DIPLOMSKO DELO

(1)

U

^{NIVERZA V}

L

^JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

DIPLOMSKO DELO

Neža Lanišek

Ljubljana, 2022

(2)

(3)

U

^{NIVERZA V}

L

^JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

UNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE KEMIJA

Optimizacija HPLC metode za določanje antioksidantov v polimerih

DIPLOMSKO DELO

Neža Lanišek

M

^ENTORICA

: prof. dr. Irena Kralj Cigić

Ljubljana, 2022

(4)

(5)

IZJAVA O AVTORSTVU

diplomskega dela

Spodaj podpisana Neža Lanišek sem avtorica diplomskega dela z naslovom: Optimizacija HPLC metode za določanje antioksidantov v polimerih.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof.

dr. Irene Kralj Cigić;

• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;

• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.

V Ljubljani, 10. 1. 2022 Podpis avtorice:

(6)

(7)

Rada bi se zahvalila svoji mentorici prof. dr. Ireni Kralj Cigić za vodstvo, vso pomoč in nasvete, ki sem jih bila dežena tekom izdelave diplomskega dela. Zahvala gre tudi prof.

dr. Matiji Strliču za popravke in komentarje.

Za pomoč pri eksperimentalnem delu ter odgovore na mnoga vprašanja in dileme se zahvaljujem Tjaši Rijavec. Za pomoč pri iskanju kemikalij in steklovine se zahvaljujem

zaposlenim na katedri za Analizno kemijo.

Hvala tudi mami, Moniki in Katji za pregled diplomskega dela in slovnične popravke.

Hvala sošolcem za vso pomoč tekom študija. Hvala za vse skupaj preživete dni. Želim si, da bi jih lahko več prebili v predavalnici in laboratoriju.

Hvala Danijelu, družini in prijateljem. Za vašo podporo, ljubezen in spodbudne besede na prehojeni poti.

(8)

(9)

Optimizacija HPLC metode za določanje antioksidantov v polimerih

Povzetek: Antioksidanti so spojine, ki se tekom proizvodnje dodajajo polimerom za zaščito le-teh pred oksidacijo in posledično razgradnjo. V diplomskem delu sem optimizirala HPLC metodo za določanje dveh antioksidantov, ki sta lahko prisotna v polivinilkloridu (PVC); oktadecil 3-(3,5-diterc-butil-4-hidroksifenil)propionat (AO 1) in 3,9-bis(oktadeciloksi)-2,4,8,10-tetraoksa-3,9-difosfaspiro[5.5]undekan (AO 2). Najprej sem poiskala ustrezno topilo, v katerem sta se raztopila oba antioksidanta. Ugotovila sem, da je to aceton. Nato sem poiskala najbolj optimalne HPLC pogoje za separacijo obravnavanih antioksidantov. Uporabila sem reverznofazno kolono C18, za gradientno elucijo sem uporabljala dve mobilni fazi – acetonitril in MQ vodo, volumen injiciranja je znašal 30 μL, pretok pa sem ohranjala konstanten pri 1 mL/min. Na detektorju je bila nastavljena valovna dolžina 192 nm. Z injiciranjem mešanih standardnih raztopin različnih koncentracij določevanih antioksidantov sem izrisala umeritveni premici.

Ugotovila sem, da je za AO 1 metoda linearna pri nižjih koncentracijah tega antioksidanta, poleg tega pa sta tudi meja zaznave in posledično meja določitve bistveno nižji kot za AO 2. Preverila sem še, če lahko s to metodo učinkovito določimo obravnavana antioksidanta v primeru, da vzorec PVC-ja vsebuje mehčala. To sem napravila z injiciranjem mešane standardne raztopine, ki je vsebovala oba antioksidanta in bis(2-etilheksil) ftalat (DEHP), ki je v PVC-ju lahko prisoten kot mehčalo. Ugotovila sem, da DEHP ne moti določitve obravnavanih antioksidantov. Nazadnje sem na dveh realnih vzorcih PVC-ja preizkusila metodo in ugotovila, da lahko s to metodo kvalitativno in kvantitativno določim le AO 1, saj za AO 2 ni bilo ustreznega kromatografskega vrha.

Ključne besede: antioksidanti, polimeri, HPLC, optimizacija

(10)

Optimization of HPLC method for determination of antioxidants in polymers Abstract: Antioxidants are compounds that are added to polymers during production to protect them from oxidation and consequent degradation. In this diploma thesis, I optimized the HPLC method for the determination of two antioxidants that may be present in polyvinyl chloride (PVC); octadecyl 3-(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)propionate (AO 1) and 3,9-bis(octadecyloxy)-2,4,8,10-tetraoxa-3,9-diphosphaspiro[5.5]undecane (AO 2). First, a suitable solvent for both antioxidants was discovered. It proved to be acetone. Then the most optimal HPLC conditions for the separation of antioxidants were sought using a C18 reverse phase column and two mobile phases for gradient elution – acetonitrile and MQ water. The injection volume was 30 μL and the flow was kept constant at 1 mL/min. A wavelength of 192 nm was set on the detector. Mixed standard solutions of different concentrations of antioxidants were injected and the calibration lines were drawn. For AO 1 the method was linear at lower concentrations of this antioxidant, in addition, the limit of detection and consequently the limit of determination were significantly lower than for AO 2. Effectiveness of determination of the antioxidants in the case that the PVC contains plasticizers was discovered. This was achieved with an injection of a mixed standard solution containing both antioxidants and bis(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), which may be included in PVC as a plasticizer. DEHP did not interfere with the determination of the antioxidants. Finally, the method on two PVC samples was tested. Only AO 1 could be qualitatively and quantitatively determined by this method, as there was no corresponding chromatographic peak for AO 2.

Keywords: antioxidants, polymers, HPLC, optimization

(11)

Kazalo

1 Uvod ... 1

1.1 Antioksidanti v polivinilkloridu ... 1

1.1.1 Oktadecil 3-(3,5-diterc-butil-4-hidroksifenil)propionat... 3

1.1.2 3,9-bis(oktadeciloksi)-2,4,8,10-tetraoksa-3,9-difosfaspiro[5.5]undekan ... 3

1.2 Metode za določanje antioksidantov v polivinilkloridu... 4

1.2.1 Tekočinska kromatografija ... 4

1.2.2 Druge metode ... 6

2 Namen dela... 9

3 Eksperimentalni del ... 11

3.1 Seznam uporabljenih kemikalij ... 11

3.2 Seznam uporabljenih aparatur ... 11

3.3 Priprava osnovnih standardnih raztopin ... 11

3.4 Priprava mešanih standardnih raztopin za umeritveni premici ... 12

3.5 Analiza vzorcev... 12

3.5.1 Podatki o vzorcih ... 12

3.5.2 Priprava vzorcev ... 12

4 Rezultati in razprava ... 13

4.1 Optimizacija separacije ... 13

4.1.1 Izbira kolone ... 13

4.1.2 Določitev optimalnih kromatografskih pogojev... 14

4.2 Umeritveni premici... 16

4.2.1 Meja določitve ... 18

4.2.2 Meja zaznave... 19

4.3 Določanje antioksidantov v polivinilkloridu, ki vsebuje mehčala ... 21

4.4 Analiza vzorcev... 22

4.4.1 Kromatografski pogoji ... 22

4.4.2 Izračun koncentracije in masnega deleža analitov v vzorcih... 24

(12)

4.4.3 Diskusija ... 24

5 Zaključek ... 27

6 Literatura ... 29

7 Priloge ... 31

(13)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

ACN acetonitril

AO antioksidant

DAD detektor na diodni niz (angl. diode array detector) DEHP bis(2-etilheksil) ftalat (angl. bis(2-ethylhexyl) phthalate) GC plinska kromatografija (angl. gas chromatography)

HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (angl. high performance liquid chromatography)

IR infrardeča (angl. infrared)

MF mobilna faza

MQ dodatno očiščena deionizirana voda

MS masna spektrometrija (angl. mass spectrometry) PDA fotodiodni niz (angl. photodiode array)

PVC polivinilklorid (angl. polyvinyl chloride) THF tetrahidrofuran (angl. tetrahydrofuran)

TLC tankoplastna kromatografija (angl. thin-layer chromatography) UV ultravijolična (angl. ultraviolet)

UV-VIS ultravijolična-vidna (angl. ultraviolet-visible) XRF rentgenska fluorescenca (angl. X-ray fluorescence)

(14)

(15)

N. Lanišek: Optimizacija HPLC metode za določanje antioksidantov v polimerih

1

1 Uvod

Polimeri so gradniki materialov, ki jih najdemo na vsakem koraku. Produkti, ki temeljijo na polimerih, so postali del našega vsakdana – oblačila, narejena iz sintetičnih vlaken, plastične vrečke, teflonski kuharski pripomočki ipd. [1] Za potrošnike je pomembno, da so na trgu produkti z ustrezno kvaliteto. V ta namen se med proizvodnjo polimerov le- tem dodaja številne dodatke, s katerimi se izboljšajo njihove lastnosti. Ti dodatki so antioksidanti, svetlobni in termični stabilizatorji, ultravijolični absorberji, zaviralci gorenja, mehčala, vezivna sredstva, barvila, pigmenti in belila. Dodatki izboljšajo izgled, učinkovitost in vzdržljivost polimerov [2].

V diplomskem delu sem se osredotočila na dva antioksidanta, ki se uporabljata v proizvodnji polivinilklorida, enega najbolj razširjenih sintetičnih polimerov.

1.1 Antioksidanti v polivinilkloridu

Polivinilklorid (PVC) je eden najbolj uporabljanih sintetičnih polimerov v svetovnem merilu. Proizvaja se s polimerizacijo vinilkloridnega monomera (slika 1) [3].

Slika 1: Polimerizacija vinilkloridnega monomera. Povzeto po [3].

Neobdelani organski polimeri, med njimi tudi PVC, so podvrženi termooksidativni razgradnji. Povzročijo jo toplota, svetloba, nečistoče, prisotnost kisika ali mehanski stres.

Iz polimera (RH) pri avtooksidaciji nastane prosti alkilni radikal (R^·), ki pri reakciji z molekularnim kisikom tvori peroksidni radikal (ROO^·). Le-ta nadalje reagira z drugim polimerom in tvori hidroperoksid (ROOH) ter nov prosti alkilni radikal, kar nadaljuje cikel razgradnje. Shema razgradnje je prikazana na sliki 2 [2, 4, 5].

(16)

2

Slika 2: Razgradnja PVC-ja. Povzeto po [4].

Hidroperoksidi in njegovi razgradni produkti (alkoksi in hidroksilni radikali) povzročijo spremembe v strukturi in molekulski masi polimera, kar se odraža v poslabšanju mehanskih lastnosti in videzu le-tega [2, 5].

V izogib razgradnji in posledičnemu poslabšanju lastnosti se tekom proizvodnje polimerom dodajajo različni dodatki, med njimi antioksidanti. Antioksidanti so spojine, ki iz polimera odstranijo proste radikale, jih s tem stabilizirajo in inhibirajo proces oksidacije. V osnovi ločimo dve vrsti antioksidantov – primarne antioksidante in sekundarne antioksidante [2, 4, 5, 6].

Primarni antioksidanti imajo reaktivno hidroksilno skupino (sterično ovirani fenoli) ali aminsko skupino (sekundarni aromatski amini). Proces oksidacije inhibirajo s prenosom protona na prosti radikal – v primeru sterično oviranega fenola prenesejo proton na peroksidni radikal (slika 3) [2].

Slika 3: Deaktivacija peroksidnega radikala s primarnim antioksidantom. Povzeto po [4].

Pogosto so v kombinaciji s primarnimi antioksidanti uporabljeni sekundarni antioksidanti. Običajno so to fosfiti, ki razgradijo reaktivne hidroperokside do nereaktivnih produktov (slika 4) [2, 4].

Slika 4: Razgradnja hidroperoksida s sekundarnim antioksidantom.

Povzeto po [4].

(17)

3

V svojem diplomskem delu sem se osredotočila na dva antioksidanta – oktadecil 3-(3,5- diterc-butil-4-hidroksifenil)propionat, ki ga bom v diplomskem delu imenovala s kratico AO 1 in 3,9-bis(oktadeciloksi)-2,4,8,10-tetraoksa-3,9-difosfaspiro[5.5]undekan, ki ga bom v diplomskem delu imenovala s kratico AO 2.

1.1.1 Oktadecil 3-(3,5-diterc-butil-4-hidroksifenil)propionat

Oktadecil 3-(3,5-diterc-butil-4-hidroksifenil)propionat je sterično oviran fenolni antioksidant (slika 5). V polimerih ima vlogo primarnega antioksidanta, kar pomeni, da s prenosom protona z reaktivne hidroksilne skupine na peroksidni radikal prepreči razgradnjo polimera [7].

Slika 5: Oktadecil 3-(3,5-diterc-butil-4-hidroksifenil)propionat.

Je brez vonja, nizko hlapen in stabilen na svetlobi. Pri sobni temperaturi se nahaja v obliki belega praška. Njegova molekulska masa znaša 531 g/mol. Topen je v nepolarnih organskih toplih, v vodi je slabo topen. Kompatibilen je z večino substratov, skupaj z ostalimi dodatki pa se uporablja predvsem v številnih polimerih za zaščito pred termooksidativno razgradnjo. Njegova vsebnost v polimerih znaša od 0,1 do 0,4 % [7].

1.1.2 3,9-bis(oktadeciloksi)-2,4,8,10-tetraoksa-3,9-difosfaspiro[5.5]undekan

3,9-bis(oktadeciloksi)-2,4,8,10-tetraoksa-3,9-difosfaspiro[5.5]undekan je fosfit (slika 6), ki ima v polimerih vlogo sekundarnega antioksidanta [8].

(18)

4

Slika 6: 3,9-bis(oktadeciloksi)-2,4,8,10-tetraoksa-3,9- difosfaspiro[5.5]undekan.

Pri sobni temperaturi se nahaja v obliki belih lističev. Njegova molekulska masa znaša 732 g/mol. Topen je v nepolarnih organskih toplih, v vodi je slabo topen . Skupaj z ostalimi dodatki se uporablja v polimerih za zaščito pred razgradnjo. Pripomore tudi k stabilnosti barve in molekulske mase polimerov [9]. Njegova vsebnost v polimerih znaša od 0,1 do 0,25 % [10].

1.2 Metode za določanje antioksidantov v polivinilkloridu

Analitske metode za določanje antioksidantov v polimerih se delijo na direktne in posredne metode. Za uporabo posrednih metod je potrebna predhodna priprava vzorca – na ta način antioksidant izoliramo iz vzorca za nadaljnjo detekcijo. Uporaba direktnih metod ne zahteva predhodne priprave vzorca oz. je le-ta minimalna. Ena od najbolj uporabnih analitskih metod za določanje antioksidantov v polimerih je tekočinska kromatografija, ki spada med posredne metode [11, 12].

1.2.1 Tekočinska kromatografija

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) je vrsta kromatografije in najširše uporabljena analitska tehnika za ločbo in kvantitativno določitev komponent v mešanici.

Komponente v mešanici ločimo glede na njihovo različno porazdeljevanje med stacionarno in mobilno fazo [13, 14].

Stacionarna faza je nanešena na trden nosilec znotraj kromatografske kolone in je v obliki majhnih poroznih delcev premera 1–5 μm. Osnova stacionarne faze je polarni silikagel (normalna faza), ki ga lahko kemično modificiramo v bolj nepolarnega (reverzna faza).

Mobilna faza je pri HPLC tekočina, ki se pomika skozi kromatografsko kolono s pomočjo črpalke [13, 14].

Aparaturo imenujemo tekočinski kromatograf. Glavni deli aparature za HPLC so rezervoar za mobilno fazo, črpalka, injektor, kromatografska kolona, detektor in instrument za zapis signala (slika 7) [13].

(19)

5

Slika 7: Shema aparature za HPLC. Povzeto po [14].

Ustrezno pripravljeno mešanico z injektorjem injiciramo na začetku kromatografske kolone. Skupaj z mobilno fazo, ki pride iz rezervoarja, mešanico s črpalko potiskamo skozi kromatografsko kolono. Komponente mešanice potujejo skozi kromatografsko kolono različno dolgo in se iz nje ločeno eluirajo. Tam jih zaznamo z ustreznim detektorjem. Električni signali, ki jih posreduje detektor, se zapišejo kot grafični prikaz v instrument za zapis signala (običajno računalnik). Signali se kažejo kot kromatografski vrhovi, celotno krivuljo pa imenujemo kromatogram [13, 14].

Razlog, da se komponente mešanice eluirajo ob različnih časih, je njihovo različno porazdeljevanje med stacionarno in mobilno fazo. Lastnosti, ki vplivajo na to, kako se komponente v mešanici porazdeljujejo med stacionarno in mobilno fazo, so polarnost, molekulska masa in prisotnost funkcionalnih skupin. Stacionarna faza zadrži komponente mešanice različno močno (glede na njihovo strukturo), po določenem času pa jih sprosti nazaj v mobilno fazo. Komponente mešanice se torej eluirajo ob različnih časih (retencijskih časih), ki so na kromatogramu prikazani kot vrhovi. Različni vrhovi na kromatogramu pa tako pripadajo različnim komponentam mešanice. Ožji kot je vrh, boljša je ločba [13, 14].

Izbira detektorja je odvisna od tega, s kakšnimi spojinami imamo opravka, torej glede na njihove fizikalno-kemijske lastnosti (UV-absorpcija, lomni količnik, fluorescenca ipd.).

Najpogostejši detektorji pri HPLC so spektrofotometrični, refraktometrični, fluorescenčni in elektrokemični [13, 14].

Čas, ki ga posamezna komponenta potrebuje za potovanje skozi kromatografsko kolono, imenujemo retencijski čas. Predstavlja nam kvalitativni podatek, saj s primerjavo retencijskih časov analitov na kromatogramu vzorca z retencijskimi časi analitov na kromatogramu standardne raztopine lahko identificiramo posamezne komponente v mešanici. Kvantitativni podatek predstavlja ploščina ali višina kromatografskega vrha, ki je sorazmerna količini komponente v mešanici [13].

rezervoar za MF

črpalka kromatografska kolona

vzorec

injektor detektor

odpad

(20)

6

V literaturi do sedaj ni omenjene HPLC metode, ki bi omogočala določanje AO 1 in AO 2 v polimerih hkrati. Vendar pa so že razvite različne HPLC metode za določanje AO 1 in AO 2 posebej. Kromatografski pogoji v teh metodah so odvisni od dodatkov v polimerih, ki so jih z določeno metodo določali. Kot topilo za AO 1 je bil uporabljen metanol, za AO 2 pa THF. Kot mobilna faza za določanje AO 1 je bil uporabljen ACN v kombinaciji z metanojsko kislino oz. ACN v kombinaciji s THF in etanojsko kislino za določanje AO 2. Uporabljena je bila reverznofazna kolona C18, volumen injiciranja pa je bil 10–20 μL za določanje AO 1 oz. 10 μL za določanje AO 2. Pretok je bil 0,3–0,5 mL/min za določanje AO 1 oz. 1,3 mL/min za določanje AO 2. Detekcija je bila izvedena s PDA detektorjem pri valovni dolžini 276 nm za AO 1 oz. 280 nm za AO 2 [6, 15, 16].

Na sliki 8 je prikazan UV-VIS absorpcijski spekter za AO 1, UV-VIS absorpcijskega spektra za AO 2 pa v literaturi nisem našla.

Slika 8: UV-VIS absorpcijski spekter za AO 1. Povzeto po [17].

1.2.2 Druge metode

Za primerjavo navajam še druge analitske metode, ki se uporabljajo za določanje antioksidantov v polimerih.

Poleg tekočinske kromatografije sta v uporabi še plinska kromatografija in tankoplastna kromatografija, ki spadata med posredne metode [11].

Plinska kromatografija (GC) je metoda, primerna za ločbo, identifikacijo in kvantifikacijo antioksidantov v polimerih. Metoda je primerna za hlapne in termično stabilne spojine,

(21)

7

saj se izvaja pri temperaturah do 350 °C. Če antioksidant, ki se ga določa v polimeru, ni hlapen, ga je torej potrebno predhodno ustrezno pripraviti – derivatizirati. Tiste antioksidante, ki so bolj termično stabilni in bolj hlapni, se lahko z GC identificira pri nižjih koncentracijah. Eden od načinov za učinkovito izvedbo GC za namen določanja antioksidantov v polimerih je uporaba plinskega kromatografa s plamensko-ionizacijskim detektorjem in izotermnim načinom pri 250 °C ali 300 °C [13, 18, 19].

Tankoplastna kromatografija (TLC) je ena izmed starejših metod za kvalitativno določanje antioksidantov v polimerih. Kot stacionarno fazo se uporabi silikagel, v tanki plasti nanešen na stekleno ploščo. Na začetek plošče se v enakomernih presledkih na ravni liniji nanese standarde in vzorec, nato pa se ploščo postavi v komoro z mobilno fazo.

Sestava mobilne faze je odvisna od tega, katere antioksidante se določa. Po razvijanju kromatograma se ploščo posuši in pogleda pod UV svetilko oz. se jo poškropi z ustreznim reagentom, da se identificira in označi pozicije lis. Če se lisa, ki se pojavi na določeni poziciji nekega standarda, pojavi pri enaki poziciji tudi pri vzorcu, pomeni, da je ta spojina v vzorcu prisotna. Tako se lahko določi, če je nek antioksidant prisoten v vzorcu polimera [13, 19, 20, 21].

Antioksidante v polimerih se lahko določa tudi s spektroskopskimi metodami (IR spektroskopija, XRF spektroskopija) in z masno spektrometrijo, ki spadajo med direktne metode [11, 12]. Masna spektrometrija (MS) je pogosto uporabljena v kombinaciji s kromatografskimi metodami (GC ali HPLC) [6].

V diplomskem delu sem za določitev antioksidantov v polimerih uporabila metodo HPLC. Ta metoda je na tem področju najširše uporabljena, saj omogoča kvalitativno in kvantitativno analizo AO 1 in AO 2. GC bi nekoliko težje uporabila zaradi nizke hlapnosti AO 1, XRF spektroskopijo pa bi lahko uporabila le za določanje sekundarnega antioksidanta AO 2. TLC in IR spektroskopija omogočata le dobro kvalitativno analizo.

Lahko pa bi uporabila MS v kombinaciji s HPLC [12].

(22)

(23)

9

2 Namen dela

Namen diplomskega dela je bil optimizirati HPLC metodo za določanje dveh antioksidantov v PVC-ju. Ta dva antioksidanta sta oktadecil 3-(3,5-diterc-butil-4- hidroksifenil)propionat, ki ga bom v diplomskem delu imenovala s kratico AO 1 in 3,9- bis(oktadeciloksi)-2,4,8,10-tetraoksa-3,9-difosfaspiro[5.5]undekan, ki ga bom v diplomskem delu imenovala s kratico AO 2.

V ta namen sem najprej poiskala ustrezno topilo, v katerem se raztopita oba antioksidanta.

Nato sem poiskala najbolj optimalne HPLC pogoje za separacijo obravnavanih antioksidantov; kolono, sestavo mobilne faze, pretok, volumen injiciranja in valovno dolžino na detektorju. Zanimalo me je, kje je metoda linearna, zato sem izrisala umeritveni premici za oba antioksidanta. Nadalje sem določila še mejo določitve in mejo zaznave za oba antioksidanta.

Želela sem ugotoviti, če prisotnost mehčal moti določitev obravnavanih antioksidantov v PVC-ju. To sem ugotavljala za DEHP, ftalat, ki je pogosto kot mehčalo prisoten v polimerih, med njimi tudi v PVC-ju.

Moj zadnji cilj je bil preizkus metode na dveh realnih vzorcih PVC-ja. Preizkusila sem, če lahko s to metodo kvalitativno in kvantitativno določim obravnavana antioksidanta v obeh vzorcih.

(24)

(25)

11

3 Eksperimentalni del

3.1 Seznam uporabljenih kemikalij

• Oktadecil 3-(3,5-diterc-butil-4-hidroksifenil)propionat: Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (TCI), Japonska; čistost: > 98,0 %;

• 3,9-bis(oktadeciloksi)-2,4,8,10-tetraoksa-3,9-difosfaspiro[5.5]undekan: Sigma Aldrich, ZDA; čistost: ni podana;

• aceton: Honeywell, ZDA; čistost: ≥ 99,8 %;

• acetonitril (HPLC): Fisher Scientific, ZDA; čistost: ≥ 99,9 %;

• metanol: J. T. Baker, Poljska; čistost: ni podana;

• tetrahidrofuran: Honeywell, ZDA; čistost: ≥ 99,9 %.

3.2 Seznam uporabljenih aparatur

• HPLC instrument 1 (Agilent Technologies 1100 Series) s kvarterno črpalko, razplinjevalcem, avtomatskim vzorčevalnikom in DAD detektorjem;

• HPLC kolone:

o kolona 1: Gemini 3u C18 110A (150 x 4,60 mm, 3 μm);

o kolona 2: Eclipse XDB-C8 (4,6 x 150 mm, 3,5 μm);

o kolona 3: Poroshell 300SB-C18 (2,1 x 75mm, 5 μm);

• ultramikrotehtnica (XPR2U, Mettler Toledo);

• ultrazvočna kopel (Sonis 4, Iskra);

• stresalnik (Thys 2, MLW);

• grelna plošča (TMA 2071, Assistent);

• vorteks mešalec (TTS2, IKA).

3.3 Priprava osnovnih standardnih raztopin

Osnovni standardni raztopini sem pripravila za vsak antioksidant posebej. Pripravila sem raztopini AO 1 in AO 2 v acetonu s koncentracijo 200 mg/L. Obe raztopini sem pripravila tako, da sem antioksidant prepihala pod tokom dušika, ga zatehtala v 25-mL bučko, raztopila v acetonu in bučko postavila na ultrazvočno kopel za 10 minut. Raztopini sem hranila v hladilniku. Iz teh raztopin sem v nadaljevanju pripravila mešane standardne raztopine.

(26)

12

3.4 Priprava mešanih standardnih raztopin za umeritveni premici

Iz osnovnih standardnih raztopin sem pripravila mešano standardno raztopino, ki je vsebovala oba antioksidanta skupaj v koncentraciji 100 mg/L. Z redčenjem le-te sem v HPLC vialah pripravila še raztopine koncentracij 20, 40, 60, 80 in 100 mg/L. Posnela sem kromatograme na HPLC in skonstruirala umeritveni premici za vsak antioksidant posebej. Nadalje sem pripravila mešane standardne raztopine nižjih koncentracij. Najprej sem iz mešane standardne raztopine s koncentracijo 100 mg/L pripravila mešano standardno raztopino koncentracije 10 mg/L. Z redčenjem le-te sem v HPLC vialah pripravila še raztopine koncentracij 1, 2, 3, 4, 5 in 10 mg/L. Posnela sem kromatograme na HPLC in dopolnila umeritveni premici. Pripravila sem mešane standardne raztopine še nižjih koncentracij. Iz mešane standardne raztopine s koncentracijo 10 mg/L sem najprej pripravila mešano standardno raztopino koncentracije 1 mg/L. Z redčenjem le-te sem v HPLC vialah pripravila še raztopine koncentracij 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 in 1 mg/L.

Posnela sem kromatograme na HPLC in dopolnila umeritveni premici. Vse navedene raztopine sem pripravljala z redčenjem z ACN.

3.5 Analiza vzorcev

3.5.1 Podatki o vzorcih

Analizirala sem dva vzorca. Vzorec 1 je bil prozorna mapa (PVC 1, leto 2019). Vzorec 2 je bil vzorec materiala, iz katerega je narejen balon, ki so ga Angleži skonstruirali leta 2018 v znak protesta proti obisku nekdanjega predsednika ZDA, Donalda Trumpa, in se sedaj nahaja v londonskem muzeju Museum of London.

3.5.2 Priprava vzorcev

V 7-mL vialo sem natehtala 30 mg vzorca. Dodala sem 2 mL acetona in pustila na stresalniku 90 minut. PVC je nabreknil in pomotnil. V čisto 7-mL vialo sem s pipeto v celoti prenesla ekstrakt. V vialo z vzorcem sem ponovno dodala 1 mL acetona in stresala 15 minut. Nato sem ekstrakt prenesla v isto 7-mL vialo. Še enkrat sem dodala 1 mL acetona in ponovila postopek. Skupen ekstrakt sem pod tokom dušika posušila do suhega.

Pomagala sem si s toplo kopeljo. Dodala sem 0,2 mL ACN, premešala z vorteksom in prenesla v insert za HPLC vialo. Vzorec 2 sem pred prenosom v insert za HPLC vialo prefiltrirala skozi najlonski filter s porami premera 0,45 μm. Vzorca sem injicirala na HPLC in posnela kromatograma.

(27)

13

4 Rezultati in razprava

V okviru svojega diplomskega dela sem pripravila standardne raztopine obeh antioksidantov, jih injicirala v HPLC instrument in optimizirala separacijo – izbrala pravo kolono, poiskala ustrezno sestavo mobilne faze in ostale kromatografske pogoje . Tako sem našla najbolj optimalno HPLC metodo za določanje obeh antioksidantov hkrati.

Najprej pa sem morala najti ustrezno topilo, v katerem sta se raztopila oba antioksidanta in je bilo hkrati tudi kompatibilno z izbrano mobilno fazo (ACN/MQ). Najprej sem poizkusila z ACN in ugotovila, da v tem topilu antioksidanta nista topna. Poizkusila sem še z metanolom in ugotovila, da je v le-tem topen le AO 1. AO 2 se je raztopil v mešanici THF/ACN (50:50, V/V). Nadalje pa sem poskusila še z acetonom, v katerem sta se raztopila oba antioksidanta. Aceton sem tako izbrala kot optimalno topilo za oba antioksidanta. Za popolno raztapljanje antioksidantov v acetonu (da sta raztopini antioksidantov postali bistri) je bilo potrebno raztopini stresati na ultrazvočni kopeli (10 minut).

4.1 Optimizacija separacije

4.1.1 Izbira kolone

Uporabila sem tri različne kolone:

• kolona 1: Gemini 3u C18 110A (150 x 4,60 mm, 3 μm);

• kolona 2: Eclipse XDB-C8 (4,6 x 150 mm, 3,5 μm);

• kolona 3: Poroshell 300SB-C18 (2,1 x 75mm, 5 μm).

S kolono 1 se je eluiral le AO 1, AO 2 se ni eluiral oz. na kromatogramu vrh ni bil viden.

Enako se je izkazalo pri uporabi kolone 2. Kolona 3 se je izkazala kot najbolj optimalna za separacijo obravnavanih antioksidantov. S to kolono sta se eluirala oba antioksidanta, kromatografska vrhova pa sta bila dovolj ločena in sta imela zadostno p loščino za nadaljnjo obravnavo. Kolona 3 je v primerjavi s kolono 1 in kolono 2 krajša, velikost delcev stacionarne faze v koloni pa je večja. Kolona 1 in kolona 3 imata stacionarno fazo z vezanimi C18 alkilnimi skupinami, kolona 2 pa stacionarno fazo z vezanimi C8 alkilnimi skupinami. Najbolj primerna kolona za separacijo AO 1 in AO 2 je očitno krajša kolona, ki omogoča nižje retencijskečase, in stacionarna faza z vezanimi C18 alkilnimi skupinami, saj je bolj nepolarna.

(28)

14

Vsi kromatogrami, prikazani v diplomskem delu, so nastali z injiciranjem raztopin na kolono 3.

4.1.2 Določitev optimalnih kromatografskih pogojev

Da sem dobila izrazita in dobro vidna kromatografska vrhova za analizirana antioksidanta, sem morala najti ustrezne kromatografske pogoje. Za elucijo sem uporabljala dve mobilni fazi. Mobilna faza A je bila MQ voda, mobilna faza B pa čisti ACN. Na kolono sem injicirala po 30 μL raztopine, najbolj optimalen način elucije pa je podan v tabeli 1. Pretok sem ohranjala konstanten pri 1 mL/min.

Tabela 1: Spreminjanje sestave mobilne faze pri eluciji standardnih raztopin.

t [min] mobilna faza B [%]

0 45

10 100

13 100

14 45

16 45

Kromatografske vrhove sem odčitala pri valovni dolžini 192 nm. Na sliki 9 in sliki 10 sta prikazana UV-VIS absorpcijska spektra za AO 1 in AO 2. Razvidno je, da je pri valovni dolžini 192 nm absorbanca najvišja za oba antioksidanta, čeprav je za AO 2 bistveno nižja kot za AO 1. Dobljen UV-VIS absorpcijski spekter za AO 1 je primerljiv tudi s podatki, pridobljenimi iz literature (slika 8). Kromatografske vrhove za AO 1 bi sicer lahko odčitala tudi pri valovni dolžini okoli 280 nm, a je pri tej valovni dolžini absorbanca za AO 2 nizka. Ker je bil moj namen določiti oba antioksidanta hkrati, sem torej kot valovno dolžino detekcije izbrala 192 nm.

(29)

15

Slika 9: UV-VIS absorpcijski spekter za AO 1.

Slika 10: UV-VIS absorpcijski spekter za AO 2.

0 50 100 150 200 250 300 350

210 230 250 270 290 310 330 350 370 390 410

absorbanca[mAU]

λ[nm]

UV-VIS absorpcijski spekter (AO 1)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

210 230 250 270 290 310 330 350 370 390 410

absorbanca[mAU]

λ[nm]

UV-VIS absorpcijski spekter (AO 2)

(30)

16

4.2 Umeritveni premici

Ko sem definirala ustrezne kromatografske pogoje, sem lahko na kromatogramu identificirala oba antioksidanta (slika 11). Kot sem predvidevala, ima AO 1 krajši retencijski čas kot AO 2, saj ima AO 1 nižjo molekulsko maso od AO 2 in je manj nepolaren.

Slika 11: Kromatogram po injiciranju mešane standardne raztopine AO 1 in AO 2 s koncentracijo 100 mg/L s prikazom integracije kromatografskih vrhov za AO 1 in AO 2 (kromatografska vrhova od

leve proti desni: AO 1 pri 8,2 min; AO 2 pri 11,3 min).

Nadaljevala sem z injiciranjem mešanih standardnih raztopin različnih koncentracij v HPLC instrument. Integrirala sem ploščine dobljenih kromatografskih vrhov in izrisala umeritveno premico za vsak antioksidant posebej – integrirana ploščina kromatografskega vrha za posamezen antioksidant v odvisnosti od masne koncentracije tega antioksidanta v injicirani mešani standardni raztopini (slika 12 in slika 13). Celotni podatki so v prilogi 1.

-10 90 190 290 390 490 590 690 790 890

0 2 4 6 8 10 12 14 16

intenziteta [mAU]

t [min]

Kromatogram (mešana standardna raztopina koncentracije

100 mg/L)

(31)

17

Slika 12: Prikaz umeritvene premice za AO 1.

Slika 13: Prikaz umeritvene premice za AO 2.

Iz slike 12 in slike 13 je razvidno, da ima umeritvena premica za AO 2 manj točk kot umeritvena premica za AO 1. Razlog je, da je bil kromatografski vrh za AO 2 na kromatogramu za mešano standardno raztopino AO 1 in AO 2 koncentracije 10 mg/L že

y = 94,575x - 5,0832 R² = 0,9997

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000

0 20 40 60 80 100 120

integrirana ploščina vrha[mAU]

masna koncentracija AO 1 [mg/L]

Umeritvena premica (AO 1)

y = 0,7682x + 4,0717 R² = 0,9753

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0 20 40 60 80 100 120

integrirana ploščina vrha[mAU]

masna koncentracija AO 2 [mg/L]

Umeritvena premica (AO 2)

(32)

18

tako neizrazit, da ga ni bilo več mogoče integrirati. Tako sem za AO 2 ocenila mejo določitve pri koncentraciji 20 mg/L.

Kromatografski vrh za AO 1 je bil precej višji kot za AO 2 pri isti koncentraciji. Za izris umeritvene premice za AO 1 sem zato pripravila več raztopin nižjih koncentracij, dokler nisem prišla do kromatograma za oceno meje določitve tudi za AO 1. Ugotovila sem, da je umeritvena premica za AO 1 linearna le pri nižjih koncentracijah tega antioksidanta.

Linearnost sem potrdila do koncentracije 30 mg/L. To je zadostilo mojemu namenu, da definiram linearnost pri čim nižjih koncentracijah, saj so nizke tudi koncentracije antioksidantov v realnih vzorcih PVC-ja. Vzrok, da umeritvena premica za AO 1 ni linearna pri višjih koncentracijah tega antioksidanta, je zasičenje kolone z AO 1.

4.2.1 Meja določitve

Predvidevala sem, da bo meja določitve za AO 1 bistveno nižja od meje določitve za AO 2, saj je bil kromatografski vrh za AO 1 že od najvišje koncentracije mešane standardne raztopine bistveno višji kot za AO 2. To sem tudi potrdila. Kot omenjeno v poglavju 4.2, ima AO 2 ocenjeno mejo določitve reda velikosti 20 mg/L (slika 15), AO 1 pa bistveno nižje – reda velikosti 0,1 mg/L (slika 14).

Slika 14: Kromatogram za oceno meje določitve za AO 1 po injiciranju mešane standardne raztopine AO 1 in AO 2 s koncentracijo 0,1 mg/L s prikazom kromatografskega vrha za AO 1.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

2 4 6 8 10 12 14 16

intenziteta [mAU]

t [min]

Kromatogram (mešana standardna raztopina koncentracije

0,1 mg/L)

(33)

19

Slika 15: Kromatogram za oceno meje določitve za AO 2 po injiciranju mešane standardne raztopine AO 1 in AO 2 s koncentracijo 20 mg/L s prikazom kromatografskega vrha za AO 2.

4.2.2 Meja zaznave

Ocenila sem tudi mejo zaznave za oba antioksidanta. Le-ta v teoriji znaša tretjino vrednosti meje določitve, torej je za AO 1 meja zaznave reda velikosti 0,03 mg/L in 7 mg/L za AO 2. Pri teh ocenjenih vrednostih sta prikazana kromatograma na sliki 16 in sliki 17.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

2 4 6 8 10 12 14 16

intenziteta [mAU]

t [min]

Kromatogram (mešana standardna raztopina koncentracije

20 mg/L)

(34)

20

Slika 16: Kromatogram po injiciranju mešane standardne raztopine AO 1 in AO 2 s koncentracijo 0,03 mg/L.

Slika 17: Kromatogram po injiciranju mešane standardne raztopine AO 1 in AO 2 s koncentracijo 7 mg/L.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

2 4 6 8 10 12 14 16

intenziteta [mAU]

t [min]

Kromatogram (mešana standardna raztopina koncentracije 0,03 mg/L)

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

2 4 6 8 10 12 14 16

intenziteta [mAU]

t [min]

Kromatogram (mešana standardna raztopina koncentracije

7 mg/L)

(35)

21

4.3 Določanje antioksidantov v polivinilkloridu, ki vsebuje mehčala

Želela sem ugotoviti, če prisotnost mehčala bis(2-etilheksil) ftalat (DEHP) moti določitev obravnavanih antioksidantov v PVC-ju.

Injicirala sem standardno raztopino, ki je vsebovala oba antioksidanta in DEHP v koncentraciji 50 mg/L. Kromatografske pogoje sem ohranila enake, kot so navedeni v poglavju 4.1.2. Kromatografski vrh za DEHP je bil ustrezno ločen od kromatografskih vrhov za oba antioksidanta (slika 18).

Slika 18: Kromatogram po injiciranju standardne raztopine AO 1, AO 2 in DEHP s koncentracijo 50 mg/L s prikazom kromatografskih vrhov za AO 1, AO 2 in DEHP (kromatografski vrhovi od leve proti

desni: DEHP pri 3,5 min; AO 1 pri 8,2 min; AO 2 pri 11,3 min).

Kljub ustrezni ločbi sem želela, da ima DEHP čim krajši retencijski čas, saj so lahko v PVC-ju prisotna še druga, bolj nepolarna mehčala. Zato sem v nadaljevanju spreminjala začetno vsebnost ACN v mobilni fazi. Sprememba retencijskih časov za DEHP in oba antioksidanta je prikazana v tabeli 2.

-10 490 990 1490 1990 2490

0 2 4 6 8 10 12 14 16

intenziteta [mAU]

t [min]

Kromatogram (standardna raztopina, ki vsebuje oba

antioksidanta in DEHP koncentracije 50 mg/L)

(36)

22

Tabela 2: Vpliv spremembe sestave mobilne faze na retencijske čase DEHP, AO 1 in AO 2.

začetna vsebnost ACN v MF [%]

retencijski čas za DEHP [min]

retencijski čas za AO 1 [min]

retencijski čas za AO 2 [min]

45 3,466 8,160 11,340

50 2,705 7,738 11,225

55 2,199 7,186 /

60 1,821 6,508 10,781

65 1,630 5,684 10,470

70 1,484 4,757 10,111

75 1,411 3,825 9,545

Z večanjem začetne vsebnosti organske faze v mobilni fazi se opazno skrajšujejo retencijski časi za DEHP in oba antioksidanta. DEHP setudi pri najvišji začetni vsebnosti ACN v mobilni fazi (75 %) ustrezno loči od AO 1. Ta začetna sestava mobilne faze je torej ustrezna za določanje obeh analiziranih antioksidantov v PVC-ju, ki vsebuje tudi bolj nepolarna mehčala, kar sem potrdila z analizo vzorcev.

4.4 Analiza vzorcev

4.4.1 Kromatografski pogoji

Pripravljena vzorca sem injicirala na kolono; po 30 μL raztopine, sestava mobilne faze je podana v tabeli 3. Pretok sem ohranjala konstanten pri 1 mL/min. Kromatografske vrhove sem odčitala pri valovni dolžini 192 nm.

Tabela 3: Spreminjanje sestave mobilne faze pri eluciji vzorcev.

t [min] mobilna faza B [%]

0 75

10 100

13 100

14 75

16 75

(37)

23

Kromatogram ekstrakta vzorca 1 je prikazan na sliki 19 in ekstrakta vzorca 2 na sliki 20.

Slika 19: Kromatogram po injiciranju raztopine vzorca 1 s prikazom kromatografskega vrha za AO 1.

Slika 20: Kromatogram po injiciranju raztopine vzorca 2 s prikazom kromatografskega vrha za AO 1.

-100 400 900 1400 1900 2400

0 2 4 6 8 10 12 14 16

intenziteta [mAU]

t [min]

Kromatogram (vzorec 1)

-50 0 50 100 150 200

0 2 4 6 8 10 12 14 16

intenziteta [mAU]

t [min]

Kromatogram (vzorec 2)

(38)

24

4.4.2 Izračun koncentracije in masnega deleža analitov v vzorcih

Pri nobenem od vzorcev ni bilo kromatografskega vrha za AO 2, pri obeh vzorcih pa je bil kromatografski vrh za AO 1 (slika 19 in slika 20). Tako sem lahko izračunala koncentracijo in masni delež v obeh vzorcih le za AO 1.

Najprej sem integrirala ploščino dobljenega kromatografskega vrha za AO 1 (SUP) in iz enačbe umeritvene premice za AO 1 (enačba 1) izračunala koncentracijo AO 1 v raztopini vzorca 1 (γUP). Želela sem se prepričati, da je dobljeni kromatografski vrh res kromatografski vrh za AO 1, zato sem vzorec 1 še enkrat injicirala, tokrat s standardnim dodatkom. Kot standardni dodatek sem uporabila mešano standardno raztopino AO 1 in AO 2 koncentracije 100 mg/L. Ponovno sem integrirala ploščino dobljenega kromatografskega vrha za AO 1 (SSD) in z upoštevanjem standardnega dodatka izračunala koncentracijo AO 1 v raztopini vzorca 1 (γSD). Izračunala sem še masni delež AO 1 v vzorcu 1 (ωvz) (enačba 2). Enak postopek in izračun sem ponovila za vzorec 2. Podatki o zatehtah vzorcev, integriranih ploščinah kromatografskih vrhov za AO 1, izračunanih koncentracijah in masnih deležih AO 1 v vzorcih so zbrani v tabeli 4.

Enačba 1: SUP = 94,575γUP – 5,0832 Enačba 2: ωvz = ^γ^UP × 200 × 10^-6 L

mvz × 100 %

Tabela 4: Podatki o zatehtah vzorcev, integriranih ploščinah kromatografskih vrhov za AO 1, izračunanih koncentracijah in

masnih deležih AO 1 v vzorcih.

vzorec mvz [mg] SUP [mAU] γUP [mg/L] SSD [mAU] γSD [mg/L] ωvz [%]

vzorec 1 30,4541 1911,1 20,2610 2086,05 29,5845 0,013

vzorec 2 29,5795 277,348 2,9863 475,595 2,6699 0,006

4.4.3 Diskusija

Pri nobenem kromatogramu po injiciranju raztopine vzorcev ni bilo kromatografskega vrha za AO 2. S tem možnost, da je AO 2 prisoten v vzorcu 1 in vzorcu 2, ni povsem izključena –možno je, da je prisoten v majhnih koncentracijah, pod mejo zaznave. Kot sem ugotovila v poglavju 4.2.2, je ocenjena meja zaznave za AO 2 dokaj visoka – reda velikosti 7 mg/L, kar je verjetno razlog, da kromatografski vrh za AO 2 ni viden na kromatogramu nobenega od vzorcev.

(39)

25

Na kromatogramih obeh vzorcev pa je bil kromatografski vrh za AO 1. Razlika med koncentracijo AO 1, izračunano iz umeritvene premice (γUP, tabela 4), in koncentracijo AO 1, izračunano z metodo standardnega dodatka (γSD, tabela 4), je pri vzorcu 2 dokaj majhna. S tem podatkom sem potrdila, da izbrani kromatografski vrh ustreza AO 1 in je AO 1 v vzorcu 2 prisoten.

Pri vzorcu 1 pa je razlika med koncentracijo AO 1, izračunano iz umeritvene premice (γUP, tabela 4), in koncentracijo AO 1, izračunano z metodo standardnega dodatka (γSD, tabela 4), večja. Predvidevam, da lahko potrdim, da izbrani kromatografski vrh ustreza AO 1 in je AO 1 v vzorcu 1 prisoten, saj se je kromatografski vrh za AO 1 z dodatkom standarda povečal. Razliko med izračunanima vrednostma koncentracij pripisujem manipulaciji z vzorcem. Poleg tega pa je bil pri vzorcu 1 volumen standardnega dodatka manjši kot pri vzorcu 2, zato so verjetno nastale napake tudi pri pipetiranju majhnega volumna standardnega dodatka.

Z uporabo enačbe 2 sem izračunala še masna deleža AO 1 v vzorcu 1 in v vzorcu 2 (tabela 4). Ugotovila sem, da sta nekaj velikostnih redov manjša od masnih deležev, navedenih v literaturi. Povzeto po literaturi, naj bi masni delež AO 1 v polimerih znašal od 0,1 do 0,4 % [7]. Razliko pripisujem izgubam v postopku priprave vzorca (izguba pri ekstrakciji, za vzorec 2 tudi izguba pri filtraciji).

Omenila bi še, da so bili vzorci, kot navedeno, analizirani pri drugačni sestavi mobilne faze, kot je bila sestava mobilne faze, pri kateri je bila izrisana umeritvena premica.

Začetni delež ACN v mobilni fazi za analizo standardnih raztopin je znašal 45 %, medtem ko je začetni delež ACN v mobilni fazi za analizo vzorcev znašal 75 %. Predvidevam, da bi tudi to lahko prispevalo k razliki med določeno vsebnostjo antioksidantov in podatki, pridobljenimi iz literature.

(40)

(41)

27

5 Zaključek

Namen diplomskega dela je bil optimizacija HPLC metode za določanje dveh antioksidantov v PVC-ju. Poiskala sem ustrezno topilo za oba antioksidanta in kromatografske pogoje za učinkovito separacijo analiziranih antioksidantov. Izrisala sem umeritveni premici, da sem ugotovila linearnost metode, meji določitve in meji zaznave za oba antioksidanta. Preverila sem še, če prisotnost DEHP moti določitev teh antioksidantov v PVC-ju, in nazadnje preizkusila metodo na dveh realnih vzorcih PVC- ja.

Kot ustrezno topilo se je izkazal aceton, v katerem sta se, sicer s pomočjo ultrazvočne kopeli, raztopila oba antioksidanta. To topilo je bilo kompatibilno tudi z izbrano mobilno fazo (ACN/MQ). Oba antioksidanta sta se eluirala šele z uporabo kolone 3. Sestavo mobilne faze sem spreminjala, da sem na kromatogramu dobila ustrezna kromatografska vrhova za analizirana antioksidanta. S separacijo kromatografskih vrhov nisem imela težav, saj se antioksidanta zadosti razlikujeta po molekulskih masah in polarnosti ter sta se eluirala pri različnih retencijskih časih. Ugotovila sem, da ima DEHP ustrezno različen retencijski čas od obravnavanih antioksidantov, zato ju lahko nemoteno določamo tudi v PVC-ju, ki vsebuje mehčala.

Rezultat, da je metoda linearna pri nizkih koncentracijah AO 1, je bil zadovoljiv. Ustrezno nizki meja zaznave in meja določitve za AO 1 pa sta dodatno pripomogli, da sem v realnih vzorcih PVC-ja lahko določila vsebnost AO 1. Kromatografski vrh za AO 1 na kromatogramu vzorcev sem potrdila z metodo standardnega dodatka. Primerjala sem koncentraciji AO 1, ki sem ju izračunala z metodo umeritvene premice in z metodo standardnega dodatka. Pri vzorcu 2 je bilo ujemanje ustrezno, pri vzorcu 1 nekoliko manj, predvidoma zaradi manipulacije z vzorcem in nenatančnega pipetiranja majhnega volumna standardnega dodatka. Izračunala sem še masni delež AO 1 v vzorcih in ugotovila, da se nekoliko razlikuje od masnega deleža AO 1 v polimerih, ki ga navaja literatura. Razliko pripisujem izgubam pri pripravi vzorca.

Tekom celotnega dela sem imela težave predvsem z določanjem AO 2. Absorbanca za AO 2 pri izbrani valovni dolžini detekcije je bistveno nižja kot za AO 1, zato je bil kromatografski vrh za AO 2 izrazito manjše intenzitete kot za AO 1, s tem pa tudi meja določitve in meja zaznave za AO 2 ustrezno višji. Na tem področju vidim prostor za nadaljnje raziskave in izboljšave. Menim, da bi bilo smiselno poiskati drugačne kromatografske pogoje za elucijo AO 2 – poiskati drugačno sestavo mobilne faze in način

(42)

28

elucije ter spremeniti pretok. Na kromatogramih po injiciranju raztopin vzorcev kljub standardnemu dodatku nisem mogla potrditi kromatografskega vrha za AO 2, ker je lahko v vzorcu prisoten v prenizkih koncentracijah. Menim, da bi bila potrebna optimizacija HPLC metode posebej za AO 2, da bi lahko z drugačno metodo prišli do nižje meje določitve in meje zaznave.

(43)

29

6 Literatura

[1] H. Namazi: Polymers in Our Daily Life. BioImpacts 2017, 7, 73–74.

[2] V. Ambrogi, C. Carfagna, P. Cerruti, V. Marturano: Additives in Polymers. V:

Modification of Polymer Properties. 1. izd., C. F. Jasso-Gastinel, J. M. Kenny (ur.), Chadds Ford, PA: Elsevier 2016, str. 87–108.

[3] Polyvinyl chloride. Wikipedia, The Free Encyclopedia.

https://en.wikipedia.org/wiki/Polyvinyl_chloride (pridobljeno 28. 11. 2021).

[4] F. P. Cortolano: Antioxidants and UV Stabilizers: A Summary of Their Utilization in PVC. J. Vinyl Technol. 1993, 15, 69–75.

[5] R. Fiorio, D. R. D’hooge, K. Ragaert, L. Cardon: A Statistical Analysis on the Effect of Antioxidants on the Thermal-Oxidative Stability of Commercial Mass- and Emulsion-Polymerized ABS. Polymers (Basel). 2018, 11.

[6] Q. B. Lin, B. Li, H. Song, X. M. Li: Determination of 7 Antioxidants, 8 Ultraviolet Absorbents, and 2 Fire Retardants in Plastic Food Package by Ultrasonic Extraction and Ultra Performance Liquid Chromatography. J. Liq. Chromatogr.

Relat. Technol. 2011, 34, 730–743.

[7] Irganox 1076. BASF.

http://www.gapchemical.com/Upload/file/20170323/2017032310010588588.pdf (pridobljeno 16. 10. 2021).

[8] Weston Phosphite Antioxidants. ChemPoint.

https://www.chempoint.com/insights/si-group-weston-phosphite-antioxidants (pridobljeno 10. 12. 2021).

[9] Weston 619F phosphite. Addivant.

https://www.brenntag.com/media/documents/bsi/product_data_sheets/material_s cience/addivant/weston_619f_pds.pdf (pridobljeno 16. 10. 2021).

[10] Dover Chemical Doverphos S680 Distearyl Pentaerythritol Diphosphite. MatWeb.

http://www.matweb.com/search/datasheettext.aspx?matguid=69c3f2354c8149ef8 43dd8d511dae4dc (pridobljeno 16. 10. 2021).

[11] A. Ritter, E. Michel, M. Schmid, S. Affolter: Interlaboratory Test on Polymers:

Determination of Antioxidants in Polyolefins. Polym. Test. 2005, 24, 498–506.

[12] T. Tikuisis, V. Dang: Antioxidants: Their Analysis in Plastics. V: Plastic Additives.

1. izd., G. Pritchard (ur.), Dordrecht: Springer 1998, str. 80–94.

[13] H. Prosen, I. Kralj Cigić, M. Strlič: Praktikum iz analizne kemije. 1. izd. Ljubljana:

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 2014, str. 121–124.

(44)

30

[14] S. C. Moldoveanu, V. David: Essentials in Modern HPLC Separations. 1. izd.

Waltham, MA: Elsevier 2012, str. 2, 3, 21.

[15] M. A. Haney, W. A. Dark: Reversed-Phase High Pressure Liquid Chromatographic Method for Analysis of Additives in Polyolefins. J. Chromatogr. Sci. 1980, 18, 655–659.

[16] M. S. Dopico-García, J. M. López-Vilariñó, M. V. González-Rodríguez:

Antioxidant Content of and Migration from Commercial Polyethylene, Polypropylene, and Polyvinyl Chloride Packages. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 3225–3231.

[17] M. S. Dopico-García, C. Cela-Pérez, J. M. López-Vilariño, M. V. González- Rodríguez, L. F. Barral-Losada: An Approach to Imprint Irganox 1076: Potential Application to the Specific Migration Test in Olive Oil. J. Appl. Polym. Sci. 2010, 119, 2866–2874.

[18] J. A. Denning, J. A. Marshall: The Identification of Antioxidants in Polyethylene by Gas Chromatography. Analyst 1972, 97, 710–712.

[19] D. A. Wheeler: Determination of Antioxidants in Polymeric Materials. Talanta 1968, 15, 1315–1334.

[20] D. Dolenc: Praktikum iz organske kemije. 1. izd. Ljubljana: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo 2016, str. 76–82.

[21] D. Simpson, B. R. Currell: The Determination of Certain Antioxidants, Ultraviolet Absorbers and Stabilisers in Plastics Formulations by Thin-Layer Chromatography. Analyst 1971, 96, 515–521.

(45)

31

7 Priloge

Priloga 1: Tabela masnih koncentracij mešanih standardnih raztopin različnih koncentracij AO 1 in AO 2 in njim pripadajoče ploščine integriranih kromatografskih vrhov, uporabljene za izris umeritvenih

premic.

masna koncentracija AO

1 in AO 2 [mg/L] integrirana ploščina vrha

za AO 1 [mAU] integrirana ploščina vrha za AO 2 [mAU]

0,1 7,10948 /

0,2 13,4474 /

0,3 25,3576 /

0,4 32,6533 /

0,5 49,3631 /

1 92,8286 /

2 191,401 /

3 280,915 /

4 388,643 /

5 461,125 /

10 898,233 /

20 1877,51 15,5295

30 2850,35 /

40 3143,51 39,9457

60 3803,60 48,8026

80 4241,90 68,4286

100 4576,44 78,1060