ZNANSTVENE METODE V GENETIKI

Za proučevanje genetike so potrebne metode na molekularnem nivoju, kar od izvajalca zahteva podrobno znanje iz molekularne biologije. Tako je v genetiki in biokemiji potekel razvoj mnogih orodij za karakterizacijo in manipulacijo DNA, RNA in proteinov. Izolacija, opredelitev in kasneje pridobivanje rekombinantnih encimov, ki sodelujejo pri podvojevanju DNA, prepisovanju v RNA ter cepitvi DNA in povezovanju fragmentov DNA in vitro je omogočilo delo oz. raziskave na področju molekularne biologije. Ključni encimi so:

- polimeraze DNA, ki omogočajo sintezo komplementarne verige DNA na enoverižno matrično verigo z dodajanjem komplementarnih nukleotidov,

- nukleaze, ki režejo molekulo DNA na specifičnih mestih ali pa jo popolnoma razgradijo na posamezne nukleotide in

- ligaze, ki povezujejo fragmente DNA s tvorbo fosfodiestrske vezi med 5' koncem enega fragmenta/molekule DNA s 3' koncem druge DNA.

Za opazovanje molekul DNA je bila opisana detekcija na osnovi fluorescence ali radioaktivnosti.

Metode, ki vključujejo predhodno navedene encime in postopke so med drugimi:

Ločevanje molekul DNA z elektroforezo in vnašanje molekul (tudi rekombinantnih) DNA v celice; obe metodi sta vključeni v:

- kloniranje molekul DNA,

- hibridizacijo DNA (npr. za ugotavljanje lokalizacije genov/regij na kromosomih), - sekvenciranje DNA, s katerim ugotovimo zaporedje nukleotidov v molekuli DNA,

in

- verižno reakcijo s polimerazo (PCR), kjer iz posameznega gena ali izbrane regije DNA s pomočjo polimeraze DNA dobimo večje količine pomnožkov (Griffiths in sod., 2015).

2.1.1 Verižna reakcija s polimerazo – PCR

PCR je in vitro metoda, ki pomnožuje posamezne gene ali izbrane regije DNA s pomočjo encima polimeraza DNA. Regijo ali gen, ki jo želimo pomnožiti definira vezava dveh kratkih sintetičnih molekul DNA-začetnih oligonukleotidov na začetku in koncu regije oz. gena na eno verižni matrični DNA. Po vezavi začetnih oligonukleotidov nadaljuje sintezo komplementarne DNA encim polimeraza DNA (običajno Taq-polimeraza) (slika 1). Vse to se dogaja v aparaturi za PCR, ki je v osnovi mikroprocesorsko vodeni termostat. PCR-

aparatura se segreva in ohlaja glede na program, ki ga določimo. Pri tem je predvsem pomemben izbor števila ciklov, saj iz ene izhodiščne molekule DNA dobimo 2ⁿ pomnožkov DNA izbrane regije, pri čemer je n število ciklov (Tomažič in sod., 2017).

Slika 1: Poenostavljen prikaz delovanja PCR (Tomažič in sod., 2017)

Postopek metode PCR se prične z pripravo PCR-reakcijske mešanice v mikrocentrifugirki.

Mešanica vsebuje matrično DNA, začetne oligonukleotide, vse štiri deoksiribonukleotid trifosfate (za sintezo DNA) in temperaturno tolerančni encim polimerazo DNA (slika 2). V postopku pomnoževanja se matrična DNA najprej denaturira s segrevanjem do 95°C, kar povzroči razpad vodikovih vezi med vijačnicama in zato iz dvojne vijačnice DNA dobimo dve enojni vijačnici DNA. Prva ali začetna denaturacija je običajno daljša, kot denaturacija med cikličnim ponavljanjem postopka, prav tako pa lahko poteka pri višji temperaturi. S tem zagotovimo, da prekinemo vse vodikove vezi v DNA. Uspešnost te začetne denaturacije je ključna za potek reakcije PCR. Začetni denaturaciji običajno sledi prva denaturacija, ki je del cikličnega ponavljanja. Druga reakcija, ki se ciklično ponavlja je vezava/hibridizacija začetnih oligonukleotidov. Ta vezava običajno poteka pri temperaturah med 50 do 65°C.

Tretja reakcija, ki se ponavlja v ciklih pomnoževanja, je izgradnja komplementarne verige DNA. Začne se, ko se reakcijska mešanica segreje na 72-74°C, ključen za izvedbo pa je encim termostabilna polimeraza DNA. Običajno se uporablja Taq-polimeraza. Sinteza komplementarnih verig je podobna procesu podvojevanja DNA v celici. Po izbranem številu ciklov je del običajnih protokolov za izvedbo reakcije PCR še t.i. zaključno pomnoževanje oziroma dodajanje nukleotidov, pri katerem se med drugim dogradijo morebitne nedokončane molekule DNA. Reakcija PCR poteka v grobem v treh sklopih: 1. začetna denaturacija, ciklično ponavljanje denaturacije, 2. vezave začetnih oligonukleotidov in 3.

zaključno pomnoževanje. V učbenikih se zaradi poenostavitve največkrat kot reakcijo PCR

prikaže samo sklop 2. – ciklično ponavljanje. V 2,5 ure lahko s PCR DNA pomnožimo za milijardo krat (Griffiths in sod., 2015).

Slika 2: Shema poenostavljenega postopka PCR (prirejeno po: https://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-3-genetics/35-genetic-modification-and/pcr.html, pridobljeno, 19. 3. 2021)

2.1.2 Gelska elektroforeza

Je metoda za ločevanje negativno nabitih molekul DNA, ki potujejo zaradi električne napetosti skozi gelsko sito od negativne proti pozitivni elektrodi. Izolirano ali v reakciji PCR pomnožene molekule DNA vnesemo v posebej za to oblikovane jamice v agaroznem gelu.

Gel je v elektroforezni komori orientiran tako, da so jamice z vnesenimi vzorci DNA na katodni strani (negativno nabita). Hitrost potovanja molekul v gelu je obratno sorazmerna z velikostjo molekul, saj agaroza (polisaharid) deluje kot sito, skozi katero majhni fragmenti DNA potujejo lažje in hitreje kot večji. Ločene fragmente DNA lahko vizualiziramo tako, da v gel dodamo etidijev bromid. Molekule etidijevega bromida iz gela se vrinejo med organske baze v DNA. Ko po končani elektroforezi gel presvetlimo z UV svetlobo, etidijev bromid le-to absorbira pri 302 nm in jo oddaja kot fluorescenco pri 590 nm, kar zaznamo kot rdeče-vijolično obarvano liso (DNA). Zaradi učinka sita potujejo fragmenti DNA različnih velikosti različno hitro skozi gel, ti se po detekciji vidijo kot lise, ki so na različnih razdaljah od jamice. V kolikor so bile v vzorcu, ki smo ga vnesli v jamico molekule DNA

enake velikosti, bomo po detekciji videli samo eno liso (črto), če pa so bili v vzorcu fragmenti DNA različnih velikosti, pa po detekciji vidimo več lis. Absolutna velikost fragmentov iz mešanice se lahko določi s primerjavo prepotovane razdalje s standardom fragmentov znanih velikosti (slika 3) (Griffiths in sod., 2015).

Slika 3: Slika gela z ločenimi fragmenti DNA. Stolpca označena z M sta standarda z znanimi velikostmi fragmentov DNA (prevedeno po: Griffith in sod., 2015).

Za izvedbo elektroforeze potrebujemo naslednjo opremo (slika 4): horizontalna elektroforezna komora z nosilci za gel in glavnikom za pripravo jamic v gelu, električni napajalnik, set mikropipet, transiluminator z UV žarnicami (valovna dolžina 302 nm), digitalna kamera in primeren program za prenos in obdelavo posnetkov. Za pripravo gela ustrezno prečiščeno agarozo ter pufer. Enako razredčen pufer, kot ga uporabimo za pripravo gela uporabimo tudi za samo elektroforezo. V laboratorijih običajno uporabljajo pufra TBE ali TAE. Agarozo raztopimo s kuhanjem v ustrezno razredčenem pufru, jo ohladimo, dodamo ustrezno količino etidijevega bromida, počakamo, da se ohladi na približno 55°C ter jo vlijemo v pripravljen nosilec za gel. Glavničke lahko vpnemo v nosilec predno vlijemo agarozo, ali takoj po vlitju. Ko se agarozni gel strdi, previdno odstranimo glavniček, položimo gel vodoravno v elektroforezno komoro in dolijemo pufer za elektroforezo. Pufer mora prekrivati gel. V pripravljene jamice odpipetiramo vzorec, namestimo pokrov komore in ga povežemo z električnim napajalnikom. DNA običajno ločujemo pri napetosti 10V/cm gela.

Mattos in sod. (2004) navajajo, da se po končani elektroforezi gel obarva z etidijevim bromidom (EtBr, 0,5µg/ml). Slabost uporabe opisanega načina gelske elektroforeze v šolskih laboratorijih je potencialna nevarnost za zdravje. Etidijev bromid je namreč mutagen

(ker se vriva med bazne pare v DNA), prav tako je koži in očem škodljivo in mutageno sevanje UV (pri 302 nm). Pri rokovanju z etidijevim bromidom je obvezna uporaba nitrilnih zaščitnih rokavic za enkratno uporabo, upoštevati pa moramo tudi, da moramo odpadke kontaminirane z etidijevim bromidom odstraniti v skladu z okoljsko regulativo (Mattos in sod., 2004). Pri uporabi UV sevanja je obvezna uporaba očal ali maske, ki blokira UV žarke.

Alternativna barvila, ki naj ne bi predstavljala tveganja za zdravje, so bila razvita v namene širše in vsakodnevne uporabe (npr. GR Safe, SYBR Safe, Eva Green, Midori Green), saj fluorescirajo modro svetlobo in jih lahko odlivamo odtoke. Prav tako je pomembno, navaja Keller (2015), da tveganje za zdravje zmanjšamo z uporabo modro svetlobnega transiluminatorja z visoko intenzivno modro LED svetlobo ozkega spektra brez škodljivega UV sevanja. Z GR Safe ali SYBR Safe obarvana DNA se tako lahko varno opazuje skozi očala ali masko z rumenim filtrom (Keller, 2015).

Slika 4: Aparatura za gelsko elektroforezo (lasten vir).