MAGISTRSKO DELO

(1)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

MAGISTRSKO DELO

Špela Marolt

Ljubljana, 2022

(2)

(3)

U

NIVERZA V

L

JUBLJANI

F

AKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE KEMIJA

Ustvarjanje koncentracijskega gradienta v pretočnem sistemu in analizna uporaba

MAGISTRSKO DELO

Špela Marolt

M

ENTOR

: doc. dr. Nataša Gros

Ljubljana, 2022

(4)

(5)

IZJAVA O AVTORSTVU

magistrskega dela

Spodaj podpisana Špela Marolt sem avtorica magistrskega dela z naslovom:

Ustvarjanje koncentracijskega gradienta v pretočnem sistemu in analizna uporaba.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

 je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom doc.

dr. Nataše Gros;

 sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

 se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

 sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;

 je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.

V Ljubljani, 2. 2. 2022 Podpis avtorice:

(6)

(7)

Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Kemija. Delo je bilo opravljeno na UL FKKT.

Senat UL FKKT je za mentorico magistrskega dela imenoval doc. dr. Natašo Gros.

Recenzenti: prof. dr. Irena Kralj Cigić, izr. prof. dr. Miha Lukšič

Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela

Predsednik komisije: izr. prof. dr. Miha Lukšič

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Članica: doc. dr. Nataša Gros

Članica: prof. dr. Irena Kralj Cigić

(8)

(9)

Zahvala

Mentorici doc. dr. Nataši Gros se najlepše zahvaljujem za strokovne nasvete in razlage, sistematično vodenje, usmerjanja in predloge pri izvedbi magistrskega dela.

Hvala tudi mladi raziskovalki Aleksandri Kuljanin za spodbudo in koristne nasvete pri eksperimentalnem delu ter dobro vzdušje v laboratoriju.

Za tehnično pomoč pri vzpostavitvi nove programske opreme na črpalkah se zahvaljujem Dušanu Komelu.

Iskrena hvala družini za razumevanje in podporo tekom celotnega študija.

Hvala vsem prijateljem, ki so mi stali ob strani, verjeli vame in me spodbujali.

(10)

(11)

Ustvarjanje koncentracijskega gradienta v pretočnem sistemu in analizna uporaba Povzetek:

Pri magistrskem delu smo v pretočnem sistemu ustvarjali koncentracijski gradient z uporabo dveh črpalk z nameščenima brizgama. Tovrstne črpalke omogočajo funkcije, s pomočjo katerih smo uspeli nastaviti programa za doseganje linearnega in eksponentnega gradientnega profila. Pretok prve črpalke se je s časom linearno/eksponentno povečeval od nič do maksimalne vrednosti, medtem ko se je pri drugi črpalki linearno/eksponentno zmanjševal od maksimalne vrednosti do nič. Ustreznost nastavljenih programov smo preverili s potiskanjem vode skozi sistem in nato še dveh barvil z različnim absorpcijskim maksimumom. Skladno s tem smo definirali pogoje za izvedbo titracije. Z gradientnim načinom v pretočni analizi vodimo reakcije. Primer titracije, ki smo jo spremljali spektrometrično, je reakcija Cu(II) z raztopino dinatrijeve soli EDTA, pri kateri nastane modro obarvan produkt, ki močneje absorbira svetlobo kot raztopina bakrovih ionov.

Rezultati titracij so odvisni od koncentracijskega območja analitov in razmerij s titrirnim sredstvom, ki se tvorijo v pretoku pri različnih načinih zagotavljanja gradienta. Potrdili smo oblikovne razlike v FIA-gramih, dobljenih za različne koncentracije Cu(II) pri uporabi eksponentnega oz. linearnega gradientnega programa. Izvedli smo tudi gradientno titracijo Cu(II) z raztopino dinatrijeve soli EDTA, in sicer na dva načina.

Najprej smo izmenično potiskali Cu(II) in raztopino dinatrijeve soli EDTA, nato pa smo v neprekinjen tok raztopine dinatrijeve soli EDTA potiskali Cu(II). V prvem primeru smo prišli do zaključka, da maksimum krivulje za produkt pri večjem volumskem paketu Cu(II) nastopi kasneje, v drugem primeru pa se ob spremenjeni obliki krivulje maksimum zviša.

Ključne besede: koncentracijski gradient, pretočna injekcijska analiza, titracija v pretočnem sistemu, Cu(II), EDTA

(12)

(13)

Generation of concentration gradient in flow-injection system and analytical applications

Abstract:

In the master's thesis we created a concentration gradient in the flow-injection system by using two syringe-based pumps. Such pumps enable functions, which helped us to set programs to achieve a linear and exponential gradient profile. Flow rate of the first pump increased linearly/exponentially from zero to maximum value, while on the second pump flow rate decreased linearly/exponentially from maximum value to zero. Suitability of the set programs was checked firstly by pushing water through the system and secondly by pushing two dyes with different absorption maximum. Accordingly, we defined the conditions for titration. Reactions are controlled by gradient mode in flow analysis. The model titration which we monitored spectrometrically was the Cu(II)-EDTA disodium salt solution reaction producing a blue-colored product that absorbs more light than the solution of Cu(II). The titration results depend on the concentration range of the analytes and the ratios with the titrant that are formed in the flow by different gradient modes. We confirmed the shape differences in FIA-grams obtained for different concentrations of Cu(II) using exponential/linear gradient program. We further performed a gradient titration of Cu(II) with EDTA disodium salt solution in two different ways. First, Cu(II) and EDTA disodium salt solution were pushed alternately and second, Cu(II) was pushed into the continuous flow of EDTA disodium salt solution. In the first case we came to the conclusion that maximum of the curve for the product is shifted towards later times with increase in volume of Cu(II), in contrast to the second case, in which the maximum rises while the shape of the curve changes.

Keywords: concentration gradient, flow injection analysis, titration in flow-injection system, Cu(II), EDTA

(14)

(15)

Kazalo vsebine

1 Uvod ... 1

1.1 Pretočna injekcijska analiza ... 2

1.2 Koncentracijski gradient ... 3

1.3 Pretočne titracije ... 5

2 Namen dela ... 9

3 Eksperimentalni del ... 11

3.1 Aparature in pribor ... 11

3.2 Kemikalije ... 12

3.3 Raztopine in reagenti ... 12

3.4 Postopki in programske nastavitve ... 15

3.4.1 Parametri in funkcije na črpalki... 15

3.4.2 Zajem mase s tehtnice v programu WinWedge ... 16

3.4.3 Zajem spektrov s spektrometra v programu Ocean View ... 17

3.4.4 Sestava gradientnih programov na črpalkah in preverjanje profila pretoka .. 17

3.4.5 Preverjanje delovanja gradienta z mešanjem dveh barvil ... 21

3.4.6 Pretočne titracije ... 25

4 Rezultati in razprava ... 31

4.1 Gradientni programi na črpalkah in preverjanje profila pretoka ... 31

4.1.1 Eksponentni profil pretoka ... 31

4.1.2 Linearni profil pretoka ... 32

4.2 Preverjanje delovanja gradienta z mešanjem dveh barvil ... 33

4.2.1 Tridimenzionalna predstavitev meritev z Ocean Optics... 33

4.2.2 Linearni gradient... 35

4.2.3 Eksponentni gradient ... 36

4.3 Analizna uporaba - pretočne titracije... 37

4.3.1 Titracija z gradientnim programom ... 38

4.3.2 Gradientna titracija ... 41

(16)

(17)

5 Sklep ... 45 6 Literatura ... 47

Kazalo slik

Slika 1: Skeletna formula barvila Erioglaucine ... 4 Slika 2: Skeletna formula barvila Sunset Yellow ... 4 Slika 3: Pot vzorca in titrirnega sredstva do detektorja ... 6 Slika 4: Molekula EDTA, narisana in energijsko optimizirana v programu Spartan ter njena skeletna formula ... 7 Slika 5: Raztopini barvil Erioglaucine in Sunset Yellow, uporabljeni za preverjanje delovanja gradienta ... 13 Slika 6: Delovne raztopine Cu(II) ionov za pretočne titracije ... 15 Slika 7: Shema pretočnega sistema za preverjanje profila pretoka s potiskanjem vode 19 Slika 8: Pretočni sistem za preverjanje profila pretoka s potiskanjem vode ... 20 Slika 9: Shema pretočnega sistema za preverjanje delovanja gradienta z mešanjem dveh barvil ... 21 Slika 10: Pretočni sistem za preverjanje delovanja gradienta z mešanjem dveh barvil . 22 Slika 11: Shema potiskanja reaktanta in titrirnega sredstva pri gradientni titraciji s prekinjenim tokom titrirnega sredstva ... 28 Slika 12: Odvisnost pretoka od časa za primarno in sekundarno črpalko ter skupni pretok v programu z zanko »LP:09« (tabela 3) ... 31 Slika 13: Odvisnost pretoka od časa za primarno in sekundarno črpalko ter skupni pretok v programu brez zanke (tabela 4) ... 32 Slika 14: Absorpcijska spektra barvila Erioglaucine z vrhom pri 628 nm ob času 748,83 s in barvila Sunset Yellow z vrhom pri 481 nm ob času 88,50 s ... 35 Slika 15: Odvisnost normalizirane absorbance od časa za barvili Sunset Yellow in Erioglaucine skozi celotno trajanje programa v primeru linearnega gradienta (tabela 5) ... 36 Slika 16: Odvisnost normalizirane absorbance od časa za barvili Sunset Yellow in Erioglaucine skozi celotno trajanje programa v primeru eksponentnega gradienta (tabela 6) ... 36 Slika 17: Absorpcijska spektra za reaktant Cu(II) 0,005 mol/L in produkt, kompleks Cu(II)-EDTA z začetno c obeh reaktantov 0,01 mol/L, ki sta se mešala v razmerju 1:1 38

(18)

(19)

Slika 18: Odvisnost absorbance od časa za titracijo z eksponentnim gradientnim programom (tabela 6) Cu(II) 0,01 mol/L z raztopino dinatrijeve soli EDTA 0,01 mol/L pri valovni dolžini 740 nm – vpliv medija ... 39 Slika 19: Absorpcijski spekter Cu(II) 0,005 mol/L v vodi in acetatnem pufru ... 39 Slika 20: Odvisnost absorbance od časa za titracijo Cu(II) (0,001; 0,002; 0,0025; 0,005;

0,01; 0,02; 0,05 mol/L) v acetatnem pufru z raztopino dinatrijeve soli EDTA 0,01 mol/L, izvedeno z eksponentnim gradientnim programom (tabela 6) pri valovni dolžini 740 nm v 7 cm dolgi tekočinski poti z notranjim premerom 0,75 mm ... 40 Slika 21: Odvisnost absorbance od časa za titracijo Cu(II) (0,001; 0,002; 0,0025; 0,005;

0,01; 0,02 mol/L) v acetatnem pufru z raztopino dinatrijeve soli EDTA 0,01 mol/L, izvedeno z linearnim gradientnim programom (tabela 9) pri valovni dolžini 740 nm v 7 cm dolgi tekočinski poti z notranjim premerom 0,75 mm in 30 cm dolgo navito cevko 41 Slika 22: Odvisnost absorbance od časa za gradientno titracijo Cu(II) 0,01 mol/L v acetatnem pufru z raztopino dinatrijeve soli EDTA 0,01 mol/L pri različnih časih potiskanja Cu(II) s pretokom 0,5 mL/min, valovni dolžini 740 nm in prekinjenem toku raztopine dinatrijeve soli EDTA v 7 cm dolgi tekočinski poti z notranjim premerom 0,75 mm in 30 cm dolgo navito cevko ... 42 Slika 23: Odvisnost absorbance od časa za gradientno titracijo Cu(II) (0,0025; 0,005;

0,01; 0,02 mol/L) v acetatnem pufru z raztopino dinatrijeve soli EDTA 0,01 mol/L pri 12 s potiskanju Cu(II) s pretokom 0,5 mL/min, valovni dolžini 740 nm in prekinjenem toku raztopine dinatrijeve soli EDTA v 7 cm dolgi tekočinski poti z notranjim premerom 0,75 mm in 30 cm dolgo navito cevko ... 43 Slika 24: Odvisnost absorbance od časa za gradientno titracijo Cu(II) 0,01 mol/L v acetatnem pufru z raztopino dinatrijeve soli EDTA 0,01 mol/L pri različnih časih potiskanja Cu(II) v neprekinjen tok raztopine dinatrijeve soli EDTA pri pretoku 0,5 mL/min in valovni dolžini 740 nm v 7 cm dolgi tekočinski poti z notranjim premerom 0,75 mm in 30 cm dolgo navito cevko ... 44

(20)

(21)

Kazalo tabel

Tabela 1: Priprava delovnih raztopin Cu(II) ionov ... 14 Tabela 2: Vgrajene funkcije črpalke in njihov pomen ... 16 Tabela 3: Sestavljena programa na črpalkah za preverjanje profila pretoka s potiskanjem vode. Program vsebuje zanko. ... 17 Tabela 4: Sestavljena programa na črpalkah za preverjanje profila pretoka s potiskanjem vode. Program ne vsebuje zanke. ... 18 Tabela 5: Sestavljena programa na črpalkah za preverjanje gradienta z mešanjem dveh barvil. Pretok se s časom spreminja linearno s korakom 0,05 mL/min. ... 23 Tabela 6: Sestavljena programa na črpalkah za preverjanje gradienta z mešanjem dveh barvil. Pretok se s časom spreminja eksponentno s korakom 0,01 mL/min. ... 24 Tabela 7: Sestavljena programa na črpalkah za snemanje absorpcijskega spektra reaktanta Cu(II) in produkta Cu(II)-EDTA ... 25 Tabela 8: Dodatne faze programa za snemanje spektra raztopine slepega vzorca in ozadja ... 26 Tabela 9: Nastavljena programa na črpalkah za titracijo z gradientnim programom. Pretok se s časom spreminja linearno. ... 27 Tabela 10: Nastavljena programa na črpalkah za izmenično potiskanje titrirnega sredstva, raztopine dinatrijeve soli EDTA, in različnih volumskih paketov reaktanta Cu(II) ... 28 Tabela 11: Nastavljena programa na črpalkah za potiskanje volumskih paketov reaktanta Cu(II) v neprekinjen tok titrirnega sredstva, raztopine dinatrijeve soli EDTA ... 29 Tabela 12: 3D grafa mešanja barvil ter pripadajoče nastavitve v programu ... 34 Tabela 13: Volumski paketi in pripadajoči časi potiskanja Cu(II), raztopljenega v acetatnem pufru, v neprekinjen tok raztopine dinatrijeve soli EDTA ... 44

(22)

(23)

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

FIA pretočna injekcijska analiza (angl. flow injection analysis)

SIA sekvenčna injekcijska analiza (angl. sequential injection analysis) LOV laboratoriji na ventilu (angl. lab on valve)

Na2H2Y natrijev etilendiamintetraacetat dihidrat (angl. disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate)

EDTA etilendiamintetraocetna kislina (angl. ethylenediaminetetraacetic acid) TIT titracija z injekcijo titranta (angl. titrant injection titration)

SIT titracija z injekcijo vzorca (angl. sample injection titration) PAR 4-(2-piridilazo)resorcinol (angl. 4-(2-pyridylazo)resorcinol)

(24)

(25)

Špela Marolt, Ustvarjanje koncentracijskega gradienta v pretočnem sistemu in analizna uporaba

1

1 Uvod

V zadnjih štirih desetletjih se je pretočna analiza zelo razvila. Sam razvoj še poteka, in sicer v miniaturizaciji, instrumentaciji in načinih detekcije. Pri pretočni analizi se faze analize izvajajo v toku nosilne tekočine, ki je bodisi kontinuiren bodisi segmentiran.

Vključujejo mešanje ene ali več raztopin, pri čemer pride do disperzije znotraj cevi [1, 2].

Disperzija je najpomembnejši fizikalni pojav v vseh pretočnih sistemih, ki se tvori tekom potovanja tekočine od injektorja do detektorja. Natančneje gre za dinamično in ponovljivo mešanje raztopine neke snovi z nosilno tekočino. Profil toka snovi je ob injiciranju v nosilno tekočino pravokoten. Ko se injicirana snov razprši v nosilni tekočini, se poveča širina profila toka [1].

Za nastanek disperzije sta odgovorna dva procesa: konvekcija nosilne tekočine in difuzija, ki je posledica tvorbe koncentracijskega gradienta med raztopino neke snovi in nosilno tekočino. Konvekcijo povzroči laminaren tok, pri katerem je linearna hitrost raztopine snovi ob stenah cevi enaka nič, na sredini cevi pa dvakrat večja od hitrosti nosilne tekočine. Rezultat je paraboličen profil toka. Difuzija poteka aksialno in radialno glede na smer nosilnega toka. Pomemben je le prispevek radialne difuzije, ki zmanjša linearno hitrost raztopine neke snovi na sredini cevi, ob stenah cevi pa jo poveča [1, 2, 3].

Če so pogoji za izvedbo pretočne analize ponovljivi, je tudi disperzija ponovljiva in nadzorovana. S spreminjanjem geometrije tekočinske poti je mogoče doseči nizko, srednjo ali visoko disperzijo. Analizni rezultati so odvisni od stopnje disperzije, ki je opisana s koeficientom disperzije. Ta predstavlja kvocient med koncentracijo snovi pred disperzijo in po njej [1, 2, 4, 5].

Obstajajo trije načini izvedbe pretočne analize:

 pretočna injekcijska analiza (FIA - angl. flow injection analysis),

 sekvenčna injekcijska analiza (SIA - angl. sequential injection analysis),

 laboratoriji na ventilu (LOV - angl. lab on valve) [6].

FIA je čedalje bolj uporabljana in razširjena tehnika, kjer je najpreprostejši analizator sestavljen iz črpalke, injektorja, reakcijske cevke in detektorja. Osnovna funkcija črpalke je potiskanje nosilnega toka tekočine, injektorja pa odmerjanje volumna vzorca v nosilni tok. V reakcijski cevki odmerjeni vzorec reagira z nosilnim tokom tekočine [1, 2].

Pri SIA se posamezne operacije, vodene preko računalnika, izvajajo v zaporedju- sekvencah. Analizator je sestavljen iz injekcijske batne črpalke, več-potnega izbirnega ventila, detektorja in mešalne cevke. LOV je izboljšana tehnika, ki odpravlja pomanjkljivosti predhodnih dveh možnosti [6, 7].

(26)

2

1.1 Pretočna injekcijska analiza

Začetnika na področju FIA, Jaromir Ružička in Elo Harald Hansen, sta FIA opredelila kot tehniko, ki temelji na vbrizgavanju tekočega vzorca v nedeljiv in neprekinjen tok nosilne tekočine. Vbrizgani vzorec tvori cono, ki potuje proti detektorju. Ta neprekinjeno meri absorbanco, električni potencial ali katerokoli drugo fizikalno veličino, ki se stalno spreminja zaradi potovanja vzorca skozi pretočno celico. Pravzaprav gre za pridobivanje rezultatov glede na koncentracijski gradient, ustvarjen iz vbrizganega, natančno določenega območja tekočine, ki je razpršen v nedeljiv in neprekinjen tok nosilne tekočine. V FIA sistemih morata biti vzorec in reagent dobro premešana za uspešno detekcijo nastalega produkta. Prav tako je pomemben čas njunega stika, ki vpliva na tvorbo samega produkta. Krivulja odziva ima obliko vrha, katerega višina/širina/površina je povezana s koncentracijo analita. V primerjavi z višino in površino je širina za določanje manj primerna. Kljub temu je uporabna v primeru višjih koncentracij, kjer maksimalna višina pogosto ni zajeta [1, 2].

Za sestavo FIA sistema se najpogosteje uporabljajo cevi z dolžino do 1 m in notranjim premerom 0,5 mm. Značilne vrednosti pretoka običajno ne presežejo 2 mL/min, volumni injiciranega vzorca znašajo 30 μL. Pri nekaterih aplikacijah so tovrstne dimenzije premajhne, kar velja na primer za procese v industriji. Ker so v določenih primerih reagenti zelo dragi, je smiselna miniaturizacija sistemov. Za ustrezno zasnovo sistema je dobro vedeti, koliko se injicirana raztopina razredči na poti do detektorja in koliko časa preteče od injiciranja do detekcije [1].

Med FIA se uvrščajo tudi gradientne tehnike, kot so gradientno redčenje, gradientna kalibracija, »stopped-flow«, gradientno skeniranje in gradientne titracije. Pri vseh naštetih igra ključno vlogo disperzija, nadzorovana v prostoru in času [1, 4].

FIA se uporablja na številnih področjih, in sicer v farmaciji, živilstvu, nanotehnologiji, medicini itd. Prednosti njene uporabe so:

 avtomatizacija pri pripravi vzorcev in detekciji analitov,

 preprosta konfiguracija sistema,

 analizna učinkovitost (običajno 100-300 vzorcev na uro),

 hiter odzivni čas z dobro ponovljivostjo,

 manjša poraba vzorcev in reagentov ter posledično manj odpadkov,

 preprosta, prilagodljiva in poceni instrumentacija [2].

(27)

3

1.2 Koncentracijski gradient

Po definiciji je koncentracijski gradient topljenca sprememba koncentracije na enoto razdalje v dani smeri v raztopini. Nastane z difuzijo med dvema območjema, kjer se koncentracija snovi razlikuje. Difuzija poteka, dokler se koncentraciji na obeh območjih ne izenačita [8].

Koncentracijski gradient v pretočnih sistemih nastane zaradi disperzije volumskega paketa raztopine neke snovi na poti do detektorja. Signal na detektorju je tako odvisen od velikosti volumskega paketa snovi in ne odraža direktno odziva koncentracije analita [1].

V tekočinskih linijah je mogoče z dvema črpalkama ustvariti linearni ali eksponentni gradientni profil. Sam profil je odvisen od programa, ki ga nastavimo. Pri tem poljubno določimo, kako se bo spreminjal pretok. Profil pretoka lahko preverimo s potiskanjem vode skozi sistem in merjenjem mase iztekajoče tekočine [9]. S pomočjo enačbe V = m/ρ izračunamo volumen iztisnjene vode in v nadaljevanju pretok, če poznamo časovni interval spremembe volumna.

Za ustvarjanje eksponentnega gradienta na črpalki nastavimo gradientni program, v katerega vključimo funkcijo, ki izvede zanko. Znotraj zanke uporabimo funkcijo, ki omogoča naraščanje/padanje vrednosti pretoka, in določimo število korakov, v katerem se pretok poveča/zmanjša za določeno vrednost. Pri funkciji, ki omogoča naraščanje/

padanje, nastavimo še željeni korak spremembe pretoka in pripadajoč odmerek volumna.

Tako dosežemo, da se pretok spreminja eksponentno s časom. Na eni črpalki smo nastavili program, kjer je pretok eksponentno naraščal, na drugi pa istočasno eksponentno padal.

Ustvarimo lahko tudi linearni gradient, kjer pretok na eni črpalki s časom linearno narašča, na drugi linearno pada. V kolikor programska oprema črpalke ne vsebuje linearne funkcije, moramo za ustvarjanje linearnega gradienta pri vsaki spremembi pretoka spremeniti tudi vrednost volumna. Tovrsten program posledično vsebuje veliko število faz. Če programsko opremo črpalke posodobimo, pridobimo linearno funkcijo, kar nam bistveno skrajša prvotni program za linearni gradient.

Ustvarjen gradient lahko preverimo tako, da skozi pretočni sistem potiskamo dve barvili, katerih absorpcijska spektra se minimalno prekrivata. Primera tovrstnih barvil sta Erioglaucine (slika 1) in Sunset Yellow (slika 2). Obe barvili uporabljajo v živilski industriji. Erioglaucine je modre barve in ima absorpcijski maksimum pri valovni dolžini 628 nm, Sunset Yellow je rumeno oranžne barve z absorpcijskim maksimumom pri 481 nm [10, 11]. Z nastavljenim pretokom na črpalki potiskamo posamezno barvilo in na osnovi spektrometrične detekcije spremljamo spreminjanje absorbance [12].

(28)

4

Slika 1: Skeletna formula barvila Erioglaucine

Slika 2: Skeletna formula barvila Sunset Yellow

(29)

5

1.3 Pretočne titracije

V pretočni analizi lahko vodimo reakcije z gradientnim načinom. FIA titracija je gradientna tehnika, pri kateri na podlagi ustvarjenih koncentracijskih gradientov določamo stanja, kjer sta koncentraciji titrirnega sredstva in analita v stehiometričnem razmerju. Za rezultat dobimo vrh, ki mu odčitamo širino. Ta je podana kot časovni razmik med naraščanjem in padanjem stranic vrha oziroma gre za časovni razmik med dvema elementoma tekočine z enakim disperzijskim koeficientom. Pretočna titracija je obravnavana bolj izkustveno, saj jo je s teoretičnimi modeli težko opisati zaradi raznolikosti sistemov in posameznih eksperimentalnih nastavitev. Ker so reagenti tudi v nestehiometričnih razmerjih, so poimenovane kot »psevdo« titracije. Dobljeni rezultati so posledica kemijske reakcije in fizikalne disperzije. Ta dva procesa potekata hkrati ne glede na vrsto pretočnega sistema. Njuno medsebojno prepletanje je v FIA sistemu dokaj kompleksno. Dispergirane cone niso homogeno pomešane, temveč jih tvorijo koncentracijski gradienti, nastali s postopnim prodiranjem reakcijskih zvrsti v aksialni in radialni smeri. V FIA načinu je mogoče izvesti nevtralizacijske, kompleksometrične, obarjalne in redoks titracije. Temelj je torej enak kot pri klasični titraciji, in sicer gre za porabo ekvivalentne količine reagenta. V eno-linijskem sistemu je princip sledeč: če je vzorec kislina, je le-ta vbrizgana v nosilni tok baze. Dispergirana cona se pri potovanju skozi sistem postopoma nevtralizira na čelu in koncu. Rezultat sta dve ekvivalentni točki z enakim disperzijskim koeficientom, katerih fizikalna časovna razdalja pri konstantnem pretoku narašča z naraščajočo koncentracijo injiciranega vzorca oziroma pada z naraščajočo koncentracijo titrirnega sredstva v nosilnem toku. Tako kot pri ostalih tehnikah, ki temeljijo na odčitku širine vrha, za FIA gradientne titracije velja, da je razmerje med koncentracijo analita oziroma titrirnega sredstva in fizikalno časovno razdaljo odvisno od koncentracijskega profila, ki nastane na poti od injektorja do detektorja zaradi disperzije con. Titracijo je mogoče izvesti tudi dvo-linijsko, kar pomeni, da vzorec in titrirno sredstvo potiskamo hkrati in sta pretoka v obeh tekočinskih linijah enaka. Kot pri vseh ostalih titracijah, končno točko določimo z ustreznim detektorjem [1, 4, 13, 14, 15].

Slika 3 prikazuje pot titrirnega sredstva in vzorca do detektorja. Pri tem se coni vzorca in titrirnega sredstva združita, premešata in zreagirata. V kolikor se na poti do detektorja uspešno zmešata in je na voljo dovolj časa za nastanek produkta, lahko zaznamo produkt [1].

(30)

6

Slika 3: Pot vzorca in titrirnega sredstva do detektorja

Čedalje več komercialno dostopnih FIA sistemov je opremljenih z dvema posamezno delujočima črpalkama. Titracijo, ki temelji na kontinuirnem pretoku, lahko izvedemo tako, da sočasno potiskamo tekočini bodisi pri enakem pretoku bodisi tako, da na eni črpalki spreminjamo pretok od maksimalne vrednosti do nič, na drugi pa od nič do maksimalne vrednosti, pri čemer se skupni pretok tekom procesa ohranja. Tako dosežemo potiskanje tekočin v želenem razmerju z uravnavanjem pretoka na osnovi predhodno nastavljenih gradientnih programov na črpalki. Tovrsten sistem je dokaj enostaven za upravljanje, vendar lahko naletimo na določene omejitve, kot so kompleksnost nastavitev in morebitna nestabilnost sistema, neustrezne koncentracije reagentov in zamik v delovanju črpalk. Eden izmed možnih pristopov za izvedbo gradientne titracije je tudi črpanje s prekinitvami. To pomeni, da črpalki delujeta izmenično. Medtem ko ena črpalka miruje, druga potiska tekočino in obratno [1, 16].

V magistrskem delu smo za izvedbo gradientne titracije in titracije z gradientnim programom v pretočnem sistemu izbrali reakcijo Cu(II) z dinatrijevo soljo etilendiamintetraocetne kisline (Na2H2Y – angl. disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate), ki v vodi disociira. Poteka naslednja reakcija: Cu²⁺(aq) + Na2H2Y(aq) → [CuY]^2-(aq) + 2H⁺(aq) + 2Na⁺(aq). Natančneje gre za kompleksometrično titracijo, pri kateri nastane temno modro obarvan kompleks. Pri reakciji se sprostita dva protona, zato je potrebno titrirati v prisotnosti pufra. Ena izmed prednosti izbrane titracije je, da indikator ni potreben. Končno točko titracije lahko določimo spektrometrično. Na sliki 4 je prikazana etilendiamintetraocetna kislina (EDTA – angl. ethylenediaminetetraacetic acid), ki se v analizni kemiji pogosto uporablja, saj tvori s kovinskimi ioni stabilne koordinacijske spojine - kelate v razmerju 1:1 ne glede na naboj kationa [17, 18, 19].

V pretočnem sistemu je titracija Cu(II) z EDTA že poznana, med drugim so jo izvedli za preučevanje nastalih dvojnih vrhov. Ti so rezultat injiciranja vzorca Cu(II) različnih koncentracij v tok EDTA. Vzrok za nastanek dvojnih vrhov je pomanjkanje reagenta zaradi nezadostnega mešanja z vzorcem [1, 9].

(31)

7

V enem izmed člankov so reakcijo Cu(II) z EDTA uporabili za preučevanje tako v FIA kot SIA sistemu. Cu(II) so določali spektrometrično. Reakcijo so spremljali pri 732 nm in pri tem na osnovi spreminjanja fizikalnih in kemijskih parametrov, kot so pretok, velikost reakcijske cevke, volumen Cu(II), pH medija, volumen in koncentracija EDTA ugotavljali, kakšni so optimalni pogoji za izvedbo [20].

Slika 4: Molekula EDTA, narisana in energijsko optimizirana v programu Spartan ter njena skeletna formula

Kot titrirno sredstvo so EDTA uporabili tudi za simultano določanje kalcija in magnezija v SIA sistemu s spektrometrično detekcijo, za tvorbo kompleksa s kalcijem in magnezijem pa so uporabili kalmagit. Na ta način je mogoče analizirati izvirsko, mineralno in površinsko vodo [7].

V vodi lahko z gradientno titracijo določimo koncentracijo fluorida [21]. Na splošno so tovrstne titracije uporabne tudi za določevanje kislin, kislosti (kis, dežne kapljice, olje, sadni sokovi), površinsko aktivnih snovi, aminov in njihovih soli [14].

Za določanje Fe(II) s spektrometrično detekcijo in ocetne kisline s konduktometrično detekcijo so razvili dva postopka, titracijo z injekcijo titranta (TIT - angl. titrant injection titration) in titracijo z injekcijo vzorca (SIT - angl. sample injection titration). Pri prvem postopku so titrirno sredstvo injicirali v tok vzorca, ki se je neprestano črpal in potoval proti detektorju. Pri drugem postopku so vlogi titrirnega sredstva in vzorca zamenjali.

Vzorec so injicirali in združili s titrirnim sredstvom, ki se je stalno črpalo. Koncentracijski gradient so kalibrirali z eno samo standardno raztopino, titrirnim sredstvom. Pretočni

(32)

8

sistem je bil voden s pomočjo računalnika. Ta metoda je omogočila obdelavo velikega števila vzorcev v kratkem času [13].

Obstaja tudi reverzen FIA sistem s spektrometrično detekcijo. Metodo so uporabili za hkratno določanje Fe(II) in Fe(III) v vzorcih vode. Majhno količino titrirnega sredstva, EDTA so vbrizgali v tok vzorca, ki je vseboval mešanico indikatorjev, sulfosalicilno kislino in 1,10-fenantrolin. V kislem okolju sulfosalicilna kislina tvori kompleks s Fe(III), 1,10-fenantrolin pa s Fe(II). Po injiciranju EDTA nadomesti sulfosalicilno kislino in s Fe(III) tvori bolj stabilen brezbarven kompleks. Prednost takšnega sistema je izboljšanje občutljivosti [22].

Prav tako obstaja ciklična FIA. To vrsto analize so izvedli za določitev Cu(II) s 4-(2- piridilazo)resorcinolom (PAR - angl. 4-(2-pyridylazo)resorcinol) v prisotnosti EDTA.

PAR nastopa kot indikator pri titraciji Cu(II) z EDTA. Poteka sledeča reakcija izmenjave ligandov: Cu(II)-PAR + EDTA → Cu(II)-EDTA + PAR. Pri tem se PAR stalno regenerira. Prednosti ciklične FIA sta bolj smotrna poraba reagentov in nižji stroški. Pri tovrstni analizi je pomembno, da je volumen injiciranega vzorca čim manjši. Veliko število injiciranj namreč vodi do razredčenja raztopine reagenta. S ciklično FIA je mogoče rutinsko določevati Cu(II) v industrijskih vzorcih ali vzorcih iz okolja [23].

(33)

9

2 Namen dela

Namen magistrskega dela je ustvariti koncentracijski gradient v pretočnem sistemu z uporabo dveh črpalk z nameščenima brizgama, kjer nastavljamo ustrezno razmerje med tekočinama z uravnavanjem pretoka, ter na modelu titracije ugotoviti vplive na FIA- grame. Prvi cilj je nastaviti linearni oziroma eksponentni gradientni program na posamezni črpalki in preveriti njegovo ustreznost s potiskanjem vode/dveh barvil skozi sistem. Nadalje je cilj preizkusiti nastavljen gradient na primeru kompleksometrične titracije Cu(II) z raztopino dinatrijeve soli EDTA in za primerjavo izvesti titracijo na istem modelu v klasičnem pretočnem načinu.

(34)

10

(35)

11

3 Eksperimentalni del 3.1 Aparature in pribor

Pri delu smo uporabili sledeče aparature in sestavne dele:

 Dve črpalki z nameščeno eno brizgo: model AL-1000 Dual Syringe Pump, WPI / Aladdin, Sarasota, Florida, ZDA.

 Merilna tehtnica Mettler Toledo, model AB204, Greifensee, Švica.

 Spektrometer, model USB4000 UV-VIS, Ocean Optics, Duiven, Nizozemska.

 Optična vlakna, QP400-025-SR, Ocean Optics, Duiven, Nizozemska.

 Svetlobni izvor, model DH-2000, Mikropack, Ostfildern, Nemčija.

 Pretočna celica Fiber Optics SMA Z-Flow, FIAlab, Seattle, ZDA.

 Atenuator.

 USB (Aten, UC2324) pretvornik.

 Štoparica.

 CBL-DUAL-3 kabel za sinhrono delovanje črpalk.

 Manjši T-kos, narejen v laboratoriju.

 Reakcijska cevka z dolžino 30 cm.

 Konektor za cev.

 Cevke z notranjim premerom (ID) 0,5 in 0,75 mm.

Rokovali smo z naslednjim priborom:

 Štiri plastične brizge, 10 mL, Chirana, Stara Tura, Slovaška.

 Dve čaši, 100 in 150 mL, Duran, Lenz, Nemčija.

 Volumetrične bučke, (20, 50, 100, 200, 1000) mL, razred A, Duran/Brand, Wertheim, Nemčija.

 Posodica za urin, 100 mL.

 Sponke za ustavitev pretakanja tekočine po ceveh.

 Polnilna pipeta, 1 mL, razred AS, ISOLAB, Nemčija.

 Polnilna pipeta, (2, 4, 5) mL, razred A, Normax, Marinha Grande, Portugalska.

 Polnilna pipeta, 10 mL, razred AS, Brand, Wertheim, Nemčija.

 Coulter counter viale, 20 mL, Brand, Wertheim, Nemčija.

 Plastične posode, 1 L.

 Indikatorski papir Duotest, pH 1-12, Macherey-Nagel + CO, Düren, Nemčija.

 Tehtalna ladjica.

 Steklena žlička.

(36)

12

 Plastična kapalka.

 Urno steklo.

3.2 Kemikalije

Za eksperimente smo uporabili sledeče kemikalije:

 Barvilo Erioglaucine, C37H34N2O9S3Na2 (M = 792,86 g/mol), CAS: 3844-45-9, Sigma-Aldrich, Japonska.

 Barvilo Sunset Yellow, C16H10N2O7S2Na2 (M = 452,37 g/mol), CAS: 2783-94-0, Sigma-Aldrich, Japonska.

 Dinatrijev etilendiaminotetraacetat dihidrat, Kompleksal III, EDTA-Na2⸱2H2O, C10H14N2Na2O8⸱2H2O (M = 372,24 g/mol), številka CAS: 6381-92-6, Kemika, Hrvaška.

 Bakrov(II) sulfat pentahidrat, CuSO4⸱5H2O (M = 249,68 g/mol, w = 0,99), številka CAS: 7758-99-8, Gram-mol, Zagreb, Hrvaška.

 Brezvodni natrijev acetat, C2H3NaO2 (M = 82,03 g/mol), številka CAS: 127-09- 3, Gram-Mol, Zagreb, Hrvaška.

 Ocetna kislina, CH3COOH (M = 60,05 g/mol, w = 0,99, ρ = 1,05 g/mL), številka CAS: 64-19-7, Sigma-Aldrich, Češka.

3.3 Raztopine in reagenti

Za pripravo raztopin smo uporabili dvakrat deionizirano vodo, dodatno prečiščeno v sistemu Milli-Q (»Milli-Q water purification system«) in acetatni pufer.

Osnovna raztopina barvila Erioglaucine 0,0035 g/L

0,0035 g barvila Erioglaucine (slika 5) smo natehtali v tehtalno ladjico. Nato smo ga prenesli v 1000-mL volumetrično bučko, raztopili v prečiščeni vodi in razredčili do oznake volumna. Pripravljeno raztopino smo prelili v plastično posodo.

Osnovna raztopina barvila Sunset Yellow 0,0186 g/L

0,0186 g barvila Sunset Yellow (slika 5) smo natehtali v tehtalno ladjico. Nato smo ga prenesli v 1000-mL volumetrično bučko, raztopili v prečiščeni vodi in razredčili do oznake volumna. Pripravljeno raztopino smo prelili v plastično posodo.

(37)

13

Slika 5: Raztopini barvil Erioglaucine in Sunset Yellow, uporabljeni za preverjanje delovanja gradienta

Acetatni pufer 0,1 mol/L

5,7734 g natrijevega acetata smo natehtali na tehtalno ladjico. Nato smo ga prenesli v plastično posodo, dodali 704 mL prečiščene vode in dobro premešali. Potem smo dodali 1,7 mL koncentrirane ocetne kisline in 296 mL prečiščene vode. Vse skupaj smo dobro premešali. Z indikatorskim papirjem smo preverili, če je vrednost pH pufra 5.

Osnovna raztopina Cu(II) 0,1 mol/L

2,4970 g bakrovega(II) sulfata pentahidrata smo natehtali v tehtalno ladjico. Nato smo ga prenesli v 100-mL volumetrično bučko, raztopili v prečiščeni vodi in razredčili do oznake volumna ter dobro premešali.

Delovna raztopina Cu(II) ionov 0,01 mol/L za snemanje absorpcijskega spektra V Coulter counter vialo smo odpipetirali 5 mL acetatnega pufra, 4 mL prečiščene vode in 1 mL osnovne raztopine Cu(II) ter premešali.

Delovna raztopina Cu(II) ionov 0,01 mol/L za titracijo

V 50-mL volumetrično bučko smo odpipetirali 5 mL osnovne raztopine Cu(II) in razredčili s prečiščeno vodo do oznake volumna.

Osnovna raztopina kompleksanta (EDTA-Na2⸱2H2O) 0,1 mol/L

3,7244 g kompleksanta smo natehtali v tehtalno ladjico. Nato smo ga prenesli v 100-mL volumetrično bučko, raztopili v prečiščeni vodi in razredčili do oznake volumna ter dobro premešali.

(38)

14

Delovna raztopina kompleksanta (EDTA-Na2⸱2H2O) 0,01 mol/L za snemanje absorpcijskega spektra

V Coulter counter vialo smo odpipetirali 9 mL prečiščene vode in 1 mL osnovne raztopine kompleksanta ter premešali.

Delovna raztopina kompleksanta (EDTA-Na2⸱2H2O) 0,01 mol/L za titracijo

V 100-mL volumetrično bučko smo odpipetirali 10 mL osnovne raztopine kompleksanta, 20 mL acetatnega pufra in razredčili s prečiščeno vodo do oznake volumna.

Osnovna raztopina Cu(II) 0,05 mol/L

2,4991 g bakrovega(II) sulfata pentahidrata smo natehtali na tehtalno ladjico. Nato smo ga prenesli v 200-mL volumetrično bučko, raztopili v acetatnem pufru in razredčili do oznake volumna ter dobro premešali.

Delovne raztopine Cu(II) ionov za titracijo

Pripravili smo jih z redčenjem osnovne raztopine Cu(II) 0,05 mol/L z acetatnim pufrom (slika 6). Postopki priprave so navedeni v tabeli 1.

Tabela 1: Priprava delovnih raztopin Cu(II) ionov

c [mol/L] 0,02 0,01 0,0025 0,002

V (bučka) [mL] 20 100 100 100

V (Cu(II)) [mL] 8 20 5 4

Delovno raztopino Cu(II) 0,005 mol/L smo pripravili iz 0,01 mol/L Cu(II) v 20-mL volumetrični bučki tako, da smo odpipetirali 10 mL 0,01 mol/L raztopine in jo razredčili do oznake volumna z acetatnim pufrom.

Delovno raztopino Cu(II) 0,001 mol/L smo pripravili iz 0,002 mol/L Cu(II) v 20-mL volumetrični bučki tako, da smo odpipetirali 10 mL 0,002 mol/L raztopine in jo razredčili do oznake volumna z acetatnim pufrom.

(39)

15

Slika 6: Delovne raztopine Cu(II) ionov za pretočne titracije

Osnovna raztopina kompleksanta (EDTA-Na2⸱2H2O) 0,01 mol/L za titracijo

0,7444 g kompleksanta smo natehtali na tehtalno ladjico. Nato smo ga prenesli v 200-mL volumetrično bučko, ki smo jo napolnili do oznake z acetatnim pufrom, ter dobro premešali.

Delovna raztopina Cu(II) 0,01 mol/L za snemanje absorpcijskega spektra

0,0496 g bakrovega(II) sulfata pentahidrata smo natehtali na tehtalno ladjico. Nato smo ga prenesli v 20-mL volumetrično bučko, raztopili in razredčili s prečiščeno vodo do oznake volumna ter dobro premešali.

3.4 Postopki in programske nastavitve

3.4.1 Parametri in funkcije na črpalki Na posamezni črpalki smo določili parametre:

 notranji premer brizge, »Diameter«: 16 mm

 enota za pretok, »Units«: mL/min

 enota za volumen, »Units«: mL

(40)

16

Črpalke z nameščeno brizgo imajo vgrajene številne funkcije, ki opredeljujejo določeno operacijo, ki jo črpalka lahko izvede. Z uporabo teh funkcij lahko po fazah nastavimo poljuben program črpanja. Vsaka funkcija predstavlja eno fazo programa. Posledično lahko nastavimo program iz velikega števila faz. Črpalki, ki smo ju uporabili pri našem delu, sta bili omejeni s številom faz. Največje možno število faz v programu je bilo 41 [24]. V tabeli 2 so navedene funkcije, ki smo jih uporabili pri nastavitvi programov, in njihov pomen.

Tabela 2: Vgrajene funkcije črpalke in njihov pomen

Funkcija Pomen

PS:00 zaustavitev črpalke in čakanje na sprožilo za nadaljevanje programa

PS:10/PS:30/PS:60/PS:90 zaustavitev črpalke za 10/30/60/90 sekund OUt.0/OUt.1 sprožilo/ponastavitev sprožila

Et:03 čakanje na sprožilo in skok na fazo št. 3

rAtE konstanten pretok

InCr/dECr zvišanje/znižanje pretoka

LP:St začetek programske zanke

LP:09/LP:99 9/99 korakov v zanki

LInr linearna funkcija za doseganje linearnega profila pretoka

bEEP pisk črpalke

StOP konec programa – konec črpanja

3.4.2 Zajem mase s tehtnice v programu WinWedge

Meritve s tehtnice smo zajemali s pomočjo računalniškega programa WinWedge. V programu smo nastavili parametre v zavihku »Port Settings« (vrednosti parametrov so bile določene na podlagi navodil za uporabo tehtnice Mettler Toledo, model AB204):

 »Connector«: COM4

 »Baud Rate«: 19200

 »Parity«: None

 »Data Bits«: Eight

 »Stop Bits«: 1

 »Flow Control«: None

 »Input Buffer Size«: 32000

 »Output Buffer Size«: 512

(41)

17

Pomemben je tudi zavihek »Define«, kjer smo izbrali »Serial Output Strings« in tam določili časovni interval zajema posamezne meritve. V našem primeru je ta sprva znašal 1000 ms, nato smo ga povečali na 2000 ms in 4000 ms.

3.4.3 Zajem spektrov s spektrometra v programu Ocean View

Za zajem spektrov smo v programu Ocean View pred začetkom eksperimenta nastavili pogoje merjenja in parametre za shranjevanje.

Pogoji merjenja:

 »Integration Time«: 100 ms

 »Scans to Average«: 3

 »Boxcar width«: 3

 »Data Update Rate«: 0 ms Parametri za shranjevanje:

 »File Format«: Append Series (column data)

 »Save every scan«

 »Stop after this amount of time« (vnese se čas trajanja programa)

3.4.4 Sestava gradientnih programov na črpalkah in preverjanje profila pretoka Sprva smo na črpalkah nastavili ustrezna programa, ki sta predstavljena v tabelah 3 in 4.

Tabela 3: Sestavljena programa na črpalkah za preverjanje profila pretoka s potiskanjem vode. Program vsebuje zanko.

zaporedna št. faze

primarna črpalka sekundarna črpalka funkcija pretok

[mL/min]

volumen [mL]

funkcija pretok [mL/min]

1 PS:10 Et:03

2 OUt.0 PS:00

3 rAtE 1 1,1 PS:60

4 LP:St rAtE 0,1 0,1

5 dECr 0,1 0,1 LP:St

6 LP:09 InCr 0,1 0,1

7 PS:60 LP:09

8 OUt.1 rAtE 1 1

9 bEEP bEEP

10 StOP StOP

(42)

18

Značilnosti programa iz tabele 3:

 spreminjanje pretoka: od 0 mL/min do 1 mL/min in od 1 mL/min do 0 mL/min

 pričakovani celotni iztisnjeni volumen tekočine iz posamezne brizge: 2 mL

 korak spremembe pretoka: 0,1 mL/min (»InCr«/»dECr« = 0,1)

 posamezni odmerki volumna tekočine v zanki: 0,1 mL

 celotno trajanje programa: 5 min

 časovni interval zajema meritev s tehtnice: 1000 ms

Prvi dve fazi programa s pripadajočima funkcijama povzročita začetek delovanja črpalk tako, da ena črpalka sproži začetek delovanja druge. Primarno črpalko (»MASTER«) smo zagnali s pritiskom na gumb »Start«. Po desetih sekundah mirovanja je »MASTER«

sprožila odziv pri sekundarni črpalki (»SLAVE«), ki se je na ta način samodejno zagnala.

Tovrstno sinhronizacijo med črpalkama omogoča kabel CBL-DUAL-3, ki črpalki medsebojno povezuje.

Tabela 4: Sestavljena programa na črpalkah za preverjanje profila pretoka s potiskanjem vode. Program ne vsebuje zanke.

zaporedna

št. faze primarna črpalka sekundarna črpalka

1 PS:10 Et:03

2 OUt.0 PS:00

3 rAtE 0,5 0,55 PS:60

4 rAtE 0,45 0,495 rAtE 0,05 0,055

5 rAtE 0,4 0,44 rAtE 0,1 0,11

6 rAtE 0,35 0,385 rAtE 0,15 0,165

7 rAtE 0,3 0,33 rAtE 0,2 0,22

8 rAtE 0,25 0,275 rAtE 0,25 0,275

9 rAtE 0,2 0,22 rAtE 0,3 0,33

10 rAtE 0,15 0,165 rAtE 0,35 0,385

11 rAtE 0,1 0,11 rAtE 0,4 0,44

12 rAtE 0,05 0,055 rAtE 0,45 0,495

13 PS:60 rAtE 0,5 0,55

14 OUt.1 bEEP

15 bEEP StOP

16 StOP

(43)

19

Značilnosti programa iz tabele 4:

 spreminjanje pretoka: od 0 mL/min do 0,5 mL/min in od 0,5 mL/min do 0 mL/min pričakovani celotni iztisnjeni volumen tekočine iz posamezne brizge: 3,025 mL

 korak spremembe pretoka: 0,05 mL/min

 korak spremembe volumna: 0,055 mL

 čas trajanja posamezne faze pretoka (»rAtE«): 66 s

 celotno trajanje programa: 12 min

 časovni interval zajema meritev s tehtnice: 2000 ms

V drugem primeru (tabela 4) smo nastavili program, ki ni vseboval funkcije »LP«

(»loop«). To pomeni, da v program ni bila vključena zanka. Namesto zanke smo morali pri nastavljanju programa ustrezno spreminjati vrednosti pretoka in volumna, da smo ohranili enak časovni interval pri vseh fazah. Posledično je program trajal dlje časa in je vseboval bistveno več faz, kot v prvem primeru (tabela 3).

Sliki 7 in 8 predstavljata uporabljen sistem za preverjanje profila pretoka.

Slika 7: Shema pretočnega sistema za preverjanje profila pretoka s potiskanjem vode

(44)

20

Slika 8: Pretočni sistem za preverjanje profila pretoka s potiskanjem vode

Sistem je sestavljen iz dveh črpalk z nameščenima brizgama. Vsaka izmed brizg je povezana s cevko, ki vodi do T-kosa. V T-kosu se tekočina iz obeh brizg združi in potuje naprej po cevki do zbiralne čaše. Ta je nameščena znotraj tehtnice.

Tehtnica je povezana s prenosnim računalnikom preko USB pretvornika. Na eno izmed pozicij pretvornika je priklopljena tehtnica, na drugo prenosni računalnik.

10-mL plastični brizgi smo napolnili z vodo. Sprva smo zgolj na eno brizgo namestili cevko, povezano s T-kosom. Cevko smo ročno napolnili z vodo, da smo se znebili zračnih mehurčkov. Po tem smo brizgo pritrdili na črpalko. Enak postopek je sledil za drugo brizgo, ki smo jo namestili na drugo črpalko.

Ko so bile vse cevke napolnjene z vodo, smo zagnali črpalki. Glede na nastavljen program na črpalkah smo imeli na voljo deset sekund pred dejanskim začetkom potiskanja tekočine. V tem času smo zagnali še program WinWedge za zajemanje meritev s tehtnice (programske nastavitve so navedene pri točki 3.4.2). Z zajemom smo pričeli takrat, ko so črpalke začele potiskati tekočino.

(45)

21

3.4.5 Preverjanje delovanja gradienta z mešanjem dveh barvil

Za preverjanje delovanja gradienta smo sestavili sistem, ki je prikazan na sliki 9.

Slika 9: Shema pretočnega sistema za preverjanje delovanja gradienta z mešanjem dveh barvil

Sistem na sliki 9 je nadgradnja sistema s slike 7. Prav tako je sestavljen iz dveh črpalk z nameščeno eno brizgo. Vsaka izmed brizg je povezana s cevko, ki vodi do T-kosa. V T- kosu se barvili iz obeh brizg združita in potujeta naprej po cevki skozi pretočno celico do zbiralne čaše.

Na pretočno celico sta preko optičnih vlaken priključena spektrometer in atenuator, s katerim uravnavamo intenziteto svetlobe. Z optičnimi vlakni sta prav tako povezana svetlobni izvor in atenuator.

Del tega sistema je tudi prenosni računalnik. Razlika glede na prvi sistem (slika 7) je ta, da je nanj neposredno priključen spektrometer. Povezava s tehtnico je identična, preko USB pretvornika.

Slika 10 prikazuje sistem, kjer je vidna tudi povezava s prenosnim računalnikom (skrajno levo).

(46)

22

Slika 10: Pretočni sistem za preverjanje delovanja gradienta z mešanjem dveh barvil

Nato smo na obeh črpalkah nastavili programa (tabeli 5 in 6). Tabela 5 prikazuje program za ustvarjanje linearnega gradienta, tabela 6 program za eksponentni gradient.

(47)

23

Tabela 5: Sestavljena programa na črpalkah za preverjanje gradienta z mešanjem dveh barvil. Pretok se s časom spreminja linearno s korakom 0,05 mL/min.

[mL/min]

1 PS:10 Et:03

2 OUt.0 PS:00

3 rAtE 1 1,5 PS:90

4 rAtE 0,95 0,475 rAtE 0,05 0,025

5 rAtE 0,9 0,45 rAtE 0,1 0,05

6 rAtE 0,85 0,425 rAtE 0,15 0,075

7 rAtE 0,8 0,4 rAtE 0,2 0,1

8 rAtE 0,75 0,375 rAtE 0,25 0,125

9 rAtE 0,7 0,35 rAtE 0,3 0,15

10 rAtE 0,65 0,325 rAtE 0,35 0,175

11 rAtE 0,6 0,3 rAtE 0,4 0,2

12 rAtE 0,55 0,275 rAtE 0,45 0,225

13 rAtE 0,5 0,25 rAtE 0,5 0,25

14 rAtE 0,45 0,225 rAtE 0,55 0,275

15 rAtE 0,4 0,2 rAtE 0,6 0,3

16 rAtE 0,35 0,175 rAtE 0,65 0,325

17 rAtE 0,3 0,15 rAtE 0,7 0,35

18 rAtE 0,25 0,125 rAtE 0,75 0,375

19 rAtE 0,2 0,1 rAtE 0,8 0,4

20 rAtE 0,15 0,075 rAtE 0,85 0,425

21 rAtE 0,1 0,05 rAtE 0,9 0,45

22 rAtE 0,05 0,025 rAtE 0,95 0,475

23 PS:90 rAtE 1 1,5

24 OUt.1 bEEP

25 bEEP StOP

26 StOP

Značilnosti programa iz tabele 5 - linearni gradient:

 pričakovani celotni iztisnjeni volumen tekočine iz posamezne brizge: 6,25 mL

 korak spremembe pretoka: 0,05 mL/min

 korak spremembe volumna: 0,025 mL (izjema pri »MASTER« - iz faze 3 v fazo 4 in pri »SLAVE« - iz faze 22 v fazo 23: 1,025 mL – zaradi časovne uskladitve)

 čas trajanja posamezne faze pretoka (»rAtE«): 30 s (izjema na začetku in koncu – 90 s)

 celotno trajanje programa: 12,5 min

(48)

24

Tabela 6: Sestavljena programa na črpalkah za preverjanje gradienta z mešanjem dveh barvil. Pretok se s časom spreminja eksponentno s korakom 0,01 mL/min.

[mL/min]

1 PS:10 Et:03

2 OUt.0 PS:00

3 rAtE 1 1,01 PS:60

4 LP:St rAtE 0,01 0,01

5 dECr 0,01 0,01 LP:St

6 LP:99 InCr 0,01 0,01

7 PS:60 LP:99

8 OUt.1 rAtE 1 1

9 bEEP bEEP

10 StOP StOP

Značilnosti programa iz tabele 6 - eksponentni gradient:

 pričakovani celotni iztisnjeni volumen tekočine iz posamezne brizge: 2 mL

 korak spremembe pretoka: 0,01 mL/min (»InCr«/»dECr« = 0,01)

 posamezni odmerki volumna tekočine v zanki: 0,01 mL

 celotno trajanje programa: 7 min 15 s

Ko smo nastavili program, smo 10-mL plastični brizgi napolnili z vodo. Sprva smo zgolj na eno brizgo namestili cevko, ki je povezana s T-kosom. Cevko smo ročno napolnili z vodo, da smo se znebili morebitnih mehurčkov. Po tem smo brizgo pritrdili na črpalko.

Enak postopek je sledil za drugo brizgo, ki smo jo namestili na drugo črpalko. S tem smo dosegli, da je bil sistem napolnjen z vodo, ki je služila za snemanje referenčnega spektra pri odprtem atenuatorju, in ozadja pri zaprtem atenuatorju. Oba smo posneli na način, da smo tekočino ročno potiskali.

Nato smo zamenjali brizgi. Na primarno črpalko smo namestili brizgo, napolnjeno z barvilom Sunset Yellow, na sekundarno pa brizgo z barvilom Erioglaucine. Pred pričetkom zajemanja spektrov in mase smo skozi sistem ročno potiskali barvilo Erioglaucine in s tem izpolnili linijo do T-kosa. Po tem smo ročno potiskali še drugo barvilo, da so bile cevke napolnjene vse do zbiralne čaše, zagnali črpalki in hkrati začeli z zajemanjem spektrov in mase (programske nastavitve za zajem meritev s tehtnice in spektrov so navedene v točkah 3.4.2 in 3.4.3). Na koncu smo vse cevke ročno sprali z dvema plastičnima brizgama, napolnjenima z vodo.

(49)

25

3.4.6 Pretočne titracije

Snemanje absorpcijskih spektrov reaktanta Cu(II) in produkta Cu(II)-EDTA Sprva smo na črpalkah nastavili kratka programa za snemanje absorpcijskega spektra reaktanta Cu(II) in produkta Cu(II)-EDTA, ki sta prikazana v tabeli 7.

Tabela 7: Sestavljena programa na črpalkah za snemanje absorpcijskega spektra reaktanta Cu(II) in produkta Cu(II)-EDTA

[mL/min] volumen

[mL] funkcija pretok

[mL/min] volumen [mL]

1 PS:10 Et:03

2 OUt.0 PS:00

3 rAtE 1 2 rAtE 1 2

4 StOP StOP

Nato smo 10-mL plastično brizgo napolnili z raztopino slepega vzorca, pripravljeno iz vode in acetatnega pufra v volumskem razmerju 1:1, ter posneli referenčni spekter in ozadje, tako da smo raztopino slepega vzorca ročno potiskali proti detektorju. Potem smo na primarno črpalko namestili brizgo, napolnjeno z reaktantom Cu(II) 0,01 mol/L, na sekundarno pa brizgo s titrirnim sredstvom, raztopino dinatrijeve soli EDTA 0,01 mol/L.

S sočasnim potiskanjem obeh raztopin pri pretoku 1 mL/min smo posneli absorpcijski spekter kompleksa Cu(II)-EDTA. Podobno smo posneli spekter reaktanta Cu(II) 0,01 mol/L, le da smo imeli na sekundarni črpalki brizgo, napolnjeno z raztopino slepega vzorca.

Z indikatorskim papirjem smo preverili pH začetne raztopine reaktanta Cu(II) in nastalega kompleksa Cu(II)-EDTA. pH vrednost je znašala v obeh primerih 5, kar pomeni, da je acetatni pufer dobro služil svojemu namenu.

(50)

26

Titracija z gradientnim programom a) Eksponentni gradient

Titracijo smo izvedli v sistemu s slike 9 in z uporabo identičnih programov, ki sta v tabeli 6. Med drugo in tretjo fazo smo vrinili tri nove faze (faze 3, 4 in 5), ki so prikazane v tabeli 8. Te so nam omogočile, da smo pred dejansko izvedbo titracije avtomatizirano posneli spekter raztopine slepega vzorca in ozadje.

Tabela 8: Dodatne faze programa za snemanje spektra raztopine slepega vzorca in ozadja

zaporedna

št. faze primarna črpalka – raztopina

dinatrijeve soli EDTA sekundarna črpalka – Cu(II) funkcija pretok

[mL/min] volumen

[mL] funkcija pretok

[mL/min] volumen [mL]

3 PS:30 rAtE 1 0,5

4 rAtE 1 1,5 PS:90

5 bEEP bEEP

Na primarno črpalko smo pritrdili 10-mL plastično brizgo s titrirnim sredstvom, raztopino dinatrijeve soli EDTA 0,01 mol/L, na sekundarno pa brizgo, napolnjeno z reaktantom Cu(II) (0,001; 0,002; 0,0025; 0,005; 0,01; 0,02; 0,05 mol/L).

Najprej se je 30 s avtomatizirano potiskal reaktant Cu(II), nato 90 s titrirno sredstvo. Tako smo posneli referenčni spekter raztopine slepega vzorca, ki je bila titrirno sredstvo, in ozadje.

Ko sta črpalki zapiskali (funkcija »bEEP«), smo začeli z zajemanjem spektrov (točka 3.4.3). Prvih 60 s se je pri konstantnem pretoku potiskalo zgolj titrirno sredstvo, nato se je začelo potiskanje reaktanta Cu(II) s postopnim naraščanjem pretoka, hkrati pa je začel upadati pretok za potiskanje titrirnega sredstva. Zadnjih 60 s se je potiskal le Cu(II) pri konstantnem pretoku. Na koncu smo sistem dobro sprali s potiskanjem vode.

b) Linearni gradient

Titracijo smo izvedli v sistemu s slike 9, razlika je bila le ta, da smo imeli med T-kosom in pretočno celico še navito cevko z dolžino 30 cm. Tako smo podaljšali reakcijsko pot.

Tabela 9 prikazuje nastavitve programa. S posodobitvijo programske opreme črpalk smo pridobili linearno funkcijo (»LInr«). Za ustvarjanje linearnega gradienta smo v program dodali dve fazi z linearno funkcijo. Pri prvi smo nastavili začetni pretok, pri drugi končni pretok. Za obe smo nastavili še čas trajanja faze [25, 26]. Prednost uporabe funkcije

»LInr« je zmanjšanje števila faz v programu.

(51)

27

Sam postopek snemanja raztopine slepega vzorca, ki je bila titrirno sredstvo, in ozadja ter vrstni red potiskanja reaktantov je bil enak kot pri eksponentnem gradientu, le da se je tu pretok povečeval/zmanjševal linearno.

Tabela 9: Nastavljena programa na črpalkah za titracijo z gradientnim programom. Pretok se s časom spreminja linearno.

zaporedna

št. faze primarna črpalka – raztopina dinatrijeve

soli EDTA sekundarna črpalka – Cu(II)

funkcija pretok

[mL/min] volumen [mL] čas

[min] funkcija pretok

[mL/min] volumen [mL] čas

[min]

1 PS:10 Et:03

2 OUt.0 PS:00

3 PS:30 rAtE 1 0,5

4 rAtE 1 1,5 PS:90

5 bEEP bEEP

6 rAtE 1 1 PS:60

7 LInr 1 3 LInr 0 3

8 LInr 0 0 LInr 1 0

9 PS:60 rAtE 1 1

10 OUt.1 bEEP

11 bEEP StOP

12 StOP

Značilnosti programa iz tabele 9 - linearni gradient:

 pričakovani celotni iztisnjeni volumen tekočine iz posamezne brizge: 1,5 mL

 celotno trajanje programa: 5 min, brez snemanja spektra slepe in ozadja

Gradientna titracija

a) Prekinjen tok titrirnega sredstva

V sistemu s slike 9 z vključeno navito cevko smo sprva potiskali titrirno sredstvo, raztopino dinatrijeve soli EDTA 0,01 mol/L, nato reaktant Cu(II) 0,01 mol/L in na koncu zopet titrirno sredstvo, kot je prikazano na sliki 11.

(52)

28

Slika 11: Shema potiskanja reaktanta in titrirnega sredstva pri gradientni titraciji s prekinjenim tokom titrirnega sredstva

Potiskali smo različne volumske pakete Cu(II), kar je navedeno v tabeli 10 pri fazi 7. Fazi 3 in 4 sta namenjeni snemanju spektra raztopine slepega vzorca, ki je bila titrirno sredstvo, in ozadja.

Tabela 10: Nastavljena programa na črpalkah za izmenično potiskanje titrirnega sredstva, raztopine dinatrijeve soli EDTA, in različnih volumskih paketov reaktanta Cu(II)

primarna črpalka – raztopina dinatrijeve soli EDTA

sekundarna črpalka – Cu(II) funkcija pretok

[mL/min]

1 PS:10 Et:03

2 OUt.0 PS:00

3 PS:30 rAtE 0,5 0,25

4 rAtE 0,5 0,75 PS:90

5 bEEP bEEP

6 rAtE 0,5 0,25 PS:30

7 PS:06/09/12/

18/24/30

rAtE 0,5 0,05/0,075/

0,1/0,15/

0,2/0,25

8 rAtE 0,5 0,75 PS:90

9 OUt.1 StOP

10 StOP

(53)

29

b) Neprekinjen tok titrirnega sredstva

V sistemu s slike 9 z vključeno navito cevko dolžine 30 cm smo v tok titrirnega sredstva, raztopine dinatrijeve soli EDTA 0,01 mol/L, potiskali različne volumske pakete reaktanta Cu(II) 0,01 mol/L, ki so navedeni v programu pri fazi 6 (tabela 11). Fazi 3 in 4 sta namenjeni snemanju spektra raztopine slepega vzorca, ki je bila titrirno sredstvo, in ozadja.

Tabela 11: Nastavljena programa na črpalkah za potiskanje volumskih paketov reaktanta Cu(II) v neprekinjen tok titrirnega sredstva, raztopine dinatrijeve soli EDTA

primarna črpalka – raztopina dinatrijeve soli EDTA

sekundarna črpalka – Cu(II) funkcija pretok

[mL/min]

volumen [mL]

1 PS:10 Et:03

2 OUt.0 PS:00

3 PS:30 rAtE 0,5 0,25

4 rAtE 0,5 0,75 PS:90

5 bEEP bEEP

6 rAtE 0,5 1 rAtE 0,5 0,1/0,15/0,2/0,25

7 OUt.1 StOP

8 StOP

(54)

30