U
NIVERZA VL
JUBLJANIF
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJODIPLOMSKO DELO
Gašper Anton Komatar
Ljubljana, 2021
U
NIVERZA VL
JUBLJANIF
AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJOUNIVERZITETNI ŠTUDIJSKI PROGRAM 1. STOPNJE BIOKEMIJA
Kloniranje biotin ligaze BioID2 in primerjava različnih biotin ligaz za namen iskanja interakcijskih partnerjev
DIPLOMSKO DELO
Gašper Anton Komatar
M
ENTOR: doc. dr. Miha Pavšič
Ljubljana, 2021
IZJAVA O AVTORSTVU
diplomskega dela
Spodaj podpisani Gašper Anton Komatar sem avtor diplomskega dela z naslovom: Kloniranje biotin ligaze BioID2 in primerjava različnih biotin ligaz za namen iskanja interakcijskih partnerjev.
S svojim podpisom zagotavljam, da:
• je diplomsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom doc. dr. Mihe Pavšiča;
• sem poskrbel/a, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem diplomskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;
• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);
• sem poskrbel/a za slovnično in oblikovno korektnost diplomskega dela;
• je elektronska oblika diplomskega dela identična tiskani obliki diplomskega dela.
V Ljubljani, septembra 2021 Podpis avtorja:
Zahvala
Zahvaljujem se mentorju doc. dr. Mihu Pavšiču za podporo pri načrtovanju eksperimentov, potrpežljivo razlago vseh nejasnosti in zelo hitre odgovore po elektronskih medijih.
Prav tako se za pregled diplomskega dela zahvaljujem prof. dr. Brigiti Lenarčič.
Zelo močno se zahvaljujem Andreji Habič in Urošu Prešernu. Najprej za veliko prijetnih skupnih trenutkov ter za vso spodbudo in pomoč tekom celotnega dodiplomskega študija. Andreji, da si me sprejela pod svoje delovno mentorstvo, me učila načrtovati in izvajati eksperimente, pomagala interpretirati rezultate in me, ob manjših in večjih zagatah, tudi v pogovoru in molitvi ves čas spremljala in spodbujala. Urošu, da si, kadar je ni bilo v laboratoriju ali ni bila dosegljiva, z nasveti vskočil namesto Andreje ter njej tako močno stal ob strani, da je tudi ona lahko spodbujala ostale.
Rad bi se zahvalil tudi prijateljem jezuitom. Da ste me sprejeli v Jezuitski kolegij, kjer sem imel odlične pogoje za študij in pisanje diplomskega dela. Za veliko nasvetov, spodbude ter pomoči pri organizaciji mojega dela in predvsem za duhovno vodenje ter zgled na naši Poti.
Zahvaljujem se tudi svoji družini, da ste verjeli v moje sposobnosti, me spodbujali in mi stali ob strani ter me z zaupanjem finančno in materialno podpirali.
Še posebej pa se zahvaljujem mojemu čudovitemu dekletu Eriki. Zelo sem ti hvaležen, da me sprejemaš v vsem, kar sem in me vabiš v Življenje tudi tam, kjer sem jaz že (skoraj) zaprl vrata. In hodiš z mano – korak po korak.
Neubesedljivo gre Bodu Očetu, za vse kar prejemam.
Kloniranje biotin ligaze BioID2 in primerjava različnih biotin ligaz za namen iskanja interakcijskih partnerjev
Povzetek: V razvoju je nova metoda iskanja interakcijskih partnerjev DNA, ki temelji na trikomponentnem sistemu, katerega osnova je označevanje bližnjih proteinov z biotinom. Trikomponentni sistem je sestavljen iz fuzijskega proteina z biotin ligazo, kontrolnega fuzijskega proteina in F-DNA, na kateri se nahaja fragment DNA, katerega interakcijski partnerji nas zanimajo, ki omogoča kolokalizacijo vseh omenjenih komponent. Biotin protein ligaze so sicer zelo specifični encimi, vendar jih z uvajanjem določenih mutacij preoblikujemo tako, da nespecifično označujejo proteine v njihovi bližini. Zato so zelo uporabne pri odkrivanju proteinskih interakcijskih partnerjev. Do zdaj so bile s trikomponentnim sistemom vse raziskave opravljene z biotin ligazo TurboID, a je bilo zaznati veliko nespecifične biotinilacije. Zanimalo nas je, če bi bilo z uporabo BioID2 slednje manj, kar bi izboljšalo razmerje signal/šum. Zato smo v našem eksperimentu nameravali najprej klonirati vektor z BioID2 v fuziji s proteinom Tus, ki se veže na F-DNA, izraziti rekombinantni fuzijski protein in primerjati delovanja tega encima z delovanjem encima TurboID v fuziji s Tus. Uspelo nam je pomnožiti posamezne fragmente z zapisi za omenjeni protein, jih sestaviti v vključek Tus-link72-BioID2 in ga ligirati z vektorjem pET-22b(+). Tako smo dobili vektor pET22b(+)_Tus- BioID2, ki se ga lahko uporabi za pripravo fuzijskega proteina v bakterijskem ekspresijskem sistemu. Po kloniranju smo delo nadaljevali z bioinformatsko analizo TurboID in BioID2. Najprej smo želeli dodatno razložiti mehanizem vzroka povečanja hitrosti biotinilacije TurboID in BioID2. Zato smo izvedli poravnavo modelov strukture BioID2 in TurboID z eksperimentalo določenimi strukturami biotin ligaz divjega tipa. Ugotovili smo, da se katalitična aktivnost BioID2 od divjega tipa razlikuje samo zaradi zamenjave aminokislinskega ostanka v aktivnem mestu in da samo z modeliranjem ne moremo pokazati razlik, ki bi nam pomagale bolje razumeti mehanizem delovanja TurboID. Za natančnejšo analizo bi morali določiti kristalno strukturo TurboID in jo primerjati s strukturo BirA. V zadnjem delu smo teoretično analizirali še aminokislinsko zgradbo BioID2 in TurboID ter začrtali nadaljnje korake, ki so potrebni, da bi potrdili ali ovrgli postavljeno hipotezo.
Ključne besede: TurboID, BioID2, kloniranje, model strukture, interakcijski partnerji
Cloning of Biotin Ligase BioID2 and Comparison of Different Biotin Ligases in Search of Interaction Partners
Abstract: There is an ongoing development of a novel approach for DNA interaction partners discovery, which is founded on a three-component system that enables enzyme-catalyzed proximity labeling of proteins. The three- component system is comprised of a fusion protein with biotin protein ligase, control fusion protein, and F-DNA that carries DNA fragment of interest and enables colocalization of all described components. Biotin protein ligases are very specific enzymes, but with some mutations applied they become very useful for nonspecific biotinylation of surrounding proteins. That is why they are so useful for protein interaction partners discovery. Up to now all research on the three-component system was made by biotin ligase TurboID. But a big rate of nonspecific biotinylation disturbed the experiment and we became interested if using BioID2 would give a better ratio signal/background. Therefore we planned our experiment so that we would start it with cloning the vector that carries a sequence of BioID2 fusion protein with Tus that binds F-DNA, to continue with expressing recombinant fusion protein to use it in a three-component system. At last, we intended to compare the results of BioID2 and TurboID biotinylation. We succeeded to multiply fragments of a fusion protein with BioID2, assemble them in insert Tus-link72-BioID2, and ligate the insert with a cloning vector to form vector pET-22b(+)_Tus-BioID2 that could be used for fusion protein preparation in bacterial expression system. Afterward, we performed a bioinformatic analysis of TurboID and BioID2. We wanted to additionally explain the mechanism causing faster biotinylation of mutated TurboID and BioID2. That is why we aligned model structures of BioID2 and TurboID with experimentally determined structures of wild-type biotin ligases. We figured out that BioID2 catalytic activity differs from wild-type biotin ligase activity only because of amino acid residue substitution.
Small and uncharged glycine stabilizes reactive intermediate in a different way than arginine. We also concluded that modeling the structure of TurboID is not a sufficient way to show the differences in TurboID structure which would provide us with a better understanding of the mechanism for biotinylation acceleration.
For more accurate analysis a crystal structure of TurboID should be determined and then compared with a structure of BirA. In the last part, we made a theoretical study of BioID2 and TurboID amino acid structure and defined the next phases that are necessary for our hypothesis verification or disproval.
Keywords: TurboID, BioID2, cloning, model of structure, interaction partner
Kazalo
1 Uvod ... 1
1.1 Biotin protein ligaze ... 1
1.1.1 Struktura BPL in mehanizem biotinilacije ... 2
1.1.2 Biološka funkcija BPL in njihova uporabnost... 3
1.1.3 Prvi zametki razvoja promiskuitetnih BPL ... 3
1.2 Iskanje interakcijskih partnerjev ... 4
1.2.1 Prednosti označevanja bližnjih molekul z biotinom v primerjavi s starimi metodami ... 4
1.2.2 Promiskuitetne BPL ... 5
1.2.3 Trikomponentni sistem ... 5
1.2.4 Razvoj in vitro metode ... 6
2 Namen dela in hipoteze ... 9
2.1 Namen dela ... 9
2.2 Hipoteza ... 9
3 Materiali in metode ... 11
3.1 Zasnova molekulskega kloniranja ... 11
3.2 Verižna reakcija s polimerazo ... 15
3.2.1 Verižna reakcija s polimerazo na osnovi kolonije ... 17
3.3 Agarozna gelska elektroforeza ... 18
3.4 Izolacija DNA iz agaroznega gela ... 19
3.5 Priprava lepljivih koncev vključka in vektorja (restrikcija) ... 20
3.6 Ligacija (DNA) ... 20
3.7 Transformacija bakterijskih celic z vektorsko DNA ... 21
3.8 Priprava prekonočnih bakterijskih kultur ... 22
3.9 Izolacija plazmidne DNA iz bakterijskih celic ... 22
3.10 Preverjanje nukleotidnega zaporedja ... 23
3.11 Bioinformatika ... 23
4 Rezultati in razprava ... 25
4.1 PCR1 – priprava fragmentov za vključek ... 25
4.2 PCR2 – priprava vključka B-Tus-link72-BioID2 ... 26
4.3 Dvakratna restrikcija vključka in vektorja – priprava lepljivih koncev .. 27
4.4 PCR na osnovi kolonije – preverjanje uspešnosti klonirnega postopka 28 4.5 Sekvenciranje – potrditev uspešnosti klonirnega postopka ... 29
4.6 Bioinformatska analiza TurboID in BioID2 ter zasnova nadaljnjih eksperimentov ... 31
4.6.1 Poravnava modela strukture promiskuitetnih BPL z BPL divjega tipa 32 4.6.2 Poravnava aminokislinskih zaporedij BioID2 in TurboID ... 35
4.6.3 Zasnova nadaljnjih eksperimentov ... 36
4.6.4 Polarnost in izoelektrična točka ... 37
5 Zaključek ... 39
6 Seznam uporabljenih virov ... 41
Seznam uporabljenih kratic in simbolov
AGE agarozna gelska elektroforeza
AMP adenozin monofosfat (ang. adenosine monophosphate) ATP adenozin trifosfat (ang. adenosine triphosphate)
BCCD biotin vezavna domena (ang. biotin carboxyl carrier domain)
bp bazni par
BPL biotin protein ligaza C-konec karboksilni konec CO2 ogljikov dioksid
DNA deoksiribonukleinska kislina (ang. deoxyribonucleic acid) dNTP deoksiribonukleotid trifosfat
F-DNA fuzijska DNA
GFP zeleni fluorescenčni protein (ang. green fluorescent protein) HTH vijačnica-zavoj-vijačnica (HTH, ang. helix-turn-helix)
IP interakcijski partner Kd konstanta disociacije N-konec aminski konec
PCR verižna reakcija s polimerazo (ang. polymerase chain reaction) RNA ribonukleinska kislina (ang. ribonucleic acid)
rpm obrati na minuto (ang. revolutions per minute)
sfGFP zeleni fluorescenčni protein z izboljšanim zvijanjem (ang.
superfolder GFP)
U encimska enota (primer U/µl) TKS trikomponentni sistem
NAMEN DELA IN HIPOTEZE
1
1 Uvod
1.1 Biotin protein ligaze
Biotin protein ligaze (BPL) so encimi, ki na karboksilaze kovalentno pritrdijo biotin.
Reakcija je zelo specifična, zato imajo omenjeni encimi majhno število substratov in to lastnost uspešno izkoriščamo v mnogih biotehnoloških procesih1. Eno izmed najbolj perspektivnih področij, ki je v zadnjih letih v hitrem razvoju, je iskanje interakcijskih partnerjev (IP), s čimer je povezana tudi tematika tega diplomskega dela.
Slika 1.1: Strukture BirA (E. coli) z intermediatom biotinil-5'-AMP v aktivnem mestu. A – BPL je sestavljena iz treh podenot; B – aktivno mesto z označenimi ključnimi aminokislinskimi ostanki R118, W123, D176, K183 (rumena) in reakcijskim intermediatom biotinil-5'-AMP (rdeča).
N-končna domena
Katalitična domena
C-končna domena
A
B
D176
NAMEN DELA IN HIPOTEZE
2 Slika 1.2: Shematski prikaz domen BPL. Člani vseh treh razredov imajo C-
končno in osrednjo katalitično domeno, ki sta esencialni za potek katalize; BPL prvega razreda nimajo N-končne domene; BPL drugega razreda imajo kratko DNA-vezavno N-končno domeno; BPL tretjega razreda pa imajo dolgo N- končno domeno z zaenkrat še neznano vlogo.
1.1.1 Struktura BPL in mehanizem biotinilacije
BPL v splošnem lahko razdelimo v tri razrede, v katerih so člani sestavljeni iz dveh do treh različnih domen (slika 1.2). To so (1) C-končna, SH3 podobna domena, (2) osrednja katalitična, SH2 podobna domena, in (3) N-končna domena.
Vsi trije razredi imajo ohranjeno osrednjo katalitično domeno, ki katalizira biotinilacijo tarčnih proteinov. Pri tem so ključni štirje aminokislinski ostanki:
R118, W123, D176 in K183 (slika 1.1)1.
Prvi korak reakcije je vezava biotina v vezavno mesto. S tem je povezana sprememba konformacije biotin vezavne zanke in konformacija stranske skupine triptofanskega ostanka W123, ki omogoči vezavo ATP v aktivno mesto, vezan ATP pa je stabiliziran preko interakcij z ostankoma R118 in D176. V naslednjem koraku je prava konformacija lizinskega ostanka K183 ključna za nukleofilni napad karboksilnega kisikovega atoma biotina na α-fosfatno skupino ATP.
Dobimo biotinil-5'-AMP, ki je ključni intermediat biotinilacije in ga v aktivnem mestu stabilizirata R118 in K183. V zadnjem koraku biotin vezavna domena tarčnega proteina (BCCD, ang. biotin carboxyl carrier domain) z lizinskim ostankom nukleofilno napade karboksilni ogljikov atom v biotinil-5'-AMP. Dobimo biotiniliran tarčni protein, kar pomeni, da je prek lizinskega ostanka nanj vezan biotin in prost AMP1–6.
NAMEN DELA IN HIPOTEZE
3
Prav tako imajo vse BPL tudi C-končno domeno. Skupaj z osrednjo katalitično domeno je nujna za encimsko aktivnost BPL, natančen mehanizem pa še ni poznan7.
BPL prvega razreda imajo le dve domeni, člani drugega in tretjega razreda pa imajo še N-končno domeno. N-končna domena drugega razreda BPL je DNA- vezavna domena v obliki vijačnica-zavoj-vijačnica (HTH, ang. helix-turn-helix), ki omogoča encimu, da deluje tudi kot represor operona za biosintezo biotina1, 5. N- končna domena tretjega razreda BPL pa je precej večja in nima DNA vezavne vloge. Sodeluje pri pripenjanju biotina na tarčni protein, saj mutacije v tej regiji precej zmanjšajo nivo biotinilacije tarčnih proteinov2, 8.*
1.1.2 Biološka funkcija BPL in njihova uporabnost
Biotin je vodotopen vitamin B7 in je esencialen pri vseh živih organizmih. BPL katalizirajo njegovo kovalentno pripenjanje na karboksilaze, ki sodelujejo v pomembnih reakcijah energijskega metabolizma, torej metabolizma aminokislin, maščobnih kislin in ogljikovih hidratov. Vloga biotina je, da pri omenjenih reakcijah katalizira prenos CO2, vloga BPL pa, da se biotin znajde na pravem mestu, torej na eni od karboksilaz, saj šele po tem lahko opravi svojo pomembno vlogo v organizmu9.
Pripenjanje biotina na lizinske ostanke proteinov s pomočjo BPL že nekaj časa uspešno izkoriščamo v biokemijskih raziskavah10, v zadnjem času pa se odpirajo povsem nove možnosti uporabe teh encimov.
1.1.3 Prvi zametki razvoja promiskuitetnih BPL
Leta 1986 so na BPL iz bakterije E. coli (BirA) po naključni mutagenezi identificirali mutacijo R118G, kar pomeni, da je bil v aktivnem mestu 118. ostanek namesto arginina glicin11. Spomnimo, da ima pri BirA divjega tipa R118 pomembno vlogo pri stabilizaciji reaktivnega intermediata biotinil-5'-AMP (slika 1.1). Omenjena mutirana BirA* (tudi BioID) ima v primerjavi z BirA divjega tipa 100-krat večjo disociacijsko konstanto (Kd) za biotin, biotinil-5'-AMP pa iz aktivnega mesta disociira 400-krat hitreje1. Podobno se spremeni tudi delovanje mutirane BPL iz organizma A. aeolicus, če je z glicinom zamenjan argininski ostanek R40G13,14, ki ima sicer enako funkcijo kot R118 pri BPL iz E. coli. To pomeni, da se zmožnost biotinilacije takih mutiranih encimov ohrani, kinetika pa
NAMEN DELA IN HIPOTEZE
4
je celo večja in s tem biotinilacija hitrejša. Povsem nov pogled na BPL pa odkriva ugotovitev, predstavljena v nadaljevanju.
Mutacija omenjenima BPL omogoča tudi biotinilacijo za divji tip BPL netarčnih proteinov, kar pomeni, da se spremeni specifičnost tega encima. Mutirani BPL ne pripenjata biotina več le na zelo ozek izbor proteinov, kot je značilno za divji tip BPL, ampak tudi na druge proteine, ki se znajdejo v njeni okolici14. Ta pojav se imenuje nespecifična biotinilacija in je zelo pomembno odkritje, saj omogoča označevanje različnih proteinov. To pa odpira povsem nove možnosti iskanja interakcijskih partnerjev bioloških molekul15.
1.2 Iskanje interakcijskih partnerjev
Do te ugotovitve je iskanje interakcijskih partnerjev v biokemijskih raziskavah predstavljalo velik izziv. Nekatere interakcije bioloških molekul v živih organizmih so sicer močne, dolgotrajne in zdržijo tudi ostre pogoje celične lize in čiščenja vzorca, mnoge druge pa so šibke in kratkotrajne, zato je njihova detekcija s starimi metodami otežena. Z optimizacijo pogojev celične lize, izboljšanimi načini čiščenja in uvedbo vedno novih metod se je znanstvenikom sicer posrečilo odkriti mnoge pomembne interakcije1,16,17. Prednosti z biotinom označenih interakcijskih partnerjev pa vse to presegajo18. Zato je v zadnjih letih razvoj sistemov za označevanje interakcijskih partnerjev z biotinom doživel velik razvoj. Razvijajo se sistemi za določanje interakcijskih partnerjev z biotinom pri interakciji med proteini, proteomiki organelov, interakcijah RNA-protein in interakcijah DNA- protein15,19,20,37.
1.2.1 Prednosti označevanja bližnjih molekul z biotinom v primerjavi s starimi metodami
Označevanje bližnjih proteinov z biotinom (PDB, ang. proximity dependent biotinylation) je metoda, ki temelji na treh osnovnih korakih: molekulskem kloniranju, biotinilaciji in izolaciji z nadaljnjo identifikacijo produktov15, 21.
Izvedemo jo tako, da najprej pripravimo vektorski zapis, v katerem protein, pri katerem nas zanimajo interakcijski partnerji, združimo v fuziji s promiskuitetno BPL. Nato promiskuitetne biotin protein ligaze proizvedejo reaktivne intermediate, ki se prek lizinskih ostankov pripnejo na bližnje proteine, in po določenem času, potrebnim za biotinilacijo, celice liziramo. Zadnji korak je
NAMEN DELA IN HIPOTEZE
5
izolacija biotiniliranih proteinov, kar lahko izvedemo s streptavidinom, vezanim na nosilce15.
Prva velika prednost PDB je, da kovalentna vez med biotinom in interakcijskimi partnerji željenega proteina zdrži tudi celično lizo v neugodnih pogojih. Zelo pomembna pa je tudi enostavna izolacija biotiniliranih produktov. Biotin se namreč z veliko afiniteto veže na streptavidin, kar precej olajša izolacijo in čiščenje1.
1.2.2 Promiskuitetne BPL
Molekulsko kloniranje, liza celic in čiščenje so že precej izpopolnjeni koraki označevanja bližnjih molekul z biotiom. Zato izboljšave metode trenutno temeljijo predvsem na optimizaciji biotinilacije in s tem na iskanju optimalne BPL.
Od leta 2012 naprej je pripravljenih vedno več promiskuitetnih BPL. Najprej poznane BioID (E. coli)15, BioID2 (A. aeolicus)13 in BASU (B. subtilis)20 imajo sicer zadovoljivo natančnost, vendar pa je encimska kataliza počasna. Kasneje so z uvedbo novih mutacij na osnovi BirA iz E.Coli ustvarili še TurboID in miniTurbo22. Biotinilacija je pri slednjih mnogo hitrejša kot pri prej omenjenih različicah BPL, zaradi hitrejše kinetike pa pride do večje količine nespecifične biotinilacije, kar ni nujno vedno zaželjeno za namen raziskav20, 22–24. Vsaka izmed njih ima torej svoje prednosti in slabosti, zato univerzalne BPL ni. Od sistema, na katerem poteka raziskovanje, je odvisno, katera od BPL bo zanj najprimernejša.
1.2.3 Trikomponentni sistem
V našem primeru nas zanimajo vsi proteinski interakcijski partnerji (IP) znanega zaporedja DNA, tudi tisti, ki z njim tvorijo le šibke ali prehodne interakcije. Zato se je začel razvoj metode za označevanje bližnjih molekul z biotinom, ki temelji na uporabi trikomponentnega sistema (TKS), in ga je v svojem diplomskem delu predstavila Andreja Habič37. Že ime jasno sporoča, da je TKS sestavljen iz treh komponent (slika 1.3). To so (1) fuzijska DNA (F-DNA), ki vsebuje preučevano zaporedje DNA ter mesti Ter in UASGAL, (2) fuzijski protein z BPL, ki se veže na Ter, in (3) kontrolni fuzijski protein, ki se veže na UASGAL. Sestava F-DNA torej skrbi za kolokalizacijo fuzijskih protinov in iskanih IP, BPL pa označi interakcijske partnerje in kontrolni protein37.
NAMEN DELA IN HIPOTEZE
6
Fuzijski protein z BPL je sestavljen iz proteina Tus, gibljivega povezovalnega zaporedja link72 in BPL TurboID37, ki ga želimo zamenjati z BioID2. Za Tus je znano, da tvori stabilen kompleks protein—DNA z zaporedjem Ter, Tus—Ter25. Ter mora biti zato od preučevane DNA oddaljen toliko, da so iskani IP znotraj radija biotinilacije BPL. Da preverimo, če je v danih pogojih biotinilacija sploh potekla, je v sistem vključen še kontrolni fuzijski protein, ki se mora nahajati na enaki razdalji od BPL kot iskani IP. Sestavljen je iz DNA vezavnega fragmenta proteina Gal4, ki se stabilno veže na UASGAL26, gibljivega povezovalnega zaporedja link45 in zelenega fluorescenčnega proteina z izboljšanim zvijanjem (sfGFP, ang. superfolder GFP). sfGFP se ob pravilnem delovanju sistema biotinilira, in vivo pa zaradi svoje fluorescence omogoča preverjanje izražanja fuzijskih proteinov37.
1.2.4 Razvoj in vitro metode
Cilj sistema je, kot smo že omenili, iskanje IP s pomočjo TKS, kar lahko izvedemo tako in vivo kot in vitro. Vsak pristop ima svoje prednosti. Ker in vitro uporaba predvsem pri uravnavanju razmerja med komponentami omogoča večji nadzor nad sistemom, se je najprej začel razvoj in vitro metode. V ta namen se preučuje odsek DNA z znanim interakcijskim partnerjem. Izbrana je bila interakcija proteina
Slika 1.3: Shematski prikaz TKS, ki ga želimo pripraviti. Kontrolni fuzijski protein:
vidimo biotiniliran sfGFP (oranžna), link45 in DNA vezavni protein Gal4 (turkizna), ki je vezan na UASGAL (svetlomodra DNA). BPL – BioID2: BioID2 (zelena) ima v aktivnem mestu biotin (rumena) in biotinilira sosednje proteine, link72 jo povezuje z DNA vezavnim proteinom Tus, ki je vezan na DNA zaporedje Ter (rdeča). Preučevana DNA – na DNA (svetlo vijolična) je vezan biotiniliran proteininterakcijski partner tega zaporedja.
* Z dovoljenjem avtorice slike Andreje Habič sem sliko prilagodil tako, da so na njej komponente TKS označene z barvami, ki sovpadajo z barvami na slikah DNA fragmentov, uporabljenih v eksperimentih.
KONTROLNI PROTEIN BPL – BioID2 PREUČEVANA DNA
NAMEN DELA IN HIPOTEZE
7
p53, ki ga pričakujemo v lizatu celic HEK 293T, izpostavljenih oksidativnemu stresu, z zaporedjem GADD iz promotorja gena gadd45, na sliki 1.3 imenovana preučevana DNA27.
Eksperiment se začne s pripravo in inkubacijo vseh osnovnih komponent sistema (F-DNA, fuzijska proteina) z jedrnim lizatom celic HEK 293T, izpostavljenih oksidativnemu stresu. Zatem sprožimo biotinilacijo z dodatkom biotina, izoliramo biotinilirane proteine in s proteinskimi sondami detektiramo pričakovane biotinilirane proteine. Pri označevanju v opisanem sistemu se je za uspešno že izkazala TurboID, vendar pa je bilo pri eksperimentih zaznati zelo visoko raven nespecifične biotinilacije37. Zanima nas, če bi z manj nespecifične biotinilacije dobili bolj zanesljive rezultate, zato bomo v TKS uporabili še druge BPL.
NAMEN DELA IN HIPOTEZE
8
NAMEN DELA IN HIPOTEZE
9
2 Namen dela in hipoteze
2.1 Namen dela
Promiskuitetne BPL imajo različne lastnosti. Ni še dostopnih podatkov o obnašanju različnih BPL v TKS. Vemo pa, da je v drugih sistemih biotinilacija s TurboID sicer res zelo hitra, vendar v do zdaj znanih eksperimentih pride do precej obsežne nespecifične biotinilacije. Zanima nas, če bi z manj nespecifične biotinilacije v TKS dobili bolj zanesljive rezultate. Zato je bil namen tega diplomskega dela ustvariti gen za fuzijo BioID2 s Tus, da bi v naslednjih korakih eksperimenta izrazili in primerjali in vitro aktivnost oz. delovanje BioID2 in TurboID znotraj TKS.
2.2 Hipoteza
Glede na lastnosti BioID2 in TurboID v ostalih sistemih predpostavljamo, da je v TKS biotinilacija z BioID2 sicer počasnejša, a je nespecifična biotinilacija manj obsežna.
NAMEN DELA IN HIPOTEZE
10
MATERIALI IN METODE
11
3 Materiali in metode
3.1 Zasnova molekulskega kloniranja
S procesom molekulskega kloniranja (slika 3.4) smo želeli pripraviti vključek z zapisom za protein Tus, na katerega bi bila z gibljivim povezovalnim zaporedjem pripeta BioID2. Pri tem smo izhajali iz vektorjev, ki jih prikazuje slika 3.1. S tehniko verižne reakcije s polimerazo (ang. PCR, polymerase chain reaction) smo želeli pripraviti vključek Tus-link72-BioID2, ki je prikazan na sliki 3.2. Pri tem smo v reakcijski mešanici (tabela 3.2) k ostalim komponentam dodali začetne oligonukleotide, prikazane v tabeli 3.1, in po programu (tabela 3.3 in tabela 3.4) izvedli PCR reakcijo. Nato smo z restriktazama HindIII in NdeI (tabela 3.7) rezali plazmid pET-22b(+), prikazan na sliki 3.2, in vključek Tus-link72-BioID2, ter ju povezali z ligazo (tabela 3.8). S tako dobljenim vektorjem smo transformirali klonirni sev DH5α in bakterije čez noč pustili rasti na trdnem gojišču (tabela 3.9).
Izbrali smo željene kolonije in s PCR na osnovi kolonije (tabela 3.5 in tabela 3.6) preverili, v kateri izmed kolonij smo dobili klonirni vektor z željenim vključkom (slika 3.3). Kolonijo, ki je dala pozitiven rezultat, smo pripravili za sekvenciranje (tabela 3.10), s katerim smo preverili pravilnost dobljenega zaporedja.
Tabela 3.1: Tabela začetnih oligonukleotidov.
Začetni
oligonukleotid Zaporedje Tm
[°C]
B_Tus-F GAACATATGGCGCGTTACGATCT 58,1
BioID2-5R.2 CAGCCAGATCAGGTTCTTGAAactaccgcctccagaacctcctccaccgcta 78,0
BioID2-F TTCAAGAACCTGATCTGGCTG 63,2
BioID2-His-R CCCTAATGATGATGATGGTGATGgcttcttctcaggctgaac 61,2
B_His-R CCCAAGCTTCCCTAATGATGATGATGGTGATG 58,2
T7-terminator GCTAGTTATTGCTCAGCGG 61,3
T7-promoter TAATACGACTCACTATAGGG 55,9
MATERIALI IN METODE
12 Slika 3.1: Vektorski karti vektorjev pET-22b(+)/TusTurboID in myc-BioID2-MCS. A – vektor nosi zapis za DNA- vezavni protein TUS (rdeč) in link72 (črn) ; B – vektor nosi zapis za biotin protein ligazo BioID2 (svetlo zelen).
A
B
MATERIALI IN METODE
13 Slika 3.2: Shema vključka Tus-link72-BioID2 in vektorska karta plazmida pET-
22b(+). A – shematski prikaz sestavljenega vključka s prikazanima restrikcijskima mestoma HindIII in NdeI; B – klonirni vektor z restrikcijskima mestoma za HindIII in NdeI, lac operonom, RBS ter T7-promotorjem in T7-terminatorjem.
A
B
Slika 3.3: Vektorska slika pet22b(+)_Tus-BioID2. Klonirni vektor, sestavljen iz pET22b(+) in vključka Tus- link72-BioID2.
MATERIALI IN METODE
14
1)
+
B_Tus-F B_His-R=B-Tus-link72-BioID2 II) PCR2 B_Tus-F
BioID2-5R.2
+
I) PCR1-A I) PCR1-B
BioID2F BioID2_His-R
+
=Tus-link72 =BioID2
Slika 3.4: Shema eksperimenta. 1 – Iz izhodiščnih vektorjev pET-22b(+)/TusTurboID in myc-BioID2-MCS smo z uporabo verižne reakcije s polimerazo (PCR) z začetnimi oligonukleotidi B-Tus-F, BioID2-5R.2, BioID2F in BioID2_His-R v prvem koraku pomnožili zapisa za Tus-link72 (PCR1-A) in BioID2 (PCR1-B) ter ju v drugem koraku (PCR2) združili v vključek B-Tus-link72-BioID2. 2 – z restriktazama NdeI in HindIII smo pripravili lepljive konce in vektor ter vključek ligirali v pet22b(+)_Tus-BioID2. 3 – eksperiment smo zaključili s kloniranjem dobljenega vektorja v klonirnem sevu DH5α in analizo dobljene sekvence.
+
2)
KLONIRANJE IN ANALIZA PRODUKTA
3)
I) Restrikcija
II) Ligacija NdeI
HindIII
A
MATERIALI IN METODE
15
3.2 Verižna reakcija s polimerazo
Metodo PCR uporabljamo za pomnoževanje željenih odsekov matrične DNA med začetnima oligonukleotidoma. Proces se odvija ciklično s ponavljanjem treh ključnih korakov. Ti so: (1) denaturacija, pri kateri se matrična DNA razklene, (2) prileganje, pri katerem se začetni oligonukleotidi vežejo na enoverižno matrično DNA, in (3) podaljševanje, kjer termostabilna polimeraza podaljšuje nastajajočo verigo na osnovi matrične DNA.
Reakcijsko mešanico smo pripravili s polimerazo Phusion 2 U/µl (Thermo Fisher Scientific), 5-kratnim pufrom Phusion HF (Thermo Fisher Scientific), 2,5 mM mešanico dNTP (Thermo Fisher Scientific), začetnimi oligonukleotidi (Sigma- Aldrich) in ustrezno matrico oz. fragmenti DNA.
Reakcijo smo izvedli v napravah Veriti® 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) in GeneAmp® PCR System 2700 (Applied Biosystems).
Začetne oligonukleotide smo načrtovali s pomočjo programov ApE in SnapGene Viewer (tabela 3.1).
V našem eksperimentu smo metodo uporabili v dveh korakih (slika 3.4). V prvem koraku smo pri PCR1 z uporabo količin reagentov (tabela 3.2) in s programom (tabela 3.3 in tabela 3.4), kot ju predlaga proizvajalec polimeraze, pomnožili fragmenta, ki ju potrebujemo za željeni vključek. Z uporabo začetnih oligonukleotidov BioID2F in BioID2_His-R (tabela 3.1) smo iz vektorja myc- BioID2-MCS, ki je prikazan na sliki 1, pomnožili fragment z zapisom za BioID2 in hkrati z uporabo začetnih oligonukleotidov B_Tus-F in BioID2-5R.2 iz vektorja pET-22b(+)/TusTurboID fragment z zapisom za Tus-link72. Oligonukleotid BioID2-5R.2 se prilega na 5'-konec zaporedja fragmenta BioID2, zato smo v drugem koraku (PCR2) v isti reakcijski mešanici zmešali oba pri PCR1 pridobljena fragmenta in dodali začetna oligonukleotida B_Tus-F in B_His-R ter dobili pomnožen vključek B_Tus-link72-BioID2, ki ga vidimo na sliki 3.2.
MATERIALI IN METODE
16
Komponenta Količina za 50 µl
mešanice
Končna koncentracija
dH2O do 50 µl
5-kratni pufer Phusion HF 10 µl 1×
dNTP (2,5 mM) 4 µl 200 µM
smerni začetni oligonukleotid (10µM) 2,5 µl 0,5 µM protismerni začetni oligonukleotid (10µM) 2,5 µl 0,5 µM
matrična DNA 10–100 ng* 0,2–2 ng/µl
polimeraza Phusion (2 U/µl) 0,5 µl 0,02 U/µl
* V primeru več matric velja količina za vsako posebej.
Tabela 3.3: Temperaturni program za izvedbo PCR s polimerazo Phusion.
Proces Temperatura [°C] Čas [s] Število ciklov
začetna denaturacija 98 40 1
denaturacija 98 10
prileganje Ta 30 30
podaljševanje 72 15–30/kbp
končno podaljševanje
72 10 min 1
Tabela 3.2: Splošna reakcijska shema PCR s polimerazo Phusion.
MATERIALI IN METODE
17
Tabela 3.4: Temperature prileganja (Ta)
Stopnja Ta [°C]
PCR1-A 63,2
PCR1-B 61,2
PCR2 63,2
PCR na osnovi kolonije
50
3.2.1 Verižna reakcija s polimerazo na osnovi kolonije
Metodo smo uporabili za preverjanje uspešnosti klonirnega poskusa. Proces je enak klasičnemu PCR, s tem da matrično DNA dobimo tako, da v reakcijsko mešanico (tabela 3.5) z zobotrebcem prenesemo kolonijo, ki je zrasla na trdnem gojišču, in izvedemo PCR reakcijo po navodilih proizvajalca (tabela 3.6). Smerni in protismerni oligonukleotid se vežeta na zaporedji v območju T7-promotorja in T7-terminatorja. Ti se v našem končnem vektorju pet22b(+)_Tus-BioID2 nahajata tik pred in tik za vključkom (slika 3.3). Če je ligacija vektorja in vključka uspešna, se v našem primeru pomnoži 1915 bp dolg fragment.
Pri eksperimentu smo uporabljali GoTaq Green Mastermix (Promega), ki jo sestavljajo polimeraza Taq, dNTP-ji, MgCl2, pufer prave koncentracije in barvilo za vizualizacijo potovanja DNA pri AGE. Polimeraza Taq je sicer manj natančna od mnogih drugih polimeraz, vendar popolna natančnost pri takem eksperimentu niti ni potrebna. Zanima nas le, ali je med T7-promotorjem in T7-terminatorjem vključek (dobimo produkt dolg približno 1900 bp) ali ga ni (produkt je dolg približno 300 bp).
MATERIALI IN METODE
18
Tabela 3.5: Reakcijska mešanica za izvedbo PCR s polimerazo Taq na osnovi kolonije.
Komponenta Količina [ul] za
10 µl mešanice
GoTaq Green Mastermix (2X) 5
T7-promoter (10 µM) 1
T7-terminator (10 µM) 1
dH2O 3
DNA matrica *
* Z zobotrebcem smo prenesli kolonijo s trdnega gojišča.
Tabela 3.6: Temperaturna shema za izvedbo PCR s polimerazo Taq na osnovi kolonije.
Proces Temperatura [°C] Čas [s] Število ciklov
začetna denaturacija 95 120 1
denaturacija 95 30
prileganje 50 40 25
podaljševanje 73 150
končno podaljševanje
73 300 1
3.3 Agarozna gelska elektroforeza
Agarozno gelsko elektroforezo (AGE) uporabljamo za ločevanje fragmentov DNA po njihovi velikosti in obliki. Lahko jo uporabimo samo za primerjanje velikosti fragmentov v vzorcu ali pa za nadaljnjo uporabo določenega fragmenta po izolaciji DNA iz agaroznega gela.
MATERIALI IN METODE
19
Najprej agarozo glede na velikost modela in željeno zamreženost stehtamo in stalimo v ustrezni količini elektroforeznega pufra. Vse skupaj malo ohladimo, dodamo etidijev bromid (končna koncentracija 0,5 µg/ml) in nalijemo v model.
Počakamo, da polimerizira, nato pa gel zalijemo z elektroforeznim pufrom.
Vzorcu z DNA dodamo nanašalni pufer, ga nanesemo na agarozni gel in priključimo v električno polje. Negativno nabiti fragmenti DNA se v električnem polju, ki ga ustvarjata negativna katoda in pozitivna anoda, gibajo v smeri pozitivne anode, polimerizirana agaroza pa vpliva na hitrost potovanja fragmentov. Splošno velja, da hitreje potujejo krajši in bolj kompaktno zloženi fragmenti, torej višje na gelu pričakujemo daljše fragmente, nižje na gelu pa krajše. Etidijev bromid je sicer karcinogen interkalator, ki pa pod UV-svetlobo fluorescira, zato z njim zaznamo položaj fragmentov DNA v gelu.
Agarozne gele smo pripravili s pufrom TAE (40 mM Tris pufer, pH 8, 20 mM ocetna kislina in 1 mM EDTA), agarozo (Sigma Aldrich) in etidijevim bromidom (Sigma Aldrich). Pred nanosom na gel smo vzorcem dodali 6-kratni nanašalni pufer (0,25-odstotni ksilencianol, 0,25-odstotni bromfenol modro, 15-odstotni fikol tip 4000 in 120 mM EDTA) in velikost fragmentov naših vzorcev spremljali s standardoma velikosti GeneRuler 1 kbp Ladder (Thermo Fisher Scientific) in GeneRuler 100 bp Ladder (Thermo Fisher Scientific).
Za slikanje gelov smo uporabljali MiniBIS Pro (DNR Bio-Imaging Systems, Izrael).
Pri našem eksperimentu smo metodo uporabljali za izolacijo željenih fragmentov DNA iz gela po PCR1, PCR2 in restrikciji vektorja ter vključka in za spremljanje velikosti produktov po PCR na osnovi kolonije.
3.4 Izolacija DNA iz agaroznega gela
Izolacije DNA iz agaroznega gela se lotimo, ko želimo izmed vseh fragmentov DNA v vzorcu izolirati samo točno določene in jih uporabljati v nadaljnjem eksperimentu.
Izolacijo smo izvedli s kompletom reagentov E.Z.N.A Gel Extraction Kit (Omega Bio-Tek) po navodilih proizvajalca. Po protokolu željen fragment DNA od ostalih ločimo tako, da izrežemo košček gela s pripadajočo velikostjo. Nato izvedemo izolacijo, ki jo začnemo z dodajanjem DNA vezavnega pufra, nadaljujemo z vezanjem DNA na kolono s pozitivno nabitim nosilcem in zaključimo z elucijo DNA v željeno raztopino. Namesto z njihovim pufrom smo elucijo opravili z
MATERIALI IN METODE
20
deionizirano vodo. Koncentracijo DNA smo merili z merjenjem absorbance pri valovni dolžini 260 nm.
3.5 Priprava lepljivih koncev vključka in vektorja (restrikcija) Restrikcijske endonukleaze ali restriktaze so encimi, ki prepoznajo nekaj baznih parov (bp) dolgo palindromno zaporedje in cepijo DNA na točno določenem mestu. Po rezanju nastanejo topi ali lepljivi konci. To nam omogoča vnos vključka v vektor na željeno mesto.
Restrikcijo smo izvedli z restriktazama NdeI 10 U/µl (Thermo Fisher Scientific) in HindIII 10 U/µl (Thermo Fisher Scientific), z 10-kratnim pufrom R (Thermo Fisher Scientific), vključkom B_Tus-link72-BioID2 in vektorjem pET-22b(+). Razmerje komponent je prikazano v tabeli 3.7.
Kadar hkrati režemo z dvema restriktazama, moramo izbrati optimalen pufer in dodati zadostno količino obeh restriktaz. Da smo s kar se da malo encima dosegli optimalno restrikcijo, smo mešanico pustili pri 16 °C čez noč.
Tabela 3.7: Reakcijska shema restrikcije vključka in vektorja.
Komponenta vključek
B_Tus-link72-BioID2
vektor pET-22b(+) vključek B_Tus-link72-BioID2 9 (0,5 pmol) 25 (0,15 pmol)
pufer R 2 3
NdeI 1 1
HindIII 1 1
H2O 7 /
3.6 Ligacija (DNA)
DNA-ligaze ponovno povežejo proste konce DNA med seboj, tako da tvorijo fosfodiestrsko vez med prostima 5' in 3' koncema. V našem eksperimentu smo z DNA-ligazo povezali lepljive konce vektorja pET-22b(+) in vključka B_Tus-link72-
MATERIALI IN METODE
21
BioID2 (tabela 3.8) in tako pripravili nov vektor pET-22b(+)_Tus-BioID2. Ligacijo smo izvajali 3 ure.
Uporabili smo DNA-ligazo bakteriofaga T4 5 U/µl (Thermo Fisher Scientific) in 10-kratni pufer za DNA-ligazo T4 (Thermo Fisher Scientific).
Tabela 3.8: Reakcijska shema ligacije vektorja in vključka z DNA-ligazo T4.
Komponenta Količina [µl], (10 µl)
2-krat rezan pET-22b(+) (9,6 ng/µl) 4
2-krat rezan B_Tus-link72-BioID2 (35,9 ng/µl) 2
pufer 1
DNA-ligaza 1
H2O 2
3.7 Transformacija bakterijskih celic z vektorsko DNA
Transformacija je proces, v katerem kompetentne bakterijske celice sprejmejo tujo DNA. V naravi zanje to lahko predstavlja določeno selekcijsko prednost, v laboratoriju pa nam omogoča, da pripravimo bakterije z željeno vektorsko DNA.
Pri transformaciji in kloniranju smo uporabljali bakterijski sev Escherichia coli DH5α (F-φ80lacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rκ-,mκ+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1).
Transformacijo smo izvedli po standardnem postopku. Kompetentnim celicam (100 µl) smo najprej dodali ligacijski produkt z vključkom B_Tus-link72-BioID2 (5 µl) in inkubirali na ledu. Po 20 minutah smo izvedli toplotni šok (40 s pri 42 °C), celice ohladili, jim dodali tekoče gojišče LB (400 µl) in jih inkubirali (1h pri 37 °C), da so si celice opomogle. V zadnjem koraku smo jih sterilno razmazali na trdno gojišče LBA (tabela 3.9) in inkubirali čez noč pri 37 °C.
MATERIALI IN METODE
22
Tabela 3.9: Sestava tekočega oz. trdnega gojišča LBA.
Komponenta Količina
kvasni ekstrakt 5 g
kazeinski hidrolizat 10 g
NaCl 10 g
dH2O do 1 l
Ampicilin* 100 µg/ml**
agar*** 20 g
* LB je gojišče, pripravljeno po istem postopku, vendar brez ampicilina.
** Končna koncentracija antibiotika. Dodali smo ga po avtoklaviranju.
*** Samo pri pripravi trdnega gojišča.
3.8 Priprava prekonočnih bakterijskih kultur
Prekonočne kulture pripravljamo z namenom pomnoževanja bakterijskih celic z željenim vektorjem, kadar hočemo izolirati zadostno količino vektorske DNA.
V našem primeru smo metodo izvedli po analizi s PCR na osnovi kolonije in izbrali kolonijo, ki je na tem testu dala pozitiven rezultat. Sterilno smo jo prenesli v 10 ml gojišča LBA in v stresalniku pri 37 °C inkubirali čez noč pri 140 rpm.
3.9 Izolacija plazmidne DNA iz bakterijskih celic
Izolacijo plazmidne DNA izvedemo, kadar želimo izoliran plazmid uporabljati v nadaljnjih eksperimentih in kadar želimo preveriti njegovo nukleotidno zaporedje.
Za izolacijo našega vektorja iz prekonočnih bakterijskih kultur v tekočem gojišču smo uporabljali komplet reagentov GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific) po protokolu proizvajalca. Če ga povzamemo v nekaj ključnih korakih: celice iz gojišča najprej odcentrifugiramo, pelet resuspendiramo in celice liziramo z alkalno raztopino. Lizat nevtraliziramo, plazmidno DNA vežemo na kolono in jo v zadnjem koraku eluiramo v željenen topilu. Namesto z njihovim pufrom smo elucijo opravili z deionizirano vodo. Koncentracijo DNA smo določili z merjenjem absorbance pri valovni dolžini 260 nm.
MATERIALI IN METODE
23
3.10 Preverjanje nukleotidnega zaporedja
Iz prekonočne kulture izoliran plazmid smo poslali na sekvenciranje v podjetje Eurofins Genomics. Mešanico komponent za sekvenciranje smo pripravili po njihovih navodilih (tabela 3.10). Za sekvenciranje smo uporabili začetna oligonukleotida T7-promoter in T7-terminator.
Tabela 3.10: Mešanica komponent za sekvenciranje.
Komponenta Volumen Količina
plazmidna DNA z vključkom (80–
100 ng/µl)
5 µl 500 ng
začetna oligonukleotida (10 µM) 2,5 µl 2,5 µM
dH2O do 10 µl ______
3.11 Bioinformatika
Modela struktur BioID2 in TurboID so pripravili na spletni strani I-TASSER28–30. Za pripravo modela strukture BioID2 smo uporabili aminokislinsko zaporedje BioID2 (tabela 4.1). V programu smo kot predlogo vpisali edino znano strukturo BPL organizma A. aeolicus divjega tipa brez vezanih ligandov s PDB kodo 3FJP12 in I-TASSER pa je pri modeliranju uporabil še strukturo s PDB kodo 3EFR12. Za pripravo modela strukture TurboID smo uporabil aminokislinsko zaporedje TurboID (tabela 4.1), kot predlogo pa smo v program vpisali PDB kodo edine določeno strukture BPL organizma E. coli 1BIA31. I-TASSER je pri modeliranju uporabil še strukturo s PDB kodo 2EWN32.
Nato smo v programu Chimera naredili primerjavo modela strukture BioID2 s strukturo BPL iz organizma A. aeolicus s PDB kodo 3FJP12 (slika 4.6, A) in primerjavo modela strukture TurboID s strukturo BirA s PDB kodo 1BIA31 (slika 4.6, B). Vzeli smo posamezno strukturo BPL in ju v isti orientaciji, kot na poravnavi (slika 4.6, B), v programu Chimera obarvali še v skladu z elektrostatskim potencialom ter pripravili primerjavo površin na sliki 4.7.
Poravnavo večih zaporedij, to so rezultati sekvenciranja in nukleotidno zaporedje vključka (slika 4.5), smo ustvarili na spletni strani EMBL-EBI z orodjem MAFFT33. Nukleotidno zaporedje BioID2 iz vektorja MCS-BioID2-HA13 in nukleotidno
MATERIALI IN METODE
24
zaporedje TurboID iz vektorja Andreja_elements, pripravljenega v diplomski nalogi Andreje Habič37, smo v aminokislinsko (tabela 4.1) prevedli z orodjem Translate34 na strani Expasy. Nato smo na isti spletni strani z orodjem ProtParam35 določili izoelektrično točko in število polarnih aminokislinskih ostankov (tabela 4.2) ter na spletni strani EMBL-EBI z orodjem LALIGN36 naredili lokalno poravnavo omenjenih zaporedji (slika 4.8).
REZULTATI IN RAZPRAVA
25
4 Rezultati in razprava
4.1 PCR1 – priprava fragmentov za vključek
Namen tega diplomskega dela je bil ustvariti gen za fuzijo BioID2 s Tus. Zato smo v prvem koraku PCR reakcij želeli ustvariti fragmenta BioID2 in Tus, ki bi jih v naslednjem koraku s PCR reakcijo povezali v vključek Tus-link72-BioID2. Na sliki 4.1 (2 in 3) vidimo fragment velikosti okrog 1000 bp in nekaj zelo majhnih fragmentov spodaj. To ustreza pričakovanjem, saj naj bi bil fragment, ki vsebuje protein Tus, dolg 1026 bp37. Na sliki (5) vidimo tudi fragment, ki je malo manjši od 750 bp. Ta ustreza pričakovani velikosti fragmenta BioID2, ki je dolg 719 bp13. Zelo šibek fragment zgoraj verjetno pripada matrični DNA vektorja.
Kose gela, ki so vsebovali fragmente ustrezne velikosti, smo izrezali, izolirali DNA in jo uporabili v PCR2, kot je prikazano na sliki 3.4.
Slika 4.1: Produkt PCR1. 1 – standard velikosti: 1 kbp Ladder; 2,3 – Tus-link72 s previsom na 3'-koncu (1026 bp), spodaj oligonukleotidi; 4 – standard velikosti: 100 bp Ladder; 5 – vektor (zgoraj), BioID2 s His-tagom (719 bp).
REZULTATI IN RAZPRAVA
26
4.2 PCR2 – priprava vključka B-Tus-link72-BioID2
Na sliki 4.2 (1) je najbolj izrazit fragment velikosti nekje med 1500 bp in 2000 bp.
To ustreza velikosti pričakovanega vključka B-Tus-link-BioID2, ki naj bi bil velik 1733 bp. Ostale lise pripadajo začetnim oligonukleotidom in preostalim produktom, ki so nastali ob pomnoževanju s PCR.
V naslednjem koraku smo izrezali opisano liso, vključek izolirali in ga z restrikcijo in ligacijo vnesli v klonirni vektor.
Slika 4.2: Produkt PCR2: 1 – vključek B-Tus-link72-BioID2 (1733 bp); 2 – standard velikosti: 1 kbp Ladder.
REZULTATI IN RAZPRAVA
27
4.3 Dvakratna restrikcija vključka in vektorja – priprava lepljivih koncev
Vektor pET-22b(+) in s PCR reakcijami dobljen vključek B-Tus-link72-BioID2 smo rezali s HindIII in NdeI. Na AGE smo po vrsti nanesli nerezan vektor pET-22b(+) (1), rezan vektor pET-22b(+) (2), standard velikosti (3) in rezan vključek B-Tus- link72-BioID2 (4). Na sliki 4.3 (1) vidimo liso, ki je nekje med 4000 bp in 6000 bp, kar je nekoliko pod liso rezanega vektorja (2). Ker isto dolga krožna DNA potuje hitreje od linearne, lahko rečemo, da je kontrola z nerezanim vektorjem v tem primeru uspešna. Na sliki 4.3 (2) namreč vidimo liso malo pod 6000 bp, kar ustreza pričakovanjem za 2-krat rezan vektor, ki je dolg 5378 bp. Na sliki 4.3 (4) vidimo liso nekje med 1500 bp in 2000 bp, kar ustreza 2-krat rezanemu vključku dolžine 1720 bp.
Lisi smo izrezali iz gela in izolirali DNA ter fragmenta v naslednjih korakih najprej ligirali, nato pa z ligacijskim produktom transformirali klonirni sev bakterij E. coli DH5α in bakterije namnožili na trdnem gojišču. Dobili smo plošče s kolonijami, ki smo jih uporabili za PCR na osnovi kolonije.
Slika 4.3: 2-kratna restrikcija vektorja in vključka 1 – nerezan vektor pET-22b(+), krožna DNA (5493 bp); 2 – rezan vektor pET-22b(+), linearna DNA (5378 bp); 3 – standard velikosti: 1 kbp Ladder; 4 – rezan vključek B-Tus-link72-BioID2 (1720 bp).
REZULTATI IN RAZPRAVA
28
4.4 PCR na osnovi kolonije – preverjanje uspešnosti klonirnega postopka
Na plošči, kamor smo nacepili klonirne bakterije, smo izbrali šest kolonij za PCR na osnovi kolonije. Na sliki 4.4 vidimo le eno izrazito liso (5). Ta se nahaja nekje med 1500 bp in 2000 bp, kar pomeni, da se med T7-promotorjem in T7- terminatorjem v vektorju te kolonije nahaja vključek, dolg nekje med 1500 bp in 2000 bp. Po tem sklepamo, da je v tej koloniji vektor z vključkom, katerega pričakovana dolžina je 1915 bp, ki smo ga želeli ustvariti. Na sliki 4.4 (3,4,6,7,8) še vidimo, da je bil PCR pri ostalih vzorcih neuspešen. Iz bakterij z vektorjem, v katerem smo potrdili prisotnost vključka (slika 4.4, 5), smo pripravili prekonočno kulturo in pomnožen plazmid izolirali. Da bi preverili, če je zaporedje vključka pravilno, smo ga poslali na sekvenciranje.
Slika 4.4: Produkt PCR na osnovi kolonije. 1 – standard velikosti: 1 kbp Ladder; 2 – standard velikosti: 100 bp Ladder; 5 – lisa pri 1915 bp prikazuje »poln vektor«; 3,4, 6, 7. 8 – PCR ni uspel.
REZULTATI IN RAZPRAVA
29
4.5 Sekvenciranje – potrditev uspešnosti klonirnega postopka Rezultate sekvenciranja smo predstavili s poravnavo nukleotidnega zaporedja (slika 4.5). Najvišje je zapisan teoretično sestavljen zapis za vključek B-Tus- link72-BioID2, sledita pa zaporedji, ki so jih s sekvenciranjem določili v podjetju.
Forward je poimenovan odsek, ki poteka od mesta prileganja začetnega oligonukleotida T7-promoter v smeri kodirajoče verige, reverse pa je poimenovano obratno komplementarno zaporedje odseka, ki poteka od mesta prileganja začetnega oligonukleotida T7-terminator v smeri zapisa nekodirajoče verige.
Na sliki 4.5, kjer je prikazana poravnava vseh treh omenjenih zaporedij, je z zeleno označen del, kjer je zaporedje forward povsem identično zapisu vključka.
In sicer vse od začetka zapisa za vključek do mesta, kjer so, z izjemo dveh nukleotidov s konca zaporedja reverse in enega s konca zaporedja forward, identična vsa tri zaporedja, kar je označeno rdeče. Zaporedje reverse je, razen omenjenih dveh nukleotidov, identično zapisu vključka vse do konca zapisa za vključek, kar je označeno rumeno. Ker je zapis zaporedja reverse na tej sliki predstavljen z obratnim komplementarnim zaporedjem tega odseka, sta nukleotida, ki ne sovpadata z zaporedjem ostalih dveh zapisov, povsem na koncu zaporedja reverse. Povsem na koncu takih odsekov pa pri uporabljeni metodi sekvenciranja včasih pride do napak. Ker sta na mestih, kjer pride do odstopanj, identična zapisa ostalih dveh zaporedij, je sekvenciranje potrdilo pravilnost zaporedja našega vključka.
To pomeni, da je bilo naše delo uspešno in smo uspeli ustvariti zapis za fuzijo BioID2 s Tus13,37.
1. B-Tus-link72 ga---acatatggcg 2. Forward ggggtaattccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatggcg 3. Reverse --- 1. B-Tus-link72 cgttacgatctcgtagaccgactcaacactacctttcgccagatggaacaagagctggct 2. Forward cgttacgatctcgtagaccgactcaacactacctttcgccagatggaacaagagctggct 3. Reverse --- 1. B-Tus-link72 atatttgccgctcatcttgagcaacacaagctattggttgcccgcgtgttctctttgccg 2. Forward atatttgccgctcatcttgagcaacacaagctattggttgcccgcgtgttctctttgccg 3. Reverse --- 1. B-Tus-link72 gaggtaaaaaaagaggatgagcataatccgcttaatcgtattgaggtaaaacaacatctc 2. Forward gaggtaaaaaaagaggatgagcataatccgcttaatcgtattgaggtaaaacaacatctc 3. Reverse --- 1. B-Tus-link72 ggcaacgacgcgcagtcgctggcgttgcgtcatttccgccatttatttattcaacaacag 2. Forward ggcaacgacgcgcagtcgctggcgttgcgtcatttccgccatttatttattcaacaacag
REZULTATI IN RAZPRAVA
30 3. Reverse --- 1. B-Tus-link72 tccgaaaatcgcagcagcaaggccgctgtccgtctgcctggcgtgttgtgttaccaggtc 2. Forward tccgaaaatcgcagcagcaaggccgctgtccgtctgcctggcgtgttgtgttaccaggtc 3. Reverse --- 1. B-Tus-link72 gataacctttcgcaagcagcgttggtcagtcatattcagcacatcaataaactcaagacc 2. Forward gataacctttcgcaagcagcgttggtcagtcatattcagcacatcaataaactcaagacc 3. Reverse --- 1. B-Tus-link72 acgttcgagcatatcgtcacggttgaatcagaactccccaccgcggcacgttttgaatgg 2. Forward acgttcgagcatatcgtcacggttgaatcagaactccccaccgcggcacgttttgaatgg 3. Reverse --- 1. B-Tus-link72 gtgcatcgtcatttgccggggctgatcacccttaatgcttaccgcacgctcaccgttctg 2. Forward gtgcatcgtcatttgccggggctgatcacccttaatgcttaccgcacgctcaccgttctg 3. Reverse --- 1. B-Tus-link72 cacgaccccgccactttacgctttggttgggctaataaacatatcattaagaatttacat 2. Forward cacgaccccgccactttacgctttggttgggctaataaacatatcattaagaatttacat 3. Reverse --- 1. B-Tus-link72 cgtgatgaagtcctggcacagctggaaaaaagcctgaaatcaccacgcagtgtcgcaccg 2. Forward cgtgatgaagtcctggcacagctggaaaaaagcctgaaatcaccacgcagtgtcgcaccg 3. Reverse --- 1. B-Tus-link72 tggacgcgcgaggagtggcaaagaaaactggagcgagagtatcaggatatcgctgccctg 2. Forward tggacgcgcgaggagtggcaaagaaaactggagcgagagtatcaggatatcgctgccctg 3. Reverse ---gagcgagagtttcaggatatcgctgccctg 1. B-Tus-link72 -ccacagaacgcgaagttaaaaatcaaacgtccggtgaaggtgcagccgattgcccgcgt 2. Forward -ccacagaacgcgaagttaaaaatcaaacgtccggtgaaggtgcagccgattgcccgcgt 3. Reverse cccccagaacgcgaagttaaaaatcaaacgtccggtgaaggtgcagccgattgcccgcgt 1. B-Tus-link72 ctggtacaaaggagatcaaaaacaagtccaacacgcctgccctacaccactgattgcact 2. Forward ctggtacaaaggagatcaaaaacaagtccaacacgcctgccctacaccactgattgcact 3. Reverse ctggtacaaaggagatcaaaaacaagtccaacacgcctgccctacaccactgattgcact 1. B-Tus-link72 gattaatcgggataatggcgcgggcgtgccggacgttggtgagttgttaaattacgatgc 2. Forward gattaatcgggataatggcgcgggcgtgccggacgttggtgagttgttaaattacgatgc 3. Reverse gattaatcgggataatggcgcgggcgtgccggacgttggtgagttgttaaattacgatgc 1. B-Tus-link72 cgacaatgtgcagcaccgttataaacctcaggcgcagccgcttcgtttgatcattccacg 2. Forward cgacaatgtgcagcaccgttataaacctcaggcgcagccgcttcgtttgatcattccacg 3. Reverse cgacaatgtgcagcaccgttataaacctcaggcgcagccgcttcgtttgatcattccacg 1. B-Tus-link72 gctgcacctgtatgttgcagatggtggaggaggttctggaggcggtggaagtggtggcgg 2. Forward gctgcacctgtatgttgcagatggtggaggaggttctggaggcgaggaaa--- 3. Reverse gctgcacctgtatgttgcagatggtggaggaggttctggaggcggtggaagtggtggcgg 1. B-Tus-link72 aggtagcggtggaggaggttctggaggcggtagtttcaagaacctgatctggctgaagga 2. Forward --- 3. Reverse aggtagcggtggaggaggttctggaggcggtagtttcaagaacctgatctggctgaagga 1. B-Tus-link72 ggtggacagcacccaggagagactgaaggagtggaacgtgagctacggcaccgccctggt 2. Forward --- 3. Reverse ggtggacagcacccaggagagactgaaggagtggaacgtgagctacggcaccgccctggt 1. B-Tus-link72 ggccgacagacagaccaagggcagaggcggcctgggcagaaagtggctgagccaggaggg 2. Forward --- 3. Reverse ggccgacagacagaccaagggcagaggcggcctgggcagaaagtggctgagccaggaggg 1. B-Tus-link72 cggcctgtacttcagcttcctgctgaaccccaaggagttcgagaacctgctgcagctgcc 2. Forward --- 3. Reverse cggcctgtacttcagcttcctgctgaaccccaaggagttcgagaacctgctgcagctgcc
REZULTATI IN RAZPRAVA
31 1. B-Tus-link72 cctggtgctgggcctgagcgtgagcgaggccctggaggagatcaccgagatccccttcag 2. Forward --- 3. Reverse cctggtgctgggcctgagcgtgagcgaggccctggaggagatcaccgagatccccttcag 1. B-Tus-link72 cctgaagtggcccaacgacgtgtacttccaggagaagaaggtgagcggcgtgctgtgcga 2. Forward --- 3. Reverse cctgaagtggcccaacgacgtgtacttccaggagaagaaggtgagcggcgtgctgtgcga 1. B-Tus-link72 gctgagcaaggacaagctgatcgtgggcatcggcatcaacgtgaaccagagagagatccc 2. Forward --- 3. Reverse gctgagcaaggacaagctgatcgtgggcatcggcatcaacgtgaaccagagagagatccc 1. B-Tus-link72 cgaggagatcaaggacagagccaccaccctgtacgagatcaccggcaaggactgggacag 2. Forward --- 3. Reverse cgaggagatcaaggacagagccaccaccctgtacgagatcaccggcaaggactgggacag 1. B-Tus-link72 aaaggaggtgctgctgaaggtgctgaagagaatcagcgagaacctgaagaagttcaagga 2. Forward --- 3. Reverse aaaggaggtgctgctgaaggtgctgaagagaatcagcgagaacctgaagaagttcaagga 1. B-Tus-link72 gaagagcttcaaggagttcaagggcaagatcgagagcaagatgctgtacctgggcgagga 2. Forward --- 3. Reverse gaagagcttcaaggagttcaagggcaagatcgagagcaagatgctgtacctgggcgagga 1. B-Tus-link72 ggtgaagctgctgggcgagggcaagatcaccggcaagctggtgggcctgagcgagaaggg 2. Forward --- 3. Reverse ggtgaagctgctgggcgagggcaagatcaccggcaagctggtgggcctgagcgagaaggg 1. B-Tus-link72 cggcgccctgatcctgaccgaggagggcatcaaggagatcctgagcggcgagttcagcct 2. Forward --- 3. Reverse cggcgccctgatcctgaccgaggagggcatcaaggagatcctgagcggcgagttcagcct 1. B-Tus-link72 gagaagaagccatcaccatcatcatcattagggaagcttg--- 2. Forward --- 3. Reverse gagaagaagccatcaccatcatcatcattagggaagcttgcggccgcactcgagcaccac 1. B-Tus-link72 ---gg
2. Forward ---tg 3. Reverse caccaccaccactgagatccggctgctaacaaagcccgaaagaagcgaggcg
4.6 Bioinformatska analiza TurboID in BioID2 ter zasnova nadaljnjih eksperimentov
V eksperimentalnem delu diplomskega dela smo ustvarili zapis za fuzijo BioID2 s Tus. To je šele prvi korak do potrditve hipoteze. Da bi ugotovili, če je količina nespecifične biotinilacije z BioID2 res manjša, moramo izvesti še nadaljnje eksperimente. Iz do zdaj znanih podatkov smo naredili še kratko bioinformatsko analizo BioID2 in TurboID.
Slika 4.5: Poravnava pričakovanega nukleotidnega zaporedja vključka B-Tus-link72-BioID2 z rezultati dobljenimi s sekvenciranjem. 1. vrstica je nukleotidno zaporedje vključka B-Tus-link72- BioID2; 2. vrstica je nukleotidno zaporedje, določeno od mesta prileganja začetnega oligonukleotida T7-promoter v smeri kodirajoče verige (Forward); 3. vrstica je nukleotidno zaporedje, določeno od mesta prileganja začetnega oligonukleotida T7-terminator v smeri zapisa nekodirajoče verige (Reverse).
LEGENDA: Zelena – označuje odsek, kjer pride do prekrivanja vključka in zaporedja forward; rdeča – označuje odsek, kjer pride do prekrivanja vseh treh zaporedij; rumena – označuje odsek, kjer pride do prekrivanja vključka in zaporedja reverse.
REZULTATI IN RAZPRAVA
32
4.6.1 Poravnava modela strukture promiskuitetnih BPL z BPL divjega tipa
Katalitična domena
C-končna domena
A
R40G
Slika 4.6: Poravnava modelov promiskuitetnih BPL BioID2 in TurboID s strukturami divjih tipov BPL iz istega organizma: A – Model BioID2 (rdeča) se skoraj popolnoma prekriva s strukturo BPL divjega tipa (zelena), prikazani sta katalitična ter C-končna domena in mutacija R40G, kjer se G40 v aktivnem mestu BioID2 popolnoma prekriva z R40 v aktivnem mestu BPL divjega tipa; B – prikazane so N-končna, katalitična in C-končna domena divjega tipa BPL organizma E. coli BirA (zelena) in mutirane TurboID (rdeča). Model TurboID se skoraj po celotni površini prilega strukturi BirA, do največjih odstopanj pride v predelu gibljivih zank. Za primerjavo modelov je še posebej neprimerna odsotnost koordinat v strukturi BirA v predelu zanke z R118.
N-končna domena C-končna domena
Katalitična domena
B
Odsotnost koordinat
R118S
REZULTATI IN RAZPRAVA
33
Pri BioID2 je glede na divji tip mutiran le argininski ostanek v aktivnem mestu R40G. Kot je opisano v uvodu, je zaradi te mutacije, podobno kot pri BirA* v primerjavi z divjim tipom BPL organizma E. coli, hitrost biotinilacije BioID2 večja13,
14. Zanima nas, kaj vpliva na spremembo hitrosti katalize, zato smo pripravili poravnavo modela strukture BioID2 z divjim tipom BPL iz organizma A.
aeolicus12. Konformacija modela strukture BioID2 je v primerjavi z divjim tipom skoraj identična (slika 4.6). Vendar ker smo tudi kot predlogo pri modeliranju v program vnesli strukturo te iste BPL iz A. aeolicus, bi bila lahko opažena enakost posledica samega procesa modeliranja in ne identičnosti konkretnih struktur.
Kljub vsemu pa sta, z izjemo mutiranega R40G, aminokislinski zaporedji mutirane BPL in BPL divjega tipa identični, zato sta tudi strukturi najverjetneje tudi v resnici zelo podobni. Iz tega vseeno sklepamo, da pride do spremembe katalitične aktivnosti predvsem zaradi manjše stabilizacije intermediata v aktivnem mestu z glicinom, kar je podobno kot pri BioID. Zato bo verjetno delovanje BioID2 v primerjavi s TurboID podobno, kot če bi primerjali BioID in TurboID24.
Tudi v aktivnem mestu TurboID je prisotna podobna mutacija, saj je arginin zamenjan s serinom, ki zaradi svoje nukleofilnosti najverjetneje še slabše kot glicin pri BioID2 stabilizira reaktiven biotinil-5'-AMP. Glede na divji tip pa je pri TurboID še 13 drugih točkovnih mutacij, razporejenih naključno po celem proteinu. Vemo, da se hitrost katalize pri TurboID v primerjavi z BirA precej poveča, jasen mehanizem vzroka spremembe katalitične aktivnosti pa še ni poznan22. Predvidevamo, da oddaljene mutacije vplivajo na strukturo ali pa togost aktivnega mesta in s tem še pospešijo katalizo1.
Da bi preverili, če lahko določimo kakšno pomembno strukturno razliko, smo naredili primerjavo modela TurboID s strukturo divjega tipa BPL iz organizma E.
coli, BirA31. Vendar s primerjavo modela in strukture ne najdemo pomembnejših razlik (slika 4.6). Model od strukture odstopa predvsem na mestih gibljivih zank, ki povezujejo sekundarne strukture obeh BPL, vendar je njihovo dejansko konformacijo z modeliranjem težko točno določiti. Največji problem se pojavi v tem, da struktura zanke z R118 v aktivnem mestu edine določene strukture BirA brez ligandov sploh ni točno določena. Predvidevamo, da je brez vezanega intermediata ta zanka gibljiva, kar je v kristalni strukturi povezano s slabše definirano ali celo odsotno elektronsko gostoto v tem delu in posledično odsotnostjo koordinat te regije v modelu strukture.
