvisna od strukture parabena (49).

Številne raziskave na človeški koži, kožnih modelih, človeških in podganji celičnih frakcijah ter celičnih frakcijah miniaturnih prašičev so potrdile, da se parabeni v veliki meri metabolizirajo in imajo majhno možnost kopičenja v tkivih. Pomembnejši izsledki in vitro raziskav o metabolizmu, ki smo jih našli, so povzete v Preglednicah VIII in IX. Glavne ugotovitve v zvezi z metabolizmom parabenov in vitro so:

• metabolizem parabenov je odvisen od načina izpostavitve, hkrati se metabolizirajo hitro in v veliki meri (50);

• hidrolizo parabenov katalizirajo esteraze, predvsem karboksilesteraze in v manjši meri tudi acetilholinesteraze, konjugacijo pa UGT, SULT in NAT (42);

• v koži najdemo vsaj štiri različne hCE, sposobne cepiti parabene (40);

• hitrost hidrolize je odvisna od dolžine alkilne verige parabena in vrste stranske skupine (38), in sicer ima hCE1 večjo afiniteto do MP in EP, hCE2 pa do PP, BP in BeP. Prva prevladuje v jetrih, druga pa v koži in tankem črevesju (42, 43);

• glavni metaboliti parabenov so PHBA in pripadajoči alkohol ter konjugati PHBA, v manjši meri nastanejo konjugati parabena s sulfatom, glukuronidom in glicinom (49);

• krajši parabeni se raje konjugirajo s sulfatom, daljši in bolj razvejani pa z glukuronidom (51);

• parabeni se v večji meri metabolizirajo v jetrnih celičnih frakcijah kot v kožnih (42);

• na lokalni metabolizem v koži vpliva pretok skozi kožo, in sicer večji kot je pretok, manj obsežen je metabolizem (37);

• metabolizem v koži vpliva na penetracijo lipofilnih snovi, in sicer se z večanjem lipofilnosti poveča penetracija (47);

• zaradi obširnega metabolizma parabenov je majhna možnost, da bi delovali toksično (43).

Preglednica VIII: Izsledki in vitro raziskav o metabolizmu parabenov

Rezultati, ugotovitve v človeški koži vsaj 4 esteraze, ki cepijo parabene z različno afiniteto kožni metabolizem vpliva na penetracijo lipofilnih snovi - višja hitrost metabolizma poveča skupno penetracijo hidroliza parabenov je hitrejša v podganjih kot človeških frakcijah, pri človeških je hitrejša v jetrnih; BP hidrolizirajo predvsem karboksilesteraze večji pretok skozi kožo zmanjša obseg hidrolize

Vrsta parabena in uporabljena koncentracija MP, EP, PP, BP v konc. 0,5 mmol/L PP in BP v 20 % (m/v) PHBA, MP, EP, PP, BP; 100 µmol/L MP, BP v 50 µmol/L

Testni material homogenati človeškega epidermisa in dermisa, podkožja in HaCaT celic podganja koža tretirana z/brez DFP jetrne in kožne celične frakcije ljudi in podgan človeška koža

Namen raziskave kateri del kože prispeva k hidrolizi parabenov in kateri encimi so vključeni vpliv kožnega metabolizma na dermalno absorpcijo hitrost hidrolize parabenov in identifikacija encimov, ki hidrolizirajo BP kapaciteta lokalnega metabolizma v koži

Referenca (prvi avtor, letnica) Lobemeier, 1996 Bando, 1997 Harville, 2007 Williams, 2008

Preglednica IX: Izsledki in vitro raziskav o metabolizmu parabenov (nadaljevanje)

Rezultati, ugotovitve po 1x izpostavitvi se MP ne hidroliza popolno in je kot osnovna spojina lahko vir sistemske konc.; poškodovana koža poveča sistemsko konc. MP in PHBA; PP se metabolizira v veliki meri, pretežno nastane PHBA in PP-sulfat pri vseh v največji meri nastaneta PHBA in pripadajoči alkohol; hitrost metabolizma in ostali metaboliti so tkivno specifični in odvisni od strukture parabena v jetrni frakciji se hidroliza manjša z dolžino alkilne verige, v kožni pa veča; obseg metabolizma jetra < koža < plazma; PeP se hidrolizira bolje od alkilnih parabenov

Vrsta parabena in uporabljena koncentracija 0,1 % (m/m) MP v 9 različnih formulacijah (1 vodna raztopina, 4 hidrogeli, 4 O/V emulzije) PP v 10 µL/cm2 kože 16 strukturno različnih parabenov; 5 µmol/L 9 strukturno različnih parabenov v konc. 0,02– 7,5 mmol/L

Testni material prašičja koža (uhelj) EpiSkin™ S9, človeška koža jetrna S9 frakcija, EpiSkin™ S9 človeška jetrna frakcija S9, človeška kožna frakcija S9, človeška plazma

Namen raziskave potencial sistemske absorpcije MP skozi intaktno in poškodovano kožo primerjava metabolizma 10 sestavin iz kozmetičnih izdelkov vpliv strukture parabena na metabolizem v jetrih in koži vpliv dolžine in razvejanosti verige na metabolizem

Referenca (prvi avtor, letnica) Pažourekova, 2013(52) Genies, 2020 Lester, 2021 Obringer, 2021