MAGISTRSKA NALOGA ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

JERNEJA POGAČNIK

MAGISTRSKA NALOGA

ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA

Ljubljana, 2021

(2)

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

JERNEJA POGAČNIK

SINTEZA IN VREDNOTENJE TIAZOLNIH ZAVIRALCEV ENCIMA MURA

SYNTHESIS AND EVALUATION OF THIAZOLE- BASED MURA INHIBITORS

Ljubljana, 2021

(3)

i

Magistrsko nalogo sem opravljala na Katedri za farmacevtsko kemijo Fakultete za farmacijo, pod mentorstvom doc. dr. Staneta Pajka, mag. farm. in so mentorstvom doc. dr. Martine Hrast, mag. farm.

ZAHVALA

Iskreno se zahvaljujem mentorici doc. dr. Martini Hrast, mag. farm za potrpežljivo vodenje in usmerjanje med nastajanjem magistrske naloge. Hvala za vse prijazne nasvete, hitro odzivnost in ustvarjeno prijetno vzdušje.

Zahvalila bi se rada tudi so mentorju asist. dr. Damijanu Knezu, mag. farm. za vso pomoč, potrpežljivost in dobro voljo v laboratoriju.

Ob zaključku študija bi se rada zahvalila svoji družini, ki mi je omogočila študij, vsem prijateljem in možu Petru, da ste me vztrajno bodrili, spodbujali in mi stali ob strani na moji študijski poti.

IZJAVA

Izjavljam, da sem magistrsko nalogo izdelala samostojno pod mentorstvom doc. dr. Staneta Pajka, mag.

farm., so mentorstvom doc. dr. Martine Hrast, mag. farm., ter asist. dr. Damijanom Knezom, mag. farm.

Jerneja Pogačnik

Ljubljana, 2021

Predsednica komisije: prof. dr. Mirjana Gašperlin, mag. farm.

Član komisije: asist. dr. Matjaž Ravnikar, mag. farm.

(4)

ii

VSEBINA

1 UVOD ... 1

1.1 PROTIBAKTERIJSKE ZDRAVILNE UČINKOVINE ... 1

1.1.1 Delovanje protibakterijskih učinkovin ... 1

1.1.1.1 Zaviralci sinteze celične stene ... 3

1.2 BAKTERIJE ... 4

1.2.1 Celična stena ... 5

1.2.2 Peptidoglikan ... 5

1.2.3 Biosinteza peptidoglikana ... 6

1.3 ENCIMI ... 8

1.3.1 MurA ... 8

1.3.2 Zaviralci MurA ... 9

1.3.3 Fosfomicin ... 13

1.3.3.1 Razvoj odpornosti bakterij na fosfomicin ... 13

2 NAMEN IN NAČRT DELA ... 15

3 MATERIALI IN METODE ... 16

3.1 MATERIALI IN METODE ZA KEMIJSKE SINTEZE ... 16

3.1.1 Kromatografija ... 16

3.1.1.1 Tankoplastna kromatografija (TLC) ... 16

3.1.1.2 Kolonska kromatografija ... 16

3.1.1.3 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti ... 16

3.1.2 Spektroskopija ... 16

3.1.2.1 Jedrska magnetna resonanca (NMR) ... 16

3.1.2.2 Masna spektroskopija visoke ločljivosti (ESI-HRMS) ... 16

3.1.3 Določanje temperature tališča ... 17

3.1.4 Risanje in poimenovanje spojin ... 17

3.2 MATERIALI IN METODE BIOKEMIJSKIH TESTOV ... 17

3.2.1 Laboratorijska oprema ... 17

3.2.2 Reagenti ... 17

3.2.3 Postopek ... 17

3.2.4 Rezidualna aktivnost encima ... 18

3.2.5 Vrednost IC50 ... 18

4 EKSPERIMENTALNO DELO ... 20

(5)

iii

4.1 Poskus sinteze 2-bromotiazola – postopek A ... 20

4.2 Poskus sinteze 2-bromotiazola – postopek B ... 20

4.3 Sinteza derivatov 2-bromotiazola ... 21

4.3.1 Splošni postopek bromiranja - sinteza spojin 2–7 ... 21

4.3.1.1 Sinteza 2-bromo-4-(terc-butil)tiazola 2 ... 22

4.3.1.2 Sinteza 2-bromo-4-(3,4-difluorofenil)tiazola 3 ... 22

4.3.1.3 Sinteza etil-2-bromotiazol-4-karboksilata 4 ... 23

4.3.1.4 Sinteza etil 2-(2-bromotiazol-4-il)acetata 5 ... 23

4.3.1.5 Sinteza etil 2-bromotiazol-5-karboksilata 6 ... 23

4.3.1.6 Sinteza metil 2-(2-bromotiazol-4-il)acetata 7 ... 24

4.4 Sinteza estrov ... 25

4.4.1 Splošni postopek sinteze spojin 8–13 ... 25

4.4.1.1 Sinteza metil 2-bromotiazol-4-karboksilata 8 ... 25

4.4.1.2 Poskus sinteze metil 2-bromotiazol-5-karboksilata 9 ... 26

4.4.1.3 Sinteza metil 2-(2-aminotiazol-4-il)acetata 10 ... 26

4.4.1.4 Poskus sinteze metil 2-bromo-4-metiltiazol-5-karboksilata 11 ... 26

4.4.1.5 Poskus sinteze metil 2-bromotiazol-5-karboksilata 12 ... 26

4.4.1.6 Sinteza metil 2-bromotiazol-5-karboksilata 13 ... 27

4.5 Sinteza 2-viniltiazolov ... 27

4.5.1 Splošni postopek sinteze 2-viniltiazolov 14–21 ... 28

4.5.1.1 Poskus sinteze 4-(terc-butil)-2-viniltiazola 14 ... 28

4.5.1.2 Sinteza metil 2-(2-viniltiazol-4-il) acetata 15 ... 29

4.5.1.3 Sinteza etil 2-viniltiazol-4-karboksilata 16... 29

4.5.1.4 Sinteza metil 2-viniltiazol-4-karboksilata 17 ... 30

4.5.1.5 Sinteza etil 2-(2-viniltiazol-4-il) acetata 18 ... 30

4.5.1.6 Sinteza metil 2-viniltiazol-5-karboksilata 19 ... 31

4.5.1.7 Poskus sinteze 5-metil-2-viniltiazola 20... 31

4.5.1.8 Sinteza etil 4-metil-2-viniltiazol-5-karboksilata 21 ... 31

4.6 Sinteza karboksilatov – odščita estra ... 32

4.6.1 Splošni postopek sinteze spojin 22–25 ... 32

4.6.1.1 Sinteza 2-(2-bromotiazol-4-il)ocetne kisline 22 ... 32

4.6.1.2 Sinteza 2-viniltiazol-4-karboksilne kisline 23 ... 33

4.6.1.3 Poskus sinteze 2-viniltiazol-5-karboksilne kisline 24 ... 33

(6)

iv

4.6.1.4 Sinteza 4-metil-2-viniltiazol-5-karboksilne kisline 25 ... 33

4.7 Poskus sinteze 2-jodotiazola... 34

5 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 35

5.1 KOMENTAR SINTEZNIH POSTOPKOV ... 35

5.1.1 Komentar sinteze bromotiazolov (spojine 1-7) ... 35

5.1.2 Komentar sinteze estrov (spojine 8-13) ... 37

5.1.3 Komentar sinteze viniltiazolov (spojine 14-21) ... 37

5.1.4 Komentar hidrolize estrov (spojine 22-25) ... 39

5.1.5 Komentar poskusa sinteze jodotiazolov (spojina 26) ... 40

5.2 REZULTATI BIOKEMIJSKEGA TESTIRANJA ... 41

6 SKLEP ... 45

7 LITERATURA ... 46

(7)

v

KAZALO SLIK

Slika 1: Tarče delovanja različnih antibiotikov; prirejeno po (3). ... 2

Slika 2: Struktura peptidoglikana pri Gram-pozitivnih in Gram-negativnih bakterijah; prirejeno po (9). ... 6

Slika 3: Shematska predstavitev biosinteze peptidoglikana; prirejeno po (11). ... 7

Slika 4: Tridimenzionalna struktura MurA v odprti domeni (a) in zaprti domeni (b); prirejeno po (11). ... 9

Slika 5: Reakcijski mehanizem MurA encima; prirejeno po (17). ... 9

Slika 6: Shematski prikaz delovanja dveh različnih zaviralcev (A) fosfomicina in (B) tereične kisline; prirejeno po (16). ... 11

Slika 7: Strukturni prikaz znanih zaviralcev encima MurA; prirejeno po (13, 16). ... 12

Slika 8: Strukturni prikaz vezave fosfomicina na encim MurA; prirejeno po (12). ... 13

Slika 9: Sintezni načrt. ... 15

Slika 10: Reakcijska shema sinteze spojine 1a. ... 20

Slika 11: Reakcijska shema sinteze spojine 1b. ... 20

Slika 12: Shema sinteze spojin 2–7 (substituenti R1 in R2 so prikazani v Tabeli 1). ... 21

Slika 13: Shema sinteze estrov 8–13 (substituenti X, R1, R2, R3 in R4 so prikazani v Tabeli 2). ... 25

Slika 14: Shema sinteze 2-viniltiazolov 14–21 (substituenti R1 in R2 so prikazani v Tabeli 3). ... 27

Slika 15: Shema priprave karboksilnih kislin 22–26 (substituenti X, R1, R2, R3 in R4 so prikazani v Tabeli 4). ... 32

Slika 16: Reakcijska shema sinteze spojine 26. ... 34

Slika 17: Mehanizem Sandmeyerjeve reakcije; prirejeno po (20). ... 36

Slika 18: Stillejeva reakcija, prirejeno po (27). ... 37

Slika 19: Poenostavljen katalitski cikel Stillejeve reakcije; prirejeno po (27). ... 38

(8)

vi

KAZALO TABEL

Tabela 1: Substituenti derivatov 2-bromotiazola sintetiziranih po postopku prikazanem na Sliki 12. 21 Tabela 2: Substituenti estrov tiazola sintetiziranih po postopku prikazanem na Sliki 13. ... 25 Tabela 3: Substituenti 2-viniltiazolov sintetiziranih po postopku prikazanem na Sliki 14. ... 28 Tabela 4: Substituenti pri sintezi karboksilnih kislin po postopku prikazanem na Sliki 15. ... 32 Tabela 5: Rezultati biokemijskega testiranja sinteznih spojin: zeleno obarvane so izkazale najmočnejše zaviralno delovanje (RA < 50 %), z belo pa so obarvane spojine s slabšim zaviralnim delovanjem (RA

> 50 %). ... 42

(9)

vii

POVZETEK

Kljub odkritju in uspešnemu razvoju protibakterijskih učinkovin, učinkovitost zdravljenja bakterijskih okužb vztrajno pada. Glavni razlog pripisujemo razvoju odpornosti bakterijskih sevov na posamezne protibakterijske učinkovine. V klinični uporabi je širok nabor protibakterijskih zdravilnih učinkovin, a je potreba po razvoju antibiotikov z novim mehanizmom delovanja zelo velika. Zanimivo in obetavno področje razvoja predstavljajo bakterijski encimi, ki sodelujejo pri sintezi glavnega gradnika celične stene, to je peptidoglikana. Z zaviranjem sinteze peptidoglikana tako sprožimo celično smrt. Prednost tega mehanizma delovanja je selektivna toksičnost, zaviramo zgolj rast bakterijske celice, saj peptidoglikan v človeški celici ni prisoten. MurA (UDP-N-acetilglukozamin enolpiruvil transferaza) je encim, ki sodeluje v prvi stopnji sinteze peptidoglikana, v klinični uporabi pa je zdravilna učinkovina fosfomicin, ki ga uspešno zavira.

V sklopu magistrske naloge smo sintetizirali nove potencialne zaviralce MurA encima. Izhajali smo iz šestih derivatov 2-aminotiazola, iz katerih smo pripravili 2-bromotiazolne derivate. Nato smo iz različnih bromotiazolov sintetizirali osem derivatov 2-viniltiazolov in poskusili s sintezo 2-jodotiazola.

Pridobljenim spojinam smo z biokemijskim testiranjem določili zaviralno delovanje na MurA iz Escherichia coli.

Najmočnejše zaviralno delovanje je izkazalo šest sintetiziranih spojin (2, 5, 7, 11, 16 in 23). Te so zavirale encim v nizkem mikromolarnem območju, rezidualna aktivnost spojin je bila nižja od 50 % pri koncentraciji 500 µM. Najmočneje je delovala spojina 23 (IC50 = 70 µM), z vinilno skupino na mestu 2 in karboksilno skupino na mestu 4. Sledijo ji bromidni derivati, najbolje je delovala spojina 2 (IC50 = 85 µM) s terc-butilno skupino in spojina 11 (IC50 = 141 µM) z metilno skupino na mestu 4 in karboksilno skupino na mestu 5. Dobro zaviralno delovanje je izkazala še spojina 16 (IC50 = 471 µM) z vinilno skupino na mestu 2 in karboksilatom na mestu 4.

Ugotovili smo, da sta tako vinilna kot bromidna skupina ključni za zaviralno delovanje spojine, najmočnejši zaviralec pa je bil derivat 2-viniltiazolna (spojina 23). Velik vpliv na delovanje so imele na tiazolni obroč vezane stranske funkcionalne skupine, zaradi katerih so se bromotiazoli (2, 5, 7, 11) izkazali kot dobri encimski zaviralci.

Spojini 23 in 2 predstavljata potencialno dobro izhodišče za razvoj močnejših in selektivnejših zaviralcev encima MurA.

Ključne besede: MurA encim, bromotiazoli, vinitiazoli, peptidoglikan, protibakterijske učinkovine.

(10)

viii

ABSTRACT

Successful development of antibacterial agents and the effectiveness of treatment of bacterial infections is steadily declining. The main reason is development of bacterial resistance to individual antibacterial agents. There is a wide range of antibacterial drugs in clinical use, nevertheless new drugs with novel mechanisms of action are required. Interesting and promising field for development of new antibacterial are bacterial enzymes involved in the synthesis of the main building block of the cell wall, peptidoglycan. By inhibiting peptidoglycan synthesis, cell death is thus triggered. The main advantage of this mechanism of action is selective toxicity, which means that inhibition occurs only in bacterial cells, as peptidoglycan is not present in the human cell. MurA (UDP-N-acetylglucosamine enolpiruvyl transferase) is an enzyme involved in the first stage of peptidoglycan synthesis. The therapeutically effective drug in clinical use is phosphomycin.

In this master's thesis we synthesized new potential inhibitors of the MurA enzyme. The starting points were 2-aminothiazole derivatives from which we synthesized 2-bromothiazoles. Then we exchanged the bromide atom with the vinyl group and one with an iodine atom. The inhibitory activity of the obtained compounds was determined by using biochemical assays on MurA from Escherichia coli.

Six compounds (2, 5, 7, 11, 16 in 23) showed the most potent inhibitory effect. They inhibited the enzyme in the low micromolar range and the residual activities of the compounds were lower than 50%

at a concentration of 500 µM. Compound 23 (IC50 = 70 µM) had the strongest effect, with a vinyl group at position 2 and a carboxyl group at position 4. Compounds 2 (IC50 = 85 µM) and 11 ( IC50 = 141 µM) both with the bromide atom in the position 2 on the thiazole ring were identified as potent inhibitors.

Compound 16 (IC50 = 471 µM) with a vinyl group at position 2 also showed promising inhibitory activity.

In conclusion, both the vinyl group and bromide atom were crucial for the inhibitory action of the compound, nevertheless the 2-vinylthiazole derivative (compound 23) proved to be the most potent inhibiotr of MurA. Side groups attached on thiazole showed a large impact on inhibition, which proved that bromothiazoles (2, 5, 7, 11) are good enzyme inhibitors.

Compounds 23 and 2 represent a good starting point for the development of stronger and more selective MurA enzyme inhibitors.

Key words: MurA enzyme, bromothiazoles, vinylthiazoles, peptidoglycan, antibacterial agents.

(11)

ix

SEZNAM OKRAJŠAV

aceyl-CoA acetil koencim A

Asp asparagin

A. terreus Aspergillus terreus

C55-P dekaprenil fosfat

CDCl3 devteriran kloroform

CH3CN acetonitril

CuBr2 bakrov (II) bromid

CuSO4 bakrov (II) sulfat

Cys cistein

d dublet

dd dvojni dublet

ddd dublet dvojnega dubleta

DKM diklorometan

DMSO dimetilsulfoksid

DNK deoksiribonukleinska kislina

E. coli Escherichia coli

EDTA etildiamintetraocetna kislina

ekv molarni ekvivalent

EtOAc etil acetat

GlcNAc N-acetilglukozamin

GlcN-1-P glukozamin-1-fosfat

GlcN-6-P glukozamin-6-fosfat

GlmM fosfoglukozamin mutaza

GlmS glukozamin-6-fosfat sintaza

GlmU N-acetilglukozamin-1-fosfat uridiltransferaza

GlpT glicerol-3-fosfatni prenašalec

H Hillov koeficient

H. influenzae Haemophillus influenzae

HCl klorovodikova kislina

HNO3 dušikova kislina

HPLC tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

(12)

x

H3PO4 fosforjeva kislina

HRMS masna spektrometrija visoke ločljivosti

Hz Hertz

IC50 koncentracija zaviralca, kjer je zavrte 50 % aktivnosti encima

J sklopitvena konstanta

KF kalijev fluorid

K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae

K2CO3 kalijev karbonat

Lys lizin

M molska masa

MeOH metanol

MF mobilna faza

MIK minimalna inhibitorna koncentracija

MurA UDP-N-acetilglukozamin enolpiruvil transferaza

MurB UDP-N-acetilglukozamin enolpiruvil reduktaza

MurJ lipid II flipaza

MraY UDP-N-acetilmuramil-pentapeptid fosfotransferaza

MurNAc N-acetilmuraminska kislina

NaBr natrijev bromid

NaCl natrijev klorid

NADPH nikotinamid adenin dinukleotid fosfat

NAG N-acetilglukozamin

NaOH natrijev hidroksid

NaNO3 natrijev nitrat

Na2SO4 natrijev sulfat

NMR jedrska magnetna resonanca

PBP penicilin vezoč protein

PEP fosfoenolpiruvat

P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

ppm p

Pro prolin

q kvartet

(13)

xi

RA rezidualna aktivnost

Rf retencijski faktor

RNK ribonukleinska kislina

s singlet

S. aureus Staphylococcus aureus

SOCl2 tionil klorid

THF tetrahidrofuran

TLC tankoplastna kromatografija

t tercet

tR retencijski čas

Ttal temperatura tališča

UDP uridin difosfat

UDP-GlcNAc uridildifosfat-N-acetilglukozamin

UDP-GlcNAc-EP uridildifosfat-N-acetilglukozamin enolpiruvat UDP-MurNAc uridildifosfat-N-acetilmuraminska kislina

UhpT heksoza-6-fosfatni prenašalec

UTP uridil trifosfat

(14)

1

1 UVOD

1.1 PROTIBAKTERIJSKE ZDRAVILNE UČINKOVINE

Mikroorganizmi se nahajajo povsod okrog nas in v nas. Z njimi uspešno sobivamo, a vendar pod določenimi neustreznimi pogoji lahko povzročajo težave. Bakterijske okužbe so bile vzrok številnih smrti tekom človeške zgodovine, vse do 20. stoletja, ko so odkrili prve protimikrobne učinkovine. Kljub antibiotični revoluciji pred dobrimi 80. leti nas okužbe še vedno spremljajo. Antibiotiki ostajajo v razvitem in državah v razvoju najbolj pogosto predpisana zdravila. ⁽¹⁾

V medicinski literaturi pogosteje zasledimo izraz kemoterapevtik. Prvi ga je uporabil Paul Ehrlich, da bi z njim opisal sintezne učinkovine, ki uničujejo patogene mikroorganizme. Protibakterijske učinkovine v grobem delimo na antibiotike in kemoterapevtike. Antibiotik je produkt živih mikroorganizmov, kemoterapevtik pa sintezno ali pol sintezno proizvedena učinkovina. Njuna skupna lastnost je selektivna toksičnost, ki temelji na strukturnih in fizikalnih razlikah med celicami mikroorganizmov in človeškimi celicami. Cilj selektivne toksičnosti je poškodba bakterijske celice, medtem ko človeške ostanejo neprizadete. Pri razvoju protibakterijskih učinkovin stremimo k prepoznavanju biokemijskih razlik med patogenom in njegovim gostiteljem.

Bakterije so živa bitja zmožna prilagajanja. Z razvojem novih zdravilnih učinkovin učinkovito tekmujejo in tako postajajo odporne. To je eden največjih problemov sodobnega časa. Začarani krog razvoja in prilagajanja. ⁽²⁾

1.1.1 Delovanje protibakterijskih učinkovin

Protibakterijske učinkovine delujejo na različne načine (kot je prikazano na Sliki 1). Lahko zavirajo razmnoževanje bakterij – bakteriostatiki ali pa bakterijo neposredno ubijejo – baktericidi. Glede na to, koliko različnih bakterijskih vrst so sposobne uničiti, jih delimo na širokospektralne in tiste, ki delujejo na manj različnih bakterij.

Mehanizem delovanja zdravilnih učinkovin delimo v štiri večje razrede:

• Zaviralci sinteze folata ali antimetaboliti: Biosintezo folata, ki ga celica potrebuje za sintezo DNA lahko zaviramo s sulfonamidi. To so strukturni analogi PABA (p-aminobenzojske kisline), ki z njo tekmujejo in tako inhibirajo rast bakterij. V uporabi je tudi trimetoprim, zaviralec encima dihidrofolat reduktaze, ki reducira dihidrofolat do tetrahidrofolata.

• Zaviralci sinteze celične stene: peptidoglikan je glavni gradnik celične stene. Daje ji obliko in vzdržuje osmotski tlak. Zaviranje sinteze celične stene vodi v lizo celice in smrt. Zdravilne učinkovine, ki delujejo na ta način so penicilini, cefalosporini in vankomicin.

• Zaviralci sinteze proteinov: Izgradnja proteinov poteka na ribosomih. Učinkovine, ki zavirajo encime in proteine potrebne za preživetje celice so eritromicin, tetraciklin in kloramfenikol.

(15)

2

• Zaviralci sinteze nukleinskih kislin: zavirajo celično delitev in razmnoževanje. Delujejo preko inhibicije DNA giraze ali inhibicije RNA polimeraze (fluorokinoloni, nalidiksna kislina in proflavin). ⁽²⁾⁽³⁾

Slika 1: Tarče delovanja različnih antibiotikov; prirejeno po (3).

(16)

3

1.1.1.1 Zaviralci sinteze celične stene

Najbolj pogost mehanizem delovanja protibakterijskih zdravilnih učinkovin je motnja v sintezi bakterijske celične stene. Večino zaviralcev sinteze celične stene uvrščamo v skupino t.i. β-laktamskih antibiotikov, saj jim je skupna osnovna kemijska struktura, to je β-laktamski obroč. V to skupino spadajo penicilini, cefalosporini, karbapenemi in monobaktami. Poznamo še druge zaviralce bakterijske celične stene, kot so vankomicin, daptomicin, bacitracin, izoniazid, fosfomicin in cikloserin.

Izgradnjo peptidoglikanske mreže katalizirajo encimi transpeptidaze, transglikozilaze in karboksilpeptidaze, ki spadajo v skupino serinskih proteaz. Regulatorne encime lahko imenujemo tudi penicilin vezoči proteini (PBP), saj so tarča vseh β-laktamskih antibiotikov. Te učinkovine so analogi dipeptida D-alanil-D-alanin in se ireverzibilno vežejo na serinski ostanek v aktivnem mestu transpeptidaze, ki nato ustavi premreženje peptidoglikanskih verig. Sledi aktivacija lizina, kar vodi v smrt bakterijske celice.

Bakterije razvijajo odpornost na β-laktamske antibiotike na tri različne načine. Odpornost se lahko razvije, ko je zmanjšana koncentracija protibakterijske učinkovine na tarčnem mestu celične stene. Ta oblika rezistence se večinsko pojavlja pri Gram-negativnih bakterijah, kjer peptidoglikanski sloj pokriva še celična membrana. Zdravilne učinkovine tako težje prodirajo na mesto delovanja in se kopičijo na zunanji strani celične stene. Drugi mehanizem odpornosti se razvije zaradi zmanjšane vezave zdravilne učinkovine na PBP kot posledica strukturnih sprememb transpeptidaz. Tretji, najbolj pogost mehanizem, je hidroliza β-laktamskega obroča učinkovine z bakteriji lastnimi β-laktamazami. Bakterijska celica ob povečani izpostavljenosti β-laktamskim antibiotikom prične s povečanim izražanjem gena za β- laktamaze , lahko pa pride do genske mutacije.

Penicilini so protibakterijske učinkovine z zelo nizko toksičnostjo. Najbolj učinkovito delujejo v kombinaciji z zaviralci β-laktamaz: klavulansko kislino, sulbaktamom ali tazobaktamom, ki s svojo ireverzibilno vezavo na β-laktamaze omogočajo penicilinu, da opravi svojo vlogo zaviralca sinteze celične stene. Cefalosporini so derivati 7-aminocefalosporinske kisline, ki se od penicilina razlikujejo v tem, da imajo širši spekter delovanja, daljši razpolovni čas in so bolj odporni na β-laktamaze.

Karbapenemi (imipenem, meropenem, ertapenem) in monobaktami (aztreonam) so pomembni β- laktamski antibiotiki, ki delujejo proti številnim organizmom. Karbapenemi so širokospektralni, monobaktami pa ozkospektralni in delujejo proti aerobnim Gram-negativnim bakterijam.

Protibakterijska učinkovina vankomicin spada v skupino glikopeptidov in zavira sintezo peptidoglikana pri Gram-pozitivnih bakterijah. Vankomicin reagira z D-alanil-D-alanin aminokislinskim koncem peptidne verige. Sterično ovira nastajanje prečnih povezav med peptidoglikanskimi verigami in s tem zavira nastanek peptidoglikanske mreže. Bakterije so razvile odpornost na vankomicin z modulacijo genov vanA in vanB, ki spreminjajo vezavno mesto t.i. pentapeptidne konce za vezavo učinkovine.

Daptomicin je naravni ciklični lipopetid, ki se ireverzibilno veže na citoplazemsko membrano, jo depolarizira, kar vodi v celično smrt. Deluje proti Gram-pozitivnim bakterijam in je odličen za zdravljenje okužb od ostalih učinkovin odpornih stafilokokov in streptokokov.

Bacitracin je polipeptid, ki zavira sintezo celične stene tako, da se vmeša v proces defosforilacije oziroma obnove lipidnega prenašalca, ki je odgovoren za prenos peptidoglikanskih prekurzorjev preko

(17)

4

citoplazemske membrane. Poškoduje citoplazemsko membrano in zavira prepisovanje ribonukleinske kisline. Odpornost so bakterije razvile z zmanjšanim prenosom učinkovine v bakterijsko celico.

Izoniazid, etionamid in etambutol so protibakterijske učinkovine, ki motijo sintezo mikolinske kisline.

Na ta način ne pride do tvorbe maščobnih kislin. Etambutol moti sintezo arabinogalaktana v celični steni, cikloserin pa inhibira dva encima, D-alanil-D-alanin ligazo in alanin racemazo, ki prav tako katalizirata sintezo celične stene. Odpornost teh antibiotikov je posledica zmanjšanega privzema učinkovine v bakterijsko celično steno. ⁽²⁾⁽⁴⁾

1.2 BAKTERIJE

Bakterijske celice uvrščamo med prokarionte, enostavne enocelične organizme brez pravega jedra. V njihovi celici ne najdemo mitohondrijev, endoplazemskega retukuluma in Golgijevega aparata. Sredico tipične bakterije Escherichia coli sestavlja krožni kromosom s 5 milijoni baznih parov in dolžino 1.3 mm. Za primerjavo, človeški kromosom vsebuje skoraj 3 milijarde baznih parov, v dolžino pa meri 990 mm. Tudi biokemijska sestava bakterijske celice se razlikuje od živalske. Bakterije morajo vitamine sintetizirati same, medtem ko jih živalske dobijo s hrano. Za kataliziranje kemijskih reakcij potrebujejo encime. Njihovo zunanje ogrodje sestavljata celična membrana in celična stena, medtem ko celične stene pri živalski celici ni. Bakterijska celica je razvila strukturo in mehanizme, s katerimi se je prilagodila na življenje v neugodnem okolju. Preživi lahko močnejše temperaturne ekstreme in pritiske kot eukariontska celica. Prokariontska celica je sestavljena iz celične stene, pod katero leži celična membrana, citoplazme, bičkov in pilusov, s katerimi se premika in pritrja. V citoplazmi, ki jo obdaja citoplazemska membrana najdemo ribosome, proteine, metabolite, plazmide in bakterijski nukleotid (kromosom).

Bakterije razdelimo po njihovi obliki na okrogle, paličaste in spiralne, po velikosti (0,1 in 20 µm), ter po ureditvi v prostoru na verige, skupke ali samostojne celice. Njihove presnovne potrebe se v okolju, v katerem živijo razlikujejo. Aerobne za svoje preživetje potrebujejo kisik, medtem ko anaerobne brez njega lahko preživijo. Med seboj jih ločimo z barvanjem po Gramu, ki je enostaven in hiter test, s katerim bakterije razlikujemo glede na zmožnost zadrževanja barvila. Pomaga nam odkriti pravo diagnozo in s tem pravilen izbor antibiotikov. Test začnemo z barvanjem z metilvijoličnim barvilom, ki ga speremo z Lugolovo raztopino joda. Sledi spiranje z etanolom ali acetonom in dodatek rdečega barvila safranin.

Gram-pozitivne bakterije se obarvajo vijolično, Gram-negativne zaradi tankega peptidoglikanskega sloja barvila ne zadržijo in postanejo rdeče. ⁽⁴⁾⁽⁵⁾

(18)

5

1.2.1 Celična stena

Celična stena je ključnega pomena za preživetje bakterijske celice. Nahaja se tik nad citoplazemsko membrano. Celico ščiti pred zunanjimi vplivi iz okolja, ji daje obliko, rigidnost, ji posreduje informacije in snovi iz zunanjega okolja.

Struktura in funkcija celične stene se pomembno razlikuje med bakterijami. Gram-pozitivne bakterije imajo debelo, večslojno celično steno, sestavljeno izključno iz peptidoglikana (do 20 slojev), proteinov, tehojske in lipotehojske kisline, ter kompleksnih C polisaharidov. Tehojska kislina je vodotopen anionski poliolni fosfat, ki se kovalentno veže na peptidoglikan.

Celična stena Gram-negativnih molekul je bolj kompleksna, tako strukturno kot kemijsko. Sestavljena je iz zunanjega lipidnega sloja pritrjenega na peptidoglikan. Vmes se nahaja periplazemski prostor, ki vsebuje transportne sisteme za železo, proteine, sladkorje in encime, ki so odgovorni za metabolizem.

(4)(6)

1.2.2 Peptidoglikan

Murein, mukopeptid oz. peptidoglikan je ena največjih makromolekul bakterijske celice in glavna sestavina celične stene. ⁽⁷⁾ Spominja na neraztegljiv mrežast sloj, ki obdaja celotno bakterijo. ⁽²⁾ Je zaščitni polimer, sestavljen iz glikanskih verig, ki so med seboj povezane s peptidnimi enotami. S svojo rigidnostjo varuje bakterijsko celico pred osmotskim pritiskom, zagotavlja nemoteno potovanje hranil, izločanje zunajceličnih beljakovin in ji omogoča nemoteno rast. Je hetero polimer, prisoten pri vseh bakterijah. Gram-negativne bakterije sintetizirajo tanko enoslojno peptidoglikansko verigo, njihova celična stena je sestavljena pretežno iz lipopolisaharidov in lipoproteinov. ⁽⁸⁾ Gram-pozitivne bakterije sintetizirajo debelo večslojno mrežo (Slika 2). Strukturo peptidoglikana sestavljajo glikanske verige, v katerih se izmenjujeta N-acetilglukozamin (GlcNAc) in N-acetilmuraminska kislina (MurNAc), ki sta med seboj povezani z β-1,4 glikozidno vezjo. Na karboksilni ostanek N-acetilmuraminske kisline je pripet pentapeptid. Ogrodje je pri vseh bakterijah enako, razlikujejo pa se v aminokislinah vezanih na muraminsko kislino. Pri Gram-negativnih bakterijah to verigo sestavljajo L-alanin, D-glutamat, mezodiaminopimelinska kislina in D-alanin. Gram-pozitivnim bakterijam diaminopimelinsko kislino nadomešča L-lizin. Končno mrežasto strukturo peptidoglikana tvorijo glikanske prečne povezave s peptidi. ⁽⁹⁾

(19)

6

Slika 2: Struktura peptidoglikana pri Gram-pozitivnih in Gram-negativnih bakterijah; prirejeno po (9).

1.2.3 Biosinteza peptidoglikana

Biosinteza peptidoglikana poteka v treh stopnjah. Začne se v bakterijski citoplazmi iz fruktoza-6-fosfata, s pomočjo encimov GlmS, GlmM in GlmU (Slika 3).

V prvi stopnji sinteze se fruktoza-6-fosfat s pomočjo glukozamin-6-fosfat sintaze (GlmS) in glutaminom kot donorjem amida, pretvori v glukozamin-6-fosfat (GlcN-6-P). Fosfoglukozamin mutaza (GlmM) nato pretvori GlcN-6-P v glukozamin-1-fosfat (GlcN-1-P). Encim N-acetilglukozamin-1-fosfat uridiltransferaza (GlmU) s pomočjo acetilne skupine iz acetil koencima A (acetil-CoA) in uridiltrifosfata (UTP) vodi v nastanek uridildifosfat-N-acetilglukozamina (UDP-GlcNAc).

Iz UDP-GlcNAc in fosfoenolpiruvata (PEP) s pomočjo encima MurA nastaneta anorganski fosfat in uridildifosfat-N-acetilglukozamin enolpiruvat (UDP-GlcNAc-EP), ki ga nato encim MurB ob prisotnosti NADPH reducira do uridildifosfat-N-acetilmuraminske kisline (UDP-MurNAc). Na koncu sledi pripenjanje pentapeptidne verige na UDP-MurNAc. S pomočjo encimov Mur ligaza (MurC-MurF) nastane UDP-MurNAc-pentapeptid, ki je sestavljen iz aminokislinskega zaporedja L-alanin, D- glutaminska kislina, diaminopimelinska kislina oziroma L-lizin in D-alanin-D-alanin.

(20)

7

Slika 3: Shematska predstavitev biosinteze peptidoglikana; prirejeno po (11).

Druga stopnja biosinteze se odvija na notranji strani celične membrane. Encim MraY katalizira pritrditev UDP-MurNAc-pentapeptida na lipid undekaprenil fosfat (C55-P). Nastali produkt imenujemo Lipid I, ki nastopa v reakciji z encimom MurG in UDP-GlcNAc ter tvori Lipid II (lipid-disaharid-pentapeptid).

V zadnji fazi sinteze potuje Lipid II v periplazemski prostor s pomočjo encima MurJ in tako postane substrat za premreženje. Polimerizacija peptidoglikanskih verig se odvija s pomočjo transglikozilaz in transpeptidaz. Reakcija transglikozilacije ustvari β-(1-4) vez med GlcNAc in MurNAc ostanki glikanske verige. Končni, prečno premreženi peptidni mostički, pa so produkt encimov transpeptidaz. ⁽⁹⁾

(21)

8

1.3 ENCIMI

Encimi so velike proteinske molekule. Njihova glavna naloga je, da nastopajo kot katalizatorji v kemijskih reakcijah živih organizmov. Najdemo jih zasidrane v celično steno in membrano. Za svoje delovanje potrebujejo neaktivne organske snovi - koencime ali anorganske kofaktorje. Aktivne encimske sisteme imenujemo holoencimi, sestavljeni so iz apoencima in koencima oz kofaktorja.

Nastanejo iz neaktivnih proteinskih predhodnikov proencimov.

Delimo jih v šest različnih skupin glede na reakcije, ki jih katalizirajo:

- Oksidoreduktaze (oksidacije in redukcije) - Transferaze (prenos skupine)

- Hidrolaze (hidroliza različnih skupin)

- Liaza (dodajanje ali odstranjevanje skupin za tvorbo dvojnih vezi) - Izomeraza (prenos skupin znotraj molekul)

- Ligaza (združitev dveh substratov na račun hidrolize ATP)

Encimi zagotavljajo aktivno mesto za vezavo substrata in ustrezne reakcijske pogoje. Pomagajo reaktantom, da pridejo do mesta delovanja in jih postavljajo v pravilno lego. Osnovna reakcija nastanka produkta s pomočjo encima poteka tako, da se na aktivno mesto encima veže substrat. Katalizirajo lahko reakciji v obe smeri, tako v nastanek produkta kot reaktanta. ⁽⁵⁾⁽⁶⁾

1.3.1 MurA

MurA je znotrajcelični bakterijski encim, nujen za sintezo peptidoglikana. Katalizira prvi korak v intracelularni fazi sinteze peptidoglikana: prenos enolpiruvata iz fosfoenolpiruvata (PEP) na 3- hidroksi skupino UDP-N-acetilglukozamin (UDP-GlcNAc). Reakcija poteka po mehanizmu adicije in eliminacije. Produkta reakcije sta UDP-GlcNAc-enolpiruvat in anorganski fosfat (Pi). Naslednji korak katalizira encim MurB, ki UDP- GlcNAc –enolpiruvat reducira v UDP-N-acetilmuraminsko kislino. ⁽¹⁰⁾ Reakcija z MurA encimom ni najbolj pogost biokemijski proces v naravi. Gram-pozitivne bakterije imajo dve kopiji gena (murA1 in murA2), ki kodira encim, Gram-negativne pa enega.

MurA encim je sestavljen iz dveh domen (kot prikazuje Slika 4). Ti sta med seboj povezani z dvema zankama, med njima pa se nahaja aktivno mesto. ⁽¹¹⁾ Zelena ali katalitska domena (ostanki 22-229, slika 4) vsebuje aminokislinski ostanek Cys115, modro pa imenujemo C-terminalna domena (z ostanki 1-21 in 230-419). Katalitsko mesto je zasidrano globoko med obema domenama ⁽¹²⁾.

(22)

9

Slika 4: Tridimenzionalna struktura MurA v odprti domeni (a) in zaprti domeni (b); prirejeno po (11).

Aminokislinski ostanki imajo pomembno vlogo v mehanizmu reakcije. Cys115 sodeluje pri sprostitvi produkta iz aktivnega mesta, Asp305 je odgovoren za prenos protona iz mesta C-3 na tetraedričnem intermediatu, kar vodi do eliminacije fosfata. Lys22 veže PEP in sodeluje pri konformacijskih spremembah, ki vodijo do ustreznega encimskega kompleksa.

Fleksibilna zanka Pro112-Pro121 vsebuje aminokislinski ostanek s stransko verigo Cys115. Kadar je odprta, je izpostavljena topilu in omogoča vezavo substrata UDP-GlcNAc. Po vezavi UDP-GlcNAc v aktivno mesto pride do konformacijskih sprememb, domeni se zapreta, zanka pa nad njima tvori pokrov.

Zaprtje domene približa aminokislinski ostanek Cys115 PEP-u. Iz 3'-OH skupine UDP-GlcNAc se odcepi proton, ki se prenese na C-3 vezavno mesto na PEP. Nastane tetraedrični intermediat, ki predstavlja adicijski del reakcije, eliminacija fosfata pa vodi do nastanka anorganskega fosfata (Pi) in dvojne vezi med C-2 in C-3 (Slika 5). ⁽¹¹⁾

Slika 5: Reakcijski mehanizem MurA encima; prirejeno po (17).

1.3.2 Zaviralci MurA

MurA je ključen encim v sintezi peptidoglikana. V sesalskih organizmih ga ne najdemo, saj med človeškimi proteini nima homologa. Širokospektralni antibiotik fosfomicin je edini klinično uporaben zaviralec encima MurA. S kovalentno vezavo ob prisotnosti substrata UDP-GlcNAc encim ireverzibilno zavre. ⁽¹³⁾⁽¹⁴⁾

V preteklem desetletju so s pregledom kemijskih knjižnic in z rešetanjem visoke zmogljivost odkrili številne zaviralce MurA. Med temi zaviralci (Slika 7) najdemo analoge cikličnega disulfida (2) in

(23)

10

pirazolpirimidina (3). Molekule so med seboj strukturno različne, prav tako izkazujejo drugačno delovanje kot fosfomicin (1). Z ultrafiltracijo in masno spektrometrijo so odkrili, da se te učinkovine močno vežejo na encim blizu aktivnega mesta in da je vezava ne kovalentna. Njihove IC50 vrednosti so bile nižje (0,2 in 0,9 µM) od fosfomicina (8,8 µM). Protibakterijsko dejavnost so izkazale proti bakterijam S. aureus in E. faecalis z MIK med 4 - 32 µg/ml. Študije so razkrile, da je protibakterijsko delovanje učinkovin nespecifično za MurA encim, saj hkrati zavirajo tudi sintezo DNA, RNA in proteinov. ⁽¹⁵⁾⁽¹⁶⁾

Kot zelo obetavna inhibitorja sta se izkazala derivata 5-sulfonoksil-antranilne kisline (10). Njuno zaviralno delovanje je kompetitivno, časovno neodvisno, vrednosti IC50 pa izkazujeta v nizkem mikromolarnem območju. Z vezavo preprečita konformacijsko spremembo encima iz odprte v zaprto obliko. Za nadaljnjo obravnavo učinkovin pa bo potrebna izvedba številnih kliničnih študij.

Edini peptidni zaviralec, ki so ga uspeli odkriti je bil časovno odvisen in je kompetitivno zaviral encim MurA pri bakteriji Pseudomonas aeruginosa. Njegova IC50 vrednost je znašala 200 µM. ⁽¹⁶⁾

Derivata diarilmetana in imidazola: Obe učinkovini sta zavirali sintezo peptidoglikana, a je samo učinkovina dimetilamino difenil propenoksi butanon (7) uspešno zavirala MurA encim (IC50 = 6 µM).

Inhibicija je bil časovno odvisna, potrebna je bila tudi pred inkubacija s substratom UDP-GlcNAc.

Molekula je zavirala rast številnih mikroorganizmov: E. coli, H. influenzae, S. aureus in S. pneumoniae z MIK= 8,1-32,3 µg/ml.

Rešetanje visoke zmogljivosti Novartisove kemijske knjižnice je pripeljalo do odkritja derivatov 2- aminotetralona (5). ⁽¹³⁾ Te učinkovine so zavirale E. coli MurA z IC50 = 3,1-8,5 µM in S. aureus MurA z IC50 = 12-23 µM. Ireverzibilno so zavirale oba izomera MurA encima kateregakoli Gram-pozitivnega organizma. Z iskanjem povezave med strukturo in delovanjem so ugotovili, da je bil za delovanje odgovoren α-aminoketon. Učinkovini se zaradi hkratnega zaviranja dveh sesalskih encimov nista izkazali kot najboljša inhibitorja sinteze peptidoglikana.

Timerosal, tiram in ebselen (6) so inhibitorji H. influenzae MurA encima (IC50 = 0,1 – 0,7 µM). Imajo drugačno strukturo od fosfomicina, a se prav tako kovalentno vežejo na Cys117 ostanek v odprti konformaciji MurA. ⁽¹⁶⁾ Vezava sproži konformacijo encima iz odprte v zaprto obliko, s tem se prepreči vezava substrata UDP-GlcNAc. Ti zaviralci uspešno zavirajo rast Gram-negativnih bakterij E. coli, P.

aeruginosa in Gram-pozitivnih bakterij S. aureus. ⁽¹³⁾

Seskviterpenska laktona knicin (11) in kinaropikrin delujeta proti P. aeruginosa MurA (IC50 = 10,3 µM in 12,1 µM) in E. coli MurA (IC50 = 16,7 µM in 19,5 µM). Za delovanje je ključnega pomena nenasičena estrska stranska veriga. Z analizo kristalne strukture E. coli MurA so dokazali nastanek kovalentnega kompleksa med knicinom in UDP-GlcNAc, ki posnema nativni tetraedrični intermediat. Ta vez vodi v nastanek ne kovalentnega samomorilskega zaviralca. Ker elektrofilna funkcionalna skupina (lakton) reagira z drugimi nukleofili v celici, ne moremo trditi, da je njihovo delovanje posledica zaviranja MurA encima.

V Steinbachovi študiji so identificirali 1-tuliposid B in (±) tulipanin B (9) kot ustrezna zaviralca E. coli MurA. Protibakterijsko dejavnost sta izkazala v območju IC50 = 0,2-0,5 µM in IC50 = 0,1-5 µM.

Inhibicija je bila časovno odvisna, ojačana s pomočjo UDP-GlcNAc substrata, za njuno delovanje pa je

(24)

11

bila odgovorna hidroksilna skupina. V študiji so odkrili, da inhibirata encima podobno kot cinicin z ne kovalentno samomorilsko inhibicijo.

V Novartisovih kemijskih knjižnicah in z rešetanjem visoke zmogljivosti so odkrili benzotiaksalonske derivate (8), ki so s kovalentno vezavo ireverzibilno inhibirali E. coli MurA z IC50 = 0,25 – 18,54 µM.

Nekaj teh derivatov je zaviralo tudi MurA in MurZ S. aureusa (IC50 = 1,0-51,46 µM) z MIK med 4 in 128 µg/ml.

Tereična kislina je metabolit gliv A. terreus. Je kovalentni inhibitor E. cloacae MurA in E. coli MurA.

Strukturno je zaradi epoksidnega obroča podobna fosfomicinu. Kovalentno se veže na tiolno skupino Cys115 blizu aktivnega mesta encima. Inhibicija je prav tako ojačana ob prisotnosti substrata UDP- GlcNAc. Po vezavi fosfomicina se tvori zaprt kompleks encim- UDP-GlcNAc-fosfomicin. MurA kompleks s tereično kislino pa tvori odprto konformacijo, iz katere zaradi steričnega oviranja izpade substrat UDP-GlcNAc (Slika 6). Fosfomicin je skoraj 50 x močnejši od tereične kisline. ⁽¹⁶⁾

Slika 6: Shematski prikaz delovanja dveh različnih zaviralcev (A) fosfomicina in (B) tereične kisline; prirejeno po (16).

Na fakulteti za farmacijo so sestavili knjižnico 84 sintezno pripravljenih heterociklov z dušikom, na katere so bile vezane različne elektrofilne funkcionalne skupine. Raziskovali so primerno reaktivnost in stabilnost molekul s cisteinom pri S. aureus in E. coli MurA. Izbrane molekule so bile piridin, pirimidin, pirazin, imidazol, pirazol, oksazol, izoksazol in tiazol. Na heterocikle so bili vezani halogeni Cl, Br, CN, ki s cisteinom reagirajo v reakciji aromatske nukleofilne substitucije, ter vinilna in etilna skupina, ki reagirata po mehanizmu nukleofilne adicije. V raziskavi so se kot dobri zaviralci izkazali jodo- in vinil- substituirani heterocikli. ⁽¹⁴⁾

(25)

12

Slika 7: Strukturni prikaz znanih zaviralcev encima MurA; prirejeno po (13, 16).

(26)

13

1.3.3 Fosfomicin

Fosfomicin ali fosfonomicin je naravni baktericidni antibiotik in spada med starejša protimikrobna zdravila. Odkrili so ga leta 1969 v Španiji iz bakterije Streptomyces spp. Je derivat fosfonske kisline, širokospektralna učinkovina, ki zdravi okužbe tako z Gram-pozitivnimi (Staphylococcus aureus in enterococcus) kot tudi z Gram-negativnimi bakterijami (Pseudomonas aeruginosa in S. pneumoniae).

(17) Ima majhno molekulsko maso, nizko vezavo na plazemske proteine in visoko biološko uporabnost.

Na trgu ga najdemo v obliki soli, kot fosfomicin trometamin (trometamol) in fosfomicin kalcij za peroralno uporabo, ter kot dinatrijev fosfomicin za parenteralno aplikacijo. Z njim zdravimo nekomplicirane okužbe sečil- akutni cistitis pri ženskah, ki ga povzroča E. coli in Enterococcus faecalis.

V telesu sproži akutni vnetni citokinski odziv, produkcijo TNF-α, IL-1-β, IL-1-α in poveča produkcijo IL-10.

Njegovo baktericidno delovanje temelji na zaviranju encimske reakcije v prvem koraku sinteze peptidoglikana. ⁽¹⁰⁾ V bakterijsko celico vstopa s pomočjo dveh transportnih prenašalcev: L-alfa- glicerofosfata (GlpT), ki je odgovoren za privzem glicerol-3-fosfata in prenašalca za privzem heksoza- fosfata (UhpT). ⁽¹⁸⁾

Fosfomicin je analog fosfoenolpiruvata (PEP) in ima značilno epoksidno skupino, ki je ključna za njegovo protibakterijsko delovanje.

Kompetitivno in ireverzibilno zavira delovanje MurA encima s kovalentno vezavo na tiolno skupino aminokislinskega ostanka Cys115 (Slika 8). S tem onemogoči vezavo PEP na aktivno mesto encima. ⁽¹²⁾

Slika 8: Strukturni prikaz vezave fosfomicina na encim MurA; prirejeno po (12).

Interakcija fosfomicina z MurA je zelo selektivna in zato izkazuje nizko toksičnost.

1.3.3.1 Razvoj odpornosti bakterij na fosfomicin

Fosfomicin je zaradi svojega mehanizma delovanja precej edinstvena zdravilna učinkovina. Uspešno kljubuje navzkrižni odpornosti z drugimi antibiotiki. Zanimanje zanj je naraslo zaradi povečane odpornosti patogenov na eno ali več različnih protimikrobnih zdravil. ⁽¹⁷⁾

Znani so različni mehanizmi razvoja odpornosti. V E. coli in P. aeruginosa so odkrili kromosomske mutacije v genih za transportne prenašalce (GlpT in UhpT), ki so odgovorni za privzem fosfomicina v celico. Prav tako so mutacijo odkrili v genih za njuno regulacijo. Naravna odpornost se je razvila pri nekaterih bakterijah (Mycobacterium tuberculosis), ki imajo v aktivnem mestu encima asparaginski aminokislinski ostanek namesto cisteinskega. Odpornost se je razvila tudi zaradi prekomernega izražanja encima MurA, ki ga antibiotik ni uspel inhibirati.

(27)

14

Na odpornost bakterijske celice lahko vplivajo encimi, ki antibiotik oslabijo in hkrati blokirajo njegov zaviralni mehanizem. Poznamo jih pod imenom metaloencimi - FosA, FosB in FosX. FosA je od Mn (II) in K⁺ odvisna glutation transferaza, FosB je od Mg²⁺ odvisna L-cisteinska tiolna transferaza, FosX pa je od Mn (II) odvisna epoksid hidrolaza. Njihova naloga je, da se vežejo na C1 atom fosfomicina in tako z vezavo različnih substratov odprejo njegov epoksidni obroč.

Uporaba fosfomicina v terapiji žanje uspehe pri zdravljenju številnih na zdravila odpornih patogenov.

Kljub temu da so ugotovitve novejših študij njemu v prid, mora biti njegova uporaba premišljena.

Odpornost nanj se namreč lahko hitro poveča. ⁽¹²⁾⁽¹⁸⁾

(28)

15

2 NAMEN IN NAČRT DELA

Namen magistrske naloge je sinteza novih bromidnih in vinilnih tiazolov in biološko testiranje njihovega zaviralnega delovanja na MurA encim. Z rezultati testiranj bomo ovrednotili, katere molekule so ustrezne za nadaljnjo raziskovanje. Tako bi z optimizacijo naših spojin lahko pridobili nove protibakterijske zdravilne učinkovine.

Na fakulteti za farmacijo so v preteklih raziskavah vrednotili različne heterociklične elektrofile kot potencialne zaviralce MurA iz E. coli. Med njimi so testirali tudi tiazole, ki so imeli na mestu 2 vezano bromidno ali vinilno funkcionalno skupino. ⁽¹⁴⁾ Na podlagi teh rezultatov smo se odločili, da pripravimo manjšo knjižnico bromo/vinil tiazolov, da preverimo kemijski prostor MurA encima.

V okviru magistrske naloge bomo iz komercialno dostopnih različnih 2-aminotiazolov v prvi stopnji reakcije sintetizirali derivate 2-bromotiazola. Le-te bomo v drugi stopnji sinteze pretvorili do derivatov 2-viniltiazola in poskusili s sintezo 2-jodotiazolov (Slika 9). Drugi substituenti bodo zasedali različna mesta. S spektroskopskimi in kromatografskimi metodami bomo najprej potrdili strukturo in čistost spojin. Nato bomo biokemijsko vrednotili spojine na encimu MurA iz bakterije E. coli. Določili jim bomo rezidualno aktivnost in tistim, ki bodo izkazovale aktivnost pod 50 % pri koncentraciji 500 µM, določili vrednost IC50 [µM]. S to vrednostjo bomo lahko spojine primerjali glede na jakost zaviranja encima. Spojinam bomo določili tudi Hillov koeficient, ki nam pove specifičnost inhibitornega delovanja spojine na encimu.

Slika 9: Sintezni načrt.

(29)

16

3 MATERIALI IN METODE

3.1 MATERIALI IN METODE ZA KEMIJSKE SINTEZE

Pri sintezi spojin smo uporabljali topila in reagente kupljene pri proizvajalcih Acros, Apollo Scientific, Fluka, Merck in Sigma. Njihova predpriprava ni bila potrebna.

3.1.1 Kromatografija

3.1.1.1 Tankoplastna kromatografija (TLC)

Za sprotno spremljanje poteka kemijskih reakcij smo uporabljali tankoplastno kromatografijo. Izvajali smo jo na ploščicah Silica gel 60 F254, proizvajalca Merck. Na aluminijastem nosilcu velikosti 20 × 20 cm je v 0,2 mm debelem sloju nanešen silikagel. Ploščice imajo dodan fluorescenčni indikator, uporabljene mobilne faze pa so navedene pri posameznih spojinah. Le-te smo detektirali s pomočjo UV svetlobe, pri valovnih dolžinah 254 nm in 366 nm ter z orositvenima reagentoma ninhidrinom in fosfomolibdatom.

3.1.1.2 Kolonska kromatografija

Sintetizirane spojine smo čistili s »flash« kolonsko kromatografijo. Uporabljali smo steklene kolone različnih dimenzij. Stacionarna faza je bil Silica gel 60, z velikostjo delcev 0,040–0,063 mm (Merck).

Mobilne faze so navedene pri posameznem sinteznem postopku. Reakcijsko zmes smo raztopili v ustrezni mobilni fazi in nanesli na kolono.

3.1.1.3

Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) analizo končnih spojin smo izvedli na sistemu Thermo Fisher UltiMate 3000, s kolono Acquity UPLC HSS C18 1,8 μL (2,1 × 50 mm). Temperatura kolone je bila 40 °C, hitrost pretoka mobilne faze 0,4 mL/min z gradientom 10 % acetonitrila do 90 % acetonitrila v 7 min. Mobilna faza je bila mešanica 0,1 % raztopine trifluorocetne kisline v bidestilirani vodi in acetonitrilu.

3.1.2 Spektroskopija

3.1.2.1 Jedrska magnetna resonanca (NMR)

1H in ¹³C NMR spektre smo posneli na Fakulteti za farmacijo v Ljubljani, na spektrometru Burker Avance III 400 MHz. ¹H spektre smo merili pri 400 MHz, ¹³C pa pri 100 MHz. Vzorce smo raztopili v devteriranih topilih CDCl3 in DMSO-d6 z internim standardom TMS. Kemijske premike v ppm (»parts per million«) smo določili glede na uporabljeno topilo. Spektre smo analizirali v programih MastReNova (MASTERLAB RESEARCH SL.) in NMRnotebook 2.80 (NMRTEC S.A.S.).

3.1.2.2

Masna spektroskopija visoke ločljivosti (ESI-HRMS)

Masni HRMS spektri spojin so bili posneti na Fakulteti za farmacijo v Ljubljani na masnem spektrometru LC-MS/MS system Q Executive Plus (Thermo Scientific, MA, USA).

(30)

17

3.1.3 Določanje temperature tališča

Temperaturo tališča kristalnih vzorcev smo določali s pomočjo Kofflerjevega mikroskopa z ogrevalno mizico (Leica).

3.1.4 Risanje in poimenovanje spojin

Za risanje in poimenovanje kemijskih struktur smo uporabljali program ChemDraw Professional 16.0 (PerkinElmer Inc.).

3.2 MATERIALI IN METODE BIOKEMIJSKIH TESTOV 3.2.1 Laboratorijska oprema

V laboratoriju smo uporabljali mikrotitrske ploščice s 96 vdolbinicami. Rezultate smo merili spektrofotometrično, pri valovni dolžini 650 nm, s spektrofotometrom BioTek Synergy H4 hybrid reader.

3.2.2 Reagenti

Spojinam, ki smo jih sintetizirali, smo laboratorijsko določili jakost zaviranja encima MurA.

Pri biokemijskem testiranju smo uporabili naslednje reagente:

- encim MurA iz E. coli,

- dimetilsulfoksid (DMSO) kot topilo za spojine,

- pufer 1 M Hepes s pH 7,8 za zagotavljanje ustreznega okolja za delovanje encima, - raztopino UDP-NAG,

- raztopino PEP,

- površinsko aktivno snov Triton X-114, za preprečevanje nastanka hidrofobnih skupkov, - reagent BIOMOL^® GREEN, za določitev prostega fosfata

- bidestilirano vodo.

Reakcijska zmes s končnim volumnom 50 µL je vsebovala: pufer 50 mM Hepes; 0,005% Triton X- 114;

200 µM UDP-NAG; 100 µM PEP; očiščen MurA encim, raztopljen v 50 mM pufru Hepes (pH 7,8) in 500 µM testirane spojine raztopljene v DMSO 5 % (v/v).

3.2.3 Postopek

Spojine smo predinkubirali skupaj z encimom in UDP-NAG pri 37°C 30 min. Reakcijo smo začeli z dodatkom molibdata in nastalo zmes inkubirali v inkubatorju pri 37°C 15 min. Nato smo dodali 100 µL reagenta BIOMOL^® GREEN in s tem reakcijo prekinili. Po 5 min smo reakcijski zmesi izmerili absorbanco pri valovni dolžini 650 nm.

Encim MurA katalizira reakcijo med UDP-NAG in PEP, pri kateri nastane fosfat in UDP-NAG- enolpiruvat. S pomočjo reagenta BIOMOL^® GREEN smo spremljali nastanek fosfata in posredno določili aktivnost encima. Nastali fosfat je tvoril z molibdatom fosfomolibdat, ki se je nato povezal z molekulami malahit zelenega in z njimi tvoril obarvan kompleks. Le temu smo spektrofotometrično določali absorbanco pri 650 nm. V primeru prisotnosti zaviralcev MurA encima, je nastalo manj fosfata, kompleks je bil manj obarvan in absorbanca nižja.

(31)

18

Reakcija: H3PO4 + 12 H2MoO4 → PO4(MoO3)12 3- + 12 H2O + 3 H fosfat + molibdat fosfomolibdat

PO4(MoO3)12 3- + 3MG⁺ → (MG)3PO4(MoO3)12

Fosfomolibdat malahit zeleno obarvan kompleks

3.2.4 Rezidualna aktivnost encima

Zaviralno aktivnost spojine smo podali kot odstotek rezidualne aktivnosti encima (RA). Ta predstavlja razmerje med aktivnostjo encima ob prisotnosti zaviralca in v odsotnosti le tega. Izračunamo jo tako, da absorbanco vzorca delimo z absorbanco kontrole (normalno delujoč encim) in rezultat pomnožimo s 100. Obema absorbancama predhodno odštejemo absorbanco ozadja, kot je prikazano v Enačbi 1.

Enačba 1

(𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑎 𝑣𝑧𝑜𝑟𝑐𝑎 − 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑎 𝑜𝑧𝑎𝑑𝑗𝑎)

(𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑎 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑜𝑟𝑙𝑒 − 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑎 𝑜𝑧𝑎𝑑𝑗𝑎) × 100 % = 𝑅𝐴

3.2.5 Vrednost IC

50

Vrednost IC50 je koncentracija zaviralca, pri kateri je zavrte 50 % aktivnosti encima. Določali smo ga spojinam, pri katerih je bil RA pri izbrani koncentraciji zaviralca manjši od 50 %. Za izračun smo potrebovali vrednosti RA pri sedmih različnih koncentracijah zaviralca. Vrednosti IC50 smo izračunali s pomočjo Hillove enačbe (Enačba 2).

Enačba 2

log ( ^𝑅𝐴

100−𝑅𝐴) = 𝐻 × 𝑙𝑜𝑔𝑐 − 𝐻 × 𝑙𝑜𝑔𝐾𝑑 H … Hillov koeficient

c … koncentracija inhibitorja Kd … konstanta disociacije

Na graf nanesemo neodvisno spremenljivko logaritem koncentracije inhibitorja in odvisno spremenljivko log(RA/(100-RA)), ter dobimo premico z naklonom k in odsekom na y osi n. Naklon k je enak Hillovemu koeficientu H. IC50 izračunamo po Enačbi 3.

(32)

19 Enačba 3

𝐼𝐶₅₀= 10^−𝑛_𝑘 k … naklon premice n … odsek na y osi

(33)

20

4 EKSPERIMENTALNO DELO

4.1 Poskus sinteze 2-bromotiazola – postopek A

Slika 10: Reakcijska shema sinteze spojine 1a.

Mešanico 2-aminotiazola (1 g, 9,8 mmol, 1 ekv.), fosforne kisline (9 mL) in dušikove(V) kisline (4,5 mL) smo ohladili na 10 °C in ji dodali raztopino NaNO3 (0,83 g, 12,4 mmol, 1,2 ekv.) v vodi (4,5 mL).

Mešali smo 45 min in zmes prelili v raztopino CuSO4 (1,97 g, 12,4 mmol, 1,2 ekv.) in NaBr (2,56 g, 24,8 mmol, 2,5 ekv.), ter mešali čez noč na sobni temperaturi (Slika 10). Zmes smo najprej nevtralizirali z 2 M NaOH (100 mL), nato pa še z 4 M NaOH (cca 5 mL). Vodno fazo smo ekstrahirali z diklorometanom (400 mL), nato organsko fazo sprali z vodo (100 mL), nasičeno raztopino NaCl (100 mL) in sušili z Na2SO4. Na TLC smo nanesli izhodno spojino - aminotiazol in organsko fazo, ki naj bi vsebovala produkt. Po TLC analizi (MF: EtOAc/Heksan=1/1) in oroševanju z ninhidrinom produkta nismo zaznali, zato smo reakcijsko zmes zavrgli.

4.2 Poskus sinteze 2-bromotiazola – postopek B

Slika 11: Reakcijska shema sinteze spojine 1b.

2-Aminotiazolu (1 g, 10 mmol, 1 ekv.) smo na sobni temperaturi med mešanjem dodali acetonitril (40 mL), terc-butil nitrit (1,31 mL, 11,0 mmol, 1,1 ekv.) in po delih CuBr2 (3,35 g, 15,0 mmol, 1,5 ekv.), ter mešali čez noč (Slika 11). Zmesi smo dodali 1 M HCl (100 mL), etil acetat (100 mL) in sprali z vodo (2 × 50 mL). Organski fazi smo dodali nasičeno raztopino NaHCO3 (80 mL). Organska in vodna faza se nista ločili, zato smo dodali še nasičeno raztopino NaCl (100 mL) in Na2SO4. Trdno usedlino in neraztopljene organske komponente smo odnučali, v matičnici pa smo dobili ločeni fazi. Vodno fazo smo zavrgli, organsko pa uparili na rotavaporju. Na TLC smo nanesli izhodno spojino, vodno fazo in posušeno organsko fazo. Razvijali smo v mobilni fazi etil EtOAc/Heksan=1/1 ter orosili z ninhidrinom.

(34)

21

4.3 Sinteza derivatov 2-bromotiazola

Slika 12: Shema sinteze spojin 2–7 (substituenti R1 in R2 so prikazani v Tabeli 1).

Tabela 1: Substituenti derivatov 2-bromotiazola sintetiziranih po postopku prikazanem na Sliki 12.

Spojina R

1

R

2

(2) -H

(3) -H

(4) -H

(5) -H

(6) -H

(7) -H

4.3.1 Splošni postopek bromiranja - sinteza spojin 2–7

Tiazol-2-amin (1 ekv.) smo raztopili v acetonitrilu (20 mL) ter mu po kapljicah na ledeni kopeli dodajali terc-butil nitrit (0,7 ekv.). Mešanici smo počasi dodajali CuBr2 (0,2 ekv.) in pustili mešati na ledu čez noč (Slika 12). Ekstrakcijo smo izvedli z etil acetatom (2 × 50 mL) in vodo (2 × 50 mL). Organsko fazo smo sprali z NaCl (100 mL), sušili z Na2SO4, filtrirali, topilo uparili pod znižanim tlakom in produkt do suhega posušili na vakuumski črpalki. Produkt smo čistili s kolonsko kromatografijo.

Modifikacija splošnega postopka: zaradi zelo nizkih izkoristkov, smo pri sintezi spojin 4–7 povečali ekvivalente terc-butil nitrita in CuBr2 (oboje 1,20 ekv.), ter količino acetonitrila (30 mL).

(35)

22

4.3.1.1 Sinteza 2-bromo-4-(terc-butil)tiazola 2

Spojino 2 smo sintetizirali iz 4-(terc-butil)tiazol-2-amina (1 g, 6,4 mmol, 1,0 ekv.) po splošnem postopku bromiranja opisanem zgoraj. Spojino smo očistili s kolonsko kromatografijo (MF:

EtOAc/Heksan=1/1) in izolirali 21 mg produkta.

IUPAC ime 2-Bromo-4-(terc-butil)tiazol

Izgled Temnorjavo olje M = 220,13 g/mol

Tališče /

Izkoristek 14,9 %

TLC Rf (EtOAc/Heksan=1/1)= 0,77

1H NMR

(400 MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1.32 (s, 9H), 6.83 (s, 1H).

13C NMR

(100 MHz, CDCl3) δ (ppm) = 29.87 (s), 35.15 (s), 114.34 (s), 134.59 (s), 167.19 (s).

ESI- HRMS Izračunano za C7H11NBrS [M+(H)]⁺ (m/z): 219,9790.

Izmerjena vrednost: 219,9788.

HPLC Spojina ni stabilna, na HPLC ne vidimo nobenega izrazitega signala, ki bi ustrezal naši spojini.

4.3.1.2 Sinteza 2-bromo-4-(3,4-difluorofenil)tiazola 3

Spojino 3 smo sintetizirali iz 4-(3,4-difluorofenil)tiazol-2-amina (1 g, 3,26 mmol, 1,0 ekv.) po splošnem postopku bromiranja opisanem zgoraj. Spojino smo očistili s kolonsko kromatografijo (MF:

IUPAC ime 2-Bromo-4-(3,4-difluorofenil)tiazol

Izgled Bela trdna snov M = 276,10 g/mol

Tališče TTAL = 52,3–53,2 °C Izkoristek 0,1 %

1H NMR

(400 MHz, CDCl3)

δ (ppm) = 7.18 (ddd, J = 10.1, 8.6, 8.1 Hz, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.55 (dddd, J = 8.7, 4.3, 2.2, 1.4 Hz, 1H), 7.67 (ddd, J = 11.4, 7.6, 2.2 Hz, 1H).

13C NMR

(100 MHz, CDCl3)

δ (ppm) = 115.53 (d, JC,F = 18.9 Hz), 116.69 (d, JC,F = 1.5 Hz), 117.79 (d, JC,F = 17.8 Hz), 122.33 (dd, JC,F = 6.4, 3.6 Hz), 130.42 (dd, JC,F = 6.4, 3.9 Hz), 136.42 (s), 149.08–152.17 (m, 2 × Ar-C), 153.71 (d, JC,F = 2.1 Hz).

ESI-HRMS Izračunano za C9H5BrF2NS [M+(H)]⁺ (m/z): 275,92887.

HPLC tR= 5,33 min (čistost 91,36 %)

(36)

23

4.3.1.3 Sinteza etil-2-bromotiazol-4-karboksilata 4

Spojino 4 smo sintetizirali iz etil 2-aminotiazol-4-karboksilata (2,25 g, 13,1 mmol, 1,0 ekv.) po splošnem postopku bromiranja opisanem zgoraj. Spojino smo očistili s kolonsko kromatografijo (MF:

EtOAc/Heksan=1/4) in izolirali 1,53 g produkta.

IUPAC ime Etil 2-bromotiazol-4-karboksilat

Izgled Bela trdna snov M = 236,09 g/mol

Tališče TTAL = 52,2–52,7 °C Izkoristek 52,7 %

1H NMR

(400 MHz, CDCl3) δ (ppm) = 1.36 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 4.38 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 8.09 (s, 1H).

13C NMR

(100 MHz, CDCl3) δ (ppm) = 14.36 (s), 61.91 (s), 130.92 (s), 136.85 (s), 147.26 (s), 160.15 (s).

ESI- HRMS Izračunano za C6H7BrNO2S [M+(H)]⁺ (m/z): 235,93754.

4.3.1.4 Sinteza etil 2-(2-bromotiazol-4-il)acetata 5

Spojino 5 smo sintetizirali iz etil 2-(2-aminotiazol-4-il)acetata (3 g, 16,1 mmol, 1,0 ekv.) po splošnem postopku bromiranja opisanem zgoraj. Spojino smo očistili s kolonsko kromatografijo (MF:

EtOAc/Heksan=1/6) in izolirali 1,18 g produkta.

IUPAC ime Etil 2-(2-bromotiazol-4-il)acetat

Izgled Brezbarvno olje M = 250,11 g/mol

Tališče /

1H NMR

(400 MHz, CDCl3)

 (ppm) = 1.25 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 3.78 (d, J = 1.0 Hz, 2H), 4.16 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 7.16 (t, J = 0.9 Hz, 1H).

13C NMR

(100 MHz, CDCl3)

 (ppm) = 14.23 (s), 36.86 (s), 61.30 (s), 120.22 (s), 135.56 (s), 149.40 (s), 169.82 (s).

ESI-HRMS Izračunano za C7H9BrNO2S [M+(H)]⁺ (m/z): 249,95319.

4.3.1.5 Sinteza etil 2-bromotiazol-5-karboksilata 6

Spojino 6 smo sintetizirali iz etil 2-aminotiazol-5-karboksilata (3 g, 17,42 mmol, 1,0 ekv.) po splošnem postopku bromiranja opisanem zgoraj. Spojino smo očistili s kolonsko kromatografijo (MF:

EtOAc/Heksan=1/6) in izolirali 18,2 mg produkta.

(37)

24 IUPAC ime Etil 2-bromotiazol-5-karboksilat

Tališče /

1H NMR

(400 MHz, CDCl3)  (ppm)= 1.38 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 4.37 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 8.15 (s, 1H).

13C NMR

(100 MHz, CDCl3)  (ppm) = 14.27 (s), 62.08 (s), 133.27 (s), 141.98 (s), 147.80 (s), 159.99 (s).

4.3.1.6 Sinteza metil 2-(2-bromotiazol-4-il)acetata 7

Spojino 7 smo sintetizirali iz metil 2-(2-aminotiazol-4-il)acetat (4,6 g, 26,7 mmol, 1,0 ekv.) po splošnem postopku bromiranja opisanem zgoraj. Spojino smo očistili s kolonsko kromatografijo (MF:

Petroleter/Eter=2/1) in izolirali 1,62 g produkta.

IUPAC ime Metil 2-(2-bromotiazol-4-il)acetat

Tališče /

TLC Rf (Petroleter/Eter=2/1)= 0,24

1H NMR

(400 MHz, CDCl3)  (ppm) = 3.74 (s, 3H), 3.82 (d, J = 0.9 Hz, 2H), 7.18 (t, J = 0.9 Hz, 1H).

13C NMR

(100 MHz, CDCl3)  (ppm) = 36.79 (s), 52.51 (s), 120.44 (s), 135.82 (s), 149.36 (s), 170.38 (s).

(38)

25

4.4 Sinteza estrov

Slika 13: Shema sinteze estrov 8–13 (substituenti X, R1, R2, R3 in R4 so prikazani v Tabeli 2).

Tabela 2: Substituenti estrov tiazola sintetiziranih po postopku prikazanem na Sliki 13.

Spojina X R1 R2 R3 R4 Komentar

(8) -Br -COOH -H -COOCH3 -H /

(9) -Br -H -COOH -H -COOH Neuspeli poskus sinteze

(10) -NH2 -H -H /

(11) -Br -CH3 -COOH -CH3 -COOH Neuspeli poskus sinteze

(12) -Br -H -COOH -H -COOH Neuspeli poskus sinteze

(13) -Br -H -COOH -H -COOCH3 /

4.4.1 Splošni postopek sinteze spojin 8–13

Aminotiazol ali bromotiazol (1 ekv.) smo suspendirali v brezvodnem MeOH (20 mL) in zmes ohladili na ledeni kopeli. Po kapljicah smo dodali SOCl2 (2 ekv.) in segrevali čez noč pod refluksom (70 °C) (Slika 13). Naslednji dan smo raztopino ohladili na sobno temperaturo in uparili topilo. Ostanek smo raztopili v vodi (2 mL) in nevtralizirali z K2CO3. Vodno fazo smo ekstrahirali z EtOAc (2 × 25 mL).

Združeni organski fazi smo spirali z nasičeno raztopino NaCl (50 mL) in sušili z Na2SO4. Topilo smo uparili pod znižanim tlakom in produkt do suhega posušili na vakuumski črpalki. Produkt smo čistili s kolonsko kromatografijo.

4.4.1.1 Sinteza metil 2-bromotiazol-4-karboksilata 8

Spojino 8 smo sintetizirali iz 2-bromotiazol-4-karboksilne kisline (1,0 g, 4,8 mmol, 1,0 ekv.) po splošnem postopku tvorbe estra opisanem zgoraj. Spojino smo čistili s kolonsko kromatografijo (MF: