UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Mojca PODGORŠEK
VPLIV KOLAGENSKE BARIERE NA TVORBO MIKOTOKSINOV V MODELNEM SISTEMU
ZORENJA SUHIH SALAM
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij - 2. stopnja Živilstvo
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Mojca PODGORŠEK
VPLIV KOLAGENSKE BARIERE NA TVORBO MIKOTOKSINOV V MODELNEM SISTEMU ZORENJA SUHIH SALAM
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij - 2. stopnja Živilstvo
EFFECT OF COLLAGEN BARRIER ON THE MYCOTOXINS FORMATION IN THE MODEL SYSTEM DURING DRY SAUSAGES
RIPENING
M. SC. THESIS
Master Study Programmes: Field Food Science and Technology
Ljubljana, 2021
Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Živilstvo. Delo je bilo opravljeno na Katedri za tehnologijo mesa in vrednotenje živil in na Katedri za biotehnologijo, mikrobiologijo in varnost živil Oddelka za živilstvo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorja magistrskega dela imenovala izr. prof. dr.
Tomaža Polaka in za recenzentko prof. dr. Barbko Jeršek.
Mentor: izr. prof. dr. Tomaž POLAK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Recenzentka: prof. dr. Barbka JERŠEK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik:
Član:
Član:
Datum zagovora:
Mojca Podgoršek
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2
DK UDK 637.52:621.798:615.9:579.67(043)=163.6
KG suhe salame, sušene mesnine, mikotoksini, aflatoksin B1, kolagenski ovitek AV PODGORŠEK, Mojca, dipl. inž. živ. in preh. (UN)
SA POLAK, Tomaž (mentor), JERŠEK, Barbka (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2021
IN VPLIV KOLAGENSKE BARIERE NA TVORBO MIKOTOKSINOV V MODELNEM SISTEMU ZORENJA SUHIH SALAM
TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja Živilstvo) OP X, 43 str., 1 pregl., 13 sl., 2 pril., 32 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Nekatere plesni na površini salam so sposobne tvorbe mikotoksinov, ki so škodljivi za ljudi in živali. Z nalogo smo želeli ovrednotiti vpliv kolagenskega ovoja na tvorbo in prehajanje mikotoksinov s površine salam v nadev. V ta namen smo zasnovali modelni sistem zorenja salam, pri katerem smo maso za salame nanesli v petrijevke. V vzorcih smo določali vsebnost mikotoksina AFB1 (aflatoksina B1), ki so ga tvorile na površino nacepljene plesni vrste Aspergillus parasiticus ŽMJ7.
Vsebnost AFB1 smo določali v gojišču YES (gojišče s kvasnim ekstraktom in saharozo), v masi za salame, na katero nismo nanesli kolagenskega ovitka in v masi za salame z nepoškodovanim ali s poškodovanim ovitkom. Polovico vzorcev smo inkubirali pri temperaturnem programu za zorenje salam, drugo polovico pa pri 25
°C. Za ekstrakcijo na trdni fazi (SPE) smo uporabili kolone ISOLUTE Myco, vsebnost AFB1 pa smo določali s HPLC. Večina AFB1 se je tvorila že v prvih 7-14 od 21 dni zorenja. AFB1 se je začel hitreje tvoriti pri temperaturnem programu za zorenje salam, kasneje razlik med vzorci, zorjenimi pri dveh različnih temperaturnih režimih, ni bilo. Največ AFB1 se je tvorilo v gojišču, bistveno manj v masi za salame brez ovitka, najmanj mikotoksina pa so vsebovali vzorci, pri katerih smo uporabili ovoj. Kolagenska bariera je namreč vplivala na kar 80-90 % zmanjšanje vsebnosti AFB1 v nadevu za salame. Na to ni toliko vplivalo zaviranje prehajanja mikotoksina skozi ovoj v nadev, pač pa že sama prisotnost kolagenskega ovitka. S površine ovitka v nadev je skozi kolagensko bariero sicer difundirala približno polovica le-tega. Poškodba ovitka ni vplivala na večjo vsebnost AFB1 v nadevu.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 637.52:621.798:615.9:579.67(043)=163.6
CX dry sausages, dry-cured meat, mycotoxins, aflatoxin B1, collagen casing AU PODGORŠEK, Mojca
AA POLAK, Tomaž (supervisor), JERŠEK, Barbka (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology
PY 2021
TI EFFECT OF COLLAGEN BARRIER ON THE MYCOTOXINS FORMATION IN THE MODEL SYSTEM DURING DRY SAUSAGES RIPENING
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Field Food Science and Technology) NO X, 43 p., 1 tab., 13 fig., 2 ann., 32 ref.
LA sl AL sl/en
AB Certain molds on the surface of dry sausages are capable of forming mycotoxins that are harmful to humans and animals. The aim of this thesis was to evaluate the influence of a collagen casing on formation of AFB1 mycotoxin and the surface-to- interior diffusion of AFB1 in dry sausages. For this purpose, we designed a model system for ripening dry sausages, where the stuffing of dry sausages was applied to petri dishes. The content of AFB1 mycotoxin, that was formed on the surface by Aspergillus parasiticus ŽMJ7, was determined in the samples. The AFB1 content was measured in YES (Yeast Extract Sucrose Agar), in stuffing of dry sausages with no collagen casing applied and in stuffing with undamaged or damaged casing placed on top of it. Half of the samples were incubated using a temperature program for ripening sausages and the other half at 25˚C. ISOLUTE Myco columns were used for solid phase extraction (SPE) and the AFB1 content was determined by HPLC. The majority of AFB1 was formed in the first 7-14 days of the total 21 days of ripening. AFB1 began to form more rapidly in samples exposed to the temperature program for ripening sausages. There were no differences in AFB1
content between samples from the two different temperature groups in the later stages of ripening. The majority of AFB1 was formed in YES, significantly less was formed in the dry sausage stuffing without casing. The least AFB1 was determined in samples on which collagen casings were used. The presence of collagen barrier reduced the content of AFB1 in dry sausage stuffing by as much as 80-90%. This was not a result of collagen casing preventing the mycotoxin AFB1 from diffusing through the barrier into the interior of the sausage. The collagen casing by itself strongly reduced the overall formation of the mycotoxin. Approximately half of the AFB1 diffused from the surface into the stuffing through the collagen barrier.
Damaging the casing did not affect the content of AFB1 in the stuffing of dry sausages.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO PREGLEDNIC VII
KAZALO SLIK VIII
KAZALO PRILOG IX
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI X
1 UVOD 1
1.1 CILJI NALOGE 1
1.2 DELOVNE HIPOTEZE 1
2 PREGLED OBJAV 2
2.1 IZDELAVA SALAM 2
2.1.1 Sestavine 2
2.1.1.1 Meso in slanina 2
2.1.1.2 Sol 3
2.1.1.3 Začimbe 3
2.1.1.4 Nitrit 3
2.1.1.5 Sladkorji 4
2.1.1.6 Askorbinska kislina 4
2.1.1.7 Starterske kulture 4
2.1.2 Priprava nadeva 5
2.1.3 Polnjenje v ovitke 5
2.1.4 Dimljenje 5
2.1.5 Uporaba in vpliv plesni v proizvodnji sušenih mesnin 6
2.1.6 Sušenje in zorenje 6
2.1.6.1 Klasično sušene salame 7
2.1.6.2 Hitro fermentirane salame 7
2.1.7 Shranjevanje zrelih salam 8
2.2 MIKOTOKSINI 8
2.2.1 Aflatoksini 9
2.2.2 Ohratoksin A 10
2.2.3 Mikotoksini v sušenih mesninah 10 2.2.3.1 Zakonodaja o mikotoksinih v sušenih mesninah 13 2.2.4 Metode za določanje plesni in mikotoksinov v sušenih mesninah 14
2.2.4.1 Določanje plesni 14
2.2.4.2 Določanje mikotoksinov 15
2.2.5 Preprečevanje rasti plesni in tvorbe mikotoksinov v sušenih mesninah 15
2.2.5.1 Mlečnokislinske bakterije 16
2.2.5.2 Kvasovke 16
2.2.5.3 Plesni 17
3 MATERIAL IN METODE 18
3.1 PRIPRAVA MODELNEGA SISTEMA 18
3.1.1 Nacepljanje plesni 19
3.2 EKSTRAKCIJA AFLATOKSINA B1 20
3.2.1 Ekstrakcija na trdni fazi (SPE) 21
3.3 DOLOČANJE AFB1 S HPLC 21
3.3.1 Ponovljivost metode 21
3.4 ANALIZA PODATKOV 22
4 REZULTATI 23
4.1 TVORBA AFB1 V 21-DNEVNEM OBDOBJU MODELNEGA SISTEMA
ZORENJA SALAM 23
4.1.1 Prisotnost AFB1 v vzorcih po 4 dneh inkubacije 26 4.1.2 Prisotnost AFB1 v vzorcih po 7 dneh inkubacije 28 4.1.3 Prisotnost AFB1 v vzorcih po 14 dneh inkubacije 29 4.1.4 Prisotnost AFB1 v vzorcih po 21 dneh inkubacije 32
5 RAZPRAVA 34
6 SKLEPI 37
7 POVZETEK 38
8 VIRI 40
ZAHVALA PRILOGE
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Temperaturni program za zorenje salam ... 19
KAZALO SLIK
Slika 1: Masa za salame brez ovitka ... 18 Slika 2: Masa za salame prekrita s kolagensko bariero ... 18 Slika 3: Shema priprave vzorcev ... 20 Slika 4: Tvorba AFB1 v 21-dnevnem obdobju modelnega sistema zorenja salam pri 25 °C ... 23 Slika 5: Tvorba AFB1 v 21-dnevnem obdobju modelnega sistema zorenja salam pri temperaturnem programu za zorenje salam ... 24 Slika 6: Tvorba AFB1 v gojišču v 21-dnevnem obdobju inkubacije pri 25 °C in programu za zorenje salam... 25 Slika 7: Rast plesni vrste A. parasiticus na gojišču, masi za salame brez ovitka in masi za salame z ovitkom po 4 dneh zorenja/inkubacije ... 26 Slika 8: Vsebnost AFB1 v masi za salame in na ovitku po 4 dneh zorenja/inkubacije ... 27 Slika 9: Rast plesni vrste A. parasiticus na gojišču, masi za salame brez ovitka in masi za salame z ovitkom po 7 dneh zorenja/inkubacije ... 28 Slika 10: Vsebnost AFB1 v masi za salame in na ovitku po 7 dneh zorenja/inkubacije ... 29 Slika 11: Rast plesni vrste A. parasiticus na gojišču, masi za salame brez ovitka in masi za salame z ovitkom po 14 dneh zorenja/inkubacije ... 30 Slika 12: Vsebnost AFB1 v masi za salame in na ovitku po 14 dneh zorenja/inkubacije ... 31 Slika 13: Vsebnost AFB1 v masi za salame in na ovitku po 21 dneh zorenja/inkubacije ... 32
KAZALO PRILOG
Priloga A: Vsebnost AFB1 v vzorcih inkubiranih pri 25 °C
Priloga B: Vsebnost AFB1 v vzorcih inkubiranih pri programu za zorenje salam
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
AF aflatoksini
AFB1 aflatoksin B1
CFU kolonijska enota (ang. colony forming unit) DNA deoksiribonukleinska kislina
EFSA Evropska agencija za varnost hrane (ang. European Food Safety Authority) ELISA encimski imunski test
FDA Uprava za hrano in zdravila (ang. Food and Drug Administration) GRAS splošno priznano kot varno (ang. Generally Recognized As Safe)
HACCP sistem analize tveganja kritičnih kontrolnih točk (ang. Hazard Analysis Critical Control Points)
HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti
IARC Mednarodna agencija za raziskave raka (ang. International Agency for Research on Cancer)
LAB mlečnokislinske bakterije
LAMP z zanko posredovano izotermalno pomnoževanje OTA ohratoksin A
PCR verižna reakcija s polimerazo
qPCR kvantitativna verižna reakcija s polimerazo
QPS kvalificirana predpostavka varnosti (ang. Qualified Presumption of Safety) SPE ekstrakcija na trdni fazi
T25 temperatura 25 °C
TP temperaturni program za zorenje salam
YES gojišče s kvasnim ekstraktom in saharozo (ang. Yeast Extract Sucrose Agar)
1 UVOD
Suhe salame predstavljajo tradicionalno živilo in so ena bolj cenjenih sušenih mesnin pri potrošnikih. Za nekatere od njih je značilno, da jih prekrivajo plesni. Te se pri klasični tehnologiji pojavijo same od sebe že v prvih dneh zorenja, saj so okoljske razmere med zorenjem salam zelo primerne za njihovo rast na površini izdelkov. Plesni prispevajo k razvoju specifične arome in okusa sušenih mesnin, delujejo antioksidativno in vplivajo na barvo, izboljšajo teksturo in preprečujejo prekomerno sušenje in trdoto zorjenih izdelkov.
Vendar pa, predvsem pri domačem načinu izdelave, prihaja tudi do rasti neželenih plesni, ki so sposobne tvorbe mikotoksinov.
Mikotoksini so sekundarni presnovki plesni, ki so škodljivi za živali in ljudi, zato predstavljajo resno grožnjo v preskrbi s hrano. Imajo namreč rakotvorne, imunološke, alergene, nefrotoksične, hepatotoksične, imunosupresivne, mutagene, estrogene in teratogene učinke, odvisno od stopnje izpostavljenosti. Med različnimi mikotoksini, ki lahko kontaminirajo sušene mesnine, sta glede na pojavnost in toksične učinke daleč najpomembnejša ohratoksin A (OTA) in aflatoksin B1 (AFB1). Na rast plesni ter tvorbo in kopičenje mikotoksinov v salamah vplivata predvsem vodna aktivnost in temperatura med zorenjem in skladiščenjem izdelkov, vpliv pa bi naj imele tudi poškodbe ovitka. Rast toksigenih plesni v industrijski proizvodnji omejujejo z nanosom ustreznih starterskih kultur netoksigenih sevov.
Z magistrsko nalogo smo želeli ovrednotiti vpliv kolagenskega ovitka na tvorbo in prehajanje mikotoksinov v salame. V ta namen smo zasnovali modelni sistem zorenja salam, pri katerem smo maso za salame nanesli v petrijevke. V vzorcih smo določali skupno vsebnost AFB1, ki so ga tvorile na površino nacepljene toksigene plesni.
1.1 CILJI NALOGE
Cilj naloge je bil ugotoviti vpliv kolagenske bariere na prehajanje mikotoksinov, ki jih plesni tvorijo na površini.
1.2 DELOVNE HIPOTEZE
Hipoteza 1: Vsebnost mikotoksinov se bo s časom zorenja povečevala.
Hipoteza 2: Kolagenska bariera (ovitek) bo delno preprečila prehajanje mikotoksinov s površine v nadev za salame.
2 PREGLED OBJAV
2.1 IZDELAVA SALAM
Po Pravilniku o kakovosti mesnih izdelkov in mesnih pripravkov (2017) salame spadajo med sušene mesnine, kamor sodijo tudi npr. pršut, sušeno pleče, sušeno stegno, sušena vratina in panceta (Pravilnik o kakovosti …, 2017).
Salame so izdelki iz razdetega mesa (zmletega, sekljanega), slanine, dodatnih sestavin, soli, aditivov, začimb, začimbnih ekstraktov, arom in tehnoloških dodatkov. Nadev se polni v naravne ali umetne ovitke, nato se salame sušijo in zorijo v naravnih ali klimatiziranih sušilnicah in zorilnicah. Lahko so hladno dimljene, nedimljene ali poraščene s plemenito plesnijo. Aktivnost vode ne sme presegati 0,93, proizvajajo pa se lahko kot klasično sušene ali hitro fermentirane (Pravilnik o kakovosti …, 2017).
Ker je to biološki sistem, nanj vplivajo številni dejavniki, ki jih je potrebno nadzorovati, da dobimo ustrezne izdelke. To vključuje svežo in čim manj onesnaženo surovino s primernimi dodatki, ustrezno mikrofloro (starterske kulture), visoko raven higiene skozi celoten proces izdelave, ustrezno dimljenje ter nadzor časa, temperature in vlage med proizvodnjo (Ockerman in Basu, 2015).
K varnosti končnih izdelkov pripomore znižanje vrednosti pH, ki je posledica nastajanja mlečne kisline med fermentacijo, in pa zmanjšanje vodne aktivnosti, zaradi dodatka soli in sušenja. Tako v naravni kot nadzorovani (z dodanimi starterskimi kulturami) fermentaciji sodelujejo mlečnokislinske bakterije (LAB), ki mlečno kislino tvorijo iz naravnih zalog glikogena v klavnih tkivih in iz dodanega sladkorja v nadevu (Ockerman in Basu, 2015).
2.1.1 Sestavine
2.1.1.1 Meso in slanina
Na našem območju velja, da se za salame kot osnovni surovini v glavnini uporabljata prašičje meso I. kakovosti (Gašperlin in Polak, 2009) in slanina, in sicer v razmerju 3:1 do 4:1 (oziroma 20 do 25 % slanine v celotnem nadevu) (Gašperlin in Polak, 2010). Od mesa se uporabljajo še govedina, jagnjetina, meso piščancev, rac, bivolov, konjev, oslov, jelenov, zajcev in drugih vrst (Ockerman in Basu, 2015), vendar je glede poimenovanja salam pri uporabi le-teh potrebno upoštevati Pravilnik o kakovosti mesnih izdelkov in mesnih pripravkov (2017).
Ker med zorenjem salam potekajo mikrobiološki procesi, je nujno, da je surovina sveža in higiensko neoporečna (Ockerman in Basu, 2015). Meso mora biti očiščeno veziva in
normalne kakovosti, kar pomeni, da vrednost pH znaša med 5,4 in 5,8, mikrostruktura mišičnine pa je polodprta. Biti mora dobro ohlajeno ali celo rahlo namrznjeno, primernejše pa je meso nekoliko starejših in težjih prašičev (Gašperlin in Polak, 2010).
Zelo pomembna sestavina salam je slanina. Uporabna je le čvrsta hrbtna slanina, saj vsebuje manj nenasičenih maščobnih kislin, ki bi med sušenjem/zorenjem lahko oksidirale in povzročile žarkost izdelka. Da nadev ni gnecav (lepljiv) in se med razdevanjem ne pregreje, mora biti slanina pred mletjem dobro ohlajena ali še bolje rahlo namrznjena.
Mehka slanina (trebušna slanina, notranja mastnina in salo ter slanina prašičev, krmljenih pretežno s koruzo ali pomijami) ni primerna, saj rada »steče« in prekrije pore ovitka ter tako prepreči normalno sušenje salam (Gašperlin in Polak, 2010).
2.1.1.2 Sol
Glavna dodatna sestavina v sušenih mesninah je kuhinjska sol, ki vpliva na senzorične lastnosti, učinkuje kot konzervans (znižuje aktivnost vode) ter ima tehnološke lastnosti (Ockerman in Basu, 2015). Med mešanjem nadeva namreč pripomore k izločanju v vodi topnih beljakovin, ki na površini koščkov mesa ustvarijo beljakovinski lepek, ta pa zagotavlja dobro povezovanje nadeva. Dodatek je običajno med 2 in 3 % (Gašperlin in Polak, 2010), kar omogoča rast mlečnokislinskih bakterij in zavira rast neželenih mikroorganizmov (Ockerman in Basu, 2015). Preveč soli vpliva na prekomerno slanost izdelka, premalo (npr. 1,5 %) pa pomeni nevarnost mikrobiološkega kvarjenja salam že med procesom sušenja (Gašperlin in Polak, 2010).
2.1.1.3 Začimbe
Za aromo se dodajajo začimbe (npr. črni, rdeči in beli poper, kardamom, gorčica, piment, paprika, muškatni orešček, ingver, cimet, česen in različne kombinacije), ki pa lahko imajo tudi antioksidativne lastnosti in vplivajo na rast mlečnokislinskih bakterij (Ockerman in Basu, 2015). V Sloveniji sta najpogostejša črni poper (mlet, del lahko tudi v zrnih) in česen, druge začimbe pa prispevajo h krajevnim značilnostim posameznih izdelkov.
Predvsem v obrtniški in domači proizvodnji v salame dodajajo še mleti lovor, muškatni orešček, brinove jagode, včasih tudi vino ali žgane pijače (rum, konjak). Začimbe so pogosto močno onesnažene z mikroorganizmi, zato lahko pogosto pride do kontaminacije mesa in mesnih izdelkov (Gašperlin in Polak, 2010).
2.1.1.4 Nitrit
V industrijski praksi se za večjo mikrobiološko varnost in boljšo barvo izdelkov praviloma dodaja suhi razsol (natrijev klorid + nitrit) (Gašperlin in Polak, 2010). Za antibakterijske, barvne in antioksidativne lastnosti se nitrit dodaja v količini od 80 do 240 mg/kg. Lahko se
uporablja tudi v kombinaciji z nitratom, vendar ta običajno ni potreben, razen kot zaloga za nitrit pri dolgotrajni proizvodnji. Nitrit zavira rast bakterij in razširjenost salmonele (Ockerman in Basu, 2015).
2.1.1.5 Sladkorji
Za varnejšo proizvodnjo se lahko dodajajo tudi sladkorji (laktoza, saharoza), katerih naloga je zniževanje vrednosti pH v prvih dneh zorenja, kar zmanjša možnost kvara (Gašperlin in Polak, 2010). Preprosti sladkor, kot je glukoza (0,5 %, pogosto se priporoča najmanj 0,75
%), predstavlja fermentacijski substrat, ki ga zlahka uporabijo vse mlečnokislinske bakterije. Količina sladkorja vpliva na hitrost in obseg zakisanosti, ugodno pa prispeva tudi k okusu in teksturi. Večji dodatek glukoze ne pomeni dodatnega znižanja vrednosti pH, ker kislo okolje že zavre rast bakterij (Ockerman in Basu, 2015).
2.1.1.6 Askorbinska kislina
Askorbinska kislina ali natrijev askorbat se uporabljata za izboljšanje in stabilnost barve ter zaviranje oksidacije (Ockerman in Basu, 2015).
2.1.1.7 Starterske kulture
Med sušenjem/zorenjem salam pride do fermentacije, ki jo pri tradicionalno sušenih suhih salamah sproži naravno prisotna mikroflora (Ockerman in Basu, 2015) ter lastni encimi mesa in mastnine (Gašperlin in Polak, 2010). Običajno mikrobioto, ki je prisotna v teh izdelkih, sestavljajo laktobacili skupaj s kvasovkami in plesnimi, ki večinoma pripadajo kvasovkam vrste Debaryomyces hansenii in plesnim rodu Penicillium. Ti mikroorganizmi prispevajo k razvoju željenih senzoričnih lastnosti suhih salam (Delagdo in sod., 2019).
Zanašanje na naravno mikrofloro lahko privede do izdelkov neenakomerne kakovosti (Ockerman in Basu, 2015), zato v nekatere salame dodajajo tudi starterske kulture (različne bakterije, plesni in kvasovke), s čimer pospešijo proces fermentacije, proizvodnja salam pa je bolj varna in konstantna (Gašperlin in Polak, 2010). V Evropi najpogosteje uporabljene starterske kulture vključujejo bakterije vrst Lactobacillus sakei, Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus carnosus in v manjši meri Micrococcus spp. Na voljo so tudi kombinirane starterske kulture, pri katerih ena skupina mikroorganizmov tvori mlečno kislino (npr. laktobacili), druga pa izboljša okus (Micrococcaceae, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri). Dodatek starterskih kultur pomeni veliko dobrih in sprejemljivih izdelkov in praktično nobenega neželjenega.
Nastane pa zelo malo izjemno dobrih izdelkov, ker je večina starterskih kultur kombinacija le nekaj vrst mikroorganizmov, ki ne morejo ustvariti tako zaokroženega okusa, kot ga je mogoče dobiti, če je vključenih veliko vrst (Ockerman in Basu, 2015).
2.1.2 Priprava nadeva
Nadev za salame se lahko zmelje v volku z luknjačo premera 6 do 12 mm ali v kutru (za salame z zelo finim mozaikom), nadev pa se pri tem ne sme pregreti. Končna temperatura nadeva za grobo razdete salame (kmečka salama) sme biti od 0 do 2 °C, za zelo fino razdete (ogrska salama) pa od -6 do -4 °C. Zmleto meso in slanina se nato dobro premešajo, vključno z vsemi dodatki (Gašperlin in Polak, 2010).
2.1.3 Polnjenje v ovitke
V mesni predelavi so na voljo številni ovitki, ki jih na splošno delimo na naravne in sintetične (Ockerman in Basu, 2015). Nadev za salame se v glavnem polni v umetne propustne kolagenske ovitke, v naravna čreva ali pa v celulozne ovitke. Temperatura med polnjenjem ne sme presegati 5 °C, najprimernejši pa so vakuumski polnilniki, saj omogočajo izsesavanje zraka iz nadeva. Salame morajo biti napolnjene dovolj strnjeno in brez zračnih žepov. Pri slabo napolnjenih običajno pride nepravilnega sušenja, razpok in kvara v notranjosti (plesnivost, gniloba, žarkost), zunaj pa so močno nagubane in trde (Gašperlin in Polak, 2010).
2.1.4 Dimljenje
Dimljenje se uporablja za oblikovanje vonja, okusa ter značilne rdeče-rjave barve salam (Gašperlin in Polak, 2010). Hkrati sestavine dima zavirajo rast površinskih bakterij, plesni in kvasovk (Ockerman in Basu, 2015) ter salame ščitijo pred kemijskimi spremembami, ki povzročijo žarkost (Gašperlin in Polak, 2010).
Dimljenje je odvisno od tradicije in vrste izdelka na območju, kjer se proizvaja (Ockerman in Basu, 2015). Tako je v severnem delu Evrope dimljenje običajen del tehnološkega postopka, medtem ko se ponekod v Južni Evropi ne uporablja. V Sloveniji se v krajih, ki imajo dobre naravne razmere za sušenje/zorenje (Primorska), salame tradicionalno ne dimijo, posledično imajo končni izdelki bolj polno aromo zrelega mesa in slanine. Ostali deli Slovenije imajo manj ugodne razmere za sušenje salam, zato brez dimljenja v naravnih razmerah ne gre (Gašperlin in Polak, 2010).
Dim mora biti pridobljen s pridušenim sežigom trdega lesa, vedno pogosteje pa se uporablja tudi tekoči dim, ki v primerjavi s klasičnim dimom ne vsebuje toliko zdravju škodljivih komponent. Prekajevati je potrebno s hladnim dimom pri temperaturi do 25 °C, saj previsoke temperature (npr. nad 40 °C) uničijo encime v nadevu, brez katerih salama ne more zoreti, zato ni primerne senzorične kakovosti (Gašperlin in Polak, 2010).
2.1.5 Uporaba in vpliv plesni v proizvodnji sušenih mesnin
Za nekatere vrste salam je značilno, da jih prekrivajo plesni. Pri klasični tehnologiji se v prvih dneh zorenja le-te naselijo iz okolja, vendar je velika verjetnost, da se pojavijo tudi neželene plesni, ki so lahko zdravju škodljive (tvorba toksinov) (Gašperlin in Polak, 2010).
V industrijskih razmerah se zato, predvsem v južnoevropskih državah (Ockerman in Basu, 2015), na salame aplicirajo starterske kulture netoksigenih plesni (Gašperlin in Polak, 2010). To izvajajo s potapljanjem ali s škropljenjem. Te kulture plesni zavirajo rast naravno prisotnih plesni in posledično zmanjšujejo tveganje za nastanek mikotoksinov (Ockerman in Basu, 2015), ščitijo pa tudi pred drugimi patogenimi in neželjenimi mikroorganizmi (kvarljivci) (Sonjak in sod., 2011).
Plesni s svojim encimskim delovanjem prispevajo k razvoju specifične arome in okusa sušenih mesnin, predvsem z razgradnjo lipidov in proteinov. Zaradi porabe kisika, delujejo tudi antioksidativno, prispevajo k barvi in senzoričnim lastnostim, preprečujejo prekomerno sušenje površine, izboljšajo teksturo in s svojim proteolitičnim delovanjem preprečijo prekomerno trdoto zorjenih izdelkov (Pizzolato in sod., 2018).
Zaradi podaljšanega zorenja in sušenja teh izdelkov je končna vrednost pH običajno višja (pH > 5,5), četudi je po fermentaciji nižja, saj plesni lahko izkoriščajo mlečno kislino in tvorijo amoniak. Posledično mora biti končna vodna aktivnost dovolj nizka za konzerviranje (Ockerman in Basu, 2015).
Iacumin in sod. (2009) so povzeli, da kljub razlikam v sestavi mikrobiote italijanskih salam, prevladujejo plesni rodu Penicillium. Za prekritje in zorenje teh klobas so še zlasti odgovorne plesni vrste Penicillium nalgiovense in v manjši meri plesni vrste Penicillium chrysogenum. Oba seva sta skrbno izbrana in se trenutno uporabljata kot starterski kulturi za izboljšanje in standardizacijo kakovosti (Iacumin in sod. 2011) ter zagotavljane varnosti končnega izdelka (Iacumin in sod., 2009). Če uporabljeni sevi niso skrbno izbrani, ali če med samo proizvodnjo izdelka ne nadzorujemo njihove rasti, se lahko razvijejo neželene plesni (Sonjak in sod., 2011), tudi toksigene, zlasti iz rodov Aspergillus in Penicillium (Delgado in sod., 2015).
2.1.6 Sušenje in zorenje
V Evropi se temperature sušenja/zorenja gibljejo med 5 in 26 °C, pri čemer se v sredozemskem območju uporabljajo nižje temperature, v Severni Evropi pa višje (Ockerman in Basu, 2015), zato salame delimo na klasično sušene in hitro fermentirane.
Uporablja se tudi prepihovanje zraka s hitrostjo 1 m/s. Rezultat tega je končni izdelek z vodno aktivnostjo < 0,90 (Ockerman in Basu, 2015).
2.1.6.1 Klasično sušene salame
Po Pravilniku o kakovosti… (2017) so klasično sušene salame izdelane brez pospeševalcev zorenja, proces sušenja in zorenja je klasičen (počasen) in poteka pri nizkih temperaturah (do 16 °C). Lahko so dimljene ali nedimljene ter poraščene s plemenito plesnijo, vonj in okus pa sta značilna glede na vrsto uporabljenega mesa in brez kislih priokusov. H klasično sušenim salamam sodijo npr. zimska salama, želodec in suha klobasa.
Sušenje/zorenje salam lahko poteka v sušilnicah z naravno klimo, pogosteje pa v zorilnih komorah, ki omogočajo nastavitev in kontrolo zorilnih parametrov (temperatura, vlažnost in kroženje zraka). Nadev svežih salam je občutljiv za kvar, zato mora postopek sušenja/zorenja na začetku potekati počasi pri temperaturi do največ 14 °C, nato pa se lahko s povečano stopnjo osuška počasi dviga. Vlaga mora na začetku sušenja znašati 85- 90 %, nato pa se počasi zniža na 70 %. Salame je potrebno stalno opazovati in vlago ter kroženje zraka prilagajati, da se salame prehitro ne zasušijo, oziroma nasprotno, da površina ne postane vlažna, lepljiva ali plesniva (razen pri salamah z žlahtno plesnijo).
Prenizka vlaga in premočno prezračevanje, zlasti v prvih dneh sušenja, lahko povzročijo pretirano izsuševanje površine, kar prepreči prehajanje vode in nepravilno zorenje. Pojavi se trd zunanji rob in mehka, gnecava notranjost salame. Proces zorenja ustavijo tudi prenizke temperature, blizu ali pod 0 °C. Za pravilno uravnavanje parametrov so zato potrebne izkušnje, še posebej pri salamah z večjim premerom. Čas sušenja/zorenja salam je namreč odvisen od njihovega premera in tudi od temperaturnih in drugih razmer v sušilnici. Najtanjše klobase so zrele v treh do štirih tednih, salame pa, glede na njihov premer, v šestih do desetih tednih ali celo kasneje (Gašperlin in Polak, 2010).
2.1.6.2 Hitro fermentirane salame
Hitro fermentirane salame se izdeluje s pospeševalci zorenja (npr. glukono-delta lakton, starterske kulture) (Gašperlin in Polak, 2010), v primerjavi s klasično sušenimi salamami proces sušenja in zorenja poteka pri višjih temperaturah krajši čas. Prav tako so lahko dimljene ali nedimljene ter poraščene s plemenito plesnijo. Možen je kisel priokus. Najbolj poznana je čajna salama (Pravilnik o kakovosti …, 2017).
Z dodatkom starterskih kultur ali glukono-delta laktona se v začetni fazi hitro zniža vrednost pH nadeva (Gašperlin in Polak, 2010) na 4,6 do 5 (Gašperlin in Polak, 2009), da se zagotovi mikrobiološko varnost salam pri bistveno višjih temperaturah sušenja/zorenja (nad 16 °C) (Gašperlin in Polak, 2010), namreč višja kot je temperatura fermentacije in aktivnost vode, hitrejša je tvorba mlečne kisline (Ockerman in Basu, 2015). Čas zorenja je zato krajši, izdelek pa je drugačen predvsem po teksturi in aromi, v kateri prevladuje kiselkasta komponenta (Gašperlin in Polak, 2010).
Salame se običajno šest dni suši v osuševalni komori, sedmi dan pa se prestavijo v zorilno komoro. Trajanje zorenja je omejeno z osuškom, običajno so primerno zrele, ko se osušijo za okoli 35 % (Gašperlin in Polak, 2010).
2.1.7 Shranjevanje zrelih salam
Salame imajo pogosto dolgo obstojnost zaradi dodane soli, sušenja (zmanjšanje vodne aktivnosti) nitrita in/ali nitrata in nizke vrednosti pH zaradi mlečne kisline (Ockerman in Basu, 2015). Priporočljivo je, da se skladiščijo zavite (vakuumsko pakiranje, pakiranje v celofan ali druge primerne folije) pri temperaturi do največ 15 °C in vlagi okrog 70 %. V takih razmerah se salame sušijo in zorijo naprej, njihova kakovost pa se, čeprav počasneje, slabša. V primeru daljšega skladiščenja salame zamrznemo, vendar le za nekaj mesecev, da slanina ne postane žarka. Ovitek salam mora biti po zorenju suh in nepoškodovan (Gašperlin in Polak, 2010).
2.2 MIKOTOKSINI
Mikotoksini so sekundarni presnovki plesni, ki so škodljivi za ljudi in živali. Imajo rakotvorne, imunološke, alergene, nefrotoksične, hepatotoksične, imunosupresivne, mutagene, estrogene in teratogene učinke, odvisno od stopnje izpostavljenosti. Glavni viri mikotoksinov so kmetijske kulture, začimbe, meso in mesni izdelki ter mleko in mlečni izdelki. Med najpomembnejše mikotoksine spadajo aflatoksini in ohratoksin A, ki letno povzročajo milijonske izgube. Posledično so toksigene plesni pritegnile veliko pozornosti na področju živilske industrije. Negativne učinke izpostavljenosti mikotoksinom lahko omilimo z agrikulturnimi znanji in primerno pridelavo, predelavo in skladiščenjem izdelkov (Pizzolato in sod., 2018).
Mednarodna agencija za raziskave raka (IARC) mikotoksine uvršča v skupino 1 (kancerogeni za človeka), v skupino 2B (mogoče kancerogeni za človeka) in v skupino 3 (nerazvrščeni glede na kancerogenost) (IARC, 2012). Večina teh toksinov ima sorazmerno malo molekulsko maso, so toplotno in na splošno kemijsko zelo stabilni, kar dokazujejo povišane ravni bioakumulacije. Identificiranih je bilo več kot 400 vrst mikotoksinov, vendar jih je v živilih najpogostejših le 10 do 15, z aflatoksini, ohratoksini, deoksinivalenolom, nivalenolom, T-2 toksinom, fumonizini, patulinom, zearalenonom in trihoteceni kot najpogostejšimi (Turner in sod., 2015).
Mikotoksini lahko v preskrbovalno verigo s hrano vstopijo z neposredno ali posredno kontaminacijo. Do kontaminacije kmetijskih pridelkov (npr. koruze, pšenice ali ječmena) s toksigenimi plesnimi rodu Fusarium lahko pride že na polju. To se zgodi zaradi žuželk, parazitov in drugih prenašalcev, ki lahko prenašajo spore plesni iz okolja, pa tudi zaradi okoljskih dejavnikov, kot so nevihte in vlaga, ki škodujejo kulturam. Mikotoksini se lahko
pojavijo tudi po spravilu, med predelavo in skladiščenjem zrnja ali krme, če ni zagotovljena ustrezna temperatura in vlaga skladiščenja. To omogoča rast toksigenih plesni rodov Aspergillus in Penicillium (Pizzolato in sod., 2018).
Mikotoksini se pri živalih, ki so krmljene s kontaminirano krmo, lahko prenesejo v mleko, jajca in meso (Markov in sod., 2013). Tako lahko proizvodi živalskega izvora prispevajo k vnosu mikotoksinov pri ljudeh kot posledica posrednega prenosa zaradi kontaminirane krme (ang. carry-over effect) ali pa zaradi neposredne kontaminacije s plesnimi, npr. iz kontaminiranih mešanic začimb, ki se uporabljajo v predelavi mesa (Dall'Asta in sod., 2010). Vnos mikotoksinov pri ljudeh je torej posledica zaužitja kontaminiranih rastlinskih proizvodov, pa tudi proizvodov živalskega izvora (Pizzolato in sod., 2018).
Čeprav je mikotoksine iz prehrane ljudi težko popolnoma izločiti, je mogoče s strogim programom monitoringa zmanjšati tveganje za izpostavljenost. Spremljanje mikotoksinov v krmi je še posebej pomembno, saj ne samo, da ščiti živali, ampak tudi preprečuje prenos mikotoksinov v prehrano ljudi (Abd-Elghany in Sallam, 2015).
2.2.1 Aflatoksini
Pomembno skupino mikotoksinov predstavljajo aflatoksini (AF) (Pleadin in sod., 2015), ki jih tvorijo plesni rodu Aspergillus, predvsem plesni vrst A. flavus, A. parasiticus, A.
parvisclerotegenus in A. minisclerotigenes, redkeje pa plesni vrste A. nomius. Običajno plesni vrste A. flavus tvorijo samo AF tipa B, medtem ko druge vrste plesni rodu Aspergillus tvorijo tipa B in G (Pizzolato in sod., 2018). Te plesni so razširjene po vsem svetu in lahko uspevajo v različnih živilskih izdelkih (Turner in sod., 2015).
AF so zelo toksični, teratogeni, mutageni in kancerogeni (EFSA, 2004; IARC, 2012).
Aflatoksin B1 (AFB1) je dokazano najbolj strupen (EFSA, 2004). IARC ga uvršča v skupino 1 kot rakotvornega za človeka, saj povzroča raka na jetrih in drugih organih sesalcev (IARC, 2012). Izpostavljenost AFB1 pri ljudeh je povezana predvsem z uživanjem kontaminirane koruze, arašidov, sirka, kokosa, riža, indijskega oreška, lešnikov, orehov, pistacij in mandljev. Pri živalih, krmljenih s kontaminirano krmo, lahko rezidue AFB1
pričakujemo tudi v mesu in mesnih izdelkih. H kopičenju AFB1 so najbolj nagnjena jetra, tako da je posredno kontaminacijo mesnih izdelkov z AFB1 najbolj verjetno pričakovati v izdelkih iz drobovine (npr. jetrne klobase). Vendar pa ne smemo v celoti izključiti možnosti kontaminacije drugih surovin, kot so meso in druga drobovina (npr. ledvice, pljuča in srce) (Pleadin in sod., 2015). Metabolit aflatoksina B1 je tudi aflatoksin M1, ki se pojavlja v mleku in mlečnih izdelkih kot posledica vnosa krme kontaminirane z AFB1
(EFSA, 2004).
2.2.2 Ohratoksin A
Ohratoksin A (OTA) tvorijo sevi rodov Aspergillus in Penicillium. Najbolj odgovorne za pojav OTA v živilskih izdelkih so plesni vrste A. ochraceus, druge so še A. carbonarius, A.
westerdijkiae, A. steynii, A. niger ter P. verrucosum in P. nordicum (Pizzolato in sod., 2018). Tudi pri OTA lahko pride do neposredne kontaminacije s plesnijo na površini izdelkov ali do posrednega prenosa iz kontaminirane krme v meso. Med rejnimi živalmi so na kopičenje OTA še posebej občutljivi prašiči, medtem ko ga prežvekovalci lahko razgradijo v vampu. Porazdeli se v različna tkiva, največ v ledvice, pa tudi v jetra, mišice in maščobo (Pietri in sod., 2006).
Prisotnost OTA v živilih je vsekakor nezaželena, saj ga je IARC uvrstil med možne rakotvorne za ljudi, v skupino 2B (IARC, 2012). Imel bi naj teratogene, nevrotoksične, genotoksične, hepatotoksične, imunotoksične in nefrotoksične lastnosti, pojavlja pa se tudi kot možen vzrok balkanske endemične nefropatije, za katero je značilna progresivna ledvična fibroza in tumorji sečil (Iacumin in sod., 2009).
2.2.3 Mikotoksini v sušenih mesninah
Okoljske razmere v prostorih za proizvodnjo salam so zelo primerne za rast plesni na površini izdelkov. Te izvirajo iz zraka ter iz sušilnih in zorilnih komor (Iacumin in sod., 2009), njihova sestava pa je običajno kompleksna. Plesni lahko izboljšajo aromo, okus, teksturo in videz izdelka, vendar je potreben strogi nadzor temperature in relativne vlažnosti med sušenjem in zorenjem (Markov in sod., 2013), saj lahko ob neupoštevanju dobre proizvodne prakse pride do znatne rasti plesni, predvsem plesni rodov Penicillium, Aspergillus, Scopulariopsis in Alternaria, te pa so potencialno toksigene. Njihovo rast lahko omejimo z nanosom ustreznih starterskih kultur (Iacumin in sod., 2009). V Evropi se uporabljajo predvsem plesni rodu Penicillium (Markov in sod., 2013).
Relativna prevalenca sevov plesni na površini izdelkov je odvisna od vrste sušene mesnine, območja predelave in tehnoloških parametrov. Ti parametri vključujejo temperaturo in relativno vlažnost med sušenjem in zorenjem ter vodno aktivnost (Iacumin in sod., 2009) in vrednost pH izdelkov (Pizzolato in sod., 2018).
Za sušene mesnine je značilna nizka vodna aktivnost, visoka vsebnost soli in hranil ter nevtralna do nizka vrednost pH. To so parametri, ki za rast ustrezajo kserofilnim vrstam plesni, sprememba vodne aktivnosti v izdelkih pa lahko vpliva na pospešeno biosintezo mikotoksinov (Pizzolato in sod., 2018). Tvorbo mikotoksinov v mesu in mesnih izdelkih še spodbuja prisotnost kisika, temperatura med 4 in 40 °C, vrednost pH med 2,5 in 8,0 (z optimalno vrednostjo med 5,0 in 8,0), najnižja aktivnost vode 0,80 in največja koncentracija soli 14 % (Iacumin in sod., 2009).
V sušenih mesninah so najpogosteje prisotne plesni rodov Penicillium in Aspergillus (Markov in sod., 2013). Potrebna je previdnost, saj se uporabljajo tudi kot starterske kulture, ob nepravilni uporabi pa lahko tvorijo mikotoksine (Pizzolato in sod., 2018). Vrste rodu Aspergillus so pogosti kontaminanti v živilih v subtropskih in tropskih državah in običajno potrebujejo višje temperature za optimalno rast. Ker proizvodnja sušenih mesnin poteka pri nižjih temperaturah, so plesni rodu Aspergillus izolirane redkeje kot plesni rodu Penicillium (Sonjak in sod., 2011).
Sonjak in sod. (2011) so proučevali površinsko mikrobioto treh vrst slovenskih sušenih mesnin (sušeni svinjski vrat v ovitku, prekajena sušena šunka in salame). Plesni rodu Penicillium so predstavljale večji del površinske mikrobiote vseh treh sušenih mesnin. To ni presenetljivo, saj so številne vrste tega rodu psihrotolerantne/psihrofilne, sušenje/zorenje vseh treh proizvodov pa je potekalo pri temperaturah večinoma okoli 16-18 °C. Izoliranih je bilo sedem vrst plesni rodu Penicillium. Salame so imele drugačen izgled od drugih dveh izdelkov, z njihove površine pa so bile izolirane le štiri vrste plesni rodu Penicillium in kvasovke (Sonjak in sod., 2011).
Najpogosteje izolirane plesni so bile P. nordicum, ki so bile pridobljene iz vseh treh sušenih mesnin. Druga najpogostejša vrsta je bila P. nalgiovense, ki je bila izolirana samo iz salam. Ostale so še bile plesni vrst P. “milanense” (začasno poimenovana nova vrsta povezana s P. olsonii ali P. lanosum) in P. polonicum. Plesni vrst P. brevicompactum in P.
olsonii so bile izolirane samo iz sušenega svinjskega vratu in prekajene šunke, P.
chrysogenum pa samo iz šunke. Salame so bile proizvedene v ločeni zgradbi, kar je lahko vzrok za manjšo kontaminiranost z drugimi plesnimi. Fizikalno-kemijske razmere za proizvodnjo salam so bile naklonjene rasti plesni vrste P. nalgiovense, čeprav njihova rast ni omejila poznejše obsežne rasti plesni vrste P. nordicum (Sonjak in sod., 2011).
Vrste plesni rodov Eurotium, Aspergillus in Cladosporium so bile izolirane samo iz sušenega svinjskega vratu v ovitku in prekajene šunke. Vsi izolati rodu Aspergillus so bili identificirani kot A. versicolor. Med vrstami, ki so jih izolirali, lahko tvorijo mikotoksine A. versicolor, P. brevicompactum, P. chrysogenum, P. nordicum in P. polonicum (Sonjak in sod., 2011), vendar prisotnosti mikotoksinov niso preverjali.
Med različnimi mikotoksini, ki lahko kontaminirajo suhomesnate izdelke sta, glede na pojavnost in toksične učinke, daleč najpomembnejša OTA in AFB1. Za pomembnejše mikotoksine v sušenih mesninah se štejejo še aflatoksini B2, G1 in G2 (Pizzolato in sod., 2018).
Markov in sod. (2013) so v študiji izvedeni na Hrvaškem dokumentirali, da je bil prevladujoči mikotoksin v sušenih mesninah OTA. Odkrili so ga v 54 % vzorcih, v povprečju med 0,84 in 3,51 µg/kg. Koncentracije OTA v zimskih salamah so bile bistveno
višje od vseh drugih vrst sušenih mesnin, najvišja je znašala 7,83 µg/kg. AFB1 je bil prisoten v 6 od 50 vzorcev. Najvišji koncentraciji, 2,7 in 3,0 µg/kg, so določili v vzorcih zimske in čajne salame. Dejstvo, da so najvišje koncentracije mikotoksinov vsebovali komercialni vzorci salam, poudarja pomen higienskega nadzora v zorilnih komorah.
Poročali so še, da so plesni bile prisotne v le malo vzorcih, koncentracije mikotoksinov v teh vzorcih pa so bile pod mejo določljivosti, kar potrjuje, da rast plesni ne pomeni nujno tudi prisotnosti mikotoksinov. Domnevajo, da so plesni iz ostalih izdelkov bile odstranjene (Markov in sod., 2013).
Dall'Asta in sod. (2010) so preverili vsebnost OTA v 110 vzorcih sušenih stegen iz italijanskih trgovin. 84 vzorcev je vsebovalo OTA na površini izdelka s srednjo vrednostjo 0,53 µg/kg in 32 vzorcev v najglobljih plasteh izdelka v koncentracijah pod 0,1 µg/kg (Dall'Asta in sod., 2010).
Iacomin in sod. (2009) so raziskovali prisotnost plesni in OTA v salamah iz severne Italije.
Najpogosteje identificirane so bile plesni vrst P. nalgiovense, P. oxalicum, Eurotium amstelodami, P. olsonii, P. chrysogenum, P. verrucosum, P. viridicatum in Eupenicillium crustaceum. Plesni vrste A. ochraceus so bile odkrite samo v eni proizvodni seriji.
Pričakovano so detektirali plesni vrst P. nalgiovense in P. chrysogenum, saj obe vrsti veljata za tipične starterske kulture. Plesni vrste P. nalgiovense so v Italiji glavna starterska kultura v proizvodnji salam, zato so jo odkrili na površini vseh analiziranih industrijskih salam. Je pa bila ta vrsta izolirana samo iz 40 % obrtniških salam, kjer starterskih kultur ne uporabljajo. Kljub temu je bil odstotek industrijskih salam, v katerih je bila količina OTA višja od meje zaznavnosti, večji kot pri obrtnih, kar kaže, da uporaba starterske kulture ni omejila rasti mikotoksigenih plesni. To je lahko posledica spremenljivosti razmer in odsotnosti preverjanja kakovosti v celotnem proizvodnem ciklu. V Italiji ni nič nenavadnega, da v isti sušilni komori sušijo več serij salam različnih starosti, kar otežuje vzdrževanje ustreznih razmer, kot sta relativna vlaga in temperatura, to pa pogosto povzroči nenormalno rast mikotoksigenih in ne-mikotoksigenih plesni na površini salam, kljub uporabi starterskih kultur (Iacumin in sod., 2009).
Približno 45 % vzorcev je bilo pozitivnih na prisotnost OTA. Na ovoju preiskovanih salam sta bili najnižji in najvišji koncentraciji 3 oziroma 18 µg/kg. Bistvenih razlik v koncentraciji OTA med obrtnimi in industrijskimi salamami ni bilo. Ugotovili so, da so za velike koncentracije OTA (> 1 µg/kg) na površini salam, najbolj odgovorne mikotoksigene plesni vrst P. verrucosum in P. nordicum. Plesni vrste P. verrucosum so izolirali v 63 od 72 OTA-pozitivnih salam, Penicillium nordicum pa v 35 salamah. S ščetkanjem in pranjem salam so koncentracijo OTA zmanjšali pod mejo zaznavnosti (Iacumin in sod., 2009).
Zanimivo je, da v notranjosti salam OTA ni bil prisoten. To nakazuje, da presno meso ni vsebovalo OTA ter, da le-ta ni prehajal skozi ovitek v nadev. Plesni bi naj namreč
mikotoksine tvorile le na ovitku salam, ne pa tudi v notranjosti, kjer jim rast preprečuje pomanjkanje kisika. Do prisotnost mikotoksinov v notranjosti tako lahko pride, če se uporablja kontaminirana surovina ali ovitek, ki omogoča difuzijo od zunaj (Iacumin in sod., 2009).
Iacomin in sod. (2009) so zaključili, glede na to, da OTA niso zaznali v notranjosti izdelkov, da lahko odstranjevanje plesni s površine salam tveganje za zdravje omeji ali odpravi. V Italiji potrošniki raje kupujejo salame brez površinske plesni, zato jih proizvajalci z različnimi metodami odstranjujejo. Običajno po odstranitvi plesni s ščetkanjem, pranjem ali z zrakom pod tlakom na površino zorjenih salam nanesejo riževo moko (Iacumin in sod., 2009).
Iz prejšnje študije lahko sklepamo, da je kritična točka, ki spodbuja kontaminacijo s plesnimi ter tvorbo in kopičenje mikotoksinov, poleg vodne aktivnosti in temperature, tudi poškodba ovitka. Te so pogoste, zlasti ko gre za domačo izdelavo, pa tudi v industrijski proizvodnji in/ali skladiščenju. Do poškodb pride zaradi pomanjkanja izvajanja sistema HACCP, neustreznega ravnanja z izdelki med čiščenjem ali vzdrževanjem, lokaliziranega tanjšanja notranjosti ovitka (črev) med čiščenjem, kar kasneje predstavlja mesto z nizko odpornostjo, ki je nagnjeno k pritiskom med polnjenjem, pa tudi zaradi naključne škode, ki je povzročena iz različnih razlogov (Pleadin in sod., 2015).
Pleadin in sod. (2015) so raziskovali vpliv poškodbe ovitka na tvorbo AFB1 v šestmesečnem obdobju zorenja salam. Pri vzorcih brez poškodb v celotnem proizvodnem procesu niso odkrili kontaminacije z AFB1. V vzorcih s poškodovanim ovitkom so v 5.
mesecu zorenja določili koncentracijo 1,62-2,15 µg/kg (3/9 vzorcev), kar kaže na zgodnjo tvorbo AFB1. V 6. mesecu zorenja so pri vzorcih s poškodovanim ovitkom (7/9 vzorcev) opazili statistično značilno višjo raven AFB1, ki se je gibala med 2,30-4,49 µg/kg (p <
0,05). Rezultati so pokazali, da lahko v daljšem obdobju zorenja poškodbe ovitka povzročijo kontaminacijo salam z AFB1, verjetno zaradi difuzije mikotoksina s površine izdelka v njegovo notranjost (Pleadin in sod., 2015).
Zdi se, da razpoke ustvarjajo nekakšne niše za spore plesni in zagotavljajo primerno mikroklimo, ki spodbuja rast plesni in tudi poznejšo tvorbo sekundarnih metabolitov. Da se zmanjša tveganje za kontaminacijo končnih izdelkov z mikotoksini, je potrebno izvajanje načel sistema HACCP med celotnim postopkom proizvodnje salam, ohranjanje ovitka in odstranjevanje plesni s površine mesnih izdelkov (Pleadin in sod., 2015).
2.2.3.1 Zakonodaja o mikotoksinih v sušenih mesninah
Koncentracije mikotoksinov, kot so AF in OTA, se v sušenih mesninah v različnih državah razlikujejo. To upravičuje potrebo po izvajanju določenih nadzornih normativov, da bi
zmanjšali tveganja, ki so posledica uživanja teh izdelkov (Pizzolato in sod., 2018).
Evropska komisija je z Uredbo EU 1881/2006 določila mejne vrednosti nekaterih onesnaževal v živilih, vključno z mikotoksini (Uredba komisije … 2006), vendar mejne vrednosti za mikotoksine v mesu ali mesnih izdelkih niso določene (Markov in sod., 2013).
Kljub pomanjkanju uradnih standardov za mesne izdelke obstajajo predpisi za mikotoksine v rastlinskih živilih, kar nekako posredno prispeva k varnosti mesnih izdelkov (Pizzolato in sod., 2018). Mejo za OTA v svinjini in izdelkih iz nje pa so z direktivo določili v Italiji, in sicer znaša 1 µg/kg (Direttiva in materia …, 1999).
2.2.4 Metode za določanje plesni in mikotoksinov v sušenih mesninah 2.2.4.1 Določanje plesni
Razpoložljivost hitrih, preprostih in ekonomičnih metod za monitoring toksigenih plesni je med postopki zorenja suhomesnatih izdelkov ključnega pomena za zmanjšanje tveganja kontaminacije z mikotoksini (Pizzolato in sod., 2018). Trenutne metode za odkrivanje toksigenih plesni temeljijo predvsem na izolaciji mikrobov in poznejši identifikaciji z morfološkimi metodami in metodami z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) (Ferrara in sod., 2015).
Dobre metode za odkrivanje prisotnosti toksigenih plesni so tehnike, ki temeljijo na DNA, kot je kvantitativna PCR v realnem času (qPCR). Ta tehnika je specifična in zelo občutljiva, saj je DNA plesni mogoče zaznati v kompleksnih mešanicah (Rodriguez in sod., 2012). Z uporabo qPCR so določili in kvantificirali plesni, ki tvorijo AFB1, OTA in patulin v sušenem stegnu. Ugotovili so, da qPCR močno korelira z metodo štetja na ploščah in predstavlja zanesljivo in hitro metodo za kvantifikacijo toksigenih plesni, še preden te tvorijo mikotoksine (Rodriguez in sod., 2012).
Za zgodnje odkrivanje rasti plesni in razlikovanje med toksigenimi in netoksigenimi sevi se uporablja tudi analiza hlapnih spojin. Ker so hlapi realnih matriksov kompleksni, jih je potrebno oceniti kot celoto z uporabo metode e-nosu, ki temelji na nespecifičnih senzorjih.
Metoda je hitra, preprosta in poceni. Lippolis in sod. (2016) so razvili metodo z uporabo e- nosu, s katero so uspešno razlikovali vzorce sušenih mesnin kontaminiranih s sevi Penicillium, ki tvorijo OTA, od vzorcev s sevi Penicillium, ki OTA ne tvorijo.
Ferrara in sod. (2015) so razvili metodo za identifikacijo Penicillium nordicum z zanko posredovanim izotermalnim pomnoževanjem (LAMP). LAMP je uporaben, ker ni potrebna gelska elektroforeza za določitev produktov in draga laboratorijska oprema. Njegova občutljivost za tarčno plesen in majhna občutljivost za nečistoče nudi možnost neposredne uporabe na sušenih mesninah med proizvodnimi fazami, brez da bi bili potrebni dragi in časovno zamudni dodatni postopki obdelave. LAMP daje podatke samo o prisotnosti
tarčne plesni, ne pove pa nam nič o prisotnosti mikotoksinov, zato je uporaben kot preliminarni test za pregled večjega števila vzorcev, s čimer zmanjšamo število dražjih analiz za oceno kontaminacije z OTA (Ferrara in sod., 2015).
2.2.4.2 Določanje mikotoksinov
Za odkrivanje in identifikacijo mikotoksinov v živilih se uporabljajo številne analitske metode, vključno z imunoencimskimi testi (ELISA), tankoplastno kromatografijo (TLC), plinsko kromatografijo z detektorjem na zajetje elektronov (GC-ECD), plinsko kromatografijo z masno spektrometrijo (GC-MS), tekočinsko kromatografijo s tandemsko masno spektrometrijo (LC-MS-MS) in tekočinsko kromatografijo ultra visoke ločljivosti (UHPLC) s fotodiodnim detektorjem (PDA) (Sun in sod., 2015). Metoda ELISA ima zaradi visoke specifičnosti, enostavnosti uporabe, nizkih stroškov, varnih reagentov in zmožnosti hitrih analiz večjega števila vzorcev prednost pred drugimi metodami za določanje AFB1. Pomanjkljivost metode je omejen obseg zaznavanja, ki je posledica ozkega obsega občutljivosti protiteles (Pleadin in sod., 2015). Iacumin in sod. (2009) so vsebnost OTA v salamah določili z uporabo metode ELISA in nato za potrditev rezultatov še s HPLC. Ugotovili so, da se podatki dobljeni z metodo ELISA niso statistično razlikovali od podatkov dobljenih s HPLC (p > 0,05). Rodriguez in sod. (2012) so AFB1, OTA in patulin v sušenih stegnih določali s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z masno spektrometrijo (HPLC-MS). Dall'Asta in sod. (2010) so v sušenih stegnih, sveži svinjini in v salamah določali OTA s tekočinsko kromatografijo s fluorescenčnim detektorjem (HPLC-FLD).
2.2.5 Preprečevanje rasti plesni in tvorbe mikotoksinov v sušenih mesninah
Za preprečevanje pojava mikotoksinov med proizvodnjo sušenih mesnin je ključno preprečevanje rasti toksigenih plesni. Rast plesni je v večini živil mogoče učinkovito nadzorovati s kemičnimi konzervansi ali s pakiranjem v modificirano atmosfero (Nunez in sod., 2015). Protimikrobna sredstva, ozon in gama sevanje so še druge učinkovite metode, ki se uporabljajo v ta namen (Pizzolato in sod., 2018). Te metode pa niso primerne za suhomesnate izdelke, saj je aktivnost plesni bistvena za njihove senzorične lastnosti, poleg tega lahko kemični fungicidi v mesu puščajo rezidue, ki pa so za potrošnike nesprejemljivi (Nunez in sod., 2015).
Pri suhomesnatih izdelkih je rast plesni strogo odvisna od uporabljenega tehnološkega procesa. Najboljše metode za omejevanje rasti toksigenih plesni na površini salam so nadzorovanje temperature in relativne vlage med sušenjem in zorenjem, pa tudi skrben izbor zaščitnih starterskih kultur (Iacumin in sod., 2009). Pomembno je tudi ohranjanje ovitka in odstranjevanje plesni s površine izdelkov (Pleadin in sod., 2015).
Alternativa kemijskim in fizikalnim metodam so biološke metode, ki temeljijo na kompeticijskem izključevanju toksigenih plesni z antagonističnimi mikroorganizmi (plesni, kvasovke in bakterije). Čeprav je najpogostejši način delovanja teh mikroorganizmov konkurenca za hranila in prostor, lahko nekateri izmed njih tvorijo spojine, ki delujejo proti neželenim plesnim (Pizzolato in sod., 2018).
2.2.5.1 Mlečnokislinske bakterije
Prevladujočo mikrobno populacijo med proizvodnjo salam sestavljajo plesni, kvasovke in mlečnokislinske bakterije (LAB). Zadnje se v nadev pogosto dodajajo kot starterske kulture na ravni približno 5-6 log CFU/g in lahko dosežejo več kot 7-8 log CFU/g na koncu proizvodnje salam (Alvarez in sod., 2019). Veliko število LAB, vključno s tistimi, ki se uporabljajo kot zaščitne kulture, velja za varne za prehrano, saj imajo status GRAS (Generally Recognised As Safe - splošno priznano kot varno) in/ali QPS (Qualified Presumption of Safety - kvalificirana predpostavka varnosti) ameriške FDA in evropske EFSA (Di Gioia in sod., 2016).
LAB, ki se pogosto uporabljajo kot sredstva za biokontrolo proti toksigenim plesnim, so v glavnem bakterije rodov Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc in Pediococcus.
Protiglivno delovanje pa je odvisno od posameznega seva določene vrste LAB (Alvarez in sod., 2019). Alvarez in sod. (2019) so ugotovili, da je prisotnost določenega seva Enterococcus faecium povzročila znatno zmanjšanje vsebnosti OTA, zaradi plesni vrste P.
nordicum po 21 dneh inkubacije salam, čeprav ni bilo opaziti zmanjšanja rasti plesni vrste P. nordicum. To je pomemben vidik pri omejevanju mikotoksinov v živilih, saj tvorba mikotoksinov ni nujno v korelaciji s hitrostjo rasti plesni. Sanchez-Montero in sod. (2019) so ugotovili, da plesni vrst P. nordicum in P. verrucosum tvorijo več OTA v sušenih mesninah v suboptimalnih razmerah rasti ter z dodajanjem ogljikovih hidratov (Sánchez- Montero in sod., 2019). Za različne vrste LAB, predvsem bakterij rodov Bifidobacterium in Lactobacillus, so opisali tudi zmožnost detoksifikacije OTA, v glavnem z encimsko razgradnjo ali z adsorpcijo na celične stene (Luz in sod., 2018).
2.2.5.2 Kvasovke
Tudi kvasovke so se izkazale za učinkovite pri zatiranju toksigenih plesni na salamah.
Konkurenca za hranila in prostor velja za glavni mehanizem delovanja, več jih je pokazalo tudi protiglivno aktivnost, povezano s hlapnimi spojinami ali z določenimi proteini. Poleg tega lahko kvasovke zmanjšajo vsebnost mikotoksinov z njihovo adsorpcijo na molekule celične stene, kot so gliko-manoproteini ali z blokado biosintetskih poti mikotoksinov. Ena od sposobnosti kvasovk za zaviranje konkurenčnih mikroorganizmov je tudi kopičenje alkohola (Nunez in sod., 2015). Protimikrobno delovanje alkoholov pripisujejo absorpciji v
celično membrano mikrobov, kar povečuje propustnost in pospešuje difuzijo metabolitov in esencialnih ionov skozi membrano (Ingram in Buttke, 1985).
Biokontrolna učinkovitost kvasovk je odvisna od vrste, njihove kolonizacije in preživetja v živilih, nanjo pa lahko vplivajo temperatura in relativna vlažnost zraka ter vrednost pH, vsebnost hranil in aktivnost vode v izdelku (Nunez in sod., 2015).
Debaryomyces hansenii, prevladujoča vrsta kvasovk med predelavo suhomesnatih izdelkov, je učinkovita pri zatiranju patogenih plesni, prispeva pa tudi k ustreznemu razvoju okusa sušenih mesnin (Nunez in sod., 2015). Nunez in sod. (2015) so raziskovali nekaj naravnih izolatov kvasovk vrste Debaryomyces hansenii, ki so primerni za biokontrolo toksigenih plesni v mesnih izdelkih. Protiglivni učinek v salamah so izkazali izolati, ki so se v izdelku lahko kolonizirali in prevladali z doseganjem visoke populacijske ravni, njihov protiglivni učinek pa je verjetno temeljil na aditivnih ali sinergističnih učinkih več inhibitornih dejavnikov (Nunez in sod., 2015).
2.2.5.3 Plesni
Tudi določene plesni lahko zavirajo rast toksigenih sevov. Proteini, ki jih izločajo nitaste glive, imajo precej zanimiv spekter inhibicije, saj zavirajo rast drugih plesni, medtem ko ne vplivajo na prokarionte in nimajo škodljivih vplivov na celice sesalcev (Acosta in sod., 2009). Število teh proteinov je precej omejeno na AFP (ang. antifungal protein) plesni vrste A. giganteus, protiglivni peptid imenovan Anafp (ang. a novel antifungal peptide) plesni vrste A. niger, protiglivni peptid AcAFP plesni vrste A. clavatus, NFAP (ang.
Neosartorya fischeri antifungal protein) plesni vrste Neosartorya fischeri ter protiglivni proteini imenovani PAF, PgAFP in Pc-Arctin plesni vrste P. chrysogenum (Delgado in sod., 2015).
PgAFP lahko zavira širok spekter plesni (Delgado in sod., 2015), vendar pa niso vse enako občutljive (Delagdo in sod., 2019). PgAFP ima močno zaviralno delovanje proti neželenim plesnim, vključno z glavnimi toksigenimi plesnimi rodov Aspergillus in Penicillium.
Prenaša večino proteaz, visoko temperaturo in širok razpon vrednosti pH. Na učinkovitost PgAFP lahko vplivajo značilnosti živila, kot so aktivnost vode, temperatura, kemijska sestava in mikrobna populacija. V salamah je učinkovito zaviral rast plesni vrst A. flavus in P. reststricum (Delgado in sod., 2015). Prednost inokulacije plesni, ki tvori PgAFP, je nenehno sproščanje le-tega, v nasprotju z dodatkom določene količine PgAFP (Delagdo in sod., 2019).
3 MATERIAL IN METODE
3.1 PRIPRAVA MODELNEGA SISTEMA
Vpliv kolagenske bariere (ovitka) na tvorbo mikotoksinov smo proučili na osnovi modelnega sistema za zorenje salam, tako da smo maso za salame nanesli v petrijevke.
Za pripravo mase smo uporabili svinjsko pleče (II. kategorija) (82 %) in hrbtno slanino (18
%). Dodali smo nitritno sol (2,4 %), sladkor (0,2 %) in bioprotektivno startersko kulturo B- LC-20 SafePro (bakterije vrste Pediococcus acidilactici, močan antagonist bakterij vrste Listeria monocytogenes, dodatek 25 g na 100 kg; Chr Hansen, Danska). Ostalih začimb (popra, česna, itd.), zaradi možne dodatne kontaminacije, nismo dodali.
Meso in slanino smo zmleli v volku skozi luknjačo premera 5 mm. Dodali smo nitritno sol, sladkor in startersko kulturo ter vse skupaj dobro premešali (2 min), nato pustili 10 min mirovati in ponovno premešali (2 min). Tako pripravljeno maso smo nanesli v petrijevke.
V vsako smo natehtali 30 g mase.
Iz kolagenskega ovitka, ki smo ga regenerirali v 18 % raztopini NaCl, smo izrezali kroge v velikosti petrijevk. Tako pripravljene kolagenske bariere smo položili na maso vzorcev v petrijevkah (32 petrijevk). Polovico kolagenskih ovitkov (16) na masi v petrijevkah smo v sredini prebodli z iglo.
Slika 1: Masa za salame brez ovitka Slika 2: Masa za salame prekrita s kolagensko bariero
Napolnili smo še 16 petrijevk, kamor smo namesto mase za salame razlili pripravljeno gojišče YES (Yeast Extract Sucrose Agar).
Tako smo dobili 4 različne skupine vzorcev:
1. gojišče YES (brez ovitka) 2. masa za salame (brez ovitka)
3. masa za salame s kolagenskim ovitkom
4. masa za salame s poškodovanim kolagenskim ovitkom
Poskus smo izvedli v dveh ponovitvah.
3.1.1 Nacepljanje plesni
V brezprašni komori smo na vse vzorce v petrijevkah nacepili plesen, ki tvori mikotoksin AFB1. Uporabili smo suspenzijo konidijev plesni vrste Aspergillus parasiticus ŽMJ7 (iz Zbirke mikroorganizmov Laboratorija za živilsko mikrobiologijo na Oddelku za živilstvo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani), ki je zrasla na gojišču MEA (12 dni pri 25
°C). Koncentracija konidijev v suspenziji je znašala 109 konidijev/mL. V petrijevke smo nanašali 10 µL suspenizije (107 konidijev). Nacepljali smo na sredino petrijevke in pri tem nastavek pipete zabodli v gojišče, oz. kapljico suspenzije spustili na maso za salame oz.
ovitek.
Polovico od vsake skupine vzorcev smo inkubirali pri temperaturi 25 °C, drugo polovico pa pri temperaturnem programu za salame (Preglednica 1).
Preglednica 1: Temperaturni program za zorenje salam
korak T (°C) RV (%) čas (h)
1 23 90 12
2 22 88 24
3 21 85 24
4 20 80 24
5 19 80 24
6 18 80 24
7 17 80 24
8 16 75 24
9 16 75 24
10 16 75 24
11 16 75 24
12 16 75 do konca
Slika 3: Shema priprave vzorcev (številke v oklepajih pomenijo število vzorcev)
Vzorce smo med inkubacijo vzorčili 4-krat, in sicer 4., 7., 14. in 21. dan inkubacije. Na dan vzorčenja smo iz obeh temperaturnih režimov za vsako skupino vzorcev vzeli dve petrijevki in jih zamrznili (-18 °C) do analize.
3.2 EKSTRAKCIJA AFLATOKSINA B1
Zamrznjene vzorce (vsebino petrijevke) smo v laminariju prenesli v neprepustne vrečke in dodali 35 mL ekstrakcijskega topila (80 % acetonitril z 0,5 % mravljične kisline) ter vrečke dobro zavarili. Pri vzorcih s kolagenskim ovitkom smo v eno vrečko prenesli maso in v drugo ovitek. Vrečke z gojišči smo za določitev mase gojišča stehtali. Vse vrečke z vzorci smo nato postavili v ultrazvočno kopel (60 min) in jih 24 ur pustili pri sobni temperaturi, da je potekala ekstrakcija mikotoksinov.
Tekočino iz vrečke smo prelili v plastične epruvete. V primeru, da je vzorec vseboval maso za salame, smo izvedli filtracijo skozi filter s črnim trakom in še le nato filtrat prelili v plastične epruvete. Vsebino epruvet smo zamrznili (-18 °C), da se je izločila maščoba in zamrznila voda. Mikotoksini bi naj bili prisotni v acetonitrilu, ki pri teh pogojih ne zmrzne.
Zamrznjene vzorce, iz katerih se je izločila maščoba, smo centrifugirali pri 10 000 vrtljajih na minuto, 10 minut. 5 mL zgornje faze (acetonitril) smo prenesli v srčaste bučke in topilo odparili na rotavaporju (BÜCHI Labortechnik AG, Švica), 5 min pri 135 mbar, 40 °C in 75
petrijevke (64)
gojišče (16) brez ovitka (16)
T25(8) TP(8)
masa (48)
brez ovitka (16)
T25(8) TP(8)
kolagenski ovitek (32)
brez poškodb (16)
T25(8) TP(8)
preluknjan (16)
T25(8) TP(8)
vrtljajih na minuto. Po odparevanju smo v bučko odpipetirali 3 mL 10 % acetonitrila in dobro premešali na vorteksu. Tako smo dobili vzorec, primeren za ekstrakcijo na trdni fazi (SPE).
3.2.1 Ekstrakcija na trdni fazi (SPE)
Za ekstrakcijo smo uporabili kolone ISOLUTE Myco 60mg/3mL (Biotage, Švedska).
Kondicionirali smo jih z 2 mL acetonitrila, nato sprali z 2 mL 10 mM amonijevega formata. Za ustrezen pretok mobilne faze smo uporabili vakuumsko črpalko. S stekleno kapalko smo na kolono nanesli ves predpripravljen vzorec (3 mL). Za prvo spiranje nevezanih spojin smo uporabili 3 mL 10 mM amonijevega formata, sledilo je drugo spiranje s 3 mL 15 % acetonitrila, nato smo kolono osušili pod vakuumom. Sledila je elucija mikotoksinov z 2 mL 0,5 % mravljične kisline v acetonitrilu v srčasto bučko.
Vzorce, ki so vsebovali meso in ovitek, smo hkrati s spiranjem prefiltrirali še skozi filter Phree Phospholipid Removal Solutions (Phenomenex, ZDA). Pri vzorcih gojišč to ni bilo potrebno.
Eluat smo odparili na rotavaporju (BÜCHI Labortechnik AG, Švica), uporabili smo program AcN (135 mbar) in Cont., do suhega. Po odparevanju smo dodali 200 µL 80 % acetonitrila z 0,5 % mravljične kisline ter dobro premešali na mešalniku. Ves vzorec iz bučke (200 µL) smo s pipeto prenesli v 2 mL injekcijsko brizgo in ga skozi najlonski filter (0,2 µm) prefiltrirali v HPLC viale z insertom.
3.3 DOLOČANJE AFB1 S HPLC
Vzorce v vialah smo analizirali s HPLC, kjer smo za mobilno fazo uporabili 0,15 mM amonijev fluorid.
Za izračun vsebnosti AFB1 iz podatkov za površine vrhov smo potrebovali umeritveno krivuljo. Za pripravo 6-točkovne umeritvene krivulje smo uporabili standard CRM46304 - Aflatoxin Mix (Supelco, Sigma-Aldrich, Misuri, ZDA). Koeficient determinacije (R2) umeritvene krivulje je znašal 0,9997. Pri izračunu vsebnosti AFB1 smo površino vrha za posamezen vzorec delili s smernim koeficientom umeritvene krivulje, ki je znašal 359702.
3.3.1 Ponovljivost metode
Standard CRM46304 - Aflatoxin Mix (Supelco, Sigma-Aldrich, Misuri, ZDA) smo uporabili tudi za preverjanje ponovljivosti metode določanja AFB1. Izvedli smo 5 ponovitev, relativni standardni odklon oz. koeficient variacije pa je znašal 4,13 %.
3.4 ANALIZA PODATKOV
Vse podatke, ki smo jih pridobili, smo uredili in analizirali s programom Microsoft Excel (Microsoft Office Home and Student 2019 in Microsoft Office 2007).
