Table 11: IC50 value of tested compounds against a) alpha-glucosidase, b) alpha-amylase and c) DPP4.
a) IC50: alfa-glukozidazaa Fenolne spojine Skupina
< 0,4 mM
> 0,8 mM o-kumarna kislina hidroksicimetna kislina
Naringenin flavonoid
> 4,0 mM Protokatehujska kislina hidroksibenzojska kislina
c) IC50: DPP4c Fenolne spojin Skupina
a IC50 akarboze za alfa-glukozidazo je < 0,05 mM.
b IC50 akarboze za alfa-amilazo je < 0,05 mM.
c IC50 sitagliptina za DPP4 je 0,2 µM.
Izmed 29 spojin v začetnem presejanju, smo jih v nadaljnjih analizah, na vseh encimih skupaj, obravnavali 20. Krivulje encimskih aktivnosti v odvisnosti od koncentracije teh spojin so prikazane na sliki 13. Nordihidrogvajaretinska kislina je inhibirala vse tri encime.
Flavonoidi (hesperetin, naringenin, naringin, kvercetin, kvercitrin in rutin) so učinkovito inhibirali alfa-glukozidazo in DPP4. Ta dva encima je oba inhibirala tudi klorogenska kislina, medtem ko so ostale hidroksicimetne kisline (kavna kislina, ferulna kislina in o-kumarna kislina), kakor tudi resveratrol in elagna kislina, učinkovito inhibirali le alfa-glukozidazo. Galna kislina je inhibirala alfa-glukozidazo in alfa-amilazo, ostale hidroksibenzojske kisline (p-hidroksibenzojska kislina, salicilna kislina, alfa- in beta-resorcilna kislina, gentizinska kislina in protokatehujska kislina) pa samo alfa-amilazo.
Nordihidrogvajaretinska kislina je bila edina spojina, ki je inhibirala vse tri encime. Gre za lignan, v veliki količini prisoten v rastlini Larrea tridentata (DC.) Coville, ki raste v puščavah Mehike in Severne Amerike in se je že dolgo uporabljala v ljudski medicini za lajšanje sladkorne bolezni tipa 2 (Arteaga in sod., 2005). Vendar pa je bilo objavljeno zgolj majhno število raziskav o njenem učinku in vivo ali mehanizmu delovanja. V doktorskem delu smo kot prvi opisali in vitro učinek nordihidrogvajaretinske kisline na encime alfa-glukozidazo, alfa-amilazo in DPP4 in tako osvetlili vsaj enega izmed mehanizmov delovanja, preko katerih Larrea tridentata učinkuje antidiabetično.
V skladu z rezultati iz literature (Adefegha in sod., 2014), je pri testiranih fenolnih spojinah v splošnem moč opaziti boljšo inhibicijo alfa-glukozidaze kot alfa-amilaze. Vendar pa je bilo to odvisno predvsem od skupine fenolnih spojin. Hidroksibenzojske kisline so bolje inhibirale alfa-amilazo, medtem ko so flavonoidi in hidroksicimetne kisline kazale boljšo inhibitorno sposobnost pri alfa-glukozidazi in DPP4. Presenetljivo je, da je alfa-glukozidazo inhibiral podoben nabor fenolnih spojin kot DPP4, medtem ko je alfa-amilazo inhibirala druga zbirka spojin. Tega nismo pričakovali, saj sta tako alfa-glukozidaza kot alfa-amilaza encima, ki hidrolizirata sladkorje, zato smo pričakovali, da bo med inhibitorji teh dveh encimov več podobnih spojin. Po drugi strani smo pričakovali ločen niz spojin, ki bi inhibirale DPP4, čigar endogeni substrati so peptidne narave. Ugotovili smo, da so kvercetin, kvercitrin in rutin med najbolj učinkovitimi inhibitorji tako alfa-glukozidaze kot DPP4.
Učinek teh spojin je bil sicer že izpostavljen v raziskavah in vivo, vendar so bili tam predlagani tudi drugi mehanizmi učinkovanja, kot so stimulacija sproščanja inzulina in inhibicija transporta glukoze iz črevesa (Jadhav in Puchchakayala, 2012; Malini in sod., 2011; Wang in sod., 2015). Pomembno je dejstvo, da fenolne skupine lahko delujejo sinergistično, ko v in vivo pogojih delujejo na več tarč hkrati, pa tudi preko skupnega učinkovanja z drugimi fenolnimi in ne-fenolnimi spojinami iz rastlinske hrane (El-Abhar in Schaalan, 2014; Wang in sod., 2010).
Rastlinske polifenolne spojine učinkujejo pri sladkorni bolezni tipa 2 tudi po drugih mehanizmih in ne izključno preko uravnavanja hiperglikemije. Za veliko število fenolnih spojin so dokazali učinek tudi pri mikro- in makrovaskularnih zapletih, ki spremljajo
diabetes (Bahadoran in sod., 2013; El-Abhar in Schaalan, 2014; Hanhineva in sod., 2010).
Za nekatere spojine, ki v naših testih niso izkazovale pomembnega inhibitornega učinka na izbranih encimih, so pokazali učinkovitost pri lajšanju diabetesa preko drugih mehanizmov.
Katehin na primer deluje antihiperglikemično in vivo (Maruyama in sod., 2009; Nagao in sod., 2009), epikatehin pa preprečuje razvoj diabetesa preko uravnavanja imunske funkcije in varovanja pankreasnih otočkov (Fu in sod., 2013). Eskulin ima ugoden učinek pri diabetesu in pri vnetnih procesih v ledvicah, ki so povezani z oksidativnim stresom (Kang in sod., 2014). In vivo študije so prav tako potrdile antihiperglikemičen učinek siringinske kisline in umbeliferona (Muthukumaran in sod., 2013; Ramesh in Pugalendi, 2006).
Slika 13 se nadaljuje.
Slika 13: Inhibitorna aktivnost posameznih spojin za alfa-glukozidazo, alfa-amilazo in DPP4.Rezidualna encimska aktivnost je prikazana v odvisnosti od koncentracije inhibitorjev. Polna črta prikazuje aktivnost alfa-glukozidaze, črtkana črta aktivnost alfa-amilaze, pikčasta pa aktivnost DPP4.
Figure 13: The inhibitory effect of individual natural compounds on alpha-glucosidase, alpha-amylase and DPP4. The remaining enzyme activity is presented in the presence of different inhibitor concentrations. Solid line is used to demonstrate the activity of alpha-glucosidase, dashed line is used for alpha-amylase and dotted line for DPP4.
4.2.2 Ocena aktivnosti izvlečkov lesa in lubja bele jelke
Testirali smo inhibitorno aktivnost izvlečkov lesa in lubja navadne bele jelke (Abies alba) na encimih alfa-glukozidaza, alfa-amilaza in DPP4. Te aktivnosti smo primerjali z inhibitorno sposobnostjo izvlečka lesa pravega kostanja ter standardiziranega izvlečka skorje obmorskega bora (Pycnogenol®). Preverili smo tudi, kakšno sposobnost inhibicije naštetih encimov ima 9 lignanov, identificiranih v vodnem izvlečku lesa bele jelke.
Slika 14 prikazuje krivulje encimske aktivnosti v odvisnosti od koncentracije testiranih izvlečkov. Iz podatkov so bile izračunane vrednosti IC50. Oba izvlečka bele jelke sta izkazovala velik in vitro inhibitorni potencial za vse tri encime. Alfa-glukozidazo je najbolj učinkovito inhibiral izvleček lesa bele jelke (IC50 0,14 m/V %), učinek izvlečka lubja pa je bil primerljiv z učinkom Pycnogenola (IC50 0,21 m/V %). Prav nasprotno je DPP4 najboljše inhibiral izvleček lubja bele jelke (IC50 0,34 m/V %) in je bil učinek izvlečka lesa primerljiv s Pycnogenolom (IC50 0,52 m/V %). Razlika med učinkom izvlečkov lesa in lubja bele jelke je bila najbolj očitna pri inhibiciji alfa-amilaze, kjer je imel ekstrakt lesa IC50 1,18 m/V %, ekstrakt lubja pa IC50 0,33 m/V %.
Pri pogojih testiranja je Pycnogenol znatno inhibiral aktivnost DPP4 (IC50 0,48 m/V %), vendar je bila ta inhibicija manjša kot učinek, ki ga je imel Pycnogenol na aktivnost alfa-amilaze (IC50 0,15 m/V %) ali alfa-glukozidaze (IC50 0,21 m/V %). Izvleček lesa pravega kostanja je inhibiral alfa-glukozidazo (IC50 0,45 m/V %), kakor tudi DPP4 (IC50 0,91 m/V
%), vendar je bil učinek nekoliko manjši kot pri ostalih ekstraktih. Inhibicijo alfa-amilaze z izvlečkom lesa pravega kostanja smo dosegli šele v zelo visokih koncentracijah (IC50 3,82 m/V %).
Vsebnost lignanov v hrani je v glavnem nizka in običajno ne presega 2 mg/100 g (Peterson in sod., 2010). Glede na to, da je celokupna vsebnost lignanov v vodnem izvlečku lesa bele jelke kar 10 %, smo analizirali tudi inhibitorno sposobnost do obravnavanih encimov pri devetih lignanih, katerih vsebnost je bila potrjena v tem izvlečku (Tavčar Benković in sod., 2016). V preglednici 12 so zbrani odstotki inhibicije posameznih lignanov v koncentraciji 1 mg/ml. Medtem ko je ta koncentracija lignanov le v nekaterih primerih zgolj rahlo inhibirala alfa-amilazo in alfa-glukozidazo, so vsi testirani lignani inhibirali DPP4. Najmočneje je aktivnost DPP4 zavrl pinoresinol diglukozid (49,6 %), sledila pa sta mu izolaricirezinol (49,2
%) in sekolaricirezinol (42,9 %). Pinoresinol je šibko inhibiral vse tri encime.
Dokazali smo, da sta izvlečka lesa in lubja bele jelke močna inhibitorja alfa-glukozidaze, alfa-amilaze in DPP4. Njuna inhibitorna sposobnost je večja kot pri izvlečku lesa pravega kostanja, še posebej v primeru alfa-amilaze. Učinki izvlečkov bele jelke so primerljivi z učinki Pycnogenola, ki je dobro raziskan in ga zaradi teh učinkov že široko uporabljajo kot aktivno surovino v prehranskih dopolnilih. Izmed vseh testiranih ekstraktov se je izvleček
lesa bele jelke izkazal kot najmočnejši zaviralec alfa-glukozidaze, izvleček lubja bele jelke pa kot najmočnejši inhibitor DPP4.
Slika 14: Delež encimske aktivnosti v odvisnosti od koncentracije štirih analiziranih izvlečkov.
Figure 14: Residual enzyme activity plotted against inhibitor concentrations for four tested extracts.
V eksperimentih je bil Pycnogenol uporabljan kot referenčna spojina, saj gre za široko uporabljano sestavino prehranskih dopolnil s klinično dokazano anti-diabetično aktivnostjo (Liu in sod., 2004) in dokazanim zaviralnim učinkom na alfa-glukozidzo in alfa-amilazo (Kim in sod., 2005; Schäfer in Högger, 2007). V doktorskem delu smo prvič dokazali tudi njegovo inhibitorno učinkovanje na DPP4.
Preglednica 12: Inhibicija alfa-glukozidaze, alfa-amilaze in DPP4 s strani devetih lignanov iz izvlečka lesa