David MLAKAR
PRODUKCIJA FRAGMENTOV PROTITELES V KVASOVKI Pichia pastoris S KONTINUIRNIM
BIOPROCESOM
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
Ljubljana, 2022
David MLAKAR
PRODUKCIJA FRAGMENTOV PROTITELES V KVASOVKI Pichia pastoris S KONTINUIRNIM BIOPROCESOM
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
PRODUCTION OF ANTIBODY FRAGMENTS IN YEAST Pichia pastoris IN A CONTINUOUS BIOPROCESS
M. SC. THESIS Master Study Programmes
Ljubljana, 2022
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje biotehnologije. Delo je bilo opravljeno na Katedri za materiale in polimerno inženirstvo (FKKT).
Študijska komisija je za mentorja magistrskega dela imenovala prof. dr. Aleša Podgornika
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Mojca NARAT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: prof. dr. Aleš PODGORNIK
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Oddelek za kemijsko inženirstvo in kemijsko varnost
Član: prof. dr. Polona JAMNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Datum zagovora:
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Du2
DK UDK 606:616-097.3:602.4:602.3:582.282.23(043.2)
KG kemostat, Pichia pastoris, fragment protiteles Fcab, afinitetna kromatografija, SDS-PAGE
AV MLAKAR, David dipl. mikrobiol.
SA PODGORNIK, Aleš (mentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Magistrski študijski program druge stopnje biotehnologije
LI 2022
IN PRODUKCIJA FRAGMENTOV PROTITELES V KVASOVKI Pichia pastoris S KONTINUIRNIM BIOPROCESOM
TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja) OP X, 55, [2] str., 9 pregl., 17 sl., 1 pril., 31 vir.
IJ sl JI sl/en
AI V današnjem času so protitelesa in fragmenti protiteles eni izmed najbolj pogostih in zaželenih biotehnoloških produktov, pri čemer je Pichia pastoris pogosto izbrana kot produkcijski organizem, saj gre za enega bolj preučenih mikroorganizmov z izredno dobrimi lastnostmi za industrijsko produkcijo. Pri načrtovanju bioprocesne sheme se pogosto osredotočamo na podoben vzorec korakov, vendar pa je za vsak proces potrebno razviti celovit, individualen pristop. Pri našem delu smo se zato posvetili individualnemu pristopu optimizacije gojenja kvasovke vrste Pichia pastoris na majhni bioreaktorski skali z namenom produkcije protitelesnih fragmentov Fcab. S spreminjanjem priprave inokuluma in načina inokulacije smo postopek standardizirali, s spreminjanjem pogojev gojenja, kot je stopnja redčenja, pa smo uspešno s kontinuirnim postopkom gojili kulturo, ki je ostala produkcijsko aktivna. Slednje smo dokazali z analizami izolatov produkta z metodo SDS- PAGE. Reverzibilna vezava fragmenta Fcab s proteinom A nam je omogočila uporabo afinitetne kromatografske metode tako za namen njihove izolacije, hkrati pa smo z rezultati lahko ocenili tudi končno koncentracijo produkta v bioreaktorju.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 606:616-097.3:602.4:602.3:582.282.23(043.2)
CX chemostat, Pichia pastoris, Fcab antibody fragment, afinity chromatography, SDS-PAGE
AU MLAKAR, David dipl. mikrobiol.
AA PODGORNIK, Aleš (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master Study Programme in biotechnology
PY 2022
TI PRODUCTION OF ANTIBODY FRAGMENTS IN YEAST Pichia pastoris IN A CONTINUOUS BIOPROCESS
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes) NO X, 55, [2] p., 9 tab., 17 fig., 1 ann., 31 ref.
LA sl AL sl/en
AB Antibodies and their fragments are considered as one of the most desirable biotechnological products. Pichia pastoris is one of the more studied microorganisms, with extremely good properties for industrial production, which is the reason why it is often selected as the production organism of choice for such complex products. When constructing a bioprocess scheme, we often follow the same rules, but still have to take an individual approach with each one, as no organism or product responses the same way to an adjustment. In our work we took this individual approach of optimization for our small-scale cultivation of Pichia pastoris, that produced Fcab antibody fragments. With changes to the inoculum preparation and inoculation process, we were able to standardize the start of the process. Adjustments of the parameters, such as the dilution rate, enabled the continuous growth of Pichia pastoris which maintained its productivity. This was proven with the isolation of Fcab from the fermentation broth at the end of several successive small-scale bioprocesses and their successful detection with SDS-PAGE. Additionally, to the isolation, we also used the resulting data of HPLC detectors, to calculate the estimated concentrations of Fcab fragments in each vessel at the end of each successful process.
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO PREGLEDNIC VII
KAZALO SLIK VIII
KAZALO PRILOG IX
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI X
1 UVOD 1
1.1 NAMEN IN POVOD DELA 1
2 PREGLED OBJAV 2
2.1 BIOPROCESNIŠTVO 2
2.1.1 Produkcija rekombinantnih proteinov 2
2.1.2 Produkcijski organizem 3
2.1.2.1 Fenotipi kvasovke Pichia pastoris 4
2.2 NAČRTOVANJE BIOPROCESA V KEMOSTATU 5
2.2.1 Celična rast 5
2.2.2 Spremljanje in vpliv koncentracije substrata 9
2.2.3 Vpliv koncentracije kisika 9
2.2.4 Vpliv temperature 10
2.2.5 Vpliv pH 10
2.2.6 Vpliv sodohranjevanja 11
2.3 PRODUKT 12
2.3.1 Fragmenti protiteles 13
2.4 IZOLACIJA IN DETEKCIJA PRODUKTA 15
2.4.1 Gelska izključevalna kromatografija (SEC) 15 2.4.2 Ionsko izmenjevalna kromatografija (IEX) 16 2.4.3 Afinitetna kromatografija (z vezanim proteinom A) 17
3 MATERIALI IN METODE 19
3.1 MATERIALI IN LABORATORIJSKA OPREMA 19
3.2 METODE 20
3.2.1 Priprava gojišč 20
3.2.1.1 Gojišče YPG 20
3.2.1.2 Gojišči BMGY in BMMY(Buffered Glycerol-complex Medium in
Buffered Methanol-complex Medium) 21
3.2.3 Bioreaktorski sistem 22
3.2.3.1 Sestava 22
3.2.3.2 Sterilizacija, postavitev in zagon 24
3.2.4 Kromatografija 25
3.2.4.1 Priprava pufrov 25
3.2.4.2 Kromatografija s protein A vezavno kolono 26
3.2.5 SDS-PAGE 27
4 REZULTATI IN RAZPRAVA 30
4.1 PREVERJANJE KULTURE IZ CELIČNE BANKE IN TESTIRANJE IZBRANIH METOD LOČEVANJA IN DETEKCIJE PRODUKTA
30
4.1.1 Produkcija na stresalnem inkubatorju 30
4.1.2 Čiščenje vzorca in izolacija produkta s protein A kolono 31 4.1.3 Preverjanje prisotnosti Fcab v izprani frakciji 32 4.2 PREVERJANJE DELOVANJA SISTEMA IN GOJENJA V
KEMOSTATU
33 4.3 OPTIMIZACIJA IN STANDARDIZACIJA PRIPRAVE
INOKULUMA IN NAČINA INOKULACIJE
35 4.3.1 Optimizacija inokuluma (test vpliva O2) 35
4.3.2 Optimizacija gojišča (vpliv pH) 37
4.3.3 Optimizacija inokulacijskega postopka 39
4.4 ZAMENJAVA ZAČETNEGA GOJIŠČA PRODUKCIJSKEGA
SISTEMA 40
4.5 SPREMEMBA STOPNJE REDČENJA 42
4.6 PREVERJANJE PRODUKTIVNOSTI MED PROCESI 43
4.6.1 Izolacija produkta s protein A kolono 44
4.6.2 Ločevanje izoliranih vzorcev z metodo SDS-PAGE 46
4.6.3 Ocena produktivnosti procesov 47
5 SKLEPI 49
6 POVZETEK 50
7 VIRI 52
ZAHVALA PRILOGA
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Seznam uporabljene laboratorijske opreme 19 Preglednica 2: Seznam uporabljenih laboratorijskih materialov 19
Preglednica 3: Sestava gojišča YPG 20
Preglednica 4: Sestava gojišč BMGY in BMMY 21
Preglednica 5: Sestava fosfatnega pufra pH 7,5 26
Preglednica 6: Sestava acetatnega pufra pH3,6 26
Preglednica 7: Sestava pufrov in raztopin uporabljenih pri SDS-PAGE 27
Preglednica 8: Sestava gelov za SDS-PAGE 28
Preglednica 9: Sprememba pH med začetno in končno točko gojenja (23,5 h) 39
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Osnovno ločevanje tipov analiz. 7
Slika 2: Osnovna struktura protitelesa in primerjava s strukturo fragmenta Fcab. 13 Slika 3: 3D struktura Fcab z vezavnim mestom za protein HER2 (Lobner in sod.,
2017). 14
Slika 4: Shematski prikaz gelske izključevalne kromatografije (SEC) (prirejeno po: Size exclusion chromatography …, 2014).
16 Slika 5: Shematski prikaz reverzibilne vezave protiteles s proteinom A v
kromatografski koloni.
18 Slika 6: Shema sestave kontinuirnega bioreaktorskega sistema. 24 Slika 7: Poenostavljena shema postavitve elektroforezne metode ločevanja SDS-
PAGE (prirejeno po: SDS-PAGE protocol …, 2011).
29
Slika 8: Izolacija produkta Fcab iz vzorca. 32
Slika 9: Spremljanje rasti kulture v bioreaktorskem sistemu. 35 Slika 10: Primerjava rasti kulture v različnih volumnih gojišča. 36 Slika 11: Vpliv pH vrednosti produktivnega gojišča BMMY na rast P. pastoris. 38 Slika 12: Vpliv deleža inokuluma na rast kulture in potek bioprocesa. 41
Slika 13: Vpliv stopnje redčenja na potek procesa. 43
Slika 14: Izolacija produkta Fcab iz vzorca kontinuirnega bioprocesa (5 % (v/v) inokulum; D=0,23/h).
44 Slika 15: Izolacija produkta Fcab iz vzorca kontinuirnega bioprocesa (10 % (v/v)
inokulum; D=0,23/h).
45 Slika 16: Izolacija produkta Fcab iz vzorca kontinuirnega bioprocesa (10 % (v/v)
inokulum; D=0,066/h).
45 Slika 17: Rezultat ločbe eluiranih vzorcev z metodo SDS-PAGE. 47
KAZALO PRILOG Priloga A: Shematski prikaz poteka dela.
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI AOX1 in AOX2 alkohol oksidazi 1 in 2
BMGY pufrano, kompleksno gojišče z glicerolom (angl. Buffered Glycerol- complex Medium)
BMMY pufrano, kompleksno gojišče z metanolom (angl. Buffered Methanol- complex Medium)
CH, CL težka in lahka konstantna regija protitelesa D stopnja redčenja (angl. dilution rate) Fcab fragment protitelesa
HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti
Ig imunoglobulin
MUT+, MUT- in MUTs fenotipi P. pastoris (angl. methanol utilising plus, methanol utilising minus in methanol utilising slow)
OD, OD600 optična gostota (angl. Optical Density)
pAOX promotor alkohol dehidrogenaze
qSmax maksimalna specifična stopnja privzema (angl. maximal specific uptake rate)
SDS-PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza z natrijevim dodecil sulfatom (angl.
sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis) VH, VL težka in lahka variabilna regija protitelesa
YPG gojišče s kvasnim ekstraktom, peptonom in glicerolom (angl. Yeast Extract–Peptone–Glycerol Medium)
ε molarna absorptivnost, molarni ekstincijski koeficient µ in µmax specifična hitrost rasti in maksimalna specifična hitrost rasti
1 UVOD
1.1 NAMEN IN POVOD DELA
Protitelesa in fragmenti protiteles, kot so Fcab, danes predstavljajo enega najpomembnejših biotehnoloških proizvodov, saj gre za izjemno vsestransko uporabne proteinske produkte, ki služijo ne le v terapevtske namene, ampak se uporabljajo tudi pri čiščenju, detekciji in izolaciji, oziroma separaciji drugih produktov. Poleg sesalskih tkivnih kultur, je kot produkcijski organizem pogosto izbrana kvasovka Pichia pastoris, saj gre za enega bolj preučenih mikroorganizmov, z izredno dobrimi lastnostmi za industrijsko produkcijo in je hkrati eden redkih produkcijskih organizmov, katerega preoblikovan vzorec glikozilacije protitelesa je podoben človeškemu.
Pri načrtovanju bioprocesne sheme se pogosto osredotočamo na podoben vzorec korakov, vendar pa je za vsak proces potrebno razviti celovit, individualen pristop. Pri našem delu smo se zato posvetili individualnemu pristopu optimizacije gojenja kvasovke vrste Pichia pastoris z namenom produkcije protitelesnih fragmentov Fcab.
Pred začetkom dela smo si postavili naslednje delovne hipoteze:
• Z gojenjem kvasovk P. pastoris na stresalnem inkubatorju je mogoča produkcija fragmentov protiteles Fcab, ki jih je mogoče izolirati z afinitetno kromatografsko metodo s proteinom A.
• Vzpostaviti je mogoče kontinuirni miniaturni bioproces gojenja kvasovk P. pastoris z dodajanjem metanola.
• S spremembami priprave inokuluma in načina inokulacije je mogoče postopek standardizirati.
• S spreminjanjem procesnih parametrov je mogoče optimizirati gojenje in produktivnost organizma.
2 PREGLED LITERATURE 2.1 BIOPROCESNIŠTVO
Biotehnologija je znanost, ki temelji na razvoju bioloških postopkov in manipulacij, katerih cilj je ekonomska in družbena korist. Med pogostimi cilji so selekcija rastlin z bolj zaželenimi lastnostmi, kot so odpornost ali večji doprinos, razvoj mikrobnih fermentacij z namenom produkcije komercialno zanimivih produktov, kot so specifične kemikalije ali farmacevtski produkti, razvoj genskih terapij in vse pogosteje tudi ključni del procesov ravnanja z odpadki drugih industrij. Bioprocesništvo ali bioprocesno inženirstvo pa je področje, ki zavzema in povezuje biotehnologijo, kot osnovno znanost in praktično uporabo odkritji na industrijskem nivoju, pri čemer se poslužuje inženirskega pristopa pri reševanju problemov in omejitev bioloških procesov ter okolja v katerem potekajo. Ker se ne osredotoča na posamezno področje, bioprocesništvo zavzema širok nabor znanj s področij kemijskega in strojnega inženirstva, kot tudi biologije, medicine, ekologije in ekonomije (Liu, 2020).
2.1.1 Produkcija rekombinantnih proteinov
Pred razvojem genskih tehnologij, ki so v začetku osemdesetih let prejšnjega stoletja omogočile začetke produkcije rekombinantnih proteinov, se je le-te v veliki večini pridobivalo s postopki ekstrakcije iz rastlinskega ali živalskega tkiva. Poleg nadomestitve načina proizvodnje, se je skozi leta z razvojem in selekcijo novih gostiteljskih organizmov povečalo tudi število novih heterolognih proteinov, ki jih pred tem ni bilo mogoče izolirati, ali pa je bila njihova izolacija ekonomsko ali ekološko preveč nestabilna. Da je bil razvoj upravičen in da postaja vse bolj pomemben, je razvidno tudi iz ocen velikosti trgov rekombinantnih proteinov, ki neprenehoma rastejo (Vieira Gomez in sod., 2018).
V osnovi, ne glede na gostiteljski organizem ali končni heterologni produkt, ki ga ta proizvaja, se struktura ogrodja bioprocesa ohranja. Kljub temu je na vsaki pomembnejši točki potreben individualni pristop, ki je posledica variacij lastnosti produkta in gostiteljskega organizma, ki vplivajo na prilagajanje velikega nabora ključnih parametrov tekom procesa. Med pomembnejšimi parametri so koncentracije glavnih hranil in mikrohranil, potrebnih za rast ter koncentracija produkta, ki jih v določeni meri lahko uravnavamo z redčitvenim faktorjem. Prav tako relativno lahko vplivamo na temperaturo gojenja ter vrednost pH med potekom procesa, medtem ko so nekateri parametri medsebojno močno povezani in je njihova regulacija veliko težja. Med kompleksnejšimi so dinamika tekočin in prenos snovi ter kisika, na katere v določeni meri lahko vplivamo s spreminjanjem prepihovanja in mešanja, kjer pa smo med drugim omejeni z vnosom moči in prisotnimi strižnimi silami (Marques in sod., 2010).
2.1.2 Produkcijski organizem
Pichia pastoris je metilotrofna kvasovka, ki jo lahko uvrščamo v ožji izbor najbolje preučenih in industrijsko uporabnih organizmov na svetu. Prvotno jo je leta 1920 opisal in poimenoval francoski raziskovalec Alexandre Guilliermond kot Zygosaccharomyces pastori. Herman Phaff jo je kasneje v petdesetih letih prejšnjega stoletja, po izolaciji večih novih sevov, preimenoval v današnjo obliko. Z razvojem tehnologij sekvenciranja, se je po analizi ribosomalnih genov večih metilotrofnih kvasovk leta 1995 P. pastoris uvrstilo v nov rod Komagataella, vrsto pa poimenovalo v Komagataella pastoris. Z nadaljnjimi analizami 26S RNA, so se pokazale dovoljšne razlike za razdelitev vrste v več novih.
Danes poznamo šest predstavnikov v rodu Komagataella, K. pastoris, K. phaffii, K.
pseudopastoris, K. poluli, K. ulmi, in K. kurtzmanii, kljub temu pa je s klasičnimi metodami, ki ne vključujejo sekvenciranja težko razločiti med vrstami, zaradi česar se je ohranilo ime Pichia pastoris, ki prestavlja sinonim večini izolatov, ki so bili pred razcepitvijo poimenovani kot Komagataella pastoris. Kompromis je bil sprejet predvsem zaradi močno razvite biotehnološke uporabnosti sevov in že prej omenjenega težavnega razlikovanja med vrstami. Največ sevov, ki jih poimenujemo kot Pichia pastoris je tako taksonomsko uradno poimenovanih kot Komagataella pastoris ali Komagataella phaffii (Peña in sod., 2018).
Ker gre za eno izmed vrst metilotrofnih kvasovk, to pomeni, da Pichia pastoris lahko raste na metanolu, kot edinem viru ogljika, vendar pa je zmožna rasti na najrazličnejših substratih, med katerimi sta poleg metanola najpogosteje uporabljena glukoza in glicerol.
Privzem glukoze iz okolja je omejena maksimalna specifična stopnja privzema (maximal specific uptake rate: qSmax ≈ 0,35 h−1). Razlika, ki je skoraj desetkratna, je opazna predvsem v primerjavi s kvasovko Saccharomyces cerevisiae (qSmax ≈ 2,88 h−1). Nižji prevzem glukoze, je tudi eden izmed razlogov, zakaj se večina substrata uporabi v namen celične rasti kulture in tako produktov fermentacije ni mogoče zaznati, kot je to mogoče pri Saccharomyces cerevisiae. Posledično kvasovke P. pastoris uvrščamo v skupino kvasovk, ki ne izražajo Crabtree efekta (Peña in sod., 2018).
V primerjavi z veliko večino ostalih vrst kvasovk, Pichia pastoris v svojem genomu nosi štiri gene za H+/glicerolne kotransporterje, kar pripomore k sorazmerno visokemu prevzemu glicerola iz okolja. V primerjavi s kvasovko Saccharomyces cerevisiae s qSmax
≈ 0,046 h-1, je prevzem glicerola pri kvasovki Pichia pastoris približno osemkrat višji (qSmax ≈ 0,37 h-1). Stopnja privzem glicerola je izredno podobna stopnji privzema glukoze, oziroma je celo nekoliko višja. Zaradi tovrstne lastnosti se pogosto pri produkciji heterolognih proteinov v začetnih fazah gojenja pred metanolno indukcijo, ko se biomasa povečuje, pogosto uporabljajo gojišča, kjer glicerol predstavlja glavni vir ogljika (Mattanovich in sod., 2009).
Pri privzemanju metanola iz okolja kvasovke Pichia pastoris za razliko od ostalih substratov ne uporabljajo specifičnih transporterjev, temveč se metanol v celice prenaša pasivno s pomočjo difuzije skozi celično membrano. Tovrsten način transporta substrata res da ne porablja energije ali drugih snovi, kot so ioni v celici, vendar je občutneje počasnejši. To se odraža predvsem v qSmax, ki pogosto dosega vrednosti le okoli 0,02 h-1 do 0,03 h-1. Nižji tok substrata v celico, ki je na voljo za metabolizem, tako pomeni izrazito počasnejšo rast organizma (Khatri in Hoffmann, 2006). Hkrati, ker gre za pasivni transport, se lahko vrednosti močno razlikujejo in so bolj dovzetne k variabilnosti, kot to velja za izmerjene vrednosti qmax glukoze in glicerola. Tok je namreč odvisen od koncentracije metanola v okolju in znotraj celice. Posledično bo pričakovano, da je zaradi nižjega metabolizma metanola v sevih fenotipa MUTS, difuzija in posledično qSmax
počasnejša v primerjavi s fenotipom MUT+ (Singh in Narang, 2020).
2.1.2.1 Fenotipi kvasovke Pichia pastoris
Visoka zmogljivost produkcije in izločanja heterolognih proteinov, zmožnost izvajanja posttranslacijskih sprememb, sposobnost tvorbe disulfidnih povezav in glikozilacije proteinov ter doseganje visokih celičnih koncentracij med gojenjem na definiranih gojiščih, so zagotovo lastnosti, ki so bile glavno vodilo pri razvijanju tehnologij in procesov, ki so omogočili napredek pri vsestranski uporabnosti in zmožnosti produkcije najrazličnejših heterolognih produktov v P. pastoris. Poleg vseh že naštetih lastnosti je eden glavnih atributov te kvasovke prisotnost promotorja alkohol oksidaze z oznako pAOX, katerega indukcija in natančna regulacija sta odvisni od koncentracije metanola v gojišču. Indukcija promotorja je izredno dobro regulirana, saj pri gojenju na glukozi ali glicerolu alkoholnih oksidaz ni mogoče zaznati, medtem ko pri gojenju divjih tipov P.
pastoris na metanolu, te predstavljajo do 35 % celokupnih celičnih proteinov (Potvin in sod., 2012).
Med sevi P. pastoris v osnovi, glede na izkoriščanje metanola, ločimo tri glavne fenotipe.
Sevi, ki nosijo oznako MUT+ (methanol utilising plus), imajo v svojem dednem zapisu prisotne gene tako za alkohol oksidazo 1 (AOX1), kot alkohol oksidazo 2 (AOX2).
Njihova rast je primerljiva s hitrostjo rasti divjih tipov, kar pomeni, da posledično potrebujejo višje koncentracije metanola. Kljub temu, da zaradi hitre rasti sevi MUT+ potrebujejo večjo količino metanola, vseeno njegova koncentracija v gojišču ne sme biti previsoka, saj omejuje produktivnost šaržnih tipov bioprocesov, kjer se tekom procesa gojenja metanola ne dodaja. Za dobro produkcijo, je tako potrebna specifična koncentracija metanola, saj se rast celic in produktivnost kulture sorazmerno povečujeta le do točke, ko se efekt prelomi in začnejo prevladovati negativni vplivi toksičnosti metanola na kulturo. Potreba po relativno visokih količinah metanola in izredno ozko okno optimalne koncentracije, ki jo je težko uravnavati, otežujejo prenos tehnologij na večja merila, pri čemer velik problem predstavljajo toksične in eksplozivne lastnosti substrata, ki otežujejo njegovo skladiščenje na lokaciji (Potvin in sod., 2012).
Med vstavljanjem zapisov za heterologne produkte, pod promotor alkohol oksidaze 1, sta možni dve obliki fenotipa, ki pri tem nastane. V primeru, da ostane AOX1 v aktivni obliki, ohranja sev fenotip MUT+. V primerih, ko vstavljanje novega zaporedja prekine zapis za AOX1, sev ne more več proizvajati alkohol oksidaze 1 in je tako omejen na intaktno alkohol oksidazo 2. Tovrstni sevi nosijo oznako MUTS (methanol utilising slow) (Looser in sod., 2014).
Posledica izgube delovanja AOX1 v metabolni poti izrabe metanola pomeni, da je rast kulture v gojiščih, ker metanol predstavlja edini vir ogljika, odvisna od izražanja AOX2 genov in je zaradi tega počasnejša. Običajno je tako produktivnost MUTS sevov v določenem časovnem obdobju nižja kot pri produkciji z MUT+ sevi, kljub temu je vseeno možno, da preseže celokupno produktivnost tekom celotnega procesa. Z upočasnjeno rastjo se namreč zaobide nekatere tehnične težave gojenja, ki so povezane s hitro rastjo biomase. V tem primeru, je poleg odvajanja temperature, najbolj olajšano vzdrževanje dovoljšne koncentracije kisika, ki bi omejevala proces. Dodatna prednost MUTS sevov je tudi manjša občutljivost na nihanje koncentracij metanola v gojišču, kar olajša prenos procesa v večje merilo (Potvin in sod., 2012).
Tretji fenotip metilotrofnih kvasovk P. pastoris v tovrstni kategorizaciji nosi oznako MUT- (methanol utilising minus), pri katerem noben izmed zapisov za AOX1 in AOX2 ni nepoškodovan. Rast na metanolu, kot glavnemu viru ogljika, je tako onemogočena, vendar pa metanol ohrani svojo inducibilno vlogo produkcije heterolognih proteinov (Looser in sod., 2014).
2.2 NAČRTOVANJE BIOPROCESA V KEMOSTATU 2.2.1 Celična rast
Pri merjenju specifičnih parametrov v bioreaktorju, je eden osnovnih in najbolj enostavnih, merjenje celične biomase. Merjenje celične biomase je direktni pokazatelj celične rasti in posledično vitalnosti kulture ter pogosto tudi produkcije heterolognega proteina, ki ga ta proizvaja. V osnovi lahko ločimo tehnike meritev glede na način odvzema vzorca za analize, oziroma kje se le te izvajajo, posledično pa tudi njihova invazivnost za sam proces. Tovrstna klasifikacija je enaka tudi vsem vrstam analiz, katerih cilj je spremljanje ostalih parametrov tekom procesa.
Najosnovnejša metoda, je odvzem vzorca iz produkcijskega okolja ter njegovo analiziranje v laboratoriju. Tovrstno analiziranje označujemo tudi kot tako imenovano off-line analiziranje. Če se pri vodenju procesa zanašamo na tovrstne analize, je potrebno v zakup vzeti vse njegove slabe plati. Poseg v reaktor je lahko izredno invaziven, kar povečuje možnost okužbe procesa, hkrati se pri tem odvzame določena količina
bioprocesne brozge, ki predvsem pri nizkih delavnih volumnih predstavlja relativno visok delež, s tem pa lahko poruši ravnovesje v bioreaktorju. V zakup je potrebno vzeti tudi, da so analize v primerjavi z ostalimi načini, ki bodo opisani v nadaljevanju, neprimerljivo počasnejše, kar privede do zmanjšanega števila točk meritev ter tako slabši nadzor procesa. Razvoj tehnologij za merjenje v realnem času, je tako pomenil velik napredek pri spremljanju parametrov. Meritve v realnem času lahko potekajo na tri načine, ki jih označujemo kot in-line, on-line in at-line. Pri at-line analiziranju, je podobno kot pri off- line meritvah potrebno odvzemanje vzorca iz bioreaktorja, vendar pa to poteka kontinuirno, najpogosteje na iztoku, če je ta del sestave bioreaktorja. Da se poveča kapaciteta meritvenih točk, je analiziranje pogosto avtomatizirano. Dodatna prednost avtomatizacije predstavlja tudi zmožnost direktne komunikacije analizatorja in kontrolne enote, ki vodi proces, medtem ko je pri off-line analizah za to potrebna intervencija fizične osebe. On-line spremljanje parametrov, kot je optična gostota, podobno potrebuje kontinuirno odvzemanje vzorca, ki se pošilja na analizator, vendar pa se za razliko od at- line meritev v nadaljevanju vrača nazaj v bioreaktor. Vračanje vzorca pomeni, da ne prihaja do izgube bioprocesne brozge, kar je pomemben faktor predvsem pri nižjih delavnih volumnih. Obtok iz bioreaktorja predstavlja ne optimalno ali celo stresno okolje za kulturo, zaradi česar se pridobljeni parametri analiz lahko rahlo razlikujejo od pogojev znotraj bioreaktorja. Podobno velja tudi za pogoje v iztoku pri at-line analizah, odstopanje od realne vrednosti pa je v obeh primerih odvisno od pretoka. Višji kot je pretok, manjša odstopanja so pričakovana, saj je zadrževalni čas kulture v ne optimalnih pogojih krajši.
Pri in-line spremljanju parametrov so meritve izvedene direktno v bioprocesni brozgi in ne potrebujejo odvzemanja vzorca ali njegovega obtoka izven bioreaktorja. S tem je poseg v proces minimalen, število možnih točk meritev, pa je omejeno le s tehnologijo senzorja in kapaciteto analizatorja. Posledično je možno zaslediti minimalne spremembe v procesu, ki bi se z ostalimi metodami morebiti izgubile med dvema točkama meritev. V primerjavi z off-line meritvami, imajo vse tovrstne analize zmanjšan vpliv delavne napake, saj je število korakov zmanjšano, vpliv človeške napake pa je minimalen (Cabaneros Lopez in sod., 2019).
Slika 1: Osnovno ločevanje tipov analiz
Obstaja več metod analiziranja celične gostote v bioprocesni brozgi, vendar jih v osnovi večina temelji na spektroskopiji oziroma interakciji svetlobe s snovjo. Z različnimi zvrstmi spektroskopije je možno spremljati različne lastnosti biomase, vendar, če je željen podatek le celična gostota, potem se najpogosteje uporablja UV-vis spektroskopija, s katero je možno izmeriti absorbanco brozge, ki je ob upoštevanju Beer-Lamberotovega zakona sorazmerna s celično gostoto. Absorbanca je lastnost vzorca, ki pove kolikšen del energije svetlobe, s katero je bil presvetljen vzorec, je bil zadržan. Beer-Lambertov zakon določa, da se absorbanca spreminja linearno s koncentracijo absorbirajoče snovi in dolžino poti, ki jo žarek naredi skozi vzorec, vendar pa ima svoje omejitve, predvsem pri visokih celičnih gostotah. Z napravami se pravzaprav meri transmitanca (T), oziroma sprememba intenzitete svetlobe potem, ko ta presvetli vzorec. Če je na poti žarka od emitorja do detektorja prisoten absorbirajoč delec, se bo transmitanca znižala. Število delcev, s katerimi bi žarek interagiral, je odvisno od dolžine poti (l) in koncentracije delcev (c). Absorbanca je matematični preračun transmitance, katere namen je linearizacija razmerja s koncentracijo. Čeprav je absorbanca podana na skali od 0 do neskončnosti, v realnih pogojih območje merjenja večina aparatur obsega le območje med 0 in 3 do 4 (Morris, 2015).
𝑇 = 𝐼
𝐼0 = 𝑒−𝜀
𝑐 … (1)
𝐴 = − log (𝐼
𝐼0) = 𝜀 ∙ 𝑐 ∙ 𝑙
… (2)
T … transmitanca A … absorbanca
I0 in I… intenziteta svetlobe pred in po presvetlitvi vzorca
ε … molarna absorptivnost [ 𝐿
𝑚𝑜𝑙∙𝑐𝑚] c … koncentracija delcev [𝑚𝑜𝑙
𝐿 ] l … presevna dolžina [cm]
Kot omenjeno je merjenje celične gostote eden osnovnih parametrov, ki se spremljajo tekom trajanja procesa. Boljši vpogled v vitalnost kulture ter lažje primerjanje med različnimi sistemi pa podaja specifična hitrost rasti (µ).
𝜇 = 1
(𝑡𝑘− 𝑡𝑧)ln𝑋𝑘
𝑋𝑧 … (3)
Pri čemer je µ (h-1) specifična hitrost rasti, tz in tk časovni interval med začetno in končno meritvijo koncentracije kulture Xz in Xk. (Rodrigues in sod., 2019)
Specifična hitrost rasti je izrednega pomena pri gojenju kulture v kontinuirni obliki, saj določa maksimalen pretok, pri katerem se celice še ne izpirajo iz sistema. Zaradi boljšega transporta glicerola iz gojišča, v primerjavi z glukozo, je pri enakih pogojih običajno rahlo višja specifična hitrost rasti sevov P. pastoris na glicerolu kot glavnemu viru ogljika (µgly_max = 0,26 h-1, μglc_max = 0,19 h-1) (Mattanovich in sod., 2009).
Rodrigues in sod. so med optimizacijo produkcije L-asparaginaze II v rekombinantnem sevu Pichia pastoris fenotipa MUTS pri optimalnih pogojih na glicerolu dosegli specifično hitrost rasti 0,21 h-1, kar sovpada z običajnimi vrednostmi drugih raziskav.
Hkrati so opazili, da način dodajanja metanola lahko vpliva na rast kulture. Poslužili so se dveh načinov dodajanja induktorja, pulzno in kontinuirno in pri tem ugotovili, da maksimalna specifična hitrost rasti pri kontinuirnem načinu dodajanja pade na zgolj 0,005 h-1, medtem ko prekinjeno dodajanje metanola ohrani µmax višjo, in sicer 0,033h-1. Kljub temu pa je imelo sporadično dodajanje metanola negativen vpliv na profil rasti kulture, ki se je kazala v znižani suhi teži biomase in padcu koncentracije raztopljenega kisika po dodatku metanola (Rodrigues in sod., 2019).
2.2.2 Spremljanje in vpliv koncentracije substrata
Kot je bilo že predhodno omenjeno, je pri gojenju različnih sevov za doseganje optimalnih produkcijskih pogojev, izrednega pomena koncentracija substrata v gojišču.
Predvsem je poudarek na analizah, ki podajajo podatke o koncentraciji metanola v produkcijskem gojišču, saj ta močno vpliva na rast in produkcijo kulture. Pomembna je dovoljšna koncentracija metanola, da je indukcija produkcije maksimalna, hkrati pa koncentracija metanola, ki se ne porablja takoj in ostaja v gojišču, ne sme presegati kritične meje. Citotoksična meja je izredno nizka in je v določenih primerih postavljena že pri koncentraciji 3,7g/L, medtem, ko se optimalne koncentracije gibljejo med 2g/L do 3,5g/L (Potvin in sod., 2012).
Najpogostejše se spremljanje bioprocesa izvaja off-line s kromatografskimi metodami, kot sta plinska kromatografija (angl. gas chromatography, GC), in tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (angl. high-performance liquid chromatography, HPLC), ki pa sta daleč od optimalnih. Slabosti spremljanja koncentracije metanola s tovrstnimi metodami, so poleg visoke cene in daljših časovnih intervalov med meritvami, tudi nezanesljivost rezultatov, ki lahko nihajo, predvsem zaradi hlapnosti metanola tekom celotnega postopka analiz. Kot možna rešitev je GC on-line spremljanje, ki zmanjša napake, vendar ne odpravi pomanjkljivosti časovnega beleženja podatkov, saj interval vzorčenja ostaja omejen s samo metodo (Potvin in sod., 2012).
Ozka okna, ki ločujejo optimalne koncentracije metanola, je v večjih merilih mogoče dosegati le s konstantnim spremljanjem z on-line in in-line metodami, saj je le tako mogoč hiter odziv na morebitne spremembe, katerih posledica je nižanje celokupnega izkoristka bioprocesa. Tovrstne analize se poslužujejo ravnovesja koncentracije med tekočo in plinasto fazo v bioreaktorju in tako za spremljanje koncentracije metanola v gojišču uporabljajo izhodno plinasto fazo. Kot detektor metanola se lahko uporabljajo različni senzorji, kot so plamensko ionizacijski detektor (FID), Fourerovo transformirana infrardeča spektroskopija (FTIR) ali celo kovinsko oksidni polprevodnik (metal oxide semiconductor) (Potvin in sod., 2012).
2.2.3 Vpliv koncentracije kisika
Rast sevov z oznako MUT+ je primerljiva s hitrejšo rastjo divjih tipov, kar pomeni, da za uspešno, oziroma optimalno rast in produkcijo potrebujejo višje koncentracije kisika, raztopljenega v gojišču. Na drugi strani je rast sevov MUTS bolj umirjena, kar pomeni, da je pri tem potreba po kisiku nižja. Razliki med fenotipoma sta izredno pomembni pri prenašanju tehnologije na večje, predvsem industrijske produkcijske skale, saj se s povečevanjem volumna otežuje zmožnost dovajanja dovoljšne količine kisika v gojišče.
Tovrstne tehnološke omejitve v ospredje postavljajo produkcijske seve s fenotipom MUTS (Potvin in sod., 2012).
2.2.4 Vpliv temperature
Optimalna temperatura za gojenje kvasovke Pichia pastoris se nahaja v območju med 28
°C in 30°C, vendar pa je znižanje temperature na 25 °C pogosto praksa pri povečevanju produkcije rekombinantnega proteina, brez, da bi s tem drastično posegali v hitrost rasti kulture (Gasser in sod., 2007).
Rast pri specifičnih temperaturah lahko močno vpliva na profil procesa. S spreminjanjem temperature lahko dosegamo različne učinke na rast kulture. Ti se prenesejo na ostale parametre v procesu. Z nižanjem temperature zmanjšujemo specifično hitrost rasti kulture, vendar pa se s tem tudi zmanjša poraba kisika v gojišču, kar je pomembno pri procesih, kjer je pričakovana rast hitra in posledično poraba kisika visoka (Yang in Zhang, 2018).
Podobno nižja temperatura vpliva na proteazno aktivnost, ki zmanjšuje izkoristek produkcije heterolognega proteina. Aktivnost proteaz se z nižjo temperaturo zmanjša, kar je delno posledica termodinamskih lastnosti aktivnosti proteolitskih encimov, kot tudi posledica zmanjšane celične lize, zaradi katere se v gojišču zvišuje koncentracija proteaz.
Z nižanjem temperature gojenja, se zmanjša aktivnost in koncentracija proteaz, ki je posledica celične lize (Jahic in sod., 2003).
Poleg nižanja proteazne aktivnosti zmanjšanje gojitvene temperature vpliva tudi na ostale celične procese. Zmanjšanje pretoka skozi cikel citronske kisline, zmanjšanje vsebnosti proteinov, ki sodelujejo pri odzivu na oksidativni stres in zmanjšanje vsebnosti znotrajceličnih šaperonov nakazujejo zmanjšanje stresa, ki je posledica zvijanja produkta, ki posledično omogoča učinkovitejše izločanje produkta iz celice (Dragosits in sod., 2009).
Navedene spremembe znotraj celice so izjemnega pomena, saj so Gasser in sod. (2007) s spremljanjem izražanja genov pri različnih temperaturah (20 °C in 25 °C) v kemostatu pokazali, da pri temperaturi 20 °C izražanje genov produkta sicer pade v primerjavi z gojenjem na 25 °C. Kljub temu se specifična produktivnost procesa pri nižji temperaturi 1,4 krat poveča
2.2.5 Vpliv pH
Podobno kot velja za večino ostalih parametrov, je za optimalno produkcijo pomembna tudi pH vrednost gojišča, v katerem kultura raste. Vrednost pH lahko vpliva tako na
proteazno aktivnost, stabilnost heterolognega proteina, izločenega v gojišče. Kvasovka Pichia pastoris za svojo rast tolerira relativno širok spekter pH vrednosti, in sicer se te gibljejo med pH 3,0 in pH 8,0. Tako širok spekter je pomemben, saj se z minimalnim zmanjšanjem hitrosti rasti pH vrednost lahko prilagaja glede na produkt, ki ga kvasovka izloča, vendar višje pH vrednosti v večini primerov znižujejo viabilnost celic ter znižujejo stabilnost in aktivnost izločenih proteinov (Potvin in sod., 2012).
Kot že omenjeno, pH, bolj kot na rast kulture, vpliva na produkcijo proteaz in njihovo aktivnost, pri tem pa se rezultati raziskav med seboj nekoliko razlikujejo, kar je najverjetneje posledica prisotnosti različnih vrst proteaz, ki drugače vplivajo na heterologni produkt. Kobayashi in sodelavci (2000) poročajo, da proteazna aktivnost v kulturi ni bila zaznana pri pH nad 5,6 ter da se je količina produkta na račun razgradnje zmanjšala za polovico pri pH 4,3. O podobnih rezultatih so poročale tudi druge raziskovalne skupine pri produkciji interferona-τ MSP3 (merozoitni površinski protein- 3) in humanega fibrinogena (Potvin in sod., 2012). Medtem so Charoenrat in sod. (2013) pri produkciji endoglukanaze s kvasovko Pichia pastoris pokazali, da je bila proteazna aktivnost povišana pri pH 6,0 v primerjavi s pH 5,0 .
2.2.6 Vpliv sodohranjevanja
Pri sevih, ki nosijo zapis za produkt pod PAOXpromotorjem, je metanol ključnega pomena za indukcijo produkcije. Hkrati je potrebno vedeti, da so specifične hitrosti rasti organizma v gojišču z metanolom, kot edinim virom ogljika, nižje v primerjavi z gojišči z alternativnimi substrati, kot sta glukoza in glicerol, ki pogosto služita kot glavni vir ogljika v fazah rasti pred indukcijo. Rast na metanolu producira tudi več toplote, kar postane problematični faktor, predvsem s povečevanjem skale produkcijskega volumna.
Razmerje med volumnom in površino, ki omogoča odvajanje toplote iz sistema, se viša tudi z uporabo tehničnih rešitev, kot so hladilne spirale. Posledično, v primerih prehitre rasti organizma vzdrževanje željene temperature ni mogoče in sistem se začne pregrevati.
Podobno oviro predstavlja močna občutljivost sevov kvasovke Pichia pastoris MUTS na večja nihanja koncentracije metanola v gojišču. Pri tovrstnih sevih je potrebno dlje časa ohranjati specifično koncentracijo metanola, saj je njihova rast počasnejša. Ker to dodatno otežuje vodenje procesa z optimalnimi pogoji produkcije, se kot možna rešitev predstavlja uporaba dveh substratov v fazi indukcije. Tako metanol ne služi več kot glavni vir za rast kulture, hkrati pa omogoča indukcijo PAOX promotorja (Yang in Zhang, 2018).
Sun in sod. (2016) so pokazali, da dodatek sekundarnega substrata, ki se v gojišče dodaja poleg metanola, poveča produkcijo v primerjavi s procesi, kjer metanol služi kot edini vir ogljika. Pozitivne rezultate so zasledili z uporabo glicerola, sorbitola in manitola.
Glicerol sicer deluje kot represor izražanja heterolognega proteina, zaradi česar je pogosto nezaželen v gojišču produkcijske faze. Določene raziskave, kjer se je testiralo souporabo glicerola z metanolom, so kljub temu pokazale, da je možno povečati produktivnost sistema z dodajanjem glicerola. Poleg povečane hitrosti rasti organizma, ki pripomore k skupni produktivnosti, se skrajša faza prilagajanja, kjer je produktivnost običajno nizka, vendar se ob tem poveča tudi proteazna aktivnost, ki zmanjšuje koncentracijo produkta v supernatantu. Posledično je potrebno izbrati primerno specifično hitrost rasti organizma, na kar je mogoče delno vplivati s koncentracijo glicerola v gojišču z mešanima substratoma (Yang in Zhang, 2018).
2.3 PRODUKT
Imunoglobulini (Ig) so glikoproteini, ki omogočajo specifično prepoznavanje antigenskih molekul v serumu. Pri ljudeh ločimo pet glavnih izotipov z oznakami IgA, s podtipoma IgA1 in IgA2, IgD, IgE, IgM in IgG, ki se dodatno delijo v podtipe IgG1, IgG2, IgG3 in IgG4. Osnovna struktura se med izotipi protiteles ne razlikuje veliko in sestoji iz dveh težkih (H) in dveh lahkih (L) verig, slednja pa je lahko sestavljena iz verige κ ali λ. Verige so medsebojno povezane preko disulfidnih mostičkov, tako da tvorijo heterodimer.
Znotraj posameznih verig ločimo variabilne regije (V), ki so locirane na N-terminalnem koncu in konstantne regije (C) na C-terminalnem koncu verige. Sestava lahke verige je vselej ena regija C (CL) in ena regija V (VL), glede na izotip protitelesa, pa je težka veriga sestavljena iz treh ali štirih C regij (CH) ter ene V regije (VH). V težki verigi, kjer je zaporedno vezanih več verig CH, je na mestu med CH1 in CH2 razmik s pregibno regijo, ki predstavlja prepoznavno mesto za papain. Po razrezu s papainom se tvorijo trije fragmenti, med katerimi je en Fc in dva Fab. Fragmenta Fab sta medsebojno identična in vsebujeta konstantni regiji CL1 in CH1 ter variabilni regiji VL in VH. Ti skupaj tvorita fragment Fv, znotraj katerega se nahaja antigen vezavno mesto. Razlike med fragmenti Fc določajo izotip in efektorske lastnosti protitelesa. V primeru IgG, Fc sestavljata dve regiji CH2 in dve CH3. Regija CH3 predstavlja pomembno regijo za vezavo Fc receptorja (FcR), ki je pomembna za aktivacijo komplementa. Regija CH2 predstavljajo mesto glikozilacij polipeptidne verige ter mesto vezave proteina A in proteina G, lastnost, ki se izkorišča predvsem v izolacijske namene (Schroeder in Cavacini, 2010).
Slika 2: Osnovna struktura protitelesa in primerjava s strukturo fragmenta Fcab
2.3.1 Fragmenti protiteles
Uspešnost terapevtske uporabe protiteles je na področju privedla do razvoja protitelesnih fragmentov z možnostjo usmerjenega načrtovanja njihovih struktur z namenom vezave na specifične tarčne molekule, katerih razpon je teoretično neomejen. Zmanjšana velikost tovrstnih fragmentov predstavlja več prednosti v primerjavi s predhodnimi intaktnimi protitelesi. Protitelesa oblike imunoglobulina G težje prehajajo v določena tkiva, ne morejo prehajati skozi možgansko-krvno bariero in imajo zaradi svoje velikosti onemogočen dostop do določenih epitopov na površini tarčnih celic, kar zmanjšuje njihovo uporabnost, predvsem v terapevtske namene (Kholodenko in sod., 2019).
Prisotnost regije Fc v kompletnem protitelesu oblike IgG mu omogoča nemoteno cirkulacijo v krvnem obtoku, a hkrati preprečuje prehajanje v tkiva, dodaten pogosto nezaželen učinek pa predstavljajo tudi citotoksični učinki aktivacije komplementa (CDC) ali celično posredovana citotoksičnost odvisno od protiteles (ADCC). V ta namen se je razvilo več fragmentov protiteles, ki konstantne regije ne vsebujejo. Fragmenti se tvorijo bodisi z razrezom protiteles IgG ali IgM proizvedenega v celoti ali pa je potreben genetski inženiring njihove proizvodnje kot heterolognega produkta. S posluževanjem kemičnega in proteaznega razreza se med drugim tvorijo fragmenti F(ab')2, Fab', Fab in Fv, z genetskim pristopom pa scFv, diabody, triabody ali celo same variabilne domene težke (VH) ali lahke verige (VL) (Kholodenko in sod., 2019).
Prevladujoča problematika fragmentov, ki ne vsebujejo regije Fc protitelesa, ki omejuje njihovo uporabnost v terapevtske namene, je razmerno kratek biološki razpolovni čas v telesu. Podaljšanje biološkega razpolovnega časa je mogoče s fuzijo fragmentov, ki nosijo antigen prepoznavno mesto, z regijo Fc, albuminom ali peptidom, ki omogoči vezavo z neonatalnim Fc receptorjem (FcRn). V enak namen je bila preizkušena tudi pegilacija, vendar se v vseh naštetih primerih aktivna molekula močno poveča, kar poslabša zmožnost prehajanja globje v tkiva. Kot ena izmed rešitev se je pojavila konstrukcija fragmenta Fcab, pri katerem modificirana regija Fc izraža lastnost specifične vezave z antigenom. Antigen prepoznavno mesto je ustvarjeno s konstruiranjem nove zanke med C-terminalnima deloma domene CH3 fragmenta Fc. Postopek temelji na snovanju naključnih zank ter selekcije afinitete med proizvedenim fragmentom Fcab in tarčnim antigenom. Z namenom nasprotovanja rušenja stabilnosti molekule na račun tovrstnih mutacij, so bile ustvarjene nove disulfidne povezave znotraj domene CH3. Tako konstruirani fragmenti Fcab so veliki okvirno 60 kDa in tako ostajajo relativno majhni v primerjavi z protitelesi IgG, vsebujejo antigen vezavno mesto in hkrati ohranjajo lastnosti dela Fc običajne molekule IgG, kot so ohranjanje biološkega razpolovnega časa podobnega IgG, zmožnost izzvanja ADCC, interakcije s komplementom in vezava na protein A ter od pH odvisna vezava z FcRn (Ying in sod., 2014).
Slika 3: 3D struktura Fcab z vezavnim mestom za protein HER2 (Lobner in sod., 2017)
2.4 IZOLACIJA IN DETEKCIJA PRODUKTA
V biotehnologiji in sorodnih vedah je razvoj tehnik in metod čiščenja proteinov ključnega pomena, tako za raziskave na področjih, kot je proteomika, kot tudi za uspešno industrijsko produkcijo. Kromatografske tehnike z različnimi selekcijskimi metodami so se izkazale kot optimalna rešitev pri izolaciji in selekciji organskih molekul, med katerimi vedno pomembnejši del predstavljajo proteini. V osnovi tekočinski kromatografski separacijski postopki temeljijo na porazdelitvi komponent vzorca med dvema fazama - stacionarno fazo, ki jo predstavlja kromatografski medij ali adsorbent ter mobilno fazo, ki je najpogosteje raztopina vzorca v pufru ali organskem topilu. V osnovi se kromatografije uporabljene za separacijo proteinov ločujejo glede na lastnosti stacionarne faze, ki se pri tem uporablja. Poleg pravilne izbire kromatografske metode je ključna tudi pravilna predpriprava vzorca, saj kompleksnost vzorca znižuje natančnost kromatografskih metod, s katerimi je mogoče dobro ločiti le specifično število podobnih molekul. Med pogostimi postopki predpriprave vzorcev so vključeni precipitacija, centrifugiranje, filtracija, elektroforeza, ekstrakcija produkta v topila ali druga vrsta kromatografije. S povečevanjem števila postopkov ločevanja produkta se povečuje njegova čistost, vendar so pri vsakem postopku prisotne izgube (Fanali in sod., 2017).
2.4.1 Gelska izključevalna kromatografija (SEC)
Stacionarno fazo v gelsko izključevalni kromatografiji sestavljajo porozni delci, ki omogočajo osnovno ločevanje med proteini, pri čemer sta ednina faktorja ločevanja njihova velikost in oblika. Selektivnost kromatografskih kolon shematsko predstavljenih na sliki 4, je določena le s strani poroznosti delcev, ki so posledica različne stopnje zamrežitve, oziroma polimerizacije delcev. Ti so lahko naravnega izvora, kot sta agaroza ali dekstran, sintetični, kot je poliakrilamid, ali kombinacija, kot je to v primeru komercialne znamke Sepharose. Zadovoljiva in ponovljiva ločba vzorca je tako mogoča ob pravilni izbiri velikosti por kolone, saj ločevanje, kot je prikazano na sliki 4, v osnovi poteka po principu daljšega časa zadrževanja tistih delcev snovi, ki lahko prodrejo globje v pore. Pri čiščenju proteinskih vzorcev se uporablja gel z manjšimi porami za razsoljevanje in odstranjevanje manjših ne proteinskih molekul iz vzorcev, medtem ko je pri večjih porah možna ločba med globularnimi proteini različnih velikosti (Fanali in sod., 2017).
Poleg velikosti je za ločevanje pomembna tudi oblika molekule. Pogost problem pri ločevanju z drugimi kromatografskimi metodami predstavlja denaturacija proteina, ki je lahko posledica specifične sestave mobilne faze, ki se uporablja. Drugače, kot to velja za ostale kromatografske metode, selektivnosti ni mogoče regulirati s spreminjanjem sestave mobilne faze, kar v osnovi predstavlja slabost tehnike, a hkrati omogoči separacijo
molekul, katerih pravilna oblika je odvisna od pH, prisotnosti kovinskih ionov ali drugih kofaktorjev in snov (Hunt in Holding, 2013).
Slika 4: Shematski prikaz gelske izključevalne kromatografije (SEC). A: prikaz galskega nosilca in por pod povečavo. B: prikaz potovanja in zadrževanja delcev vzorca različnih velikosti. C: grafični prikaz ločbe delcev vzorca različnih velikosti v treh zaporednih časovnih točkah. D: shematski kromatogram ločbe (prirejeno po: Size exclusion chromatography …, 2014)
2.4.2 Ionsko izmenjevalna kromatografija (IEX)
Ionsko izmenjevalna kromatografija je kromatografska metoda, ki omogoča ločevanje med delci na podlagi ionskih interakcij med nabitimi deli molekule in nasprotno nabitimi skupinami, ki so vezane na stacionarno fazo kromatografske kolone. V osnovi se glede na naboj skupin stacionarne faze ločita dve vrsti ionsko izmenjevalne kromatografije. Pri kationsko izmenjevalni kromatografiji (angl. cation-exchange chromatography ,CEX) se pozitivno nabiti delci vežejo na negativne skupine, ki so vezane na površino stacionarne
faze, medtem ko se z anionsko izmenjevalno kromatografijo (angl. anion-exchange chromatography, AEX) vzpostavljajo interakcije med negativno nabitimi delci v vzorcu in pozitivno nabitimi skupinami nosilca. Ker interakcije niso stalne, je kompeticija za nabita mesta glavno vodilo, na podlagi katerega se razlikujejo elucijski časi molekul z različnimi neto naboji. Zaradi kompeticije je pomembno, da so uporabljeni pufri z nizko ionsko jakostjo, saj se drugače nabita mesta na stacionarni koloni zasedejo z nabitimi delci pufra (Fanali in sod., 2017).
Naboj proteinov je pogojen z njihovo strukturo, pri čemer so najpomembnejši nabiti aminokislinski ostanki. Aspartat in glutamat prispevata k negativnemu naboju, na drugi strani arginin, histidin in lizin prispevajo k pozitivnemu naboju proteina. Nabiti deli molekul se najpogosteje nahajajo na površini molekule, izjema so le metaloproteini, kjer je z njihovo orientacijo ligand vezan v središče molekule. Delež posamezno nabitih aminokislinskih ostankov v proteinu določa njegovo izoelektrično točko (pI), ki nam pove, v kakšnem okolju ima protein neto nevtralen naboj. Neto pozitivni naboj proteinov je pogostejši pri pH vrednosti okolja pod 8, medtem ko je neto negativen naboj proteinov prisoten pri pH nad 6, seveda pa so območja različna za posamezen protein. Izoelektrična točka proteina je tudi pomembna pri izbiri nosilca. Najpogosteje se za ločevanje proteinov uporabljajo močni ionski izmenjevalci, kot sta sulfonat pri CEX in kvartarne amonijeve spojine v AEX, katerih pKa vrednosti ležijo zunaj območja, v katerem se najpogosteje preučujejo proteini (pH vrednost med 4 in 10), kar pomeni, da se naboji stacionarne faze ne spreminjajo (Fanali in sod., 2017).
Spiranje nabitih delcev vzorcev, ki so bili vezani na kolono, najpogosteje poteka na enega izmed dveh načinov. Bodisi se s spremembo pH vrednosti pufra spremeni neto naboj delcev, ali pa se z dodatkom soli, kot je NaCl, poveča ionsko jakost elucijskega pufra (Fanali in sod., 2017).
2.4.3 Afinitetna kromatografija (z vezanim proteinom A)
Afinitetne kromatografske tehnike za doseganje separacije ali čiščenja vzorca izkoriščajo specifične reverzibilne interakcije, prisotne pogosto v bioloških sistemih. Primer tovrstne interakcije je vezava hormona na receptor ali vezava protitelesa s specifičnim antigenom.
Razvoj metode temelji na vezavi ene izmed molekul interakcijskega para, kot afinitetnega liganda na nosilec stacionarne faze, kot so agaroza ali delci silike. V tako pripravljeno kolono se aplicira vzorec, ki vsebuje drugo molekulo interakcijskega para. Ta se veže z ligandom, ostali delci pa se sperejo iz kolone. Z uporabo drugega pufra, se interakcijo prekine, kar omogoči izpiranje tarčne molekule iz kolone, čemur sledi postopek regeneracije kolone, ki se izvede s spiranjem s prvotnim, nanašalnim pufrom (Fanali in sod., 2017).
Protein A afinitetna kromatografija uporablja naravni ali rekombinantni proteinski ligand, izoliran iz bakterij Staphyloccocus aureus ali Escherichia coli, ki je vezan na matrico stacionarne faze. Specifične regije proteina A omogočajo povezavo z regijo Fc težke verige imunoglobulina G. Možna je tudi vezava izotipov protiteles IgM in IgA ter fragmentov protiteles, ki imajo v svoji strukturi ohranjeno vezavno mesto (primer: Fcab).
Postopek izolacije monoklonskih protiteles poteka v treh glavnih korakih, prikazanih na sliki 5. V prvi stopnji se na kolono nanese predhodno prečiščen vzorec, ki vsebuje protitelesa. Nanašalni pufer ima nevtralno vrednost pH, ki omogoča vezavo protiteles na ligand protein A. Nevezane nečistoče se ob tem izpirajo iz kolone. V naslednji stopnji se z zamenjavo pufra s spiralnim pufrom z nižjim pH razveže protitelesa, ki se tako lahko izperejo iz kolone. Po končani eluciji tarčne molekule je potrebno kolono regenerirati za ponovno uporabo. To se doseže s spiranjem kolone z nanašalnim pufrom. Alternativna afinitetna liganda, ki omogočata vezavo monoklonskih protiteles, sta protein G in protein L, vendar je njuna uporaba redkejša v primerjavi s proteinom A (Ramos-de-la-Peña in sod., 2019).
Slika 5: Shematski prikaz reverzibilne vezave protiteles s proteinom A v kromatografski koloni
Regeneracij a
Vezava protiteles
Elucija protiteles
Izpiranje nevezanih delcev
3 MATERIALI IN METODE
3.1 MATERIALI IN LABORATORIJSKA OPREMA
Preglednica 1: Seznam uporabljene laboratorijske opreme Laboratorijska oprema
Kombiniran hladilnik (4 °C) in zamrzovalnik (-20 °C) Zamrzovalnik ULTRA LOW (-80 °C)
Laboratorijsko stojalo Analitska tehtnica RADWAG
pH meter AD8000 ADWA INSTRUMENTS Magnetno mešalo uniSTIRRER 3 LGG Avtomatske pipete
Spektrofotometer TECAN Inkubatorski stresalnik INFORS Inkubator BINDER
Peristaltične črpalke Mikrokrmilnik ARDUINO
In-line OD senzor (emitor in detektor) Programska oprema CoolTerm Kromatografski sistem ÄKTAexplorer Programska oprema Unicorn
Kromatografska kolona z vezanim proteinom A CYTIVA Elektroforeza BIO-RAD
Preglednica 2: Seznam uporabljenih laboratorijskih materialov Laboratorijski material
Čaše (različni volumni)
Steklenice z navojnim zamaškom (različni volumni) Erlenmajerice s pregradami (različni volumni) Merilni valji (različni volumni)
Nastavki za pipete (različne velikosti) Laboratorijski liji
Silikonske cevi (različnih dimenzij) Mikrocentrifugirke (1,5 in 2 ml) Centrifugirke (50 ml)
Brizge Igle
Erlenmajerica za vakuumsko filtriranje Mikrotitrske plošče P96 (half area)
Sistem za vakuumsko filtracijo (filtrni lijak, nastavek s sintranim diskom, kovinska spojka in zbiralna steklenica)
3.2 METODE
Shema poteka eksperimentalnega dela je vključena v Prilogi A.
3.2.1 Priprava gojišč
V namen gojenja kulture P. pastoris smo tekom procesa uporabljali tri gojišča.
3.2.1.1 Gojišče YPG
Gojišče YPG je bilo prvo revitalizacijsko vegetativno gojišče, uporabljeno za namnožitev kulture iz založne banke, shranjene v glicerolu na -80 °C. Gojišče je sestavljeno iz treh komponent (Preglednica 3).
Preglednica 3: Sestava gojišča YPG
Komponenta Končna koncentracija v gojišču
Kvasni ekstrakt (BioChemica) 10 g/L
Pepton (Sigma-aldrich) 10 g/L
Glukoza (Sigma-aldrich) 70 g/L
Glukoza služi kot glavni vir ogljika, pepton kot vir aminokislin in drugih oblik dušika ter vir mineralov in vitaminov. Prav tako, je kot vir aminokislin in vitaminov, v gojišču kvasni ekstrakt, ki pospešuje rast kvasovk med eksponentno fazo rasti.
Gojišče smo pripravili tako, da smo v merilni ladjici posamezno zatehtali ustrezne količine kvasnega ekstrakta, peptona in glukoze. Komponente smo prenesli v čašo ter jih s pomočjo magnetnega mešala raztopili v primerni količini destilirane vode. Ker je bilo potrebno naknadno umeriti pH gojišča, je morala biti količina destilirane vode manjša od končnega volumna gojišča, saj je bilo potrebno upoštevati dodatek raztopine HCl za nižanje vrednosti pH na 6. Po uravnanju vrednosti pH na 6 smo dolili destilirano vodo do končnega volumna. Pripravljeno gojišče YPG smo 20 minut sterilizirali v avtoklavu pri 121 °C in 1,2 bar. Do uporabe smo ga hranili na 4 °C. Pred uporabo smo v sterilnih pogojih prenesli željen volumen gojišča v erlenmajerice z utori ter ga pred inokulacijo segreli na gojitveno temperaturo (30 °C).
3.2.1.2 Gojišči BMGY in BMMY (angl. Buffered Glycerol-complex Medium in Buffered Methanol-complex Medium)
Gojišče BMGY je služilo kot sekundarno vegetativno gojišče, v katerem smo želeli pridobiti čim večjo gostoto vitalnih celic kulture pred prenosom v indukcijsko gojišče BMMY. Osnovni sestavi gojišč sta bili enaki, razlikovali sta se le v glavnem viru ogljika.
V gojišču BMGY je bil to glicerol, v gojišču BMMY pa je bil namesto glicerola metanol.
Sestavo obeh gojišč prikazuje Preglednica 4.
Preglednica 4: Sestava gojišč BMGY in BMMY
Komponenta Končna koncentracija v gojišču
Kvasni ekstrakt (BioChemica) 10 g/L
Pepton (Sigma-aldrich) 20 g/L
K2HPO4 (Fischer Scientific) 2,29 g/L
KH2PO4 (Fischer Scientific) 11,8 g/L
(NH4)2SO4 (Merck) 10 g/L
Osnovno dušikovo gojišče za kvasovke brez aminokislin – YNB
without aminoacids (Sigma) 3,4 g/L
Biotin 4x10-5 g/L
Glicerol (Honeywell) za BMGY 10 g/L
Metanol (Merck) za BMMY 5 g/L
Gojišče je bilo tekom eksperimentov pripravljeno na več različnih načinov.
Prvotno smo gojišče pripravili po postopku, pri katerem smo posebej pripravili založne raztopine biotina, YNB, glicerola in metanola.
• 10X YNB (osnovno dušikovo gojišče za kvasovke brez aminokislin) + amonijev sulfat
100 ml založne raztopine YNB je vsebovalo 3,4 g YNB brez aminokislin in 10 g (NH4)2SO4, ki smo ju raztopili v destilirani vodi. Sterilnost gojišča smo dosegli z avtoklaviranjem 20 min pri 121 °C in tlaku 1,2 bar.
• 500X biotin (0,02 % (m/v))
Natehtali smo 20 mg biotina in ga raztopili v destilirani vodi. Tako pripravljeno raztopino smo filtrirali skozi sterilni filter s porami velikosti 0,2 µm.
• Glicerol (10 % (v/v)) in metanol (5 % (v/v))
Založni raztopini smo pripravili s pomešanjem pravilne količine glicerola ali metanola in destilirane vode ter ga sterilizirali s postopkom filtracije skozi sterilni filter s porami velikosti 0,2 µm.
Postopek priprave gojišča se je v nadaljevanju eksperimentov spremenil tako, da smo YNB brez aminokislin, amonijev sulfat ter komponenti fosfatnega pufra raztopili z ostalimi osnovnimi komponentami gojišča, saj smo ugotovili, da pri tem ne prihaja do obarjanja. To je bil osnovni razlog, zaradi katerega se je založna raztopina YNB brez aminokislin z amonijevim sulfatom v prvotnem, privzetem postopku avtoklavirala posamezno. Sterilizacija temperaturno občutljivih komponent gojišča (biotina in metanola) se je še naprej izvajala preko sterilnega filtra, podobno kot tudi založna raztopina glicerola. Razlog ločene priprave glicerola je bil v varčevanju časa in materiala, saj smo lahko enako osnovno gojišče brez dodanih virov ogljika uporabili tako za pripravo gojišča BMGY kot gojišča BMMY.
Pri testiranju vpliva pH na rast kulture smo postopek priprave gojišča rahlo prilagodili.
Zaradi potrebe različnih začetnih vrednostih pH v gojiščih smo v destilirani vodi raztopili vse komponente osnove gojišča za pripravo gojišč BMGY in BMMY (brez dodatka biotina, metanola ali glicerola) ter z uporabo 1 M HCl ali 1 M NaOH prilagodili vrednost pH.
3.2.3 Bioreaktorski sistem 3.2.3.1 Sestava
Za gojenje kulture smo uporabljali bioreaktorski sistem, ki ga je sestavljal sistem medsebojno povezanih reagenčnih steklenic in steklene viale. Glavne posode so bile medsebojno povezane s sistemom silikonskih cevk, sterilnost znotraj steklenic pa se je ohranjala z uporabo penastih čepov na reagenčnih steklenicah in silikonskih čepkov na viali. Poenostavljena shema zaporedne vezave je predstavljena na sliki 6. Prva steklenica na sliki označena z A, je vsebovala sterilno destilirano vodo in je služila navlaženju zraka, ki smo ga vpihovali v sistem. V sistem smo preko zračnega filtra s porami 0,22 μm vpihovali zrak s pretokom 2 L/min. Iz prve steklenice je vodila druga cev, preko katere smo z navlaženim zrakom prepihovali sterilno gojišče v drugi reagenčni steklenici, na sliki označeni z B. S sistemom cevi in črpalk smo s kisikom nasičeno gojišče prečrpavali v poljubno število sistemov (na sliki predstavljena postavitev za en bioreaktor označen kot C). Cev, ki je bila uporabljena za prečrpavanje gojišča, je bila poleg silikonskega dela sestavljena tudi iz krajšega dela mehansko odpornejše cevi Masterflex L/S® PharMed®
BPT, L/S 13. Ta del, je bil uporabljen na mestu v peristaltični črpalki, kjer je bila mehanska odpornost cevi ključnega pomena, saj je le ta omogočala ohranjanje
konstantnega pretoka tekom daljše obremenitve, ki bi sicer povzročila deformacije silikonske cevi. Ohranjanje razmerja pretokov in obratov črpalke smo med zaporednimi procesi ohranjali z zamenjavo tega krajšega dela cevi, saj se lastnosti cevi spremenijo z večkratnim avtoklaviranjem. Bioreaktor je sestavljala steklena viala z delovnim volumnom 25 mL, v kateri je bilo mešanje zagotovljeno z uporabo magnetnega mešala.
Dovod gojišča v bioreaktor je potekal preko kapilare, ki je bila nameščena skozi silikonski čep. Enako je veljalo za iztok iz bioreaktorja, pri čemer je bilo potrebno dolžino kapilare na notranji strani bioreaktorja prilagoditi tako, da je bila v stiku z gladino bioprocesne brozge na delavnem volumnu. Na ta način smo v sistemu ohranjali konstanten volumen.
Iztok je bil speljan v zbiralno čašo, katere volumen je moral biti prilagojen glede na pričakovan pretok gojišča tekom procesa. Za spremljanje rasti kulture v bioreaktorju je bil uporabljen in-line senzor za merjenje optične gostote. Senzor je bil sestavljen iz emitorja in detektorja, ki sta bila umeščena v ohišje, ki je obdajalo stekleno vialo. Pri tem je bilo pomembno, da je bila pot laserskega žarka emitorja poravnana z detektorjem na drugi strani, saj je bilo le tako možno natančno beleženje vrednosti merjenih pri valovni dolžini 600 nm. Podatke detektorja smo v tekstovno obliko beležili z uporabo vmesnika CoolTerm. Bioreaktorski sistem je bil postavljen znotraj inkubatorja, kar nam je omogočalo temperaturno regulacijo tako bioreaktorja kot tudi gojišča v založni steklenici B in ceveh.
Kljub temu, da se ob metabolizmu in rasti kulture sprošča veliko toplote, zaradi majhnega razmerja med volumnom in površino bioreaktorja nismo predvidevali neželenega pregrevanja.
Slika 6: Shema sestave kontinuirnega bioreaktorskega sistema. Sistem sestavljajo: steklenica A s sterilno demi H2O, steklenica B z založnim produkcijskim gojiščem, peristaltična črpalka, bioreaktor (C) z mešalcem in in-line senzorjem absorbance ter zbiralnik na (D) na iztoku iz bioreaktorja. Konfiguracija omogoča vzporedno vodenje večih bioreaktorjev, pri katerih je pretok svežega gojišča iz steklenice B upravnan z ločeno črpalko.
3.2.3.2 Sterilizacija, postavitev in zagon
Sterilizacija reaktorskega sistema je potekala tako, da smo posamezne dele avtoklavirali 45 minut na 121 °C na 1,2 bar. Na ta način smo avtoklavirali silikonske cevi in reagenčno steklenico B, ki je vsebovala osnovni del gojišča BMMY. To gojišče ni vsebovalo biotina in metanola, ki sta temperaturno občutljiva in bi v postopku avtoklaviranja razpadla, ali izhlapela iz gojišča. Podobno smo avtoklavirali tudi prazne viale, mešala in silikonske čepe z vstavljenimi kapilarami. Postopku sterilizacije je sledilo ohlajanje komponent na sobno temperaturo. V tem času smo segreli inkubator na delavno temperaturo (30 °C). Ko se je gojišče v steklenici B ohladilo, smo mu v sterilni komori dodali prave koncentracije založnih, s filtrom steriliziranih raztopin biotina in metanola. Bioreaktorje smo prav tako v sterilni komori napolnili z želenim volumnom posebej pripravljenega začetnega gojišča. Pri tem smo morali upoštevati volumen inokuluma, ki smo ga kasneje nameravali dodati gojišču.
Steklenico z založnim produkcijskim gojiščem in bioreaktor smo medsebojno sterilno povezali preko silikonskih cevi ter del mehansko odpornejše cevi vpeli v peristaltično črpalko. V naslednji točki smo vklopili beleženje podatkov in-line OD senzorjev in pomerili slepe vzorce začetnega gojišča. Podatke smo kasneje pri obdelavi podatkov potrebovali za
