F
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJOMAGISTRSKO DELO
Anja Kobale
Ljubljana, 2021
F
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJOMAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE BIOKEMIJA
Primerjava metod za optimizacijo predkristalizacijskih pogojev proteinov na primeru lizocima
MAGISTRSKO DELO
Anja Kobale
M
ENTOR: znan. svet. dr. Dušan Turk S
OMENTOR: izr. prof. dr. Marko Dolinar
Ljubljana, 2021
IZJAVA O AVTORSTVU
magistrskega dela
Spodaj podpisana Anja Kobale sem avtorica magistrskega dela z naslovom: Primerjava metod za optimizacijo predkristalizacijskih pogojev proteinov na primeru lizocima.
S svojim podpisom zagotavljam, da:
● je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom znan.
svet. dr. Dušana Turka;
● sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;
● se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje
predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);
● sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;
● je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.
V Ljubljani, 25.8.2021 Podpis avtorice:
Delo je bilo opravljeno na Institutu ''Jožef Stefan'' pod skrbništvom znan. svet. dr.
Dušana Turka.
Senat UL FKKT je za mentorja imenoval znan. svet. dr. Dušana Turka in za somentorja izr. prof. dr. Marka Dolinarja.
Recenzenta: doc. dr. Gregor Gunčar in doc. dr. Miha Pavšič
Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela Predsednik komisije: doc. dr. Miha Pavšič
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Član: doc. dr. Gregor Gunčar
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Član: izr. prof. dr. Marko Dolinar
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Član: znan. svet. dr. Dušan Turk
Institut ''Jožef Stefan''
Zahvaljujem se mentorju znan. svet. dr. Dušanu Turku, da je omogočil raziskovanje mojega dela in mi nudil strokovno pomoč ter nasvete.
Zahvaljujem se dr. Ajdi Taler-Verčič, ki me je skozi izdelavo zaključnega dela prijazno in potrpežljivo vodila, mi nudila razlage in bila vedno na voljo za vsa moja vprašanja.
Zahvaljujem se tudi vsem v laboratoriju za pomoč pri delu.
Zahvaljujem se tudi izr. prof. dr. Marku Dolinarju za temeljit pregled magistrske naloge in nasvete glede strokovnega in vsebinskega dela.
Zahvala gre tudi doc. dr. Gregorju Gunčarju in doc. dr. Mihu Pavšiču za pregled zaključnega dela in vse nasvete ter popravke.
Rada bi se zahvalila tudi vsem članom moje družine, ki so me v času študija podpirali, verjeli vame in mi stali ob strani na vseh področjih mojega življenja. Zahvala gre tudi vsem mojih bližnjim prijateljem, ki so me v času študija vzpodbujali, mi stali ob strani in mi lajšali dneve. Zahvaljujem se tudi Ahdu, da je prišel v moje življenje in mi pokazal to, česar sama nisem videla.
Primerjava metod za optimizacijo predkristalizacijskih pogojev proteinov na primeru lizocima
Povzetek:
Strukture proteinov lahko določamo na različne načine. Mednje spada tudi rentgenska difrakcija. Le-ta zahteva makromolekulske kristale, v katerih se molekule geometrijsko uredijo, kar omogoča sipanje rentgenskih žarkov, ki je pogoj za uspešno določitev 3D strukture. Na urejenost makromolekul v kristalu vpliva tudi mikrookolje, v katerem se makromolekule nahajajo in kjer bo potekala kristalizacija. Mikrookolje je sestavljeno iz raztopine proteina in raztopine rezervoarja, ki predstavlja spojine z različnimi načini delovanja. Raziskave so pokazale, da tudi raztopina, v kateri je raztopljen protein, preden pripravimo kristalizacijske kapljice, pomembno prispeva h končnemu rezultatu – proteinskim kristalom. V tej magistrski nalogi smo se posvetili predkristalizacijskim pogojem testnega proteina lizocima. Primerjali smo dve metodi, s katerima lahko dobimo optimalne predkristalizacijske pogoje, diferenčno dinamično fluorimetrijo (DSF) in topnostnim testom. Namen je bil iz združenih rezultatov poiskati ugodnejše pogoje za kristalizacijo, kot jih dobimo z vsako metodo posebej, saj vsaka od obeh metod deluje na svoj način in ima svoje zahteve. Opravili smo eksperimente z obema metodama, nato rezultate obeh primerjali, jih združili in nastavili kristalizacijo, da bi preverili kristalizacijo proteina pri izbranih pogojih.
Pripravili smo tudi odločitvena drevesa, kdaj slediti kateri izmed metod glede na tip proteina, ki ga preiskujemo, razpoložljivo količino proteina ter opremo. Iz rezultatov smo ugotovili, da kadar združimo najboljše rezultate obeh metod, ni zagotovo, da bo lizocim kristaliziral, saj so se pojavili kristali lizocima tako v pufrskih pogojih, ki so bili teoretično najboljši, kot v pufrskih pogojih, ki so bili teoretično najslabši. Iz rezultatov te naloge sklepamo, da nobena izmed metod ne more razkriti analiziranih pogojev, za katere lahko z gotovostjo trdimo, da bo pri njih lizocim kristaliziral.
Ključne besede: predkristalizacijski pogoji, diferenčna dinamična fluorimetrija (DSF), topnostni test, kristalizacija
Comparison of methods for optimization of the precrystallization buffer in the case of lysozyme
Abstract:
Protein structures can be determined by using different approaches. One of them is X-ray diffraction which requires the proteins to form macromolecular crystals diffracting X-rays which in turn could lead to a successful determination of the 3D structure. The arrangement of the macromolecules in a crystal is affected by the microenvironment. The microenvironment consists of protein and reservoir solutions.
According to the literature the solution in which the protein is present before being introduced in the crystallization droplets, importantly contributes to the end result – growth of protein crystals. This master's thesis focuses on the precrystallization conditions of the test protein lysozyme. We compared two different methods which give optimal precrystallization conditions, fluorescence monitoring of thermal denaturation of proteins (DSF) and solubility test. The aim was to find favorable conditions for crystallization than obtained by each method separately because both methods work by their own principles and have their own requirements. The experiments were carried out using both methods. After comparing the results, we set up the crystallization to investigate the protein crystallization at selected conditions.
To choose the appropriate method according to the protein investigated, its available quantity and accessible equipment, a decision tree was designed. We discovered that even when we combine the best results of the two methods, it is not certain that lysozyme will crystallize. Namely, lysozyme crystals appeared both in buffer conditions that were theoretically best and in buffer conditions that were theoretically worst. The crystallization results indicate that none of the methods can reveal the best conditions for which we could say for certain that lysozyme will crystallize.
Keywords: precrystallization conditions, differential scanning fluorimetry (DSF), solubility test, crystallization
Kazalo
1 Uvod ... 1
1.1 Struktura proteinov ... 1
1.2 Rentgenska difrakcija ... 2
1.3 Kristalizacija proteinov... 3
1.3.1 Uporaba precipitantov pri kristalizaciji proteinov ... 6
1.3.2 Vpliv temperature na kristalizacijo... 7
1.3.3 Pufri in vpliv pH na kristalizacijo ... 8
1.3.4 Predhodna topnost kot pomemben faktor kristalizacije ... 8
1.4 Določanje predkristalizacijskih pogojev z diferenčno dinamično fluorimetrijo (DSF) ... 8
1.5 Določanje predkristalizacijskih pogojev kristalizacije proteinov s topnostnim testom ... 14
2 Namen dela in hipoteze ... 17
3 Eksperimentalni del ... 19
3.1 Materiali ... 19
3.2 Metode ... 20
3.2.1 Testni protein ... 20
3.2.2 Izbor pufrov ... 21
3.2.3 Diferenčna dinamična fluorimetrija... 23
3.2.4 Topnostni test ... 26
3.2.5 Združitev rezultatov obeh metod ... 27
3.2.6 Kristalizacija lizocima ... 27
4 Rezultati ... 29
4.1 Fluorescenčno spremljanje termične denaturacije lizocima v odvisnosti od sestave pufra ... 29
4.2 Reverzibilna topnost lizocima v odvisnosti od sestave pufra ... 34
4.3 Primerjava rezultatov obeh metod ... 39
4.4 Rezultati kristalizacije lizocima... 43
4.5 Odločitveni diagrami ... 48
5 Razprava ... 53
6 Zaključek ... 57
7 Literatura ... 59
Seznam uporabljenih kratic in simbolov
𝐴595 povprečna absorbanca pri valovni dolžini 595 nm
°C stopinj Celzija
A intenziteta fluorescence zvitega proteina A595 absorbanca pri valovni dolžini 595 nm ANS anilinonaftalen sulfonat
B intenziteta fluorescence razvitega proteina
BSA goveji serumski albumin (angl. Bovine Serum Albumin) C entalpija reakcije
CBB barvilo Coomassie Brilliant Blue G-250 CPM anilinonaftalen sulfonat
Cryo-EM krioelektronska mikroskopija (angl. Cryogenic Electron Microscopy) DCVJ 9-(2,2-dicianovinil)julolidin
DLS dinamično sipanje svetlobe (angl. Dynamic Light Scattering) DNA deoksiribonukleinska kislina
DSF diferenčna dinamična fluorimetrija (angl. Differential Scanning Fluorimetry)
DTT ditiotreitol
I intenziteta
kDa kilodalton
m masa
mM milimolarna koncentracija
nm nanometer
NMR jedrska magnetna resonanca (angl. Nuclear Magnetic Resonance) PDB proteinska podatkovna baza (angl. Protein Data Bank)
PEG polietilen glikol pI izoelektrična točka
PCR - rt verižna reakcija s polimerazo v realnem času
SAXS sipanje rentgenskih žarkov pod malim kotom (angl. Small Angle X- ray Scattering)
T temperatura
TCEP tris(2-karboksietil)fosfin
Tm temperatura polovice prehoda (angl. Melting Temperature) UV ultravijolično
Oznake aminokislin
alanin Ala A
arginin Arg R
asparagin Asn N
asparaginska kislina Asp D
cistein Cys C
fenilalanin Phe F
glicin Gly G
glutamin Gln Q
glutaminska kislina Glu E
histidin His H
izolevcin Ile I
levcin Leu L
lizin Lys K
metionin Met M
prolin Pro P
serin Ser S
tirozin Tyr Y
treonin Thr T
triptofan Trp W
valin Val V
1 Uvod
1.1 Struktura proteinov
Proteini so sestavljeni iz 20 različnih L-α-aminokislin, povezanih v polipeptidne verige.
Aminokisline so med seboj povezane s peptidno vezjo, razlikujejo pa se po stranskih skupinah, ki so skupaj s posttranslacijskimi modifikacijami odgovorne za pestro strukturno in funkcijsko raznolikost proteinov. Zaporedje različnih aminokislin v polipeptidni verigi z začetkom na N-koncu predstavlja primarno strukturo proteina.
Polipeptidne verige v prostoru zavzamejo različne t.i. sekundarne strukture: α-vijačnice, β-trakove in zanke, ki predstavljajo povezovalne elemente. Prostorsko ureditev elementov sekundarnih struktur imenujemo terciarna struktura. Biološka aktivnost proteinov je velikokrat odvisna od združevanja terciarnih struktur, tako da nastanejo homooligomeri ali heterooligomeri, kjer funkcionalen protein sestavlja več enakih polipeptidnih verig. To imenujemo kvartarna struktura proteinov [1].
Poznavanje struktur makromolekul nam daje vpogled v mehanizme delovanja proteinov, pomaga razložiti interakcije med proteini, nenazadnje pa prispeva tudi k razumevanju mehanizmov delovanja celičnih enot in dinamike samih celic. Za določevanje struktur obstaja veliko metod, od katerih ima vsaka svoje prednosti in slabosti. Poleg rentgenske difrakcije, jedrske magnetne resonance (angl. Nuclear Magnetic Resonance, NMR) in krio-elektronske mikroskopije (angl. Cryogenic Electron Microscopy, cryo-EM) se uporabljajo tudi metoda sipanja rentgenskih žarkov pod malim kotom (angl. Small-angle X-ray Scattering, SAXS) in druge. Vsaka metoda ima svoje zahteve glede priprave vzorca in eksperimentalnih pogojev, hkrati pa imajo metode tudi omejitve glede velikosti preučevanih proteinov ali proteinskih kompleksov (tabela 1) [2].
Tabela 1: Primerjava treh najpogostejših metod določanja 3D struktur (rentgenske difrakcije, NMR in krio-elektronske mikroskopije). Razlike med njimi so v pripravi vzorca, velikosti obravnavanih proteinov ali proteinskih kompleksov, v dobljeni informaciji o 3D strukturi (statične oz. dinamične strukture). Vsem trem metodam je skupno, da zanje potrebujemo homogen proteinski vzorec v raztopini, kjer vzorec ne agregira.
Priprava vzorca Velikost proteina
Informacije o
strukturi Omejitve
Rentgenska difrakcija
topni proteini,
ki kristalizirajo ni omejitev 3D model, odvisen od kvalitete kristala
kristalizacija, struktura je statična
NMR zelo čista
raztopina <40-50 kDa dinamične 3D
strukture uporaba izotopov Krio-
elektronska mikroskopija
raztopina > 100 kDa dinamične 3D strukture
se uporablja samo za večje makromolekule
1.2 Rentgenska difrakcija
Difrakcija rentgenskih žarkov v diskretnih smereh nastane kot posledica interakcij elektromagnetnega sevanja s periodično urejeno snovjo. Rentgenski žarki so ionizirajoče elektromagnetno sevanje z visoko energijo. Do rentgenske difrakcije pride zaradi interakcije elektromagnetnega sevanja z elektroni atomov, ki so urejeni v kristalno mrežo.
Pri snemanju podatkov proteinske kristale izpostavimo rentgenskim žarkom, ki se pri prehodu kristalne mreže razpršijo, pri čemer pride do ojačitve signala pod specifičnim kotom. S kristali upravljamo v tekočem dušiku, prav tako pri snemanju podatkov, kar zmanjša poškodbe zaradi radiacije.
V preteklosti so bili proteini izolirani iz tkiv. Z razvojem tehnologije rekombinantne DNA pa pripravo vzorca proteina za določitev njegove 3D strukture delimo na 6 glavnih korakov:
− molekulsko kloniranje in proizvodnja tarčnih proteinov v izbranih celicah (bakterije, kvasovke, insektne, sesalske celice ali drugo);
− iskanje ustreznih pogojev, pod katerimi se bodo molekule natančno uredile v trdno strukturo in tvorile kristal;
− optimizacija kristalizacije, saj želimo, da bodo kristali dovolj veliki in bo difrakcija čim močnejša;
− zbiranje difrakcijskih podatkov (s pomočjo rentgenskega slikanja ali z obiskom sinhrotrona);
− določitev 3D strukture in piljenje 3D modela;
− analiza dobljenega 3D modela [3].
Rezultat postopka je 3D struktura preučevanega proteina, ki pa ji lahko manjkajo posamezni deli, ki se v kristalu niso uredili pri vseh molekulah enako. [1,4]
1.3 Kristalizacija proteinov
Ključna stopnja pri določevanju strukture z uporabo rentgenske difrakcije je kristalizacija makromolekul. Optimiziranje pogojev, v katerih bodo nastali najbolj urejeni kristali z najboljšim sipanjem žarkov, je edinstveno za vsak protein. Molekule proteina so v raztopini nesimetrične in fleksibilne, v kristalu pa se uredijo v trdno homogeno strukturo, ki temelji na medmolekulskih šibkih interakcijah. Takšna proteinska molekula ima omejeno število intermolekularnih interakci, ki so šibke in redke, kar pojasni občutljivost in krhkost proteinskih kristalov. Nabiti aminokislinski ostanki na površini zvitega proteina so velikokrat bistvene točke intermolekularnih stikov. Praznine med molekulami proteina so zapolnjene z molekulami topila, torej z vodo in vsemi ostalimi molekulami, ki so prisotne v kristalizacijskem koktejlu, kot tudi tistimi, ki so prišle v založno raztopino proteina med postopki čiščenja proteina. [1,2]
Proces kristalizacije poteka v t. i. mikrookolju, ki ga sestavljata raztopina rezervoarja (definirana raztopina, ki je del komercialnih setov reagentov ali pa si jo pripravimo sami) in kapljica, sestavljena iz dela raztopine rezervoarja in dela raztopine proteina v izbranih pogojih. Raztopina rezervoarja je raztopina z definirano kemijsko sestavo in natančnim pH. Lahko jo sestavljajo različni pufri ter precipitanti, ki jih delimo na tri skupine spojin:
soli, organske spojine (alkoholi, aceton …) in polietilenglikole (PEG). Te spojine so prisotne v visokih koncentracijah in njihov kemijski učinek prevlada nad spojinami, ki so prisotne v raztopini proteina. V kapljici imamo tako raztopino rezervoarja razredčeno z raztopino proteina. Ker je v rezervoarju višja koncentracija spojin kakor v kapljici, bodo molekule vode počasi prehajale iz kapljice v rezervoar, da bi se afiniteti do topila tako v rezervoarju kot v kapljici izenačili. Ta proces je odvisen od razmerja koncentracij in od temperature, pri kateri hranimo kristalizacijsko ploščo, ter od velikosti kapljice. Z ustrezno kombinacijo spojin, izbrano pravo temperaturo in pravilno koncentracijo proteina se bo s počasnim zmanjševanjem volumna kapljice, večala koncentracija proteina in precipitanta, zato se bodo molekule proteina tesno zložile v kristalno mrežo in nastali bodo proteinski kristali. Če pa pogoji niso ustrezni, bo v kapljici protein ostal v
topni obliki (ne bo nobene spremembe) ali pa bo precipitiral (agregiral) in kristalov ne bo. [4,5]
Dogajanje v kapljici lahko razdelimo na več stopenj (slika 1):
− vzpostavitev homogene raztopine takoj po pripravi kapljice, kjer pride do mešanja raztopine proteina in raztopine iz rezervoarja;
− presežena meja topnosti proteina oz. nastanek prenasičene oz. metastabilne raztopine;
− od tu gre lahko dogajanje v kapljici v dve smeri: ob ustreznih pogojih in pojavu nukleacijskih jeder lahko nastanejo kristali ali pa se komponente kapljice oborijo [2,4,5].
Slika 1: Topnostni fazni diagram. Puščica A prikazuje potek parne difuzije, kamor spadata metoda sedeče in viseče kapljice. Tukaj preide raztopina iz nenasičenega področja v področje nukleacije in nato v metastabilno področje, kjer pride do rasti kristalov. S puščico B je prikazana pot kristalizacije brez difuzije, za katero je značilno, da je že na začetku največja koncentracija precipitantov in raztopina preide v metastabilno področje z znižanjem koncentracije proteina. Povzeto po [3].
Takšne pogoje dosežemo in nadzorujemo z različnimi kristalizacijskimi metodami.
Najpogostejši načini kristalizacije so parna difuzija s sedečo kapljico (angl. sitting drop), parna difuzija z visečo kapljico (angl. hanging drop) in kristalizacija brez pomembnejše parne difuzije, kjer je kapljica ponavadi pod oljem (angl. batch crystallization) (slika 2).
Poznamo še kristalizacijo z različnimi tehnikami dialize, npr. mikrodializo, difuzija brez vmesne površine (angl. free interface diffusion) ter ostale izpeljanke. [2–5]
Slika 2: Metode kristalizacije. Shema A prikazuje metodo sedeče kapljice, na shemi B je metoda viseče kapljice. Pri obeh je kapljica ločena od raztopine rezervoarja. Shema C prikazuje
kristalizacijo brez difuzije, kjer je kapljica prekrita z oljem. Povzeto po [5].
Parna difuzija s sedečo kapljico je tehnika kristalizacije, kjer je kristalizacijska kapljica na dvignjeni površini. Sestavljena je iz deleža raztopine proteina in deleža kristalizacijskega rezervoarja, ki vsebuje določeno koncentracijo soli in ostalih precipitantov. Rezervoar se napolni z raztopino iz komercialnega seta reagentov ali drugače pripravljeno raztopino, kristalizacijska kapljica pa je na dvignjeni površini.
Celotna plošča z več vdolbinami je nato neprodušno zaprta. Med raztopino kristalizacijske kapljice in raztopino rezervoarja se bo postopno vzpostavilo ravnotežje.
Voda bo difundirala skozi parno fazo do rezervoarja, koncentraciji precipitanta in proteina v kapljici pa se bosta povečevali. Posledično bo raztopila postala prenasičena.
[5]
Pri parni difuziji z visečo kapljico so komponente kapljice in rezervoarja ter fizikalni proces vzpostavljanja ravnotežja enaki kot pri parni difuziji s sedečo kapljico. Edina razlika je ta, da se kristalizacijska kapljica drži stekelca in visi nad vdolbinico, v kateri je raztopina rezervoarja. [5]
Pri kristalizaciji brez parne difuzije so kristalizacijske kapljice z raztopino proteina prekrite in prekrite z oljem. Vodna kapljica je gostejša od olja, zato je zaščitena pred izhlapevanjem ter kontaminacijo iz zraka, hkrati tak način omogoča lažje prenašanje plošč. Ta metoda se od ostalih razlikuje po tem, da že začetna kristalizacijska kapljica vsebuje končne koncentracije proteina in precipitacijskih sredstev in je difuzija minimalna. Tako so pogoji v kapljici čez celoten poskus konstantni. [5,6]
Ugodne pogoje za tvorbo kristalov iščemo s spreminjanjem pH in vrste ter koncentracije molekul v raztopini (različni pufri, soli ali ostali precipitanti). Na proces vpliva tudi temperatura, nenazadnje pa vpliva kombinacija vseh uporabljenih snovi in temperature.
Uspešno kombinacijo je nemogoče predvideti, vendar s statistično analizo podprtim načrtovanjem eksperimentov lahko pridemo do nabora do sedaj najbolj uspešnih pogojev
in na ta način so tudi pripravljeni komercialno dostopni seti reagentov za kristalizacijo.
Posamezen set reagentov ponavadi vsebuje 96 različnih pogojev.
1.3.1 Uporaba precipitantov pri kristalizaciji proteinov
Nasičenost raztopine lahko spreminjamo z uporabo širokega spektra precipitantov. To so kemijske spojine, ki znižajo topnost proteina in s tem povečajo interakcije med makromolekulami, kar lahko vodi do kristalizacije. Med seboj so si kemijsko različne in delujejo na različne načine, zato jih v grobem delimo v tri skupine: soli, organska topila in organske polimere, med katerimi se najpogosteje uporabljajo polietilenglikoli [5].
Delujejo na različne načine, več študij pa je pokazalo, da pride ob vzajemni uporabi do sinergijskega učinka in večje verjetnosti za nastanek kristalov [4].
Topnost proteina je odvisna od okolja, v katerem je. Protein ima pozitivno in negativno nabite aminokislinske ostanke, posledično bo dodatek soli bistveno vplival na njegovo stabilnost. Graf topnosti proteina v odvisnosti od koncentracije soli prikazuje, kaj se dogaja, kadar povečujemo koncentracijo soli (slika 3). Pri nizki koncentraciji soli pridemo v t. i. področje vsoljevanja, kjer pride do stabilizacije interakcij med molekulami proteina.
Ioni soli bodo stabilizirali proteinske molekule in s tem znižali elektrostatske odboje med njimi, posledično se bo topnost proteina povečala. Pri nizki koncentraciji soli lahko pride do precipitacije ali kristalizacije proteina (točka 1). Vrh topnostne krivulje predstavlja tisto koncentracijo soli, pri kateri je protein stabiliziran ravno toliko, da je najbolj topen.
Ob nadaljnjem povečanju koncentracije soli pride do nižanja naklona topnostne krivulje in graf preide v regijo, ki se imenuje izsoljevanje. Koncentracija soli se povečuje do te mere, da protein precipitira ali kristalizira. Molekule soli povzročijo, da postanejo interakcije protein-protein prevladujoče nad interakcijami protein-topilo (točka 2, slika 3). [5]
Slika 3: Topnost proteina v odvisnosti od koncentracije soli. Ob dodatku nizkih koncentracij soli se bo topnost proteina povečevala in približala regiji vsoljevanja, kjer bodo molekule soli stabilizirale interakcije med makromolekulami. Lahko pride do precipitacije ali kristalizacije (točka 1). Maksimum krivulje je najvišje dosežena topnost proteina. Ob višjih koncentracijah soli sledi regija izsoljevanja, kjer pride do povečanih interakcij protein-protein in s tem do precipitacije ali kristalizacije proteina (točka 2). Povzeto po [5].
V drugo skupino precipitantov spadajo organska topila, ki zmanjšajo dielektrično konstanto medija. Z povečevanjem koncentracije organskega topila se povečujejo privlačne sile med makromolekulami, topilo pa postane manj učinkovito, kar vpliva na kristalizacijo makromolekul. Polietilenglikoli (PEG) so polimeri in delujejo z učinkom izključitve volumna, posledično pride do ločitve makromolekule od topila. Povprečne molske mase PEG so med 400 g/mol do 20 000 g/mol, za kristalizacijo so najbolj uporabljane med 2000 g/mol in 8000 g/mol. [5]
1.3.2 Vpliv temperature na kristalizacijo
Temperatura vpliva na kristalizacijo preko topnosti. S spreminjanjem temperature se bo spreminjala topnost proteina in s tem raven prenasičenosti, kar je gonilna sila kristalizacije [4,7]. Pri proteinih, pri katerih je topnost odvisna od temperature, lahko z izbiro ustrezne temperature vplivamo na nastanek kristalov. Nadzor in manipulacijo le-te izkoriščamo za pridobivanje kristalov. Obstajajo študije, ki dokazujejo, da ima temperatura vpliv na topnost vzorca, velikost in kakovost kristalov. [8]
Klasično kristali rastejo pri 4 °C ali pri sobni temperaturi, vendar če ob uporabi temperaturnega inkubatorja izpostavljamo kristalizacijske plošče različnim temperaturnim pogojem, lahko opazimo precipitacije kot razlike v topnosti. Vplivi
temperature so lahko bolj izraziti pri nižji ionski moči precipitantov. S spremembami temperatur vplivamo na interakcije med molekulami precipitantov in molekulami proteinov. To posledično vpliva na nukleacijo, rast kristalov, sestavljanje molekul in zaključek rasti. Študije kažejo, da lahko s kristalizacijo pri različnih temperaturah vplivamo na kristalne oblike proteinov [9].
1.3.3 Pufri in vpliv pH na kristalizacijo
Z različnimi pufri vplivamo na pH raztopine proteina oz. okolje, v katerem bo potekala kristalizacija. Za kristalizacijo proteinov je bistvenega pomena pH-vrednost raztopine, saj z njenim spreminjanjem posegamo v naboj na površini molekul proteina, kar pa vpliva na elektrostatske interakcije med njimi in posledično na združevanje molekul med kristalizacijo [10,11].
Kantardjieff in Rupp sta na obsežni študiji proteinov, ki so tvorili kristale, zaznala povezavo med izračunanimi pI vrednostmi in pH-vrednostmi kristalizacije. Ugotovila sta, da za proteine, ki imajo več kislih ostankov, in za proteine, ki imajo več bazičnih ostankov, obstaja območje pH, v katerem bo raje prišlo do kristalizacije [12].
1.3.4 Predhodna topnost kot pomemben faktor kristalizacije
Eden izmed pomembnih faktorjev kristalizacije je tudi okolje, v katerem je protein, preden ga izpostavimo pogojem na kristalizacijski plošči. Če zagotovimo maksimalno topnost proteina še preden ga nanesemo na kristalizacijske plošče, izboljšamo pogoje za rast kristalov. Dejavniki kristalizacije niso samo pufri, soli in precipitanti iz komercialnih setov reagentov, ampak tudi sama raztopina, v kateri je protein, doprinese svoj delež [13].
Izvedli so sistematične študije učinka pH raztopine na rezultate kristalizacije proteinov [11]. Tudi Gosavi in sodelavci so izvedli obširno študijo vpliva založnih raztopin na uspešnost kristalizacije različnih proteinov [14]. Z izbiro optimiziranega pufra so želeli povečati topnost proteina, kar se je kasneje izkazalo, da ima za posledico več uspeha pri kristalizaciji.
1.4 Določanje predkristalizacijskih pogojev z diferenčno dinamično fluorimetrijo (DSF)
Diferenčna dinamična fluorimetrija (DSF) je metoda, ki temelji na analizi termične stabilnosti proteina z uporabo fluorescenčnih barvil. Določena fluorescenčna barvila imajo lastnost, da v vodnem okolju ne fluorescirajo, medtem ko bodo v hidrofobnem
okolju fluorescirala, ta proces pa lahko z ustrezno opremo spremljamo. Pri DSF imamo protein v različnih raztopinah (pufer, pH, sol, aditivi) in postopoma povečujemo temperaturo (od 4 °C oz. sobne temperature do 95 °C), kar pomeni, da bo pri prvotno nativnem oz. pravilno zvitem proteinu prišlo do razvitja oz. denaturacije. Med termičnim razvijanjem proteina se bo postopoma izpostavljalo hidrofobno jedro proteina, s katerim bo interagiralo fluorescenčno barvilo. Barvilo bo ob tej interakciji fluoresciralo, kar lahko izmerimo kot intenziteto fluorescence pri določeni temperaturi. Idealno je, da se protein razvije v razmiku par stopinj, saj nam to omogoča, da izračunamo temperaturo polovice prehoda ali Tm (angl. melting temperature) po Boltzmannovem modelu (enačba 1) [15,16].
𝐼 = 𝐴 + (𝐵 − 𝐴) 1 + 𝑒(𝑇𝑚−𝑇) 𝐶⁄ Enačba 1: Boltzmannov model
I predstavlja intenziteto fluorescence pri temperaturi T, A in B sta intenziteti pred in po prehodu, C je entalpija reakcije (naklon), Tm je temperatura polovice prehoda (slika 4).
Slika 4: Graf termične denaturacije, ki prikazuje razvitje proteina in vezavo fluorescenčnega barvila. Stanje A predstavlja intenziteto fluorescence zvitega proteina, kjer so njegovi
hidrofobni deli skriti v notranjost, barvilo pa je v hidrofilnem okolju. Z višanjem temperature pride do razvitja proteina oz. do stanja B, kjer se izpostavijo hidrofobni deli, na katere se lahko veže barvilo. Z vezavo barvila na hidrofobne dele proteina se poviša intenziteta fluorescence barvila. Na polovici med obema stanjema je temperatura polovice prehoda oz. Tm. Višja, ko je vrednost Tm, bolj stabilen je protein v tistem okolju. Intenziteta fluorescence pade zaradi agregacije proteina oz. zmanjšanja hidrofobnih površin. Zeleno valovanje predstavlja vstopno
valovanje svetlobe, rumeno valovanje je valovanje po interakciji s fluorescenčnim barvilom, rdeče valovanje pa predstavlja valovanje svetlobe po odboju molekul proteina in barvila.
Povzeto po [17].
Kadar enak protein izpostavimo različnim kemijskim pogojem (sestava raztopine), lahko opazujemo spremembo Tm in te vrednosti med seboj primerjamo. Višja kot je vrednost Tm, bolj termično stabilen je protein v preučevani raztopini. Večja stabilnost proteina v osnovnih pogojih je pomembna pri kristalizaciji predvsem z vidika, da protein med kristalizacijo izpostavimo najrazličnejšim pogojem in zato želimo, da se molekule proteina v osnovni raztopini »dobro počutijo« in so vse pravilno zvite. Dvig Tm v izbrani raztopini pomeni, da okolje pozitivno vpliva oz. ima stabilizacijski vpliv na protein, medtem ko znižanje Tm pomeni, da preučevana raztopina na protein vpliva destabilizacijsko in na nek način rahlja kompaktnost strukture. Z vidika upravljanja s proteinom je takšno pufrsko okolje neustrezno, saj se poveča verjetnost proteinske agregacije že med delom. Do padca intenzitete fluorescence po doseženi maksimalni vrednosti pride zaradi agregacije in precipitacije proteina, kar povzroči zmanjšanje hidrofobne površine, na katero se veže barvilo [18,19].
Za izvedbo poskusa potrebujemo napravo, ki omogoča kontrolirano natančno spreminjanje temperature in hkratno odčitavanje fluorescence. Ker je smisel preiskave v primerjavi vrednosti Tm med različnimi vzorci, mora uporabljena naprava omogočati uporabo mikrotitrskih plošč s 96 vdolbinami. V enem poskusu protein izpostavimo veliko različnim pogojem (različni pufri, pH, aditivi). Izberemo začetno temperaturo (večina inštrumentov omogoča meritve od sobne temperature naprej), nato določimo spremembo temperature med posameznimi cikli (ponavadi je to 1 °C) ter število ciklov, ki je določeno glede na temperaturni razpon (npr. 25 – 95 °C pomeni 71 ciklov). V vsakem ciklu instrument počaka, da se temperatura v vzorcu ustali in nato odčita fluorescenco. Končni rezultat eksperimenta so denaturacijske krivulje (slika 5). Te prikazujejo emisijo fluorescence barvila v odvisnosti od ciklov, pri čemer vsak cikel pomeni dvig temperature vzorca [1,15,16].
Slika 5: Rezultat DSF. Na grafu so denaturacijske krivulje proteina lizocima, ki prikazujejo intenziteto fluorescence v odvisnosti od spremembe temperature. Z vsakim ciklom se zviša temperatura za 1 °C. Krivulje predstavljajo protein v različnih okoljih, zato se tudi vrednosti Tm
vrednosti razlikujejo.
Do sedaj so testirali veliko različnih fluorescenčnih barvil na različnih tipih proteinov [16,20]. Med vsemi testiranimi barvili se je najbolje izkazalo barvilo Sypro Orange, predvsem zaradi visokega razmerja med signalom in šumom. Njegova prvotna uporaba je barvanje gelov pri NaDS-PAGE, saj je visoko občutljivo barvilo in omogoča hitro obarvanje proteinov. Zaradi fluorescenčnih lastnosti v hidrofobnem okolju se uporablja tudi pri fluorescenčnem spremljanju termične denaturacije [21]. Vzbujamo ga pri valovni dolžini 470 nm, fluorescenco pa odčitavamo pri valovni dolžini 570 nm. Barvilo je kompatibilno s standardno laboratorijsko opremo, saj lahko proteine na obarvanih gelih zaznamo z UV-transiluminatorjem ali laserskim skenerjem. Omogoča detekcijo proteinov od 6,5 kDa naprej, ni občutljivo na glikozilacijo, hkrati pa ne obarva nukleinskih kislin ali lipopolisaharidov [22]. slika 6 prikazuje strukturo Sypro Orange.
Slika 6: Struktura barvila Sypro Orange.
Kadar ne zaznamo razvitja proteina ob uporabi barvila Sypro Orange, so na voljo še ostala barvila, ki se razlikujejo glede na vzbujanje in emisijo fluorescence in jih je smiselno testirati. Niesen in sodelavci so za DSF uporabljali tudi anilinonaftalen sulfonat (1,8-ANS oz. bis-ANS), nilsko rdeče (angl. nile red) in dapoksilsulfonsko kislino [16]. Eno izmed možnih barvil za uporabo pri DSF je tudi 9-(2,2-dicianovinil)julolidin (DCVJ). DCVJ je molekulski rotor, kjer je fluorescenca julolidinskih skupin zadušena s prosto rotirajočimi diciano skupinami v raztopini. Kadar pride do vezave na oligomerna stanja, se izgubi vrtljivost diciano skupin in posledično pride do premika emisijskega vrha [23]. Pri nekaterih proteinih pa pride do visokega začetnega signala zaradi izpostavljenih hidrofobnih žepov na površini proteina ali interakcije z detergentom. V takšnih primerih lahko uporabimo tudi za tiol specifične fluorokrome, npr. na tiol reaktivni metilkumarin [24].
Pri proteinskem inženirstvu lahko že sprememba ene aminokisline vpliva na zvijanje in agregacijo proteina, zato je lahko metoda DSF v takšnih primerih zelo uporabna.
Uporablja se za hitro določanje vpliva točkovnih ali večjih mutacij na proteinu v primerjavi s proteinom t.i. divjega tipa (protein brez mutacij oz. osnovni preučevani protein) [18].
Tudi različni ligandi imajo lahko velik vpliv na termično stabilnost makromolekul. Z DSF lahko zanesljivo in hitro določimo stabilizacijski oz. destabilizacijski vpliv posameznega liganda na preučevani protein v danih pufrskih pogojih. Vezavo liganda lahko izvedemo in potrdimo tako, da izvedemo DSF pri različnih koncentracijah preučevanega liganda.
Več študij je pokazalo, da je stabilizacijski efekt komponente proporcionalen koncentraciji in afiniteti liganda [25]. Z DSF so uspešno izračunali asociacijske konstante ligandov, rezultati pa se skladajo z drugimi metodami, kot so izotermična titracijska kalorimetrija [26] in fluorescenčni polarizacijski test [27]. Takšne informacije bi lahko
uporabili za določitev koncentracije ligandov, da bi dosegli popolno zasedenost vezavnih mest na proteinu pri kristalizaciji proteinov [18].
Eden od dejavnikov, ki vplivajo na potek eksperimenta DSF, je priprava vzorca.
Pomembno je, da je vzorec, ki mu določamo vrednost Tm, čim bolj očiščen. Boivin in sodelavci priporočajo 75-odstotno ali večjo čistost [18]. Raziskave so pokazale, da imajo lahko topnostni označevalci velik prispevek k talilni krivulji in je zato moč razlikovanja med proteinom ter proteinom z označevalcem slabša [18]. Označevalec je navidez le del zvitega rekombinantnega proteina in v najslabšem primeru lahko njegov prispevek razumemo kot zvit protein. Raziskave so pokazale, da so afinitetni označevalci, kot sta His-tag ali streptavidin, znižali termično stabilnost proteina, zato je zaželeno, da so oznake odstranjene, saj le tako zagotovimo, da ostale modifikacije ne vplivajo na zvitje proteina [18]. Prav tako začetni vzorec proteina naj ne bi vseboval visokih koncentracij pufrov ali elucijskih spojin, saj bodo le-te vplivale na končni pH vzorca na plošči [18].
Uporaba reagentov, ki vplivajo na stabilizacijo (npr. glicerol) in uporabo reducirajočih sredstev, kot sta ditiotreitol (DTT) ali tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP), ter uporaba detergentov ni priporočljiva, saj lahko vplivajo na merjenje fluorescence. Če se tem sredstev ne moremo izogniti, jih je priporočljivo uporabiti v čim nižjih koncentracijah [18].
Kadar se protein koherentno razvija, dobimo za rezultat sigmoidno krivuljo, iz katere nedvoumno izračunamo Tm preko Boltzmannove enačbe [27]. Tudi kadar imamo opravka z večdomenskim proteinom, ki ima energetsko ustrezno povezane domene, dobimo kot rezultat DSF sigmoidno krivuljo [27]. Problem nastane pri manj energetsko povezanih večdomenskih proteinih, saj pride do prekrivanja tranzicij, enojno vrednost Tm pa je težje izračunati [28]. V sistematični študiji [29] so izvedli večjo raziskavo s Sypro Orange na 657 topnih proteinih, kjer v 30 % izbranih proteinov niso določili Tm, saj ni bilo enojnega prevoja na krivulji. Kljub nezmožnosti odčitka Tm so bile razlike v uspešnosti kristalizacije majhne v primerjavi s tistimi pogoji, ki so dali enojni prevoj. Proteini, ki imajo neurejene regije s kompleksnim zvijanjem, niso primerni za DSF, saj dajo kot rezultat krivulje z več prevoji, iz katerih odčitek vrednosti Tm ni trivialen, krivulje pa pogosto niso ponovljive [18]. Ugotovili so, da je tudi v primerih, ko je mogoče trend zaznati, interpretacija skoraj nemogoča, saj je stanje interakcij med proteinom in barvilom neznano [18]. Najprimernejši so torej enodomenski proteini, katerih Tm je v temperaturnem območju, ki ga omogoča uporabljena naprava.
V nekaterih primerih se zgodi, da ne pride do nastanka značilne krivulje. Takrat so razlogi za to lahko v pripravi vzorca, protokolu ali nastavitvah PCR-rt instrumenta, ali pa protein
ne vsebuje hidrofobnega jedra [18]. Večkrat se je izkazalo, da so bili v takšnih primerih proteini premajhni in je njihovo termično stabilnost potrebno preveriti z drugimi metodami, kot so cirkularni dikroizem ali dinamično sipanje svetlobe (angl. dynamic light scattering, DLS). Termično stabilnost preverimo s tema metodama tudi, kadar je Tm višja od možne dosežene temperature v eksperimentu. Priporočajo tudi, da se v eksperiment vključi pozitivna kontrola, kot je glukoza izomeraza ali citrat sintetaza, zgolj zaradi preverjanja nastavitev eksperimenta in preverjanja odzivnosti barvila [18].
Eden izmed problemov, ki se lahko pojavlja pri eksperimentu z DSF, je visok začetni signal fluorescence, ki lahko zakrije tudi prehod proteina [30]. Kadar imamo visok začetni signal, so razlogi za to lahko delno odkriti hidrofobni deli proteina v nativnem stanju, ki lahko interagirajo z barvilom ali prisotnost detergentov.
Pred eksperimentom je priporočljivo izvesti optimizacijo, s katero ugotovimo najustreznejše razmerje med proteinom in barvilom, da je razmerje med signalom in šumom čim nižje. Smiselno je upoštevati tudi hitrost dviganja temperature in hitrost merjenja temperature, saj sta to faktorja, ki lahko generirata različne rezultate. Kadar opazimo, da je krivulja preblizu ali predaleč vertikalni osi, je smiselno spremeniti in prilagoditi temperaturno območje [31].
1.5 Določanje predkristalizacijskih pogojev kristalizacije proteinov s topnostnim testom
Topnostni test je metoda, s katero ugotavljamo kemijske oz. pufrske pogoje, pri katerih je protein najbolj topen. Pri kristalizaciji je posebej pomembno, da je proteinski vzorec čist in strukturno homogen, saj bo to pripomoglo k nastanku urejenih kristalnih vzorcev.
Pogoje topnosti izboljšujemo z iskanjem ustreznega pH in vrste pufra. Vrednost pH prispeva k naboju na molekuli proteina in vpliva na elektrostatske interakcije med ostalimi molekulami. Od interakcij med molekulami proteina je odvisno pakiranje in zlaganje le-teh v osnovno celico kristala [11]. Raziskovali so hipotezo, ki pravi, da se ob večji topnosti raje oblikujejo kristali kot amorfne snovi [32]. Ta hipoteza temelji na analizi energetike tvorbe agregatov [33]. Energijska razlika, ki je potrebna za tvorbo amorfne snovi, je nižja kot v primeru tvorbe kristala. Posledično je proces kristalizacije daljši, medtem ko je pri tvorbi amorfnih agregatov kinetika hitrejša. Tako imamo s spremljanjem topnosti vpogled v kinetiko tvorbe kristala. Kadar je topnost zvišana toliko,
Zato je optimizacija topnosti predvsem iskanje ravnovesja energetike tvorbe trdnine, ki bo znižala energijske ovire ravno toliko, da bo tvorba kristala ugodna, ne pa tako, da bo nastal amorfni precipitat [13].
Koncentracijo topnega proteina določimo ob dodatku Bradfordovega reagenta, ki vsebuje barvilo Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB) (slika 7), fosforno kislino in metanol. Za CBB je značilno, da ob vezavi na protein spremeni barvo iz rdeče v modro, pri čemer se premakne vrh absorbance s 590 nm na 620 nm. Kadar je CBB v nevtralni obliki, je njegova barva zelena, absorbanco pa je mogoče izmeriti pri 620 nm. Zato je pri merjenju absorbance kompleksa protein-barvilo, dogovor merjenje absorbance pri 595 nm [34].
Slika 7: Struktura barvila Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB).
Protokol za uporabo Bradfordovega reagenta priporoča, da kadar je le mogoče, za umeritveno krivuljo uporabimo enak protein, za katerega raziskujemo topnost [34].
Problem je namreč v tem, da Bradfordov reagent temelji na interakcijah CBB z bazičnimi aminokislinskimi ostanki v proteinih in le v nekaterih primerih bo protein, uporabljen za umeritveno krivuljo, podoben (v smislu aminokislinskih ostankov) proteinu, ki ga preiskujemo. Atherton in sodelavci so ocenili, da pride do elektrostatskih interakcij CBB predvsem s pozitivno nabitimi stranskimi verigami lizina (Lys) in arginina (Arg) [35].
Nadalje so v študiji ugotovili, da so ob upoštevanju še aminokislinskih ostankov histidina (His), dobili bolj konsistentne rezultate pri proteinski kvantifikaciji [36].
Za izvajanje topnostnega testa je pomembno, da je vzorec proteina raztopljen. Protein v suspenziji ali nefiltriranem homogenatu ne bo dal primerljivih rezultatov. Najnižja molekulska masa proteina bi naj znašala med 3 000 in 5 000 Da, saj lahko v nasprotnem primeru dobimo nizke absorbance proteinske raztopine [34].
Pri pridobivanju umeritvene krivulje je priporočljivo, da za standard uporabimo enak očiščen protein, kot ga preiskujemo. Kadar to ni mogoče, uporabimo drug protein, ki ima podobne lastnosti in ga lahko primerjamo [34]. Novejše raziskave poročajo, da se barvilo CBB veže na bazične aminokislinske ostanke, kar bi lahko igralo pomembno vlogo pri izbiri standardnega proteina [36].
V primerih, ko po standardnem postopku zaznamo le majhno spremembo v barvi, proizvajalci priporočajo postopek na mikroploščah, kjer določimo ustrezno razmerje med vzorcem in barvilom [34].
2 Namen dela in hipoteze
Namen dela je bil primerjati dve metodi optimizacije predkristalizacijskih pogojev na modelnem proteinu lizocimu. Metodi imata različno biofizikalno ozadje; ena temelji na termični stabilnosti oz. termični denaturaciji testnega proteina (diferenčna dinamična fluorimetrija), druga pa na reverzibilni topnosti testnega proteina (topnostni test).
Rezultate obeh smo želeli primerjati in združiti. Namen je bil tudi pripraviti odločitveno drevo, kako obe metodi uporabljati na primeru drugih proteinov.
Postavljene hipoteze:
1. Za vsak izbran predkristalizacijski pogoj dasta metodi dinamične diferenčne fluorimetrije in topnostnega testa različne vrednosti primernega pH in koncentracije soli za kristalizacijo proteina lizocima.
2. Združitev rezultatov dinamične diferenčne fluorimetrije in topnostnega testa za posamezne predkristalizacijske pogoje bolje napove, kateri predkristalizacijski pogoji so najugodnejši za nastanek kristalov lizocima kot vsaka metoda posebej.
3. S primerjavo rezultatov dinamične diferenčne fluorimetrije in topnostnega testa je mogoče pripraviti odločitveno drevo za iskanje najugodnejših predkristalizacijskih pogojev za vsak izbrani protein.
3 Eksperimentalni del
3.1 Materiali
Kemikalije, uporabljene pri eksperimentalnem delu, so prikazane v tabeli 2 (tabela 2).
Tabela 2: Seznam kemikalij, ki so bile uporabljene pri eksperimentalnem delu, in njihovi proizvajalci.
Kemikalija Proizvajalec
amonijev acetat VWR
bicin (N,N-bis-(2hidroksietil)-glicin) Amresco
Bradfordov reagent iz kompleta ''Quick Start'' Bio-Rad Laboratories
dimetilsulfoksid Merck
dvobazni kalijev fosfat trihidrat Acros Organics dvobazni natrijev fosfat dihidrat Sigma
HEPES Serva
imidazol Acros Organics
klorovodikova kislina VWR
lizocim iz kokošjega jajčnega beljaka Fluka Analytical MES - morfolinoetansulfonska kislina Serva
MES - natrijeva sol Roth
monobazni kalijev fosfat Fisher Chemical
natrijev acetat Honeywell Fluka
natrijev citrat Sigma
natrijev dihidrogenfosfat monohidrat Merck
natrijev hidroksid EMSURE
natrijev klorid Fisher Chemical
ocetna kislina J. T. Baker
polietilenglikol 8000 Sigma
Sypro Orange (proteinsko barvilo) Thermo Fischer Scientific
tris(hidroksimetil)aminometan Serva
Laboratorijska oprema, ki smo jo uporabili pri delu, je našteta v tabeli 3 (tabela 3).
Tabela 3: Seznam laboratorijske opreme, ki smo jo uporabili pri delu, in njihovi proizvajalci.
Laboratorijska oprema Proizvajalec
centrifuga 5415R Eppendorf
centrifuga 5804R Eppendorf
kristalizacijska platforma za avtomatsko
slikanje kristalov (Rock Imager 1000) Formulatrix kristalizacijski robot (Gryphon crystallization
robot) Art Robbins Instruments
naprava za RT-PCR MX-3005P Stratagene
pH meter: Seven easy Mettler Toledo
spektrofotometer NanodropOne Thermo scientific vibracijski mešalnik Vibromix 114 Domel
3.2 Metode
3.2.1 Testni protein
Za testni protein smo uporabili lizocim iz jajčnega beljaka, ki smo ga kupili v liofilizirani obliki (Fluka Analytical, 62971-50G-F). Z lizocimom je bilo opravljenih že veliko študij na področju topnosti in kristalizacije. Zanj smo se odločili, ker je komercialno dostopen, relativno poceni, ima zelo visoko topnost in hitro tvori kristale. Lizocim je majhen protein, sestavljen iz 147 aminokislin, ki se zvijejo v globularno strukturo. Sekvenco lizocima smo pridobili iz baze o proteinih Uniprot (P00698 LYSC_CHICK).
Aminokislinsko zaporedje lizocima je izračunano z uporabo orodja ProtParam (tabela 4) [37].
Tabela 4: Podatki za protein lizocim, izračunani z uporabo orodja ProtParam [37].
število aminokislinskih ostankov 147
molekulska masa [g/mol] 16 238,65
teoretična vrednost pI 9,36
skupno št. negativno nabitih ostankov (Asp + Glu) 9 skupno št. pozitivno nabitih ostankov (Arg + Lys + His) 19 molarni ekstinkcijski koeficient [L/(mol*cm)] 37 970
molarni ekstinkcijski koeficient [g/L] 2,338
3.2.2 Izbor pufrov
Lizocim smo pri obeh uporabljenih metodah izpostavili enakim pogojem pH. Pogoje smo izbrali iz članka, ki so ga pripravili Ericsson in sodelavci [15]. Pripravili smo 23 različnih pufrov s 100 mM koncentracijo v pH-območju med 4,5 in 9. Vsi pufri s pH-vrednostmi in kemikalije, s katerimi smo dosegli ustrezen pH, so prikazani v tabeli 5 (tabela 5).
Tabela 5: Seznam pufrov z ustreznimi pH-vrednostmi. Pri vsakem je našteta tudi kemikalija, ki smo jo uporabili za uravnavanje na določeno pH-vrednost.
Pufer pH Uravnavanje pH s/z:
1 natrijev acetat 4,5 ocetna kislina
2 natrijev citrat 4,7 citronska kislina
3 natrijev acetat 5,0 ocetna kislina
4 kalijev fosfat 5,0 KOH/fosforna kislina
5 natrijev fosfat 5,5 z mešanjem NaH2PO4×H2O in
Na2HPO4×2H2O
6 natrijev citrat 5,5 citronska kislina
7 MES 5,8 NaOH
8 kalijev fosfat 6,0 KOH/fosforna kislina
9 MES 6,2 NaOH
10 natrijev fosfat 6,5 z mešanjem NaH2PO4×H2O in Na2HPO4×2H2O
11 natrijev kakodilat 6,5 HCl
12 MES 6,5 NaOH
13 kalijev fosfat 7,0 KOH/fosforna kislina
14 HEPES 7,0 NaOH
15 amonijev acetat 7,3 amoniak
16 natrijev fosfat 7,5 z mešanjem NaH2PO4×H2O in Na2HPO4×2H2O
17 tris 7,5 HCl
18 imidazol 8,0 HCl
19 HEPES 8,0 NaOH
20 tris 8,0 HCl
21 bicin 8,0 NaOH
22 tris 8,5 HCl
23 bicin 9,0 NaOH
3.2.3 Diferenčna dinamična fluorimetrija
Pri DSF smo v prvem koraku poiskali ustrezno razmerje med proteinom in barvilom, tako da smo spremljali termično denaturacijo različnih kombinacij koncentracij barvila Sypro Orange in proteina na plošči. Založno raztopino barvila 5000× koncentracije smo razredčili z destilirano vodo na 2,5×, 5×, 25×, 50×, 250× in 500× delovne koncentracije in jih nanesli vsako v svojo vrstico plošče. Nato smo pripravili šest raztopin proteina s koncentracijami 0, 0,01, 0,1, 0,5, 1, 2 in 3 mg/ml in jih nanesli v stolpce plošče. Ploščo smo vstavili v napravo za PCR, ki je združena z bralnikom fluorescenčnih plošč, RT-PCR MX-3005P (Stratagene). Začetna temperatura eksperimenta je bila 25 °C, število ciklov 71 in v vsakem ciklu se je temperatura zvišala za 1 °C. Po končanih meritvah smo podatke izvozili v programa Excel in GraphPad ter jih obdelali po navodilih za DSF-analizo [38].
Izbrali smo tisto razmerje proteina in barvila, pri katerem je bila krivulja sigmoidna in razlika med začetno fluorescenco in maksimalno odčitano fluorescenco dovolj velika, da je omogočila analizo Tm-vrednosti, kar je bilo pri 50-kratni delovni koncentraciji raztopine Sypro Orange in koncentraciji proteina 1 mg/ml.
Po izvedbi optimizacije razmerja med barvilom in proteinom smo testirali termično stabilnost proteina v 23 izbranih pufrih ter vodi. Tabela 6 prikazuje sestavo kapljice v posameznem pogoju (tabela 6).
Tabela 6: Sestava posameznega pogoja.
Komponente v kapljici Volumen [µl]
protein 7,5
pufer 12,5
barvilo 5
Poskuse smo izvedli tudi z dodatkom 0, 100, 200 in 300 mM NaCl. Tabela 7 prikazuje razpored eksperimentalnih pogojev za DSF, kjer vrednosti A-H predstavljajo mM koncentracijo NaCl (tabela 7).
Tabela 7: Sestava plošče za DSF. Uporabili smo 23 različnih pufrov in vodo pri različnih koncentracijah NaCl. Koncentracije so v enotah mM..
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
natrijev acetat pH 4,5
natrijev citrat pH 4,7
natrijev acetat pH 5,0
kalijev fosfat pH 5,0
natrijev fosfat pH 5,5
natrijev citrat pH 5,5
MES pH 5,8
kalijev fosfat pH 6,0
MES pH 6,2
natrijev fosfat pH 6,5
natrijev kakodilat
pH 6,5 MES
pH 6,5
A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
B 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
C 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200
D 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
kalijev fosfat pH 7,0
HEPES pH 7,0
amonijev acetat pH 7,3
natrijev fosfat pH 7,5
tris pH 7,5
imidazol pH 8,0
HEPES pH 8,0
tris pH 8,0
bicin pH 8,0
tris pH 8,5
bicin pH 9,0 voda
E 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
F 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
G 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200
H 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300
Shema za DSF prikazuje potek eksperimenta (slika 8). V vsako izmed 96-ih vdolbinic smo odpipetirali testni protein lizocim, barvilo Sypro Orange in enega izmed 23 pufrov (ali vodo) v vrstnem redu, ki je prikazan v tabeli (tabela 7). Pri DSF je končni rezultat temperatura polovice prehoda izračunana po Boltzmannovem modelu pri določenem pH in koncentraciji soli.
Slika 8: Shematski prikaz poteka DSF. Vsaka izmed kapljic v vdolbinicah je bila sestavljena iz proteina, barvila in enega izmed 23 pufrov (ali vode). Razpored pufrov je prikazan v tabeli (tabela 7). Rezultat DSF-eksperimenta so krivulje, iz katerih smo izračunali temperaturo polovice prehoda, Tm [17].
3.2.4 Topnostni test
Topnost proteina smo preverjali tako, da smo različne množine proteina raztopili v 1 ml destilirane vode. Alikvote po 30 µl raztopljenega proteina smo prenesli v 1 ml velike centrifugirke. Protein smo oborili z dodatkom 40-odstotnega PEG 8000 v volumskem razmerju 1:1. Vzorce smo 15 min inkubirali na sobni temperaturi in jih nato 20 min centrifugirali pri 16.000 x g pri 4 °C. Po centrifugiranju smo odstranili supernatante in usedlinam dodali 50 µl izbranega pufra s koncentracijo 100 mM oz. v 24.
mikrocentrifugirki 50 µl dH2O. Vsi uporabljeni pufri so prikazani v tabeli 5 (tabela 5) . Tako pripravljene vzorce smo inkubirali 40 min pri sobni temperaturi in jih nato ponovno centrifugirali pri 16.000x g na 4 °C. Po centrifugiranju smo vzorcem odvzeli 5 µl supernatanta in dodali 195 µl Bradfordovega reagenta. Za Bradfordov reagent smo uporabili raztopino s petkrat manjšo koncentracijo od založne raztopine. Vzorcem smo po 5 min inkubacije pri sobni temperaturi izmerili absorbanco na spektrofotometru NanodropOne pri valovni dolžini 595 nm. Na sliki 8 je prikazana shema eksperimentalnega dela pri topnostnem testu (slika 9).
Slika 9: Shema poteka topnostnega testa. Iz začetne raztopine proteina smo prenesli po 30 µL v vsako izmed 24 centrifugirk. Nato smo z vsako izmed njih ponovili postopek, ki je opisan v spodnjem delu slike.
Rezultat te metode je količina topnega proteina v vzorcu, iz česar lahko določimo količino proteina, ki se je po reverzibilnem obarjanju s PEG 8000 ponovno raztopila v določenem pufru.
3.2.5 Združitev rezultatov obeh metod
Pri DSF dobimo za rezultat temperaturo polovice prehoda (Tm) in pri topnostnem testu količino proteina, ki se je ob dodatku pufra in soli raztopila iz oborine. Za primerjavo linearnih razmerij spremenljivk, ki opredeljujejo oba eksperimenta, in ocenami, ki smo jih določili po sistemu točkovanja, smo izračunali korelacijske koeficiente. Pri sistemu točkovanja so najboljše rezultate predstavljale najvišje temperature polovice prehoda in največje mase raztopljenega proteina. Vseh 24 rezultatov smo razdelili v štiri velikostne razrede in jim na podlagi tega pripisali ustrezno oceno. To smo naredili za obe metodi in točke sešteli. Tako smo lahko izluščili najboljše in najslabše rezultate pri obeh metodah in izbrali pufre za kristalizacijo.
3.2.6 Kristalizacija lizocima
Za kristalizacijo smo 10 mg lizocima raztopili v 200 μl izbranega pufra. Na podlagi točkovanja smo izbrali devet pufrov, od katerih jih je bilo sedem z najvišjim in dva z najnižjim seštevkom točk. Pufri, ki smo jih uporabili za kristalizacijo, so našteti v tabeli 8 (tabela 8).
Tabela 8: Izbrani pufri, ki smo jih uporabili za kristalizacijo in njihov pH.
Št. Kristalizacijski pufer pH
1 natrijev acetat 4,5
2 natrijev citrat 4,7
3 natrijev acetat 5,0
4 kalijev fosfat 5,0
6 natrijev citrat 5,5
7 MES 5,8
17 tris 7,5
18 imidazol 8,0
23 bicin 9,0
Za kristalizacijo smo uporabili tri kristalizacijske plošče s po 96 pogoji s tremi kapljicami na pogoj na plošči. Pripravili smo skupno 3×3×96 pogojev, ki so imeli enake raztopine v rezervoarjih, na vsaki plošči je bil lizocim raztopljen v treh različnih pufrih ob dodatku soli NaCl. Vsaka kapljica je vsebovala 0,1 μl raztopine proteina v izbranem pufru in 0,1 μl raztopine rezervoarja.
Plošče za pripravo rezervoarjev smo pripravili po navodilih za kristalizacijo lizocima podjetja Hampton Research [39]. Raztopine v rezervoarjih so vsebovale 0,1 M NaOAc pufer ter NaCl v koncentracijah med 0,6 M in 1,1 M s pH med 4,2 in 4,8. Vsak pogoj se je ponovil štirikrat. V tabeli so prikazani pogoji na plošči za rezervoar (tabela 9).
Tabela 9: Pogoji na kristalizacijski plošči. Vsak pogoj se je ponovil štirikrat.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,6 M NaCl
pH 4,2 0,7 M NaCl
pH 4,2 0,8 M NaCl
pH 4,2 0,9 M NaCl
pH 4,2 1,0 M NaCl
pH 4,2 1,1 M NaCl pH 4,2 B
C 0,6 M NaCl
pH 4,4 0,7 M NaCl
pH 4,4 0,8 M NaCl
pH 4,4 0,9 M NaCl
pH 4,4 1,0 M NaCl
pH 4,4 1,1 M NaCl pH 4,4 D
E 0,6 M NaCl
pH 4,6 0,7 M NaCl
pH 4,6 0,8 M NaCl
pH 4,6 0,9 M NaCl
pH 4,6 1,0 M NaCl
pH 4,6 1,1 M NaCl pH 4,6 F
G 0,6 M NaCl
pH 4,8 0,7 M NaCl
pH 4,8 0,8 M NaCl
pH 4,8 0,9 M NaCl
pH 4,8 1,0 M NaCl
pH 4,8 1,1 M NaCl pH 4,8 H
Vzorce proteina v različnih pufrih in raztopine za rezervoar smo nanesli na kristalizacijsko ploščo s kristalizacijskim robotom. Po nanosu smo vse tri plošče shranili v inkubator s kamero Rock Imager 1000, kjer smo posneli slike kristalizacijskih kapljic.
Posnetki so bili narejeni takoj ob vnosu, po dvanajstih urah, po enem, dveh, treh dnevih in tako naprej po Fibonnacijevem zaporedju.
