UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA MIKROBIOLOGIJO
Doroteja VLAJ
IZOLACIJA AKTINOMICET IZ SLOVENSKIH KRAŠKIH JAM IN VREDNOTENJE NJIHOVE
PROTIMIKROBNE AKTIVNOSTI
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij - 2. stopnja Mikrobiologija
Ljubljana, 2022
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA MIKROBIOLOGIJO
Doroteja VLAJ
IZOLACIJA AKTINOMICET IZ SLOVENSKIH KRAŠKIH JAM IN VREDNOTENJE NJIHOVE PROTIMIKROBNE AKTIVNOSTI
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij - 2. stopnja Mikrobiologija
ISOLATION OF ACTINOMYCETES FROM SLOVENIAN KARST CAVES AND EVALUATION OF THEIR ANTIMICROBIAL
ACTIVITY
M. SC. THESIS
Master Study Programmes: Microbiology
Ljubljana, 2022
Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Mikrobiologija.
Delo je bilo opravljeno na Katedri za biotehnologijo, mikrobiologijo in varnost živil Oddelka za živilstvo na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorico magistrskega dela imenovala izr. prof. dr.
Anjo Klančnik, za somentorico asist. dr. Majo Paš in za recenzenta prof. dr. Blaža Stresa.
Mentorica: izr. prof. dr. Anja KLANČNIK Somentorica: asist. dr. Maja PAŠ
Recenzent: prof. dr. Blaž STRES
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Hrvoje PETKOVIĆ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: izr. prof. dr. Anja KLANČNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fak., Oddelek za živilstvo Član: asist. dr. Maja PAŠ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fak., Oddelek za živilstvo Član: prof. dr. Blaž STRES
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fak., Oddelek za mikrobiologijo
Datum zagovora:
Doroteja Vlaj
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2
DK UDK 579.87:551.435.84:615.332(043)=163.6
KG aktinomicete, slovenske kraške jame, izolacija, gojenje, ekstrakcija, tankoplastna kromatografija, sekundarni metaboliti, protimikrobna aktivnost
AV VLAJ, Doroteja, dipl. mikrobiol. (UN)
SA KLANČNIK, Anja (mentorica), PAŠ, Maja (somentorica), STRES, Blaž (recenzent)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za mikrobiologijo LI 2022
IN IZOLACIJA AKTINOMICET IZ SLOVENSKIH KRAŠKIH JAM IN VREDNOTENJE NJIHOVE PROTIMIKROBNE AKTIVNOSTI TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja Mikrobiologija) OP XI, 59 str., 11 pregl., 20 sl., 4 pril., 42 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Problem zdravljenja nalezljivih bolezni se zaradi pojava odpornosti bakterij povečuje. Razvoj novih protimikrobnih učinkovin se je usmeril v spremembe struktur že obstoječih antibiotikov in v iskanje novih učinkovin ter novih načinov delovanja antibiotikov v celici. Nove učinkovine so lahko prisotne tudi v ekstremnih in premalo raziskanih okoljih, kot so jamski ekosistemi z genetsko in metabolno raznolikimi mikroorganizmi. Zato smo se v magistrskem delu usmerili na jamsko okolje, iz katerega smo v sodelovanju pridobili jamske vzorce sedimentov, prsti, jamskega mleka ter glinene zapolnitve iz vrtin. Nato smo s pomočjo različnih selektivnih gojišč iz jamskih vzorcev pridobili 214 izolatov aktinomicet. Vsak izolat smo gojili v produkcijskem gojišču, iz katerega smo nato pripravili izvleček sekundarnih metabolitov. Pripravljenim izvlečkom sekundarnih metabolitov vsakega izolata aktinomicet smo ovrednotili protimikrobno aktivnost proti bakterijam Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, ter kvasovkam Saccharomyces cerevisiae in Candida albicans. Uporabili smo metodo difuzije v trdnem gojišču z merjenjem con inhibicije. Rezultati so potrdili protimikrobno aktivnost pri 107-ih izvlečkih sekundarnih metabolitov izolatov aktinomicet iz jamskega okolja. Največ izvlečkov (48 %) je imelo protibakterijsko aktivnost proti bakterijami M. luteus. Izpostavimo lahko še protibakterijsko aktivnost proti bakterijam S. aureus (14 % izvlečkov), proti E. coli (7 % izvlečkov), ter proti P. aeruginosa (2 % izvlečkov). Največ izvlečkov (11 %) je imelo protiglivno aktivnost proti kvasovkam S. cerevisiae, izpostavimo lahko še aktivnost proti C.
albicans (5 % izvlečkov). Aktivne sekundarne učinkovine izolatov z dokazano protimikrobno aktivnostjo bodo v nadaljevanju raziskav okarakterizirane.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 579.87:551.435.84:615.332(043)=163.6
CX actinomycetes, Slovenian karst caves, isolation, cultivation, extraction, thin layer chromatography, secondary metabolites, antimicrobial activity
AU VLAJ, Doroteja
AA KLANČNIK, Anja (supervisor), PAŠ, Maja (co-advisor), STRES, Blaž (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Microbiology PY 2022
TI ISOLATION OF ACTINOMYCETES FROM SLOVENIAN KARST CAVES AND EVALUATION OF THEIR ANTIMICROBIAL ACTIVITY
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Microbiology) NO XI, 59 p., 11 tab., 20 fig., 4 ann., 42 ref.
LA sl AL sl/en
AB Infectious diseases have recently become a serious threat to human health, due to the emergence of multiple drug resistance. The development of new antimicrobial agents has focused on modifying the structures of existing antibiotics and finding new mechanisms of action, as well as finding new antimicrobial agents in extreme and under-researched environments, such as cave ecosystems that offer unexplored genetic and metabolic diversity. Therefore, in the master's thesis we focused on the cave environment, from which we obtained cave samples of sediments, soil, cave milk and clay fillings from wells. We succeeded in isolating cave actinomycetes using selective media and obtaining extracts of secondary metabolites by culturing strains in a production medium. The extracts were used to test antimicrobial activity against selected bacteria Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and yeast Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. We found that 107 strains of isolated actinomycetes produced bioactive substances that inhibited the growth of test microorganisms. Activity against M.
luteus was shown by 48% of the extracts, activity against S. aureus by 14% of the extracts, against E. coli by 7% of the extracts, and against P. aeruginosa by 2% of the extracts. Activity against S. cerevisiae showed 11% of the extracts and against C.
albicans 5% of the extracts. Isolated strains of actinomycetes that have shown strong antimicrobial activity against Gram-positive and negative bacteria will be involved in further research with the aim of characterizing pure active substance.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO PREGLEDNIC VIII
KAZALO SLIK IX
KAZALO PRILOG X
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI XI
1 UVOD 1
1.1 NAMEN MAGISTRSKEGA DELA 2
1.2 DELOVNE HIPOTEZE 2
2 PREGLED OBJAV 3
2.1 AKTINOMICETE 3
2.1.1 Taksonomija aktinomicet 3
2.1.2 Ekologija aktinomicet 3
2.1.3 Morfologija in razmnoževanje aktinomicet 5
2.1.4 Proizvodnja antibiotikov z aktinomicetami 6
2.2 KRAS IN KRAŠKE JAME V SLOVENIJI 9
2.2.1 Aktinomicete v jamah 11
2.2.2 Izolacija aktinomicet iz jam 12
2.2.3 Bioaktivne učinkovine aktinomicet iz jam 14
3 MATERIAL IN METODE 16
3.1 MATERIAL 16
3.1.1 Jamski vzorci 16
3.1.2 Mikrobiološka gojišča 17
3.1.3 Antibiotiki 20
3.1.4 Raztopine 20
3.1.5 Mikroorganizmi 21
3.1.6 Laboratorijski material 21
3.1.7 Laboratorijske aparature 22
3.2 METODE 22
3.2.1 Shema laboratorijskega dela 22
3.2.2 Optimizacija pogojev gojenja aktinomicet za izolacijo 23 3.2.3 Izolacija aktinomicet iz vzorcev (PO1-PL8) 24 3.2.4 Shranitev izoliranih aktinomicet iz jamskih vzorcev 25
3.2.5 Revitalizacija izolatov aktinomicet 25
3.2.6 Gojenje aktinomicet 25 3.2.7 Priprava izvlečkov sekundarnih metabolitov izolatov aktinomicet 25
3.2.8 Tankoplastna kromatografija (TLC) 25
3.2.9 Ovrednotenje protimikrobne aktivnosti z metodo difuzije v trdnem gojišču 26
4 REZULTATI 28
4.1 OPTIMIZACIJA POGOJEV GOJENJA ZA IZOLACIJO AKTINOMICET 28 4.1.1 Izbor gojišča in temperature inkubacij pri izolaciji aktinomicet 28 4.1.2 Optimizacija izolacije s pred-aktivacijo spor ali brez pred-aktivacije spor 29 4.1.3 Optimizacija izolacije z dodatkom nalidinske kisline 30
4.2 IZOLACIJA AKTINOMICET IZ VZORCEV 31
4.3 GOJITEV AKTINOMICET 32
4.3.1 Opazovanje morfologije kolonij aktinomicet 32 4.3.2 Ovrednotenje vpliva revitalizacije na protimikrobno aktivnosti aktinomicet
33 4.4 TANKOPLASTNA KROMATOGRAFIJA SEKUNDARNIH METABOLITOV 34
4.4.1 Povezava med profili TLC, morfologijo kolonij izolatov aktinomicet ter protimikrobno aktivnostjo izvlečkov sekundarnih metabolitov izolatov
aktinomicet 34
4.5 OVREDNOTENJE PROTIMIKROBNE AKTIVNOSTI IZVLEČKOV
SEKUNDARNIH METABOLITOV IZOLATOV AKTINOMICET 35
4.5.1 Potek ovrednotenja protimikrobne aktivnosti, vpliva gojišča na
protimikrobno aktivnost ter obstojnosti izvlečkov sekundarnih metabolitov
izolatov aktinomicet 35
4.5.2 Protibakterijska aktivnost izvlečkov sekundarnih metabolitov izolatov
aktinomicet 37
4.5.3 Protiglivna aktivnost izvlečkov sekundarnih metabolitov izolatov
aktinomicet 42
4.5.1 Protibakterijska in protiglvina aktivnost izvlečkov sekundarnih
metabolitov izolatov aktinomicet 43
5 RAZPRAVA 46
5.1 IZOLACIJA AKTINOMICET IZ SLOVENSKIH KRAŠKIH JAM 46
5.2 MIKROBNA RAZNOLIKOST AKTINOMICET IZ SLOVENSKIH KRAŠKIH
JAM 46
5.3 PROTIMIKROBNA AKTIVNOST JAMSKIH AKTINOBAKTERIJ 48
5.3.1 Problem odpornosti mikroorganizimov 48
5.3.2 Protibakterijska aktivnost jamskih aktinobakterij 49 5.3.3 Protiglivna aktivnost jamskih aktinobakterij 51
6 SKLEPI 52
7 POVZETEK 53
8 VIRI 55
ZAHVALA PRILOGE
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Vzorci pridobljeni na Krasu in v slovenskih kraških jamah. ... 16
Preglednica 2: Sestava gojišča SM. ... 17
Preglednica 3: Sestava gojišča CRM. ... 18
Preglednica 4: Sestava gojišča ISP 4. ... 18
Preglednica 5: Sestava vegetativnega gojišča TSB. ... 19
Preglednica 6: Sestava produkcijskega gojišča GOTC z dodatkom glukoze. ... 19
Preglednica 7: Sestava gojišča 2TY. ... 20
Preglednica 8: Sestava trdnega gojišča YPD. ... 20
Preglednica 9: Protimikrobna aktivnost izvlečkov sekundarnih metabolitov izolatov aktinomicet, ki so pokazale aktivnost samo proti bakterijam.. ... 38
Preglednica 10: Protimikrobna aktivnost izvlečkov sekundarnih metabolitov aktinomicet, ki so pokazale aktivnost samo proti glivam.. ... 43
Preglednica 11: Protimikrobna aktivnost izvlečkov sekundarnih metabolitov aktinomicet, ki so pokazale obe aktivnosti – protibakterijsko in protiglivno... 44
KAZALO SLIK
Slika 1: Ekologija aktinomicet in njihova prisotnost v okolju (van der Meij in sod., 2017). 4 Slika 2: Razvojni življenjski cikel streptomicet (Barka in sod., 2016). ... 6 Slika 3: Glavne tarče antibiotikov v celici (Grasso in sod., 2016). ... 8 Slika 4: Območje krasa v Sloveniji. Označene so tri glavne vrste krasa: alpski kras,
dinarski kras in izolirani kras (Mihevc in sod., 2016). ... 10 Slika 5: Planinsko polje ter glavne jame in reke Cerkniškega polja in porečja Pivke
(Mihevc in sod., 2016). ... 11 Slika 6: Shematski prikaz podzemne reke Pivke, jame skozi katere teče ter vzorčna mesta (Kataster jam, Inštitut za raziskovanje krasa ZRC SAZU; Speleološka zveza Slovenije). . 17 Slika 7: Shema poteka laboratorijskega dela. ... 23 Slika 8:Shema optimizacije pogojev gojenja aktinomicet za izolacijo ... 24 Slika 9: Primer rasti aktinomicet vzorca JM pri temperaturi 28 °C: na gojišču CRM (A);
gojišču JM (B); ter gojišču ISP 4 (C). ... 29 Slika 10: Primer rasti aktinomicet vzorca JMK na gojišču ISP 4 pri temperaturi 28 °C: s stopnjo pred-aktivacije spor (A); ter brez stopnje pred-aktivacije spor (B). ... 30 Slika 11: Primer rasti aktinomicet vzorca JMK na gojišču CRM pri temperaturi 28 °C: brez dodane nalidinske kisline (A); ter z dodano nalidinsko kislino (B). ... 31 Slika 12: Primer izgleda kolonij izoliranih aktinomicet iz vzorca PO4, ki smo jih shranili v zbirko BF_KS. ... 31 Slika 13: Primer izgleda kolonij izoliranih aktinomicet iz vzorca PL7, ki smo jih shranili v zbirko BF_KS. ... 32 Slika 14: Primerjava rasti aktinomicet vzorcev BF_KS: 154, 155 in 156 na: gojišču ISP 4 (A) ter gojišču SM (B). ... 33 Slika 15: Profil sekundarnih metabolitov izolatov aktinomicet na TLC pod UV svetlobo. 35 Slika 16: Primer trdnega gojišča s conami inhibicije po inkubaciji. ... 37 Slika 17: Rast izolata aktinomicet BF_KS230 na gojišču SM (A). Profil izvlečkov
sekundarnih metabolitov izolata aktinomicet BF_KS230 na TLC (označen z oranžno) (B).
... 41 Slika 18: Rast izolatov aktinomicet BF_KS246 in BF_KS245 na gojišču SM (A). Profil izvlečkov sekundarnih metabolitov izolatov aktinomicet BF_KS245 (označen z rumeno) in BF_KS246 (označen z oranžno) na TLC (B). ... 41 Slika 19: Rast izolata aktinomicet BF_KS289 na gojišču SM (A). Profil izvlečkov
sekundarnih metabolitov izolata aktinomicet BF_KS289 na TLC (označen z oranžno) (B).
... 42 Slika 20: Rast izolata aktinomicet BF_KS252 na gojišču SM (A). Profil izvlečkov
sekundarnih metabolitov izolata aktinomicet BF_KS252 na TLC (označen z oranžno) (B).
... 45
KAZALO PRILOG
Priloga A: Slike inhibicijskih con testov protimikrobne aktivnosti proti izbranim testnim bakterijam in kvasovkam.
Priloga B: Preglednica s podatki o izolatih aktinomicet (ime izolata, vzorčno mesto, morfologija kolonij na trdnih gojiščih in v tekočih gojičih, premeri inhibicijskih con merjenja protimikrobne aktivnosti).
Priloga C: Drevesa združevanja za protimikrobne aktivnosti.
Priloga D: Preglednica s sestavinami za različna gojišča za izolacijo aktinomicet in pripadajoče drevo združevanja.
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
DNK deoksiribonukleinska kislina
GC bazni par gvanin-citozin
MRSA proti meticilinu odporna bakterija Staphylococcus aureus (angl. methicillin-resistant Staphylococcus aureus)
PCD programiran celična smrt (angl. programed cell death) RNK ribonukleinska kislina
TLC tankoplastna kromatografija (angl. thin layer chromatography)
UV ultravijolična svetloba
VRE proti vankomicinu odporne bakterije Enterococcus spp.
(angl. vancomycin-resistant Enterococcus spp.)
1 UVOD
Večkratna odpornost bakterij proti antibiotikom je eden večjih izzivov pri zdravljenju nalezljivih bolezni, tako v širši skupnosti, kot tudi v bolnišničnih okoljih. Intenzivna prizadevanja za odkrivanje protimikrobnih učinkovin so ustvarila veliko število antibiotikov širokega spektra. Razvoj farmacevtskih industrij je na tem področju v zadnjih dveh desetletjih dramatično upadel, zato je v zdravstvu prišlo do pomanjkanja novih antibiotikov z novimi mehanizmi delovanja. Izziv predstavlja zdravljenje okužb s po Gramu pozitivnimi bakterijami, kot so bakterije Staphylococcus aureus in proti meticilinu odpore bakterije S.
aureus (MRSA). V bolnišničnih okoljih pa predstavlja tudi izziv zdravljenje večkratno odpornih po Gramu negativnih bakterij, ki so povezane z veliko smrtnostjo v tem okolju.
Znanstveniki dokazujejo odpornost bakterij že na novejše antibiotike, kot sta antibiotika kolistin in polimiksin B. Najbolj zaskrbljujoče pa je, da se v zadnjem času pojavlja večkratna odpornost pri pomembnih patogenih bakterijah, kot so Enterococcus faecium, S. aureus, Klebsiella pneumonie, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa in Enterobacter sp. (Genilloud, 2017).
Aktinobakterije, med katere spadajo tudi aktinomicete, so bile desetletja eden najpomembnejših virov za odkrivanje novih antibiotikov in njihovih analogov, ki so bili uspešno uvedeni na trg in se še danes uporabljajo v klinični praksi (Genilloud, 2017). Veliko pripadnikov raznovrstnih aktinobakterijskih taksonov pa proizvaja tudi široko paleto drugih biološko aktivnih učinkovin, kot so npr. protirakave ali protiglivne učinkovine (Rangseekaew in Pathom-aree, 2019). Aktinobakterije spadajo v skupino po Gramu pozitivnih bakterij z visokim deležem baznih parov GC v svojem genomu in proizvajajo približno dve tretjini vseh antibiotikov, ki jih poznamo na trgu. Večina jih je iz rodu Streptomyces (Barka in sod., 2016).
Iskanje novih zdravilnih učinkovin in učinkovin z novimi načini delovanja je spodbudilo tudi vključitev ekstremnih ter manj raziskanih okolij z namenom odkritja učinkovitejših sekundarnih metabolitov oz. novih spojin. Jamski ekosistemi so pritegnili zanimanje raziskovalne skupine zaradi svojih edinstvenih značilnosti, kot so visoka vlažnost, sorazmerno nizka in stabilna temperatura ter malo hranil. Ti ekstremni pogoji omogočijo preživetje genetsko in metabolno raznovrstnih mikroorganizmov, ki pripadajo novim taksonom in imajo biotehnološke koristi. Raziskovalci poročajo kar o 47 vrstah izolatov iz 30 rodov aktinobakterij iz jamskih habitov (Rangseekaew in Pathom-aree, 2019).
1.1 NAMEN MAGISTRSKEGA DELA Namen magistrskega dela je:
(i) pridobiti izolate aktinomicet iz slovenskih kraških jam (npr. sedimenti, prst, jamsko mleko in glinene zapolnitve iz vrtin) z uporabo različnih selektivnih gojišč in jih shraniti v zbirko;
(ii) z gojenjem izolatov v produkcijskem gojišču pridobiti izvlečke sekundarnih metabolitov izolatov aktinomicet in jim ovrednotiti protimikrobno aktivnost proti izbranim sevom bakterij in kvasovk;
(iii) preko ovrednotene protimikrobne aktivnosti vsakemu izolatu aktinomicet določiti sposobnost proizvodnje bioaktivnih učinkovin.
1.2 DELOVNE HIPOTEZE
Slovensko kraško območje s svojim raznovrstnim jamskim svetom ponuja veliko možnosti za raziskovanje biodiverzitete mikrobnega sveta in njihovih naravnih produktov. Naše delovne hipoteze so:
HIPOTEZA 1: aktinomicete so prisotne tudi v vzorcih iz slovenskih kraških jam;
HIPOTEZA 2: sestava gojišča in pogoji gojenja vplivajo na rast in produkcijo bioaktivnih učinkovin izbranih izolatov aktinomicet;
HIPOTEZA 3: nekateri izolati aktinomicet proizvajajo bioaktivne učinkovine, ki vplivajo na rast izbranih sevov bakterij in kvasovk.
2 PREGLED OBJAV 2.1 AKTINOMICETE
2.1.1 Taksonomija aktinomicet
Aktinomicete so aerobne, sporogene, po Gramu pozitivne bakterije z visokim deležem baznih parov GC (57–75 %) v genomu. Zanje je značilna rast substratnega in zračnega micelija (Bhatti in sod., 2017). Aktinobakterije spadajo v domeno Bacteria. Deblo Actinobacteriota je razdeljeno na razrede: Acidimicrobiia, Actinomycetia, Coriobacteriia, Rubrobacteria in Thermoleophilia, UBA1414, UBA4738, UBA9087 in RBG-13-55-18 (GTDB, 2022). Rodovi tega debla kažejo izjemno raznolikost glede svoje morfologije, fiziologije in presnovnih sposobnosti (Barka in sod., 2016). Razred Actinomycetia vsebuje 14 redov: Acidothermales, Actinomycetales, Euzebyales, Jiangellales, Mycobacteriales, Nanopelagicales, Nitriliruptorales, Propionibacteriales, Sporichthyales, Streptomycetales, Streptosporangiales, JACCUZ01, JACCYY01, RP-AC37 (Parks in sod., 2022).
2.1.2 Ekologija aktinomicet
Aktinobakterije najdemo po celem svetu. Tvorijo stabilno in obstojno populacijo v različnih naravnih ekosistemih in predstavljajo ubikvitarno skupino mikrobov. Kot je prikazano na Sliki 1, so prisotne predvsem v tleh, kjer prevladujejo v suhi alkalni prsti, in imajo ključno vlogo pri kroženju organske snovi v talnih ekosistemih. Razširjene so tudi v raznolikih vodnih ekosistemih, vključno s sedimenti pridobljenimi iz globokega morja. Lahko so prisotne v ekstremnih okoljih, predvsem v kriofilni regiji Antarktika in celo v puščavskih tleh (Bhatti in sod., 2017). Aktinomicete iz rodu Streptomyces tvorijo tesne povezave z rastlinami kot (endo)simbioti, saprofiti in patogeni, najdemo pa jih tudi v mikrobiomih morskih organizmov, kot so spužve, morske kumare in morske alge, zraven rodov Nocardiopsis in Micromonospora (van der Meij in sod., 2017). Večina aktinobakterij (zlasti streptomicete) so saprofitski organizmi, ki živijo v tleh, in velik del svojega življenjskega cikla preživijo kot semidormantne spore, še posebej v pogojih omejenih s hranili.
Aktinobakterije najdemo tako na površini tal, kot v globinah več kot 2 metra pod zemljo (Barka in sod., 2016). Populacija je največja v površinski plasti tal in se postopoma zmanjšuje z globino, posamezni sevi pa so lahko prisotni v vseh slojih tal (Bhatti in sod., 2017). Večina aktinobakterij je aerobnih, vendar obstajajo izjeme, ki so anaerobne. Lahko so heterotrofne ali kemoavtotrofne, vendar je večina kemoheterotrofnih in lahko uporablja najrazličnejše prehranske vire, na primer beljakovine in različne kompleksne polisaharide (Barka in sod., 2016), kot so celuloza, hemi-celuloza in lignin, nekatere pa celo voske, smole, parafine in naftne vire ogljika. Kot vir dušika jim služijo nitrati, amonijeve soli, sečnina, aminokisline in druge snovi. V tleh opravljajo različne procese kot so fiksacija amonija, razgradnja celičnega tkiva ter sinteza in razgradnja humusa. So najbolj razširjeni organizmi,
ki v tleh tvorijo nitaste filamente in rastejo podobno kot glive. Nitasta filamentozna rast je značilna predvsem za aktinomicete iz rodov Streptomyces in Micromonospora. Ob rasti tvorijo pogosto veliko razvejanih hif, na konicah teh hif se tvorita ena ali dve spori. Organske ostanke v tleh najprej napadejo bakterije in glive, šele pozneje tudi aktinomicete, ker so počasnejše v aktivnosti in rasti od drugih bakterij in gliv. Razgradijo bolj odporne in težko razgradljive organske snovi in tvorijo črne in rjave pigmente, ki prispevajo k temni barvi talnega humusa, in dajejo značilen "zemeljski" vonj (Bhatti in sod., 2017).
Slika 1: Ekologija aktinomicet in njihova prisotnost v okolju (van der Meij in sod., 2017).
Gostota naseljenosti talnih aktinobakterij je odvisna od njihovega habitata in prevladujočih podnebnih razmer (Barka in sod., 2016), ocenjene vrednosti se gibljejo od 104 do 108 celic na gram zemlje (Bhatti in sod., 2017). Prevladuje rod Streptomyces, ki predstavlja več kot 95 % sevov Actinomycetales izoliranih iz tal. Na rast aktinobakterij vplivajo tudi drugi
dejavniki, kot so temperatura, vrednost pH in vlaga v tleh. Tako kot druge talne bakterije, so tudi aktinobakterije večinoma mezofilne, z optimalno rastjo pri temperaturah med 25 °C in 30 °C, termofilne aktinobakterije pa rastejo tudi pri temperaturah od 50 °C do 60 °C. Za vegetativno rast aktinobakterij v tleh je ugodna nizka vlažnost. Večina aktinobakterij raste v tleh pri vrednosti pH med 6 in 9, z optimalno rastjo okrog nevtralne vrednosti pH. Prvo študijo o vplivu podnebja na razširjenost aktinobakterij sta opravila Hiltner in Strömer, ki sta pokazala, da te bakterije spomladi predstavljajo 20 % mikrobiote tal, jeseni pa več kot 30 % zaradi velike količine rastlinskih ostankov, ki so na voljo v tem letnem času. Pozimi pa zmrzal zmanjša njihovo relativno številčnost na le 13 % (Barka in sod., 2016).
2.1.3 Morfologija in razmnoževanje aktinomicet
Aktinomicete se razmnožujejo s sporulacijo. Primer življenjskega cikla aktinomicet lahko opišemo na primeru življenjskega cikla rodu Streptomyces. Kot je prikazano na Sliki 2 se življenjski cikel začne se ob ugodnih razmerah s kalitvijo spor. Nato spora kali tako, da tvori eno ali dve kalitveni cevki, ki se naprej razvijeta v hife. Hife rastejo z razvejanjem in podaljšanjem konic, pri čimer se sproščajo zunajcelični encimi, ki razgrajujejo polimere, kot so hitin in celuloza, za zagotovitev hranil. Vzpostavi se mreža hif, ki skupaj tvorijo vegetativni micelij. Kot odziv na stres ob pomanjkanju hranil, se del micelija žrtvuje po avtolitični razgradnji s programirano celično smrtjo (angl. programed cell death, PCD). To nadalje vodi do sproščanja hranil v okolju, ki bodo uporabljena za tvorbo zračnih hif in spor.
Začetek diferenciacije celic sovpada s proizvodnjo antibiotikov, ki zagotavljajo zaščito pred konkurenčnimi mikroorganizmi, ki jih privlačijo hranila, sproščena med procesom PCD (Slika 2). Reproduktivne zračne hife so podvržene obsežni replikaciji DNK in celični delitvi za tvorbo verig spor, pri čemer vsaka spora vsebuje en sam kromosom. Začetek razvoja uravnavajo geni bld. Geni, ki so odgovorni za tvorbo zrelih in sivo pigmentiranih spor, so geni whi (van der Meij in sod., 2017). Pri vrstah rodu Streptomyces lahko sporogena celica vsebuje 50 ali več kopij kromosoma; vrstni red, položaj in ločevanje kromosomov med sporulacijo je linearno, kar vključuje vsaj dva sistema (ParAB in FtsK), ki vodita do diferenciacije in septacije apikalnih celic v verige spor (de Lima Procópio in sod., 2012).
Slika 2: Razvojni življenjski cikel streptomicet (Barka in sod., 2016).
Bioaktivni sekundarni metaboliti imajo lahko protibakterijske, protiglivne, protivirusne, protitumorske ali insekticidne aktivnosti. V svojem naravnem okolju aktinomicete izmenjujejo kemijske spojine z drugimi člani mikrobne skupnosti, poleg interakcij z mikroorganizmi pa nitaste aktinobakterije komunicirajo tudi z višjimi organizmi in pogosto živijo v simbiozi s svojimi gostitelji, kar je povezano z njihovo sposobnostjo proizvajanja koristnih naravnih produktov, kot so protimikrobna sredstva za boj proti bakterijam in glivam ali encimi za razgradnjo elastičnih biopolimerov (van der Meij in sod., 2017).
Kompleksna regulatorna omrežja urejajo procese, ki omogočajo prilagajanje aktinomicet hitro spreminjajočim se razmeram okolja v katerem živijo. To je bistvenega pomena, ker so te bakterije negibljivi micelarni organizmi, sporulacija pa je edini način, da se izognejo lokalnim biotskim in abiotskim stresom, kot so pomanjkanje hranil, sprememba vrednosti pH, anaerobioza ali mikrobna konkurenca. Talne bakterije se spopadajo tudi s stresi, kot so UV, reaktivne kisikove spojine in reaktivne dušikove spojine, suša in toplota.
2.1.4 Proizvodnja antibiotikov z aktinomicetami
Aktinomicete proizvajajo približno dve tretjini vseh znanih antibiotikov, od teh jih večino proizvedejo streptomicete. Genomi aktinomicet vsebujejo veliko biosintetskih genskih
skupin za antibiotikom podobne snovi, številni sekundarni metaboliti teh genskih skupin pa so v laboratorijskih pogojih slabo izraženi in predstavljajo potencialno zakladnico novih antibiotikov. Nadzor nad utišanimi geni za te metabolite je najverjetneje povezan z ekološkimi pogoji, v katerih se je razvila proizvodnja antibiotikov. Proizvodnja antibiotikov je močno povezana s količino hranil v okolju, predvsem z razpoložljivostjo ogljika in dušika.
Ugotovljeno je, da glukoza in drugi ugodni viri ogljika zavirajo morfološko in kemijsko diferenciacij streptomicet, enako velja tudi za dušik (van der Meij in sod., 2017), in s tem zavirajo nastajanje številnih sekundarnih presnovkov, npr. aktinorhodina v bakterijah Streptomyces lividans. Poročali so namreč, da glukoza zavira proizvodnjo aktinorhodina z represijo transkripcije gena afsR2, ki kodira globalni regulativni protein, ki sodeluje pri stimulaciji biosinteze sekundarnih metabolitov. Visoka koncentracija dušikovih virov (npr.
amonija ali aminokislin) prav tako zavira sekundarni metabolizem. Kompleksni fermentacijski mediji vključujejo beljakovine kot vire dušika. Na primer, proizvodnja streptomicinskega antibiotika v bakterijah Streptomyces griseus poteka v sojini moki z L- prolinom in nizko koncentracijo amonijeve soli. Proizvodnjo aminoglikozidnih antibiotikov zavira amonijeva sol, medtem ko nitrat in nekatere aminokisline spodbujajo njihovo proizvodnjo. Biosinteza mnogih antibiotikov je prav tako zelo občutljiva na fosfate (Grasso in sod., 2016). Bakterije Streptomyces coelicolor so modelni organizem za preučevanje proizvodnje antibiotikov (Barka in sod., 2016). Slika 3 prikazuje antibiotike, ki delujejo na strukture v celici ter njihove celične funkcije (Grasso in sod., 2016).
Slika 3: Glavne tarče antibiotikov v celici (Grasso in sod., 2016).
Med antibiotiki, ki ciljajo na celično steno, so glikopeptidi skupina zdravil, ki jih proizvajajo aktinomicete, in so sestavljeni iz glikoziliranih cikličnih ali policikličnih ne-ribosomskih peptidov. Glikopeptidi se vežejo na dipeptid D-alanil-D-alanin (D-Ala-D-Ala) v celični steni po Gramu pozitivnih bakterij, kar preprečuje dodajanje novih enot peptidoglikana in zavira njegovo sintezo. Skupina glikopeptidnih antibiotikov vključujejo antibiotike kot so vankomicin, teikoplanin, telavancin, ramoplanin, dekaplanin in protitumorski antibiotik bleomicin. Vankomicin se uporablja kot zadnji antibiotik za okužbe proti bakterijam MRSA.
Cikloserin, ki ga proizvajajo bakterije Streptomyces orchidaceus, je ciklični analog D- alanina, ki deluje proti dvema ključnim encimoma, pomembnima v citosolnih fazah sinteze peptidoglikana, alanin racemazi in D-Ala-D-Ala ligazi. Ko sta oba encima inhibirana, ostanki D-alanina ne morejo nastati in predhodno oblikovanih molekul D-alanina ni mogoče povezati (Grasso in sod., 2016).
Veliko različnih razredov antibiotikov blokira sintezo beljakovin. Tetraciklin, ki ga proizvajajo bakterije Streptomyces aureofaciens, zavira vezavo aminoacil-tRNK.
Kloramfenikol, ki ga proizvajajo bakterije Streptomyces venezuelae, ter eritromicin, ki ga proizvajajo bakterije Saccharopolyspora erythraea, se vežeta na podenoto 50S in blokirata aktivnost peptidil transferaze. Kanamicin, ki ga proizvajajo bakterije Streptomyces kanamyceticus, se veže na podenoto 30S. Tiostrepton, ki ga proizvajajo bakterije
Streptomyces laurentii, zavira od ribosoma odvisno EF-Tu in EF-G GTP-azo. Streptomicin, ki ga proizvajajo bakterije S. griseus, preprečuje nastanek iniciacijskega kompleksa z vstavitvijo nepravih aminokislin (Grasso in sod., 2016).
Rifampicin je polsintetski antibiotik, ki ga proizvajajo bakterije Amycolatopsis mediterranei, in se uporablja za zdravljenje tuberkuloze. Inhibira bakterijsko polimerazo RNK, tako da veže žep RNKP β podenote znotraj kanala DNK-RNK in destabilizira DNK-RNK polimerazno-oligonukleotidne komplekse. Novobiocin, znan tudi kot albamicin ali katomicin, je aminokumarinski antibiotik, ki ga proizvajajo bakterije Streptomyces niveus.
Je zelo močan zaviralec bakterijske DNK-giraze in deluje s ciljanjem na podenoto GyrB encima, ki sodeluje v energetskem prenosu (Grasso in sod., 2016).
2.2 KRAS IN KRAŠKE JAME V SLOVENIJI
Kras je vrsta krajine s posebnimi površinskimi, podzemnimi in hidrološkimi značilnostmi in pojavi. Njegova glavna značilnost je raztapljanje karbonatnih kamnin z vodo, obogateno s CO2, odstranjevanje kamnine v obliki raztopine in podzemna drenaža, ki tvori jame. V slovenskem jeziku kras pomeni skalnato, nerodovitno površje, razvito na apnencu ali dolomitu in se uporablja tudi kot toponim, zato je beseda kras nastala iz imena za Krasovo planoto (Mihevc in sod., 2016), ki je nizka karbonatna planota med Divačo, Sežano in Trstom. V Sloveniji pokriva 43 % površine; 35 % krasa je na apnencu in približno 8 % na dolomitu, to je približno 8. 800 km2. Glede na geološke, hidrološke in morfološke razmere v Sloveniji je kras razdeljen na tri večje enote: alpski kras, dinarski kras in vmesni predalpski in predpanonski izolirani kras, ki se zaradi morfoloških in hidrografskih lastnosti razdeli na manjše regije (Slika 4). Alpski kras je visokogorski in gorati kras v Julijskih Alpah, Savinjskih Alpah in Karavankah. Dinarski kras je razdeljen na visoki in nizki kras Primorske, Notranjske in Dolenjske. Dinarsko-alpski vmesni in izolirani kras je na območju Idrijskega, Cerkljanskega in Tolminskega, Polhograjskega gorovja, Posavskih gub, gore Gorjanci in v nekaterih drugih krajih severne Slovenije (Zupan Hajna in sod., 2004).
Slika 4: Območje krasa v Sloveniji. Označene so tri glavne vrste krasa: alpski kras, dinarski kras in izolirani kras (Mihevc in sod., 2016).
Dinarski kras je glavno kraško območje Slovenije in je glavni tip reliefa Dinarskega gorovja.
Osrednji del gorovja sestavlja vrsta od 1000 do 1700 m visokih kraških planot. Z njih se na obe strani spuščajo stopničaste nizke kraške planote. Najnižja planota na primorski strani, na meji z Italijo, je Kras. Najnižja notranja planota je Bela krajina na približno 200 m na robu Panonske kotline. Obstajajo številni obsežni jamski sistemi, ki jih tvorijo ponikanje rek (Mihevc in sod., 2016).
Porečje Pivke (Slika 5) je velika kotlina, v katerem je del površine oblikovan na flišu, del pa na apnencu kot kraško polje. Na dnu kotline je nastalo rečno omrežje. Pivka je največja ponikalna reka v porečju. Potopi se v 20 km dolgo Postojnsko jamo, na približno 511 m nadmorske višine. Jama ima več nivojev, glavni nivo je med 520 in 477 m nadmorske višine.
Podzemna reka iz Postojnske jame se ponovno pojavi po 2,5 km, v 8,5 km dolgi Planinski jami, na 460 m nadmorske višine na robu Planinskega polja (Mihevc in sod., 2016). Sistem Postojnske jame obsega več jam. Od Postojnske jame, na mestu ponora Pivke, do Pivške jame, ki omogoča popoln dostop do podzemnega toka reke Pivke znotraj tega sistema.
Podzemni tok se iz Postojnske jame nadaljuje po neraziskanih kanalih proti Planinski jami na južnem robu Planinskega polja. Podzemni tok v jami Pivka teče ob zahodnem kraku jame in se steka s tokom v jami Rak, ki zavzema vzhodni krak jame in se potopi v jamo Tkalca.
Nižje od podzemnega sotočja priteče voda iz jame Planina kot izvir Unica (Mulec in sod., 2019). Iz tega sistem jam (Postojnska jama, jama Pivka, Črna jama in Planinska jama) smo dobili tudi naše vzorce jamskih sedimentov, prsti in jamskega mleka, nekaj vzorcev pa je bilo tudi iz jamskih sedimentov jame Potočka zijalka. Na območju krasa so bili odvzeti tudi vzorci glinenih zapolnitev iz vrtin.
Slika 5: Planinsko polje ter glavne jame in reke Cerkniškega polja in porečja Pivke (Mihevc in sod., 2016).
2.2.1 Aktinomicete v jamah
Jama je vsaka naravna podzemna komora, ki je dovolj velika za vstop človeka. Razvrstimo jih glede na vrsto kamnine in način nastajanja. Najpogostejši tipi jam so iz apnenca in drugih kamnin kalcijevega karbonata. Čeprav jame preučujejo že stotine let, je njihov mikrobiom premalo raziskan in spregledan. Zaradi edinstvenih pogojev, kot so visoka vlažnost, sorazmerno nizka in stabilna temperatura ter malo hranil, naj bi jame hranile mikroorganizme, ki pripadajo novim taksonom in imajo biotehnološke koristi. Člani aktinobakterij so prevladujoča mikrobna populacija v več jamskih ekosistemih. Izolacija aktinobakterij iz edinstvenih naravnih habitatov je pomembna predvsem zato, da se zmanjša izolacija sevov, ki proizvajajo znane a neučinkovite bioaktivne metabolite (Rangseekaew in Pathom-aree, 2019).
Mikroorganizmi v jamah sodelujejo tudi v litogenih in litolitičnih procesih. Dokazi o mikrobni aktivnosti se pojavljajo kot pike na površinah, nenavadno obarvanje kapnikov, oborine, ostanki korozije, strukturne spremembe in biofilmi. V slovenskih jamah so mikrobne skupnosti in njihove interakcije preučevali v različnih mikrookoljih, kot so recimo mikrobne preproge, ki pokrivajo jamske stene v jami Planinska jama. Za raziskovalce so zanimive tudi druge interakcije mikrobov s površino kamnin, na primer tvorba tako
imenovanega "jamskega srebra". Izraz pogosto uporabljajo jamarji zaradi šibke srebrne fluorescence, ko osvetljujemo površino z virom svetlobe. V jamah obiskovalci velikokrat opazijo tudi "jamsko zlato". Zlat videz kolonij se po navadi pokaže ko jih osvetlimo in vodne kapljice pogosto povečajo rumeni pigment mikrobiološke preproge pod vodnim filmom. Te preproge opazimo na mestih, pokritih s sedimenti ali drugimi viri energije, ki jih prinesejo poplave ali pretočna voda, torej na mestih, kjer organske snovi vstopajo v jame. Poleg heterotrofov so v jamah prisotni tudi fotoavtotrofni organizmi. V osvetljenih delih jame, vhodih v jame in krajih globoko v jamah osvetljenih z umetno svetlobo je zelena odeja zasnovana pretežno iz cianobakterij in zelenih mikroalg. Številni mikrobi, ki vstopijo v jame, niso prilagojeni jamskim razmeram in njihove kolonije na različnih substratih ne trajajo dolgo, vendar lahko njihova biomasa vpliva na jamsko okolje, ki mu običajno primanjkuje hranil. Na jamsko okolje in mikrobno sestavo vpliva tudi organski vnos hranil zaradi aktivnosti človeka. Prisotnost mikrobov je zelo dobro opazna tudi v iztrebkih in mrtvih živalih. Velikokrat je prisotnost mikrobov mogoče opaziti posredno. Včasih lahko v jamah opazimo velike površine obrabljenega apnenca, ki ostane na stenah, in je posledica nepopolnega raztapljanja ogljikove kisline v jamskem okolju pod določenimi pogoji. Tako imenovano jamsko mleko je rezultat razgradnje sten ali kapnikov in je mešanica kristalov kalcita in vode (Mulec, 2008).
2.2.2 Izolacija aktinomicet iz jam
Uspešna izolacija aktinomicet iz jam je odvisna od pogojev, kot so:
(i) pred-obdelava vzorcev;
(ii) uporabljena gojišča;
(iii) pogoji gojenja aktinomicet za izolacijo.
Dejavniki so v nadaljevanju podrobneje opisani.
(i) Pred-obdelava jamskih vzorcev
Pred-obdelava vzorcev je lahko kemijska ali fizikalna in predstavlja pomembno fazo izolacije različnih vrst aktinobakterij.
Fizikalna pred-obdelava vključuje postopke (Jiang in sod., 2016):
zračnega sušenja;
vlažne toplote (vodna kopel pri 50 °C za 5-6 minut), kar omogoča odstranitev hitro rastočih bakterij;
suhe toplote (suho segrevanje pri 120 °C za eno uro), kar zmanjša število neželenih bakterij. Postopek je učinkovit pri izolaciji aktinobakterij iz rodov Dactylosporangium, Streptosporangium in Microbispora;
elektromagnetno valovanje.
Kemijska obdelava vključuje različne vrste in koncentracije kalcijevih soli. Selektivni mediji, ki jim dodamo CaCO3, omogočajo izolacijo večjega število aktinobakterij v primerjavi s selektivnimi mediji, ki jim dodamo CaCl2 in Ca(CH3COO)2. Pri nizkih koncentracijah teh treh soli (0,1 in 0,01 % (m / v)) lahko izoliramo večje število aktinobakterij, kot pa pri visoki koncentraciji ali pa v odsotnosti soli. Kalcij je pomemben za toleranco na okoljski stres pri aktinobakterijah, ker tvori spojino z dipikolinsko kislino, to je kalcijev dipikolinat, ki deluje kot sekundarni stabilizator za spore pred okoljskim stresom. Aktinobakterije odporne na visoke temperature so izolirali s kombinacijo fizikalne in kemijske pred-obdelave vzorca, s suhim segrevanjem in fenolno obdelavo, saj je to zmanjšalo število bakterij, ki niso odporne na visoke temperature (Rangseekaew in Pathom- aree, 2019).
(ii) Uporabljena gojišča
Po podatkih v študijah v zadnjem desetletju so za izolacijo jamskih aktinomicet uporabili naslednja gojišča:
trdno gojišče ISP2 (angl. International Streptomyces Project 2);
trdno gojišče TSA (angl. tryptic soy agar);
trdno gojišče HV (angl. humic acid-vitamin agar);
trdno gojišče SC (angl. starch casein agar);
trdno gojišče SCN (angl. starch casein nitrate agar);
trdno gojišče PY-BHI (angl. peptone-yeast extract/brain-heart infusion medium);
trdno gojišče R2A (angl. Reasoner's 2A agar);
trdno gojišče AI (angl. actinomycete isolation agar);
trdno gojišče Gauzovo gojiče (angl. Gauze’s medium No.1).
Za izolacijo aktinomicet so bili uspešno uporabljeni tudi izolacijski mediji, ki posnemajo pogoje z nizkimi hranili, kot so:
trdno gojišče iz vodovodne vode;
trdno gojišče 1/100 ISP2;
trdno oligotrofno gojišče M5.
V raziskavah so tudi poročali, da visoka koncentracija hranil v običajnih rastnih gojiščih povzroča odmiranje celic jamskih bakterij zaradi osmotskega stresa (Rangseekaew in Pathom-aree, 2019).
(i) Pogoji gojenja aktinobakterij za izolacijo
Dva pomembna pogoja gojenja aktinobakterij za izolacijo sta temperatura in čas inkubacije.
Pri izolaciji aktinobakterij iz jam v severni Španiji so uporabili različne temperature: 5 °C, 13 °C, 20 °C in 28 °C. Kot najprimernejša se je izkazala inkubacija pri 28 °C, pri kateri so izolirali največ aktinobakterij. Temperatura 5 °C je bila uporabljena za izolacijo psihrotrofov, 28 °C kot laboratorijska inkubacijska temperatura in 20 °C kot vmesna temperatura med jamskimi in laboratorijskimi pogoji. Največ izolatov aktinobakterij (večinoma sporoaktinomicet) je bilo pridobljenih z inkubacijo pri 28 °C, nato pri 13 °C in 20 °C, najmanj pa pri 5 °C. Večja raznolikost bakterij je bila pri inkubaciji pri 13 °C, kot pa pri 28 °C. Poleg tega je bil daljši čas inkubacije uspešen za počasi rastoče aktinobakterije (Laiz in sod., 2003).
2.2.3 Bioaktivne učinkovine aktinomicet iz jam
Jame kot ekstremno okolje lahko z svojimi edinstvenimi značilnostmi in pogoji spodbujajo proizvodnjo bioaktivnih učinkovin, tudi antibiotikov pri aktinobakterijah. Bioaktivni metaboliti, ki so jih našli v različnih študijah, so bili očiščeni in okarakterizirani in so večinoma pokazali protibakterijske in/ali protirakave aktivnosti. Za najbolj plodne proizvajalke teh snovi so se izkazale bakterije rodu Streptomyces (Rangseekaew in Pathom- aree, 2019). Veliko študij poroča o pregledu protimikrobnih aktivnosti jamskih aktinobakterij, predvsem o njihovem protibakterijskem, protiglivnem in protirakavem delovanju, vendar ne podajajo natančnejših podatkov o čistih bioaktivnih učinkovinah in njihovi strukturi. Pregled bioaktivne učinkovitost bioaktivnih učinkovin brez podane znane strukture molekul ni koristen za odkrivanje novih antibiotikov. Vendar pa te ugotovitve dokazujejo, da je prisotna protimikrobna aktivnost, in da jamske aktinobakterije predstavljajo vir za pridobivanje novih bioaktivnih učinkovin (Rangseekaew in Pathom- aree, 2019). V nadaljevanju so izpostavljene in podrobneje opisane nekatere bioaktivne učinkovine.
Bioaktivne učinkovine cervimicini A, B, C in D, ki jih proizvajajo bakterije Streptomyces tendae (izolat HKI 0179 iz jame Grotta dei Cervi v Italiji), delujejo proti po Gram pozitivnim bakterijam Bacillus subtilis, S. aureus, MRSA in proti vankomicinu odpornim bakterijam Enterococcus faecalis (VRE). Njihova protimikrobna učinkovitost na testirane bakterije je primerljiva z učinkovitostjo antibiotikov, kot so tetraciklin, vankomicin in ciprofloksacin.
Še pomembneje pa je, da imajo aktivnost proti s črpalkami odpornim bakterijam S. aureus (EfS4) in VRE 1528, saj so prej omenjeni antibiotiki neučinkoviti proti VRE in EfS4.
Cervimicini A-D predstavljajo nenavadne bisglikozilirane poliketide, ki so v obroču substituirani bodisi z akarbamoilom ali z acetilnim delom. Imajo bodisi dimetil-malonil, bodisi monometilmalonilni ostanek pritrjen na daljšo stransko verigo sladkorja.
Najpomembnejše ugotovitve so, da so cervimicini zelo aktivni proti večkratno odpornim
bakterijskim patogenom. V teku so nadaljnje študije za izboljšanje profila bioaktivnosti cervimicinov in raziskave še neznane biološke tarče teh novih antibiotikov (Herold in sod., 2005).
Bioaktivno učinkovino xiakemicin A, ki so jo odkrili v kraških tleh na Kitajskem, so izolirali iz bakterij Streptomyces sp. CC8-201. Xiakemicin A inhibira rast po Gramu pozitivnih bakterij, kot so S. aureus, Staphylococcus epidermidis, E. faecalis in E. faecium. Dokazali so tudi citotoksičnost proti številnim celičnim linijam raka, kot so človeške celice pljučnega raka A549, celice raka dojke MCF-7, hepatom HepG-2 celice, rak materničnega vratu HeLa celice, karcinom debelega črevesa HCT-116 celice p53 wt celice, celice nevroblastoma SH- SY5Y in človeški rak prostate PC-3. Xiakemicin A ima tudi šibko učinkovitost proti kvasokam Candida parapsilosis, Candida albicans, Cryptococcus laurentii in Candida tropical (Jiang in sod., 2015).
V jamskih sistemih v Tennesseeju so v bakterijah Nonomuraea sp. odkrili nov pironaftokinon-dimer z mostičkom S in njegove monomerne prekurzorje imenovane hipogeamcini A-D. Bioaktivna učinkovina hipogeamcin A je pokazala citotoksičnost za celično linijo raka debelega črevesa TCT-1, medtem ko hipogeamiicini B-D niso pokazali citotoksičnosti, pokazali pa so zaznavno aktivnost proti bakterijam B. subtilis. Vendar hipogeamicini B-D glede protimikrobnega delovanja proti bakterijam B. subtilis niso tako učinkoviti kot antibiotika eritromicin in gentamicin (Derewacz in sod., 2014).
Bioaktivne učinkovine huanglongmicin A, B in C so aromatski poliketidi iz bakterij Streptomyces sp. CB09001, izoliranih iz kraške jamske zemlje v mestu Xiangxi na Kitajskem. Huanglongmicin A je pokazal šibko aktivnost proti po Gramu negativnim bakterijam P. aeruginosa in Escherichia coli in zmerno citotoksičnost proti celični liniji pljučnega raka A549. Huanglongmicin B ima šibko protibakterijsko aktivnost proti bakterijam S. aureus in MRSA, huanglongmicin C pa ni pokazal niti protibakterijske niti protirakave aktivnosti (Jiang in sod., 2018).
Bioaktivno učinkovino undecilprodigiosin proizvajajo bakterije Streptomyces sp. JS520 izolirane iz usedlin v jami gore Miroc v Srbiji. Undecilprodigiosin je temno rdeč pigment s protibakterijsko aktivnostjo na bakterije M. luteus, B. subtilis in Candida albicans, pokazal pa je tudi antioksidativne in UV-zaščitne lastnosti (Stankovic in sod., 2012). Streptomicete so izolirali tudi iz jamskega mleka iz Bolshaya Oreshnaya jame v Sibiriji. Našli so štiri bioaktivne komponente, ki jih proizvajajo bakterije iz rodu Streptomyces sp. IB 2014/I/ 78- 8: ciklodisidin D, kaxalaktin B, stilisazol B in giroforna kislina (Axenov-Gibanov in sod., 2016).
3 MATERIAL IN METODE 3.1 MATERIAL
3.1.1 Jamski vzorci
V Preglednici 1 je seznam vzorcev, ki so bili odvzeti v slovenskih kraških jamah. Vzorce, ki so bili odvzeti 11. 12. 2019, smo 19. 12. 2019 in 27. 1. 2020 dobili od Inštituta za raziskovanje krasa, Znanstvenoraziskovalnega centra Slovenske akademije znanosti in umetnosti (ZRC SAZU). Vzorci so bili odvzeti na aseptičen način, s sterilnim materialom, enako je potekalo tudi rokovanje z vzorci v laboratoriju.
Preglednica 1: Vzorci pridobljeni na Krasu in v slovenskih kraških jamah.
Oznaka vzorca Tip vzorca Lokacija izolacije Dodatne informacije o odvzemu vzorca MEA (19 plošč)
NA (27 plošč) R2A (30 plošč)
MA (26 plošč) TA (27 plošč)
Nacepljena trdna gojišča z okoljski izolati
mikroorganizmov Potočka zijalka
JM jamsko mleko Potočka zijalka
JMK jamsko mleko z iztrebki
netopirjev Potočka zijalka
PO1 sediment (~20 g/vzorec) Postojnska jama UP, nedavno naplavljeni sediment z majhnimi vključki
lesa, Veliki Dom PO2 sediment (~20 g/vzorec) Postojnska jama
DOWN, stari sediment, naplavljen po 1982, 1 m nižje,
Veliki Dom
PO3 sediment (~20 g/vzorec) Postojnska jama RECENT, nedavno naplavljeni sediment, Spodnji Tartar PO4 sediment (~20 g/vzorec) Postojnska jama OLD, naplavljeni sediment,
Spodnji Tartar PI5 prst (~20 g/vzorec) nad jamo Pivka prst nad jamo, Kamping Pivka
jama
PI6 sediment (~20 g/vzorec) Črna jama stranska veja reke Pivka, Pivka je bila previsoka ob glavnem
kanalu
PL7 sediment (~20 g/vzorec) Planinska jama nedavno naplavljeni sediment, Pivški rokav
PL8 sediment (~20 g/vzorec) Planinska jama nedavno naplavljeni sediment, izvir
T1_12_185 glinene zapolnitve iz vrtin
(~1 g/vzorec) Kras vzorec iz globine pri 185,00 m;
konc. nitrata je bila 4,04 ppm T1_13_272 glinene zapolnitve iz vrtin
(~1 g/vzorec) Kras vzorec iz globine pri 272,50 m;
konc. nitrata je bila 21,06 ppm T2_19_129 glinene zapolnitve iz vrtin
(~1 g/vzorec) Kras vzorec iz globine pri 129,20 m;
konc. nitata je bila 16,33 ppm T2_20_7 glinene zapolnitve iz vrtin
(~1 g/vzorec) Kras vzorec iz globine pri 7,50 m;
konc. nitrata je bila 12,55 ppm
Slika 6 prikazuje shematski prikaz podzemne reke Pivka in jame skozi katere teče reka.
Pivka ponikne v Postojnski jami (511 m n.v.) in se pojavi kot reka Unica v jami Planina (453 m n.v.), s prestreženimi jamami in mesti za vzorčenje; v Postojnski jami so bili vzorčeni nedavni (S01, S02, S03) in stari (S04) sedimenti, nedavno odloženi jamski sedimenti so bili vzorčeni v Črni jami (S06) in Planinski jami (S07, S08) ter vzorčena kraška tla nad jamo Pivka (S05) (Kataster jam, Inštitut za raziskovanje krasa ZRC SAZU; Speleološka zveza Slovenije).
Slika 6: Shematski prikaz podzemne reke Pivke, jame skozi katere teče ter vzorčna mesta (Kataster jam, Inštitut za raziskovanje krasa ZRC SAZU; Speleološka zveza Slovenije).
3.1.2 Mikrobiološka gojišča Gojišče SM
Za pripravo gojišča SM (ang. Soya flour Mannitol medium) (Preglednica 2) smo vse navedene sestavine zatehtali v čašo, dodali destilirano vodo do končnega volumna 1000 mL in umerili vrednost pH na 7 z dodajanjem 5 M NaOH ali 5 M HCl. Končni volumen smo razdelili v 3 litrske durum steklenice po 330 mL in 30 minut avtoklavirali pri temperaturi 121 °C in tlaku 1,2 bara.
Preglednica 2: Sestava gojišča SM.
Sestavine Količina Proizvajalec
sojina moka 20 g Sigma-Aldrich, ZDA
manitol 20 g CARLO ERBA Reagents, Italija
agar 20 g Biolife, Italija
dH2O do 1000 mL
Gojišče CRM
Za pripravo gojišča CRM (Preglednica 3) smo vse navedene sestavine zatehtali v čašo, dodali destilirano vodo do končnega volumna 1000 mL in umerili vrednost pH na 7 z dodajanjem 5 M NaOH ali 5 M HCl. Gojišče smo 20 minut avtoklavirali pri temperaturi 121
°C in tlaku 1,2 bara.
Preglednica 3: Sestava gojišča CRM.
Sestavine Količina Proizvajalec
glukoza 10 g Sigma-Aldrich, ZDA
saharoza 103 g Gram-Mol, Hrvaška
MgCl2 × 6H2O 10,12 g VWR Chemicals, ZDA
TSB 15 g Biolife, Italija
kvasni ekstrakt 5 g Biolife, Italija
agar 20 g Biolife, Italija
dH2O do 1000 mL
Gojišče ISP 4
Za pripravo gojišča ISP 4 (International Streptomyces Project Inorganic Salts Starch Agar) (Preglednica 4) smo najprej pripravili raztopino mineralov (raztopina treh spojin: FeSO4 × 7H2O, MnCl2 × 4H2O, ZnSO4 × 7H2O) v koncentraciji 1 mg/mL. Zatehtali smo po 0,1 g vsake od treh spojin in dodali 100 mL destilirane vode. Nato smo zatehtali vse ostale sestavine gojišča, dodali 1 mL mineralne raztopine (končna koncentracija ionov je 1 mg/L) ter dopolnili z destilirano vodo do končnega volumna 1000 mL. Vrednost pH smo umerili na 7,2 z dodajanjem 5 M NaOH ali 5 M HCl. Gojišče smo pred in po avtoklaviranju konstantno mešali, s čimer smo preprečili nastanek grudic, prav tako smo ga pred avtoklaviranjem segrevali v mikrovalovni pečici, da je prišlo do zaklejitve škroba. Gojišče smo 20 minut avtoklavirali pri temperaturi 121 °C in tlaku 1,2 bara.
Preglednica 4: Sestava gojišča ISP 4.
Sestavine Količina Proizvajalec
FeSO4 × 7H2O 1 mg Merck, Nemčija
MnCl2 × 4H2O 1 mg Merck, Nemčija
ZnSO4 × 7H2O 1 mg Merck, Nemčija
K2HPO4 1 g Merck, Nemčija
MgSO4 × 7H2O 1 g Merck, Nemčija
NaCl 1 g Merck, Nemčija
CaCO3 2 g Merck, Nemčija
(NH4)2SO4 2 g Merck, Nemčija
topni škrob 10 g Sigma-Aldrich, ZDA
agar 20 g Biolife, Italija
dH2O do 1000 mL
Vegetativno gojišče TSB
Za pripravo vegetativnega gojišča TSB (Tryptic Soy Broth medium) (Preglednica 5) smo vse navedene sestavine zatehtali v čašo, dodali destilirano vodo do končnega volumna 1000 mL in umerili vrednost pH na 7,3 z dodajanjem 5 M NaOH ali 5 M HCl. Gojišče smo 20 minut avtoklavirali pri temperaturi 121 °C in tlaku 1,2 bara.
Preglednica 5: Sestava vegetativnega gojišča TSB.
Sestavine Količina Proizvajalec
pepton iz kazeina 17 g VWR Chemicals, ZDA
pepton iz soje 3 g Biolife, Italija
D+ glukoza 2,5 g Sigma-Aldrich, ZDA
NaCl 5 g Merck, Nemčija
K2HPO4 2,5 g Merck, Nemčija
dH2O do 1000 mL
Produkcijsko gojišče GOTC z dodatkom glukoze
Za pripravo produkcijskega gojišča GOTC (Preglednica 6) smo vse navedene sestavine zatehtali v čašo, dodali vodovodno vodo do končnega volumna 1000 mL. Gojišče smo segrevali v mikrovalni pečici do 80 °C, ga ohladili in umerili vrednost pH na 6,25 z dodajanjem 5 M NaOH ali 5 M HCl. Gojišče smo razdelili v 3-litrske steklenice po 330 mL in ga 30 minut avtoklavirali pri temperaturi 121 °C in tlaku 1,2 bara.
Preglednica 6: Sestava produkcijskega gojišča GOTC z dodatkom glukoze.
Sestavine Količina Proizvajalec
MOPS 7 g Carl Roth, Nemčija
glukoza 20 g Sigma-Aldrich, ZDA
sojina moka 42 g Sigma-Aldrich, ZDA
(NH4)2SO4 6 g Merck, Nemčija
MgCl2 × 6H2O 4,3 g VWR Chemicals, ZDA
NaCl 1,5 g Merck, Nemčija
CaCO3 7,3 g Merck, Nemčija
koruzni škrob 28 g Merck, Nemčija
1 % razt. ZnSO4 10 mL Merck, Nemčija
1 % razt. MnSO4 3,75 mL Merck, Nemčija
vodovodna voda do 1000 mL
Gojišče 2TY
Za pripravo gojišča 2TY (2xTY Agar) (Preglednica 7) smo vse navedene sestavine zatehtali v čašo, dodali destilirano vodo do končnega volumna 1000 mL in umerili vrednost pH na 7
z dodajanjem 5 M NaOH ali 5 M HCl. Gojišče smo 20 minut avtoklavirali pri temperaturi 121 °C in tlaku 1,2 bara.
Preglednica 7: Sestava gojišča 2TY.
Sestavine Količina Proizvajalec
pepton iz kazeina 16 g VWR Chemicals, ZDA
kvasni ekstrakt 10 g Biolife, Italija
NaCl 5 g Merck, Nemčija
agar 15 g Biolife, Italija
dH2O do 1000 mL
Trdno gojišče YPD
Za pripravo trdnega gojišča YPD (Yeast Extract–Peptone–Dextrose medium) (Preglednica 8) smo v čašo zatehtali 20 g že pripravljenega gojišča YPD (Sigma-Aldrich, ZDA) in dodali destilirano vodo do končnega volumna 1000 mL. Gojišče smo 15 minut avtoklavirali pri temperaturi 121 °C in tlaku 1,2 bara.
Preglednica 8: Sestava trdnega gojišča YPD.
Sestavine Količina Proizvajalec
pepton 20 g Sigma-Aldrich, ZDA
glukoza 20 g Sigma-Aldrich, ZDA
kvasni ekstrakt 10 g Sigma-Aldrich, ZDA
agar 20 g Biolife, Italija
3.1.3 Antibiotiki
Uporabljali smo antibiotik nalidinska kislina (Sigma-Aldrich, ZDA). Raztopino antibiotika s koncentracijo 50 mg/mL smo pripravili tako, da smo 500 mg antibiotika zatehtali v 10 mL vodne raztopine NaOH (Merck, Nemčija) (9 mL dH2O + 1 mL 1 M NaOH). Raztopino nalidinske kisline smo v sterilnih pogojih prefiltrirali skozi filter s porami 0,2 µm.
Koncentracija antibiotika v gojiščih je znašala 50 µg/mL (Yap, 2015).
3.1.4 Raztopine
Fiziološka raztopina
Za pripravo 0,9 % raztopine NaCl smo zatehtali 0,9 g NaCl (Merck, Nemčija) v 100 mL dH2O in raztopino avtoklavirali 20 minut pri temperaturi 121 °C in tlaku 1,2 bara.
Raztopina EDTA
Za pripravo raztopine EDTA smo zatehtali 63,695 g EDTA (Merck, Nemčija) v 500 mL dH2O in umerili vrednost pH na 8 z dodajanjem 5 M NaOH ali 5 M HCl.
Mobilna faza za tankoplastno kromatografijo (TLC)
Za pripravo nepolarne mobilne faze za tankoplastno kromatografijo smo zmešali 295 mL diklorometana (Kemika) 175 mL metanola (Merck, Nemčija) in 30 mL dH2O.
3.1.5 Mikroorganizmi
Mikroorganizme za testiranje protimikrobne aktivnosti smo pridobili v zbirkah na Biotehniški fakulteti na Oddelku za živilstvo: Zbirka industrijskih mikroorganizmov (ZIM) in Zbirka mikrobnih kultur Laboratorija za živilsko mikrobiologijo (ŽM). Uporabljeni mikroorganizmi: Micrococcus luteus ZIM B516, Pseudomonas aeruginosa (ŽMJ 87), Escherichia coli (ŽM 370), Staphylococcus aureus (ŽMJ 72), Candida albicans (ZIM 2202), Saccharomyces cerevisiae ZIM 2155 (S288c) in Streptomyces rimosus (HP 0508).
3.1.6 Laboratorijski material
Pri eksperimentalnem delu smo uporabili naslednji laboratorijski material:
steklovina: čaše, merilni valji, erlenmajerice, steklenice z zamaškom na navoj, palčka za mešanje
plastične petrijevke – okrogle in kvadratne
pipete in nastavke za avtomatske pipete (Eppendorf, Gilson)
lesene zobotrebce za nacepljanje
plastične kivete 10 mL, 50 mL
penaste zamaške
alufolijo
plastične cepilne zanke
plastične centrifugirke 10 mL
mikrocentrifugirke (Eppendorf)
krioviale
plastične slamice za precepljanje
plošče iz silikagela za tankoplastno kromatografijo (TLC Silica gel 60 F₂₅₄, Merck)
steklena komora za tankoplastno kromatografijo
3.1.7 Laboratorijske aparature
Pri eksperimentalnem delu smo uporabili naslednje laboratorijske aparature:
avtoklav (Sutjeska)
laminarij (Iskra Pio)
avtomatske pipete (Eppendorf, Gilson)
centrifuga (Eppendorf 5810 R)
inkubator (Kambič, Sutjeska)
termostat (Semlab)
stresalnik (Infors HT)
digestorij (Secuflow)
tehtnica (Sartorius Excellence)
UV lučka (Vilber Lourmat)
magnetno mešalo (IKA, Rotamix)
hladilnik (Gorenje)
zamrzovalnik (Gorenje)
zamrzovalnik za zbirko (Thermo Scientific)
pH meter (Mettler Toledo)
sušilna omara (Elektromedica)
mikrovalovna pečica (Sanyo)
3.2 METODE
3.2.1 Shema laboratorijskega dela
Shema laboratorijskega dela (Slika 7) prikazuje korake kako smo iz izolatov aktinomicet iz slovenskih kraških jam pripravili izvlečke sekundarnih metabolitov izolatov aktinomicet.
Izvlečkom sekundarnih metabolitov izolatov aktinomicet smo nato ovrednotili protimikrobno aktivnost proti bakterijam M. luteus, P. aeruginosa, E. coli in S. aureus ter kvasovkam C. albicans in S. cerevisiae.
Slika 7: Shema poteka laboratorijskega dela.
3.2.2 Optimizacija pogojev gojenja aktinomicet za izolacijo
Optimizacija pogojev za izolacijo aktinomicet smo izvedli na dveh vzorcih (Slika 8): jamsko mleko (JM) in jamsko mleko z iztrebki netopirjev (JMK) (Preglednica 1).
Slika 8:Shema optimizacije pogojev gojenja aktinomicet za izolacijo
Najprej smo 0,5 g vsakega vzorca resuspendirali v 2 mL fiziološke raztopine. Vzorca smo na trdna gojišča nacepljali v dveh skupinah. Pri prvi skupini smo spore predaktivirali z inkubacijo vzorcev v centrifugirkah 5 minut pri 50 °C, pri drugi skupini pa predaktivacija spor ni potekala. Vsako skupino smo razdelili še v dve dodatni skupini, in sicer glede na inkubacijsko temperaturo nacepljenih plošč: 15 °C in 28 °C. Pri temperaturi 15 °C je inkubacija plošč potekala 4 tedne, pri temperaturi 28 °C pa 2 tedna. Po 100 µL vzorca smo pri vsaki skupini nacepili na 6 različnih trdnih gojišč: SM, SM z nalidinsko kislino, CRM, CRM z nalidinsko kislino, ISP 4 in ISP 4 z nalidinsko kislino. Na vsako gojišče smo prenesli po 6 redčitev vzorcev (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6). Kolonije aktinomicet smo po 2 oziroma 4 tednih inkubacije precepili na gojišče ISP 4 in inkubirali pri temperaturi 28 °C 2 tedna.
3.2.3 Izolacija aktinomicet iz vzorcev (PO1-PL8)
Vzorce PO1-PL8 in vzorce vrtin smo suspendirali v fiziološki raztopini (0,5 g vzorca v 2 mL FR). Po 100 µL vzorca smo nacepili na tdno gojišče ISP 4 in inkubirali pri temperaturi 28 °C 2 tedna. Kolonije aktinomicet smo po 2 tednih precepili na gojišče ISP 4 in inkubirali pri istih pogojih. Nekaj vzorcev iz Potočke zijalke in jamskega mleka smo že dobili nacepljenih na trdna gojišča (izolati shranjeni pod oznako BF_KS1- BF_KS26).
3.2.4 Shranitev izoliranih aktinomicet iz jamskih vzorcev
Kolonije izoliranih aktinomicet iz jamskih vzorcev smo s lesenim zobotrebcem prenesli v krioviale, ki smo jih predhodno napolnili z 1,5 mL 20 % glicerolne raztopine, in jih shranili pri -70 °C pod oznako BF_KS. Shranili smo 291 izolatov iz jamskih vzorcev.
3.2.5 Revitalizacija izolatov aktinomicet
Aktinomicete smo iz zbirke revitalizirali dvakrat. Prvič smo jih nacepili na trdno gojišče ISP 4, drugič pa na trdno gojišče SM. Z lesenim zobotrebcem smo vzeli nekaj zamrznjene suspenzije izolatov v glicerolu in jih razmazali po trdnem gojišču. Nacepljena trdna gojišča smo inkubirali temperaturi 28 °C 10 dni.
3.2.6 Gojenje aktinomicet
Izolate, ki so zrasli na trdnem gojišču za revitalizacijo ISP ali SM smo inokulirali v tekoče gojišče TSB za vzgojo vegetativnih oblik. Nato smo s slamico kulturo iz trdnega gojišča prenesli v 5 mL tekočega gojišča TSB. Izolate smo inkubirali 48 ur na stresalniku pri temperaturi 28 °C in stresanju 220 rpm. Po 48 urah smo 500 µL suspenzije celic iz vegetativnega gojišča prenesli v 5 mL tekočega gojišča GOTC za produkcijo sekundarnih metabolitov z dodatkom glukoze, in jih inkubirali 1 teden pri temperaturi 28 °C, stresanju pri 220 rpm in vlažnosti 60 %.
3.2.7 Priprava izvlečkov sekundarnih metabolitov izolatov aktinomicet
Sekundarne metabolite izolatov aktinomicet smo ekstrahirali z metanolom. 2 mL produkcijske brozge smo prenesli v 10-mililitrsko centrifugirko in dodali 2 mL metanola ter stresali 1 uro pri 220 rpm in temperaturi 28 °C. Po končanem stresanju smo suspenzijo metanola in produkcijskega gojišča centrifugirali 5 minut pri 4000 obratih na minuto in nato supernatant, oziroma metanolni izvleček, prenesli v dvomililitrsko centrifugirko.
3.2.8 Tankoplastna kromatografija (TLC)
Tankoplastna kromatografija (TLC) je analitska ločevalna metoda (Wall, 2005), pri kateri je stacionarna faza trdna adsorpcijska snov (aluminijev oksid, silikagel, celuloza) prevlečena na nosilec. Mobilna faza (topilo) potuje navzgor po plošči skozi stacionarno fazo s kapilarnim vlekom in s tem vzame s sabo tudi mešanico metabolitov, ki je bila predhodno nanešena na spodnje dele plošče. Na postopek ločevanja vplivajo molekulske značilnosti komponent, ki so povezane z adsorpcijo (trdno-tekoče), porazdelitvijo (tekoče-trdno) in afiniteto ali z razlikami med molekulskimi masami komponent. Zaradi teh razlik nekatere
