Eva GOLJAT
RAZVOJ VEKTORJEV mRNA ZA IZRAŽANJE
MOLEKULSKIH KONSTRUKTOV V CILJNIH CELICAH
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij – 2. stopnja
Ljubljana, 2021
Eva GOLJAT
RAZVOJ VEKTORJEV mRNA ZA IZRAŽANJE MOLEKULSKIH KONSTRUKTOV V CILJNIH CELICAH
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij – 2. stopnja
DEVELOPMENT OF mRNA VECTORS FOR THE EXPRESSION OF MOLECULAR CONSTRUCTS IN TARGET CELLS
M. SC. THESIS Master Study Programmes
Ljubljana, 2021
Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje študija Biotehnologije. Delo je bilo opravljeno na Zavodu Republike Slovenije za transfuzijsko medicino v Ljubljani.
Študijska komisija je za mentorja magistrskega dela imenovala doc. dr. Uroša Rajčevića.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Mojca NARAT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko
Član: doc. dr. Uroš RAJČEVIĆ Lek Pharmaceuticals d.d.
Član: prof. dr. Simon HORVAT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko
Datum zagovora: 25. 8. 2021
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2
DK UDK 602.68:577.21:602.621(043.2)
KG mRNA, imunske celice, in vitro transkripcija, elektroporacija, GFP, CAR-T, Jurkat AV GOLJAT, Eva
SA RAJČEVIĆ, Uroš (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij Biotehnologije, Magistrski študijski program druge stopnje Biotehnologije
LI 2021
IN RAZVOJ VEKTORJEV mRNA ZA IZRAŽANJE MOLEKULSKIH KONTRUKTOV V CILJNIH CELICAH
TD Magistrsko delo (Magistrski študij – 2. stopnja) OP XIII, 57, [3] str., 18 pregl., 20 sl., 2 pril., 72 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Razvoj široko uporabnih gensko spremenjenih imunskih celic je usmerjen v zdravljenje malignih bolezni, med katere spadajo tudi B-celični raki. V ta namen se predvsem limfocite T, ki spadajo med celice, ki jih je težje transformirati, modificira, da izražajo himerni antigenski receptor ali CAR. Ena od metod, ki kaže uspeh pri transformacijah teh celic, je elektrogenski transfer z elektroporacijo, pri čemer do sedaj uporabljene vektorje, kot sta pDNA in retrovirusni vektorji, zamenjuje mRNA, ki je manj toksična. V magistrskem delu smo skušali doseči spreminjanje imunskih celic s prenosom mRNA z elektroporacijo. Najprej smo oba plazmida (s CAR in GFP) pripravili za prepis s PCR in tako linearizirali in pomnožili želen odsek. S komercialnim kompletom smo DNA in vitro prepisali v mRNA in jo v procesu opremili z ustreznimi konstrukti za stabilnost (5'kapa in 3' poli(A) rep) ter jo očistili.
Izbrane celice smo elektroporirali z mikroporatorjem Neon Transfection System v kombinaciji dveh različnih pogojev in pri petih različnih količinah mRNA. Ugotovili smo, da je z elektroporacijo mRNA v celicah Jurkat možno izraziti izbrane molekulske konstrukte, vendar nismo dosegli pričakovane ravni uspešnosti izražanja.
Sklepamo, da je v splošnem za doseg visoke uspešnosti transformacije in preživetja elektroporiranih celic pred eksperimentom nujna dodatna optimizacija elektroporacije kljub uporabi pogojev, navedenih v literaturi. Potrebno bi bilo optimizirati pripravo in kakovost mRNA vektorjev.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 602.68:577.21:602.621(043.2)
CX mRNA, immune cells, in vitro transcription, electroporation, GFP, CAR-T, Jurkat AU GOLJAT, Eva
AA RAJČEVIĆ, Uroš (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI DEVELOPMENT OF mRNA VECTORS FOR EXPRESSION OF MOLECULAR
CONSTRUCTS IN TARGET CELLS DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes) NO XIII, 57, [3] p., 18 tab., 20 fig., 2 ann., 72 ref.
LA sl AL sl/en
AB The development of widely used genetically modified immune cells is aimed at the treatment of malignant diseases including B cell cancers. For these purposes, T lymphocytes, which are among hard-to-transfect cells, are modified to express a chimeric antigen receptor or CAR. One of the methods showing success in transfecting these cells is electrogenic transfer by electroporation, whereby the vectors used so far, such as pDNA and retroviral vectors, are replaced by mRNA, which is less toxic. In the master's thesis, we tried to achieve the modification of immune cells with mRNA transfer by electroporation. Firstly, both plasmids (with CAR and GFP) were prepared for transcription by PCR to linearize and amplify the desired fragment. Using a commercial kit, DNA was transcribed in vitro and equipped with appropriate stability constructs (5'cap and 3'poly(A) tail) and purified.
Selected cells were electroporated with the Neon Transfection System microporator in a combination of two different conditions and five different mRNA quantities. We found that it is possible to express selected molecular constructs by electroporation of mRNA in Jurkat cells, but we did not achieve the expected level of expression success. We conclude that in in general, to achieve high transformation efficiency and survival of electroporated cells before the experiment, additional optimization of electroporation is necessary, despite the use of conditions listed in the literature. The preparation and quality of mRNA vectors should be optimized.
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNADOKUMENTACIJSKAINFORMACIJA ... III KEYWORDSDOCUMENTATION ... IV KAZALOVSEBINE ... V KAZALOPREGLEDNIC ... VIII KAZALOSLIK ... IX OKRAJŠAVEINSIMBOLI ... XI
1 UVOD ... 1
1.1 OPREDELITEVPROBLEMA ... 1
1.1.1 Namen naloge in cilji ... 1
1.1.2 Delovne hipoteze ... 1
2 PREGLED OBJAV ... 2
2.1 IMUNSKECELICEVPERIFERNIKRVI ... 2
2.2 LIMFOCITI ... 2
2.2.1 Označevalci pripadnosti ... 3
2.2.2 Limfociti T ... 3
2.2.2.1 Aktivacija T-limfocitov ... 3
2.2.3 Limfociti B ... 5
2.2.3.1 Krvni raki, povezani z limfociti B ... 5
2.3 VLOGAT-LIMFOCITOVPRIB-CELIČNIHRAKIH ... 6
2.3.1 Mehanizem izmikanja imunskemu sistemu ... 6
2.4 IMUNOTERAPIJARAKA ... 7
2.4.1 Strategije imunoterapije raka ... 7
2.4.1.1 Celična terapija ... 8
2.5 TERAPIJASCAR-T ... 9
2.5.1 Toksičnost terapije s CAR T celicami ... 10
2.6 ELEKTROGENSKITRANSFER ... 11
2.7 MRNAKOTVEKTORZAELEKTROGENSKITRANSFER ... 12
2.7.1 Izražanje mRNA ... 13
2.7.2 Dosedanji uspehi z elektroporacijo CAR mRNA in uporabo le-te ... 14
3 MATERIAL IN METODE ... 15
3.1 MATERIAL ... 15
3.1.1 Laboratorijska oprema ... 15
3.1.2 Kemikalije in spojine ... 16
3.1.3 Plazmidi ... 16
3.1.4 Celice ... 17
3.2 METODE ... 18
3.2.1 Gojenje kultur ... 18
3.2.1.1 Priprava gojišč ... 18
3.2.1.2 Odmrzovanje ... 18
3.2.1.3 Štetje ... 18
3.2.1.4 Namnoževanje celic ... 20
3.2.1.5 Zamrzovanje celic... 20
3.2.1.6 Priprava bakterijskega gojišča ... 21
3.2.2 Transformacija bakterijskih celic ... 21
3.2.2.1 Namnoževanje bakterij ... 21
3.2.3 Izolacija plazmida ... 21
3.2.4 Restrikcijska analiza ... 21
3.2.5 Agarozna gelska elektroforeza (AGE) ... 22
3.2.6 Merjenje koncentracije izoliranega plazmida ... 22
3.2.7 Priprava pDNA za in vitro transkripcijo (IVT) ... 23
3.2.7.1 Konstrukcija oligonukleotidnih začetnikov (OZ) za pomnoževanje DNA ... 23
3.2.7.2 Sestava verižne reakcije s polimerazo (PCR) ... 23
3.2.7.3 Potek PCR ... 23
3.2.7.4 Izolacija PCR produkta in merjenje koncentracije ... 24
3.2.8 Priprava mRNA za elektroporacijo – in vitro transkripcija... 24
3.2.9 Elektroporacija ... 24
3.2.10 Preverjanje uspešnosti ... 27
3.2.10.1 Mikroskopiranje ... 27
3.2.10.2 Priprava celic za analizo s pretočno citometrijo ... 27
3.2.10.3 Pretočna citometrija ... 28
4 REZULTATI ... 29
4.1 SHEMATSKIPOVZETEKDELA ... 29
4.2 GOJENJECELIC ... 29
4.2.1 Zamrzovanje celic ... 29
4.2.2 Kontrola zamrzovanja ... 30
4.2.3 Odmrzovanje celic ... 30
4.3 ANALIZAPLAZMIDA ... 31
4.3.1 Merjenje koncentracije ... 31
4.3.2 Restrikcijska analiza in preverjanje kvalitete z AGE ... 31
4.4 PRIPRAVALINEARNEDNASPCR ... 32
4.4.1 Konstruiranje oligonukleotidnih začetnikov (OZ) ... 32
4.4.2 Analiza PCR-produktov ... 32
4.5 IVT MRNA ... 33
4.6 ELEKTROPORACIJACELICZ MRNA ... 35
4.7 PREGLEDCELICNAMIKROSKOPU ... 35
4.8 ANALIZACELICNAPRETOČNEMCITOMETRU... 37
5 RAZPRAVA ... 42
6 SKLEPI ... 48
7 POVZETEK ... 49
8 VIRI ... 51 ZAHVALA
PRILOGE
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Uporabljena laboratorijska oprema in proizvajalci ... 15
Preglednica 2: Uporabljene kemikalije in njihovi proizvajalci ... 16
Preglednica 3: Sestava 50 μl PCR reakcije (koncentracija in volumen reagentov). ... 23
Preglednica 4: Pogoji PCR-reakcije za pomnoževanje želenega dela plazmida pcDNA3- CAR ... 24
Preglednica 5: Seznam vzorcev, ki smo jih pripravili z dvema različnima pogojema elektroporacije in razmičnimi koncentracijami mRNA-CAR oziroma mRNA-GFP ... 26
Preglednica 6: Vzorci, pripravljeni za analizo na pretočnem citometru z oznakami za uporabljeno barvilo. ... 28
Preglednica 7: Štetje celic pred zamrzovanjem ... 30
Preglednica 8: Štetje kontrole zamrzovanja ... 30
Preglednica 9: Štetje celic 24 ur po odmrzovanju ... 30
Preglednica 10: Koncentracija in čistost izoliranega plazmida pcDNA3-CAR ... 31
Preglednica 11: Koncentracija in čistost izoliranega plazmida pcDNA3-GFP ... 31
Preglednica 12: Koncentracija in čistost dobljenih PCR-pomnožkov plazmida pcDNA3- CAR (PCR-CAR) ... 33
Preglednica 13: Koncentracija in čistost dobljenih PCR pomnožkov plazmida pcDNA3- GFP (PCR-GFP) ... 33
Preglednica 14: Koncentracija in čistost in vitro prepisane mRNA-CAR ... 34
Preglednica 15: Koncentracija in čistost in vitro prepisane mRNA-GFP ... 34
Preglednica 16: Število in koncentracija celic pred pripravo za elektroporacijo ... 35
Preglednica 17: Rezultati PC – viabilnost, delež vseh pozitivnih celic [%] in delež živih pozitivnih celic [%] ... 39
Preglednica 18: Viabilnost kontrol elektroporacije ... 40
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Shema nastanka limfocitov iz HMC (prirejeno po Alberts in sod., 2017). ... 2 Slika 2: Interakcija naivne T-celice in APC ter aktivacijski signali (prirejeno po Punt in sod., 2019) ... 4 Slika 3: Inženirane T-celice za celično terapijo: primerjava med TCR in CAR
receptorjema (June in sod., 2018). T-celice lahko preusmerimo tako, da so specifične za tumorje z dodatkom transgenega TCR (skrajno levo) ali CAR (desne tri skice). CAR so fuzijski proteini, sestavljeni iz ekstracelularnega dela, ki po navadi izvira iz protitelesa, in intracelularne signalne domene, vzete od T-celičnih signalnih proteinov. CAR prve generacije vsebujejo CD3ζ, druge generacije pa imajo kostimulatorno endodomeno (npr.
CD28 ali 4-1BB) spojeno s CD3ζ. CAR tretje generacije imajo dve kostimulatorni domeni, povezani s CD3ζ (June in sod., 2018). scFv, enoveriožni variabilni fragment;
VH, variabilna težka veriga; VL, variabilna lahka veriga. ... 9 Slika 4: Celična terapija s CAR T je povezana s CRS in z nevrotoksičnostjo (prirejeno po June in sod., 2018). ... 10 Slika 5: Mapa plazmida pcDNA3-CAR (SnapGene, 2021). ... 17 Slika 6: Shema hemocitometra z označenimi deli in lokacijo nanosa vzorca (Caprette, 2006). ... 19 Slika 7: Shema mreže v števni komori na hemocitometru (lastni vir, program InkScape).
Celice štejemo samo v rumeno obarvanih kvadratih, sestavljenih iz 16 manjših. Štejejo samo celice, ki se dotikajo oziroma ležijo na zgornjem in levem robu kvadrata
(odebeljena črta). Celic, ki ležijo na spodnjem in desnem robu (črtkana črta) ne
upoštevamo. ... 19 Slika 8: Mapa pcDNA3-CAR z označenim mestom rezanja restrikcijskega encima NruI (SnapGene, 2021) ... 22 Slika 9: Elektroporator Neon Transfection System (Thermo Fisher, 2021)... 25 Slika 10: Povzetek dela – skica (lastni vir, narisano s programom InkScape) ... 29 Slika 11: AGE izoliranih plazmidov in njunih restrikcijskih produktov (100 V/30 min).
Od leve proti desni: DNA lestvica (1), pcDNA3-CAR (2), R-CAR (3), pcDNA3-GFP (4), R-GFP (5). ... 32 Slika 12: Podatki za par OZ (sekvenca, dolžina, lokacija začetka in konca OZ,
temperatura taljenja, vsebnost GC, komplementarnost) ter dolžina pomnožka (vir:
Primer-BLAST). ... 32 Slika 13: Agarozni gel – nerezana plazmida pcDNA3-CAR (2) in pcDNA3-GFP (4) ter njuni PCR produkti: PCR-CAR (2) in PCR-GFP (5). ... 33 Slika 14: Rezultati agarozne gelske elektroforeze PCR-produktov in mRNA vektorjev.
1 – DNA lestvica, 2 – PCR-GFP, 3 – PCR-CAR, 4 – ssRNA lestvica, 5 – mRNA-GFP pred poliadenilacijo, 6 – mRNA-GFP, 7 – mRNA-CAR pred poliadenilacijo, 8 –
mRNA-CAR ... 34
Slika 15: Fluorescenčna mikroskopija (200-kratna povečava) vzorcev, elektroporiranih z različnimi koncentracijami mRNA-GFP (določene v legendi) pod pogoji 1600 V/10 ms/3 pulzi po 24 urah. Merilo na posamezni sliki predstavlja dolžino 100 μm. ... 36 Slika 16: Fluorescenčna mikroskopija (200-kratna povečava) vzorcev, elektroporiranih z različnimi koncentracijami mRNA-GFP (določene v legendi) pod pogoji 1350 V/10 ms/
3 pulzi po 24 urah. Merilo na posamezni sliki predstavlja dolžino 100 μm. ... 37 Slika 17: Primer grafov, ki jih dobimo pri analizi vzorcev na PC. Grafi predstavljajo rezultate za vzorec 8 (20 μg mRNA-CAR, 1350 V/10 ms/3 pulzi). ... 38 Slika 18: Grafa viabilnosti in deležev živih pozitivnih celic pri elektroporaciji različnih koncentracij mRNA-CAR pri pogojih 1600 V/10 ms/3 pulzi in 1350 V/10 ms/3 pulzi s trendno črto. ... 39 Slika 19: Grafa viabilnosti in deležev živih pozitivnih celic pri elektroporaciji različnih koncentracij mRNA-GFP pri pogojih 1600 V/10 ms/3 pulzi in 1350 V/10 ms/3 pulzi ... 40 Slika 20: Graf viabilnosti kontrol elektroporacije ... 41
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
Okrajšava Pomen
ACT Adoptivni T-celični prenos AGE Agarozna gelska elektroforeza
aIgG Protitelo kozjega izvora proti težki in lahki verigi humanega imunoglobulina G s fluorokromom Alexa Fluor 488
APC Antigen predstavitvene celice
ARCA Analog 5' kape (angl. anti-reverse cap analogue)
BCL2 proteina B-celičnega limfoma 2 (angl. B-cell lymphoma 2) BCMA B-celični maturacijski antigen (angl. B-cell maturatuion antigen)
BCR B-celični receptor
bp Bazni pari
B7-1 Periferni membranski protein in kostimulatorni ligand, uradni simbol CD80
B7-2 Periferni membranski protein in kostimulatorni ligand, uradni simbol CD86
CAR Himerni antigenski receptor
CAR T Celice T s himernim antigenskim receptorjem
CD Označevalci pripadnosti (angl. Clusters of Differentiation)
CD19 CAR T Celice T s himernim antigenskim receptorjem, specifičnim za CD19 CD28 Kostimulatorni receptor na celicah T
CD45 Receptor za protein tirozin fosfatazo tipa C (angl. protein tyrosine phosphatase receptor type C); uradni simbol PTPRC
CLL Kronična limfoblastna levkemija
CRS Sindrom sproščanje citokinov (angl. cytokine release sindrome) CTL Citotoksične T-celice
CTLA4 CTL antigen 4 ali s CTL povezan protein 4 (angl. cytotoxic T- lymphocyte associated protein 4)
CVID Splošna pomanjkljivost imunskega sistema (angl. common variable immune deficiency)
DC Dendritična celica
DMSO Dimetilsulfoksid
DNA Deoksiribonukleinska kislina eIF Evkariontski inciacijski faktorji
FBS Fetalni telečji serum (angl. fetal bovine serum) GET Genski elektrotransfer
GFP Zeleni fluorescirajoči protein
HL Hodgkinov limfom
HMC Hematopoetska (krvotvorna) matična celica HPLC Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti
HPV Humani papiloma virus
ICOS Inducibilni kostimulator (angl. inducible costimulator)
Ig Imunoglobulini
IL Interleukin
LB Luria-Bertani medij
mAb Monoklonska protitelesa (angl. monoclonal antibodies)
MHC Poglavitni histokompatibilni kompleks (angl. major histocompatibility complex)
MicroRNA Majhne nekodirajoče ribonukleinske kisline, tudi miRNA
mRNA Informacijska ribonukleinska kislina (angl. messenger ribonucleic acid)
mRNA-CAR In vitro prepisana mRNA, ki nosi zapis za CAR mRNA-GFP In vitro prepisana mRNA, ki nosi zapis za GFP mRNP Informacijski ribonukleoproteinski delec
NHL Ne-Hodgkinov limfom
NK Naravne celice ubijalke (angl. natural killer cells)
NMD Nesmiselni razpad RNA (angl. nonsense-mediated decay)
OX40 Tumor nekrotizirajoči receptor član 4 ali CD134, uradni simbol TNFRSF4
PBMC Periferne krvne mononuklearne celice (angl. peripheral blood mononuclear cells)
pcDNA3-CAR Plazmid na osnovi vektorja pcDNA3 z zapisom za CAR-CD19 pcDNA3-GFP Plazmid na osnovi vektorja pcDNA3 z zapisom za GFP
PCR Verižna reakcija s polimerazo (angl. polimerase chain reaction) pDNA Plazmidna deoksiribonukleinska kislina
PD-1 Protein programirane celične smrti 1 (angl. programmed cell death protein 1), uradni simbol PDCD1
PD-L1 Ligand proteina programirane celične smrti 1 (angl. programmed cell death ligand 1), uradni simbol CD274
PD-L2 Ligand proteina programirane celične smrti 2 (angl. programmed cell death ligand 2), uradni simbol PDCD1LG2
PIC Preiniciacijski kompleks (angl. preinitiation complex) Pre-B Predniške celice v B-liniji po rekombinaciji VH in VL
Pro-B Zgodnje predniške celice v B-liniji
RISC Z RNA inducirani kompleks utišanja genov (angl. RNA-induced silencing complex)
RNA Ribonukleinska kislina
ROS Reaktivne kisikove spojine (angl. reactive oxygen species)
TCR T-celični receptor
TAE Tris-acetat-EDTA (Etilendiamintetraacetat)
TEX Terminalno izčrpane celice T (angl. terminaly exhausted T-cells) TGF-ß Transformirajoči rastni faktor (angl. transforming growth factor beta) TH Celice T-pomagalke (angl. helper T-cells)
TIL Tumor infiltrirajoči limfociti
TLS Sindrom lize tumorja (angl. tumor lysis syndrome)
TMO Tumorsko mikrookolje
TREG Regulatorne celice T
T7 RNA polimeraza
VH Variabilni lokus težke verige Ig (angl. heavy chain variable domain) VL Variabilni lokus lahke verige Ig (angl. light chain variable domain) 4-1BB Tumor nekrotizirajoči faktor član 9 ali CD137, uradni simbol
TNFRSF9
1 UVOD
1.1 OPREDELITEV PROBLEMA
Potencialna biomedicinska uporabnost gensko spremenjenih imunskih celic je zelo raznovrstna. Trenutna ost razvoja gensko spremenjenih imunskih celic je usmerjena v zdravljenje malignih bolezni. Iz periferne krvi pridobljene imunske celice (predvsem limfociti T) se v laboratorijskih pogojih gensko spreminja z izražanjem molekulskih konstruktov z neposrednim ali s posrednim terapevtskim učinkom. Ko imunska celica izrazi protein konstrukta in prepozna antigen ali ligand ciljne celice, lahko opravi svojo prilagojeno imunsko vlogo. Vektorji za izražanje molekulskih konstruktov v imunskih celicah so različni. Trenutno v registriranih tovrstnih terapevtikih prevladujejo retrovirusni vektorji, a njihova uporaba ni brez tveganj za genotoksičnost. Uporaba vektorjev na ravni mRNA (angl.
messenger ribonucleic acid – mRNA ali informacijska ribonukleinska kislina) je za celice celo varnejša kot uporaba pDNA (plazmidna deoksiribonukleinska kislina), a omogoča le prehodno spreminjanje celic. Poleg tega so vektorji mRNA mnogo dovzetnejši za encimsko razgradnjo in fragmentacijo.
1.1.1 Namen naloge in cilji
Namen naloge je razviti vektorje informacijske ribonukleinske kisline ustrezne kakovosti za izražanje molekulskih konstruktov v imunskih celicah.
Cilji naloge:
• iz plazmidov izraziti mRNA ter jo primerno opremiti za transfekcije z elektrogenskim transferjem;
• v limfocite T vnesti molekulske konstrukte z elektrogenskim transferjem in optimirati pogoje elektrogenskega transferja za ustrezne vektorje mRNA in ciljne celice;
• optimirati pogoje manipulacije z vektorji, da ohranijo svojo celovitost;
• dokazati izražanje molekulskih konstruktov.
1.1.2 Delovne hipoteze
Hipoteza 1: Z elektrogenskim prenosom lahko v ciljnih celicah izrazimo molekulske konstrukte na osnovi mRNA.
Hipoteza 2: Izražanje konstruktov lahko dokažemo z molekulskimi in imunološkimi metodami.
2 PREGLED OBJAV
2.1 IMUNSKE CELICE V PERIFERNI KRVI
Humane periferne krvne mononuklearne celice ali PBMC (angl. peripheral blood mononuclear cells) so vse krvne celice z okroglim jedrom (limfociti, monociti, naravne celice ubijalke ali NK in dendritične celice oziroma DC). Iz periferne krvi jih izoliramo s postopkom gradientnega centrifugiranja (Kleiveland, 2015). Delež populacij posameznih celic pri PBMC se razlikuje med posamezniki, vendar se generalne količine limfocitov gibljejo v rangu 70–90 %, monocitov v rangu 10–20 %; najmanj je dendritičnih celic, le 1–
2 %. Populacijo limfocitov predstavlja 70–85 % limfocitov T, 5–10 % limfocitov B in 5–20
% NK celic (Kleiveland, 2015). Vse krvne celice poleg imunskih nastanejo iz ene matične celice, ki jo imenujemo hematopoetska (krvotvorna) matična celica (HMC) (Alberts in sod., 2017). Ta se lahko deli v multipotentno predniško celico ali limfoidno predniško celico, lahko pa se tudi samoobnovi. Predniške celice se nato postopoma razvijajo v vedno bolj specializirane celice, kar privede do nastanka zrelih belih in rdečih krvnih celic ter trombocitov (Chapman in Zhang, 2020). Naloga belih krvnih celic ali levkocitov je boj proti infekcijam, fagocitoza in odstranjevanje debrija. Te naloge se porazdelijo med posamezne podskupine. Pomembne med celicami so tudi DC, ki so migratorne celice in po fagocitozi predstavijo tuje antigene limfocitom (so antigen predstavitvene celice ali APC) in tako sprožijo imunski odziv (Alberts in sod., 2017). Procesiranje antigenov poteka s pomočjo poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa (angl. major histocompatibility complex ali MHC). MHC so transmembranski glikoproteini, ki vežejo peptide, ki jih proizvajajo celice in jih potem izražajo na svoji površini. Poznamo razred I in II (Roche in Cresswell, 2016). Med limfocite (podskupina levkocitov) uvrščamo limfocite B, ki proizvajajo protitelesa, in limfocite T, ki uničujejo celice, okužene z virusi ter regulirajo druge bele krvne celice. Poznamo tudi limfocitom podobne celice – celice NK, ki uničujejo celice določenih tumorjev in okužene celice (Alberts in sod., 2017).
2.2 LIMFOCITI
Limfociti so del pridobljene imunosti. Nastanejo iz predniških celic, ki izvirajo iz kostnega mozga. Celice, ki migrirajo v priželjc, se diferencirajo v limfocite T. V procesu nastanka T- celičnega receptorja (TCR) in B-celičnega receptorja (BCR) se tako razvije specifičnost ter diverziteta limfocitov (LaRosa in Orange, 2008). Shema nastanka je prikazana na sliki 1.
Slika 1: Shema nastanka limfocitov iz HMC (prirejeno po Alberts in sod., 2017).
Multipotentna hematopoetska matična celica
Skupni limfoidni prednik
NK/T celični prednik
Celica NK TIMUS
Celica T
Celica B
2.2.1 Označevalci pripadnosti
Levkociti izražajo različne kombinacije molekul na celični površini, ki lahko odražajo stadije, v katerih so celice, linijsko-specifično diferenciacijo ali stadije aktivacije oziroma inaktivacije. Te molekule lahko zaznavamo z monoklonskimi protitelesi ali mAb. Te skupke antigenov imenujemo označevalci pripadnosti – CD ali Clusters of Diferentiation in so nadaljnjo diferencirani s števili in z znakom za pozitivnost (+) ali negativnost (–). Z uporabo kombinacij specifičnih monoklonskih protiteles lahko določamo subpopulacije B-celic, celic T-pomagalk (TH), citotoksičnih T-celic (CTL) in NK. Nekateri CD antigeni imajo dobro poznane funkcije, medtem ko je za določene ta neznana (Cruse in sod., 2007).
2.2.2 Limfociti T
Limfociti T predstavljajo del pridobljene imunosti z odzivi na patogene, alergene in tumorje.
Na njih sloni postavitev imunskega odziva, homeostaza in imunski spomin. Izvirajo iz predniške celice kostnega mozga, ki migrirajo v priželjc za dozoritev, selekcijo in končni eksport v periferijo (Kumar in sod., 2018). V procesu zorenja celice prerazporejajo genske lokuse TCR in, če je to uspešno, postanejo CD4+ CD8+, čemur sledi njihova pozitivna in negativna selekcija. Timus zapustijo naivni limfociti T – enojno pozitivne: CD4+ (TH) ali CD8+ (CTL) celice. Lahko pa nastanejo tudi druge linije celic, kot so limfoidne dentritične celice, NK-celice, regulatorne celice T (TREG) in druge (Punt in sod., 2019).
Naivni T-limfociti se odzivajo na nove antigene, pridružijo se jim ustrezni spominski limfociti T, ki izvirajo iz prejšnje antigenske aktivacije in skupaj vzdržujejo dolgotrajno imunost, medtem ko TREG nadzorujejo te imunske odzive (Kumar in sod., 2018). TREG lahko identificiramo kot supresorske T-celice, ki zavirajo škodljive učinke THin pomagajo ublažiti ter nevtralizirati imunski odziv. TH igrajo ključno vlogo pri uravnavanju reakcij in homeostaze, spodbujanju imunskega odziva preko interakcije s citokini in stimuliranju efektorske imunske celice (npr. CTL, celice B in makrofage) za odziv na mikroorganizme ali raka (Zaini in Al-Rehaili, 2019).
Aktivirane efektorske celice imajo sicer kratko življenjsko dobo, delež pa jih preživi kot spominske T-celice (Kumar in sod., 2018). Spominske T-celice se nato lahko hitro odzovejo, ko se spet pojavi enak antigen (Xia in sod., 2019). Gre za heterogeno skupino dolgoživečih celic, ki jih prepoznamo po visokem izražanju CD45 in jih naprej delimo v podskupine, ki lahko krožijo ali ostanejo v tkivu (Chan in sod., 2021).
2.2.2.1 Aktivacija T-limfocitov
Po razvoju naivne T-celice vstopijo v krvni obtok in potujejo do perifernega limfatičnega organa, migrirajo skozenj, nato pa se vrnejo nazaj v kri. Ta cikel se ponavlja, dokler ne
srečajo specifičnega antigena. Po srečanju se sproži proliferacija in diferenciacija celic, ki prispevajo k imunskemu odzivu (Janeway in sod., 2001; Pennock in sod., 2013). Antigen in kostimulatorne ligande predstavljajo APC (Kumar in sod., 2018), na celicah T pa je glavni mediator TCR, ki se razlikuje med posameznimi subpopulacijami limfocitov T in je tako odgovoren za njihovo specifičnost (Pennock in sod., 2013). Peptidi na MHC II so predstavljeni CD4+ naivnim T-celicam, peptidi na MHC I pa so predstavljeni CD8+ celicam (Punt in sod., 2019). Pomembni so tudi kostimulatorni receptorji, kot je CD28 ali inducibilni kostimulator (ICOS), ki ojačajo signal in aktivirajo nadaljnje dogodke. Za aktivacijo so potrebni trije signali, ki so prikazani na sliki 2. TCR/MHC interakcija s CD4 in CD8 koreceptorjema predstavljata signal 1. Kostimulacija z drugimi seti molekul, kostimulatorni receptorji na naivni celici (CD28) in kostimulatorni ligandi na APC (CD80/60) predstavljajo signal 2. Prva dva signala skupaj stimulirata kaskado, ki privede do aktivacije transkripcijskih faktorjev in citokinov (signal 3), ki usmerjajo proliferacijo T-celic (IL-2) in diferenciacijo. To so citokini, ki lahko delujejo avtokrino (samoaktivacija celice, ki jih proizvaja) ali parakrino (stimulacija sosednjih celic) (Punt in sod., 2019). Po aktivaciji se subpopulacija CD4+ celic razvije v različne efektorske podskupine celic TH in različne tipe TREG (Kleiveland, 2015). Iz populacije CD8+ celic nastanejo CTL (Punt in sod., 2019).
Efektorske celice nato potujejo na različna mesta in sprožijo odstranjevanje patogena z izločanjem efektorskih citokinov ter citotoksičnih mediatorjev (Kumar in sod., 2018).
Slika 2: Interakcija naivne T-celice in APC ter aktivacijski signali (prirejeno po Punt in sod., 2019)
Pomembne molekule, ki negativno regulirajo T-celično aktivacijo, so koinhibitorni koreceptorji – CTL antigen 4 ali CTLA4 in protein programirane celične smrti 1 ali PD-1 (Nassef Kadry Naguib Roufaiel in sod., 2015). Pomembni so za omejitev nekontrolirane proliferacije T-celic, ki bi lahko vodile v bolezenska stanja (Punt in sod., 2019).
2.2.3 Limfociti B
Limfociti B se razvijejo v kostnem mozgu, vendar dozorijo v perifernih limfatičnih organih (LaRosa in Orange, 2008). Gre za populacijo celic, ki na površini izražajo imunoglobuline (Ig) – receptorje, ki prepoznajo specifične antigenske epitope (LeBien in Tedder, 2008). Z ekspresijo genov težke in lahke verige imunoglobulinov so tako določeni tudi stadiji razvoja.
Zgodnji predniki v B-liniji (Pro-B) pričnejo z rekombinacijo variabilnega lokusa težke verige Ig ali VH, nato pa preide v rekombinacijo variabilnega lokusa lahke verige ali VL – te celice imenujemo Pre-B. Po združenju ustreznih težkih in lahkih verig nastane BCR kot IgM, ki je podvrsta Ig, in tako predstavlja nezrel limfocit B. Nezreli limfociti B nato zapustijo kostni mozeg in migrirajo v vranico, kjer dokončajo svoj razvoj in postanejo zrele celice B (LaRosa in Orange, 2008; Punt in sod., 2019). Po aktivaciji diferencirajo v plazemske celice, ki protitelesa tudi izločajo (Janeway in sod., 2001).
Subpupolacije celic B izražajo vrsto različnih označevalcev pripadnosti. Na vseh celicah iz B-linije je izražen CD19, ki regulira intracelularno transdukcijo signala. Antigen CD20 je značilen za zrele B-limfocite in služi kot kanal za kalcijeve ione (LeBien in Tedder, 2008).
2.2.3.1 Krvni raki, povezani z limfociti B
Poleg avtoimunosti (revmatoidni artritis) in pomanjkljivega imunskega delovanja (Brutonova bolezen, CVID – splošna pomanjkljivost imunskega sistema, hiper IgM sindrom) spadajo med obolenja, povezana z limfociti B, krvni raki – levkemija in limfom (LeBien in Tedder, 2008).
Levkemije nastanejo v celicah v zgodnjih stadijih razvoja, ki poteka v kostnem mozgu in so lahko mielogene ali limfocitne – odvisno od vrste celičnega prednika, od koder izvirajo.
Lahko so akutne (nenaden nastop, hiter razvoj) ali kronične (manj agresivne, počasen razvoj) v odvisnosti od kliničnega napredka (Punt in sod., 2019). Primer je kronična limfoblastna levkemija ali CLL, ki jo karakteriziramo po klonalni ekspanziji majhnih, po izgledu zrelih, CD19+ CD23+ CD5+ B-celic, ki se nabirajo v periferni krvi, kostnem mozgu in limfoidnih organih, kar povzroča limfocitozo, infiltracijo mozga, limfoadenopatijo in splenomegalijo (Kipps in sod., 2017; Darwiche in sod., 2018). Pomemben aspekt CLL je razvoj hipogamaglobulinoanemije, kar povzroča povečano tveganje za okužbe. Celice CLL izražajo višji nivo PD-L1 in PD-L2 (liganda proteina celične smrti 1 in 2), ki zavirata efektorske funkcije T-celic, ki izražajo PD-1, kar privede do nastanka terminalno izčrpanih celic T ali TEX (podrobneje v poglavju 2.3) in zmanjšane funkcije celične imunosti. Trenutno se CLL zdravi sistemsko s kemoterapijo, kemoimunoterapijo (kombinacija kemoterapije in terapevtskih monoklonskih protiteles), inhibitorji BCR signaliziranja in inhibitorji BCL2 ali proteina B-celičnega limfoma 2 (Kipps in sod., 2017).
Limfomi in mielomi se pojavijo v kasnejših stadijih razvoja krvnih celic (po migraciji iz kostnega mozga). Limfomi se razširijo po limfatičnem sistemu in se proliferirajo v sekundarnih limfatičnih organih. Mielomi nastanejo pri nekontrolirani proliferaciji popolnoma diferenciranih B-celic, ki producirajo mutirano obliko protitelesa, ki ga imenujemo protein M (Punt in sod., 2019). Generalno poznamo dva tipa B-celičnih limfomov – Hodgkinov limfom (HL) in ne-Hodgkinov limfom (NHL) (Nassef Kadry Naguib Roufaiel in sod., 2015).
2.3 VLOGA T-LIMFOCITOV PRI B-CELIČNIH RAKIH
Eden glavnih faktorjev za razvoj B-limfomov je supresija imunskega sistema ali imunska pomanjkljivost (Nassef Kadry Naguib Roufaiel in sod., 2015). Ene od pomembnih celic so CD8+ CTL. Večina tumorjev izraža MHC razreda I in so negativni za MHC razreda II. CTL lahko inducirajo uničenje tumorskih celic po prepoznavi peptidnih antigenov, predstavljenih na MHC. Pri številnih študijah v mišjih modelih so dodatno podkrepili idejo, da so CD8+
celice ključni efektorji proti tumorskim celicam (Yu in Fu, 2006).
Glavne dinamične celice v imunskem sistemu so tudi TREG. Ker uravnavajo imunske odzive, bi lahko bile pomembne pri zdravljenju avtoimunih bolezni, preprečevanju zavrnitve alografta, vendar študije pri miših in ljudeh kažejo, da TREG promovirajo napredovanje raka in zmanjšujejo protitumorno imunost. To pomeni, da bi lahko s supresijo TREG podprli imunski odziv na patogene in tumorje (Zaini in Al-Rehaili, 2019). Tako CD8+ kot CD4+
celice lahko prepoznajo tumorjeve antigene in migrirajo do lokacije tumorja. Vendar pri akumulaciji CD4+ celic znotraj tumorskega mikrookolja (TMO) pride do nekakšnega zmanjšanja efektorske funkcije CD8+ celic (Yu in Fu, 2006), saj so v TMO imunosupresivni mehanizmi, ki lahko omejijo obsežnost in moč gostiteljevih citotoksičnih reakcij (Yu in Fu, 2006; Hodi in Dranoff, 2010). TREG inhibirajo CTL in omejujejo efektorske funkcije celic NK v mišjih modelih. Posledica zmanjšanja celic TREG je povečanje z imunostjo posredovanega uničenja tumorja (Hodi in Dranoff, 2010).
2.3.1 Mehanizem izmikanja imunskemu sistemu
Da lahko celice uničijo tumor, morajo prepoznati njegove antigene. Tumorske celice se temu izognejo tako, da zmanjšajo svoj mehanizem antigenskega predstavljanja, ki ga izvajajo s pomočjo MHC I, proteosomskih podenot in transporterjev (Liu in Guo, 2018). Tako je ekspresija tumorjevega antigena zmanjšana, kar lahko privede do povečane stopnje tumorja in metastaze, saj CTL ne morejo več prepoznati tumorjevih antigenov na tumorskih celicah (Vinay in sod., 2015).
Rakave celice lahko direktno povzročijo izčrpanje celic T s spodbujanjem vezave PD-L1, B7-1 in B7-2 (periferna membranska proteina) na proteine PD-1 in CTLA4 na T-celicah ali
povečavo ekspresije PD-L1 in PD-1. Ker je ekspresija PD-L1 pozitivno regulirana z vnetno signalizacijo, onkogeno signalizacijo in posttranslacijsko stabilizacijo, bi povečana regulacija prispevala k izčrpanju celic T (Liu in Guo, 2018). Pri raku lahko celice T postanejo nefunkcionalne kot posledica persistentne izpostavljenosti antigenu. Prepoznamo jih po zmanjšani kapaciteti proliferacije, efektorske funkcije in pretiranega izražanja inhibitornih receptorjev. Ene od predstavnic takšnih celic so izčrpane T-celice ali TEX (Xia in sod., 2019).
Identifikacija tega fenotipa celic je pripeljala do teorije, da je izčrpanje postopoma razvijajoče stanje z različnimi funkcionalnimi in fenotipskimi podstanji (Paijens in sod., 2021).
Še eden od mehanizmov izmikanja imunskemu sistemu je sekrecija raznih imunosupresivnih modulatorjev, kot so TGF-ß (transformirajoči rastni faktor) ali interlevkini iz tumorskih celic v TMO. Te spojine zadušijo funkcijo in/ali dozorevanje DC, kar privede do okvarjenega predstavljanja antigena. Delovanje T celic se lahko zmanjša tudi s spremembo metabolne sestave – znižanje pH, zmanjšanje količine kisika, glukoze in aminokislin, ki promovirajo funkcijo T-celic ter povečanje količine molekul, ki inhibirajo T-celice (Liu in Guo, 2018).
2.4 IMUNOTERAPIJA RAKA
Imunoterapija raka je tip zdravljenja, ki pomaga imunskemu sistemu pri boju proti raku – aktivacija imunskega sistema proti rakavim celicam ali ustvarjanje signalov, ki vodijo imunski sistem v pravo smer (Punt in sod., 2019). Predstavlja primer t. i. natančne medicine – inhibitorji imunskih kontrolnih točk le-te natančno ciljajo; tumor infiltrirajoči limfociti (TIL), TCR T celice in CAR T celice (celice T s himernim antigenskim receptorjem) natančno ubijajo rakave celice preko prepoznave antigena; cepiva za raka pa so pripravljena iz pacientovih dendritičnih celic, tumorne DNA, RNA (ribonukleinske kisline) ali onkolitičnih virusev in tako ponujajo vrsto personalizirane medicine (Liu in Guo, 2018).
2.4.1 Strategije imunoterapije raka
Velik delež strategij za imunoterapijo je v procesu preiskav. Nekatere so že bile odobrene za zdravljenje raka. Strategije lahko razdelimo v molekularno, celično terapijo in terapijo s cepivi. Pri molekularni terapiji se lahko uporablja citokin IL-2 – za spodbujanje rasti T-celic in povečanje avtolognih TIL ali spodbujanje limfocitov, ki izražajo transgene TCR in CAR.
(Liu in Guo, 2018). Za to metodo je značilna tudi uporaba mAb, ki so specifični za markerje, ki jih najdemo samo pri rakavih celicah. Primer takega zdravila je rituximab, ki cilja B- celični marker CD20 in se uporablja za zdravljenje NHL (Punt in sod., 2019). Terapija s cepivi je zaenkrat uporabljena predvsem pri solidnih rakih, kot so raki, ki jih povzroča humani papiloma virus ali HPV (maternični, vulvularni, analni) in rak jeter (hepatitis B virus), za katere so že odobrena cepiva. Cepiva za onkolitične viruse (Epstein-Barr virus,
karcinom Merklovih celic, humani T-limfotropični virus 1, herpes virus) so glavni primer terapevtskih cepiv (Liu in Guo, 2018). Podrobneje se bomo dotaknili celične terapije.
2.4.1.1 Celična terapija
Celična terapija obsega in vitro namnoževanje pacientovih T-celic, specifičnih za tumorski antigen, in njihovo ponovno infuzijo v pacienta; gre za adoptivni T-celični prenos (ali ACT).
Obstajajo tri oblike ACT za imunoterapijo raka; te vsebujejo TIL, TCR T celice in CAR T celice (June in sod., 2018; Rajčević, 2020). TIL lahko izoliramo iz periferne krvi, limfnih žlez ali trdnih tumorjev. Čeprav so TIL prisotni v tumorjih, le-ta ostaja, kar nakazuje, da te celice niso popolnoma zmožne antitumorskih efektorskih funkcij in vivo (Punt in sod., 2019).
V tem kontekstu so periferne krvne celice T boljša izbira. Uporabljamo jih za proizvajanje genetsko spremenjenih T celic - TCR T in CAR T, ki izražajo transgene TCR oziroma CAR (himerni antigenski receptor) (Liu in Guo, 2018).
TCR je sestavljen iz dveh proteinov, ki prepoznavajo antigene, α- in ß-verige, nekovalentno vezane s štirimi CD3 proteini, ki prenašajo signal, δ, γ, ε in ζ (slika 3, levo) (June in sod., 2018; Katz in Rabinovich, 2020). TCR T celice so limfociti T, ki se jim z inženiringom doda afinitetno ojačan T-celični receptor, ki prepozna naravni procesiran peptid, ki ga imajo določene rakave celice. TCR inženirane T-celice so bile uporabljene v številnih zgodnjih stopnjah kliničnih študij melanoma, vendar je njihova zelo kratkotrajna ekspresija transgenih TCR (manj kot en mesec) ogrozila klinični učinek (Rapoport in sod., 2015). Za blokiranje nepričakovanih učinkov terapije bi lahko uporabili humano c-SRC kinazo, ki pri prekomerni ekspresiji na celicah blokira TCR signalizacijo, produkcijo citokinov, degranulacijo in citotoksičnost, medtem ko je ekspresija TCR in vezava na pravilno tarčo ohranjena (Inderberg in sod., 2017).
CAR T celice izražajo CAR, ki v osnovi vsebuje tri elemente: (1) prepoznavno domeno na površini celice; (2) transmembransko domeno; (3) intracelularni efektorski del, ki lahko vsebuje signalne domene za efektorsko celično funkcijo (Katz in Rabinovich, 2020).
Najpogosteje so sestavljeni iz signalne domene TCR ζ (zeta) verige, CD28, OX40 in/ali 4- 1BB ter enoverižni variabilni fragment (scFv, ang. single-chain variable fragment), ki je pridobljen iz variabilnih domen lahkih in težkih verig protiteles. CAR T celice ciljajo površinske proteine ali glikane na tumorskih celicah. Ene izmed celic, sprejete za uporabo, so CD19 CAR T, ki ciljajo CD19 markerje na limfocitih B. Uporabljajo se za zdravljenje akutne limfoblastne levkemije ali difuznega velikoceličnega B-limfoma. (Liu in Guo, 2018).
CAR T premagajo nekatere omejitve TCR, kot je na primer potreba po MHC predstavljanju, identiteti MHC in kostimulaciji. To da celicam protitumorno prednost, saj je eden od glavnih mehanizmov tumorja za izogibanje imunskemu sistemu ravno izguba antigenskega predstavljanja na MHC. Ena od omejitev tehnologije pa je ta, da celice potrebujejo
zunajcelične površinske tarče na tumorskih celicah (June in sod., 2018). Karakteristike TCR in CAR T celic so prikazane na sliki 3.
Slika 3: Inženirane T-celice za celično terapijo: primerjava med TCR in CAR receptorjema (June in sod., 2018).
T-celice lahko preusmerimo tako, da so specifične za tumorje z dodatkom transgenega TCR (skrajno levo) ali CAR (desne tri skice). CAR so fuzijski proteini, sestavljeni iz ekstracelularnega dela, ki po navadi izvira iz protitelesa, in intracelularne signalne domene, vzete od T-celičnih signalnih proteinov. CAR prve generacije vsebujejo CD3ζ, druge generacije pa imajo kostimulatorno endodomeno (npr. CD28 ali 4-1BB) spojeno s CD3ζ. CAR tretje generacije imajo dve kostimulatorni domeni, povezani s CD3ζ (June in sod., 2018). scFv, enoveriožni variabilni fragment; VH, variabilna težka veriga; VL, variabilna lahka veriga.
2.5 TERAPIJA S CAR-T
Rezultati prvotnih kliničnih študij uporabe CAR celic prve generacije niso dali idealnih rezultatov. Spremenjene celice niso obstale v pacientih in tudi protitumorski učinki niso trajali dolgo (Punt in sod. 2019). Kasneje, leta 2011 pa je druga generacija CD19 CAR T, ki vsebujejo kostimulatorne domene, postala model za spremenjene T-celične terapije raka.
Marker CD19 ima lastnosti skoraj popolne tarče. Pogosto in v visoki stopnji se izraža pri B- celičnih malignomih, potreben je za normalen razvoj B-celic pri ljudeh ter se ne izraža drugje kot na linijah B-celic. Uspešno zdravljeni pacienti s CD19 CAR T imajo močno B-celično aplazijo (pomanjkanje celic B), kar se lahko uredi z nadomestno terapijo z intravenoznimi Ig (June in sod., 2018). Nedavni uspehi pri uporabi tega pristopa so privedli do odobritve določenih terapevtskih produktov CAR T v ZDA in Evropi (Katz in Rabinovich, 2020; Chan in sod., 2021). Kontrola nad afiniteto CAR, ciljanje receptorjevih transgenov na specifične lokuse in izbira signalnih molekul so potencialne tehnike za produkcijo ACT, ki bi izboljšale kvaliteto in perzistenco T-celic (Chan in sod., 2021).
Po ligaciji na prepoznani antigen na tarčni celici se CAR dimerizira in postopoma pride do aktivacije signalnih kaskad. Po prepoznavi tarče CAR-i aktivirajo naravne citotoksične signalne poti, ki so prisotne v gostiteljski celici (Katz in Rabinovich, 2020). Večina
Prva generacija CAR Povezovalnik
VL
VH
Tecaj
Druga generacija CAR Tretja generacija CAR
ali
pacientov s ponovljeno levkemijo doseže popolno remisijo po zdravljenju s CD19 CAR T.
Vendar pa sta se pojavili dve obliki odpornosti na to terapijo. Pri pacientih z akutno levkemijo je prišlo do izgube antigenskega epitopa na CD19, ki je drugače tarča terapevtskih celic in tako novega mehanizma izogibanja tumorja imunskemu sistemu. Gre za podoben pojav kot pri terapijah na osnovi TCR T celic. Pri pacientih s CLL pa je odpornost na zdravljenje verjetno posledica neuspešne proliferacije CAR T celic po infuziji (June in sod., 2018).
2.5.1 Toksičnost terapije s CAR T celicami
Kljub uspešnosti v določenih kliničnih študijah je terapija s CAR povezana z resnimi zapleti.
Ti vključujejo nekontrolirano aktivacijo, ekspanzijo, obstojnost ter ubijanje netumorskih celic (Katz in Rabinovich, 2020). Določena stopnja stimulacije imunskega sistema in vnetja je pričakovana po ACT. Pri CD19-, BCMA- in CD22-specifičnih CAR T celicah pa so bili opaženi tudi primeri močnega sindroma sproščanja citokinov (ali CRS, angl. cytokine release syndrome), ki je prikazan na sliki 4. Ta sindrom je lahko hujši od gripi podobnega sindroma, ki je pogost pri terapijah na osnovi TIL in TCR. Resnost sindroma CRS korelira s stopnjo tumorja (June in sod., 2018). Pri uporabi CD19 CAR T lahko dosežemo visoko proliferacijo, kar lahko poleg CRS privede tudi do sindroma lize tumorja (TLS) in nevrotoksičnosti. Po vrhu tega pa lahko B-celični tumorji z mutacijo na CD19 uidejo tej terapiji (Katz in Rabinovich, 2020).
Slika 4: Celična terapija s CAR T je povezana s CRS in z nevrotoksičnostjo (prirejeno po June in sod., 2018).
CRS se je pojavil pri uporabi CD19 ali BCMA CAR T celicami. Ko se CAR T celica poveže z antigenom, pride do izločanja različnih citokinov in kemokinov. Makrofagi in druge celice prirojenega imunskega sistema se aktivirajo in začnejo izločati topne mediatorje. CAR T celice se pogosto pojavijo v cerebrospinalni tekočini. Citokini lahko povečajo permeabilnost topnih mediatorjev in tako omogočajo povečan prehod CAR T celic in drugih limfocitov med celice centralnega živčnega sistema (June in sod., 2018).
2.6 ELEKTROGENSKI TRANSFER
Prvi poskusi genskega transferja s pomočjo elektroporacije datirajo v leto 1982. V zadnjih desetletjih se je oprema razvijala in postajala vedno bolj izpopolnjena. Omogočeno je bilo neodvisno spreminjanje amplitude in dolžine pulza, ki sta pomembna dejavnika pri optimizaciji (Gehl, 2003). Do elektroporacije pride, ko so celice, ki jih postavimo med dve elektrodi, tretirane s pulzom visoke napetosti, ki povzroči začasno disrupcijo membrane (Heiser, 2000). Ta metoda izkorišča lastnosti celične membrane in s pulzi poveča njeno permeabilnost ter tako omogoči prehod molekulam (Lambricht in sod., 2016). Tudi brez zunanjega električnega polja lahko pride do nastanka zelo kratkotrajnih (nanosekunde trajajočih) por. Z izpostavitvijo električnemu polju pa se potrebna energija za nastanek pore zniža. Z vstopom vode se poveča možnost nastanka por in le-te so tudi bolj stabilne, kar omogoča permeabilnost tudi molekulam, ki drugače ne bi mogla preko membrane (Yarmush in sod., 2014). Stopnjo permeabilnosti lahko kontroliramo s spreminjanjem dolžine pulza in številom pulzov (Gehl, 2003).
Elektroporacija je ena najbolj široko uporabljenih fizikalnih metod vnosa informacij v celice.
Je preprosta in hitra ter omogoča transfekcijo velikega števila celic, če so optimalni pogoji določeni (Kim in Eberwine, 2010). Genski elektrotransfer (ali GET) je vedno bolj uporabna metoda prenosa genov zaradi visoke učinkovitosti in relativno nizkih negativnih učinkov.
Ena od možnih aplikacij GET je tudi zdravljenje raka – imunoterapija, cepiva za raka in antiangiogena terapija (Heller R. in Heller L., 2015). Ena od prvih kliničnih študij imunoterapije raka z GET (Daud in sod., 2008) je bila opravljena pri pacientih z metastatičnim melanomom, kjer so plazmid z zapisom za IL-12 injicirali direktno v tumor z elektrodo iz 6 igel.
Medtem ko preživetje celic ni tolikšen problem pri bakterijski transfekciji, pa predstavlja precejšnjo skrb pri transfekciji sesalskih celic (Gehl, 2003). Pri elektroporaciji je potrebno upoštevati veliko parametrov, ki jih je potrebno prilagoditi za vsako celično linijo oziroma vrsto posebej, da dosežemo optimalne pogoje za učinkovito transfekcijo. Pomembna je torej vrsta in velikost celic, uporabljen instrument, amplituda pulza, dolžina pulza, kapaciteta, širina kivete, v kateri transformiramo celice, volumen celične suspenzije, uporabljen pufer, moč električnega polja, temperatura pred in po elektroporacijo (Heiser, 2000; Gehl, 2003).
Optimalni pogoji so lahko odvisni tudi od vrste injiciranega genskega materiala (Lambricht in sod., 2016). Eden od omejujočih dejavnikov uporabe je visoka cena kompletov.
2.7 mRNA KOT VEKTOR ZA ELEKTROGENSKI TRANSFER
mRNA prenaša genetske informacije do ribosomov za sintezo proteinov. Pri evkariontih se DNA nahaja v jedru, medtem ko so ribosomi v citoplazmi, torej mora celična RNA prečkati jedrno ovojnico (Wende in sod., 2019). Večina evkariontske mRNA ima na 5’ koncu strukturo, ki jo imenujemo 5’ kapa in je sestavljena iz metil-7 gvanin nukleotida, povezanega na RNA preko trifosfatne vezi (m7GpppN). Na 3’ koncu ima mRNA rep, ki je sestavljen iz dolgega zaporedja adenozinov, zato mu rečemo poli(A) rep. Njuna naloga je stabilizacija mRNA in stimulacija translacije (Wende in sod., 2019; Tusup in sod., 2019).
V primerjavi z virusnimi vektorji ali pDNA je mRNA varnejša, saj nima sposobnosti za integracijo v genom in omogoča le začasno – episomalno izražanje zapisanega proteina (Van Lint in sod., 2013). Ker ne potrebuje transporta v jedro, je transfekcija mRNA učinkovita tudi v nedelečih se celicah. Je močan terapevtski agens v dendritičnih celicah, ki jih je drugače težko transformirati (Leonhardt in sod., 2014).
Uporaba mRNA za prenos tumorjevih antigenov ima veliko prednosti. Ker zapis vsebuje informacijo celotnega antigena, tako omogoča predstavitev vseh epitopov na MHC molekulah. Prav tako je mogoča fuzija tumorjevih antigenov s signalnimi sekvencami za MHC razreda II. mRNA lahko enostavno proizvedemo v visoki količini in čistosti brez uporabe problematičnih materialov, kot so živalski proteini (Van Lint in sod., 2013).
Plazmid z zapisom za želen protein in regulatorne sekvence je lineariziran, očiščen in prepisan in vitro z RNA polimerazo, ki prepozna promotor T7. Preostanek plazmida se odstrani z DNazo, precipitacije ali kromatografije. Celoten proces v laboratoriju traja dva do tri dni (Kreiter in sod., 2011). Tak vektor je in vitro prepisana mRNA ali IVT (ang. in-vitro transcribed) mRNA. Obstajata dva načina dodajanja kape na mRNA – med transkripcijo, če dodamo analog 5’ kape ARCA (angl. anti-reverse Cap analogue) ali po transkripciji dodamo kapo s pomočjo specifičnih encimov. Zapis za ponavljajoče adenozine oziroma za poli(A) rep je lahko na samem zaporedju DNA in se tako samo prepiše ali pa se 3’poli(A) sekvenca doda posttranskripcijsko s poli(A) polimeraze. Čiščenje mRNA produkta lahko opravimo s HPLC (tekočinska kromatografija visoke ločljivosti), selektivne precipitacije z LiCl ali kolonami s silica membranami (Tusup in sod., 2019).
2.7.1 Izražanje mRNA
Kontrola translacije pri evkariontih je ključna za regulacijo genov med pomanjkanjem hranil, stresom, razvojem in diferenciacijo, funkcioniranjem živčnega sistema, staranjem in boleznijo. Translacijo lahko razdelimo na iniciacijo, podaljševanje, terminacijo in recikliranjem ribosoma (Sonenberg in Hinnebusch, 2009). V evkariontih po transkripciji nastane primarni RNA transkript, ki vsebuje tako kodirajoče (eksoni) in nekodirajoče (introni) sekvence. Pred prepisom v protein se morata oba konca mRNA modificirati –v mRNA dobi na 5’ koncu kapo, na 3’ koncu pa poli(A) rep – introni se izrežejo z encimatsko katalizirano RNA reakcijo izrezovanja. mRNA je nato transportirana iz jedra v citoplazmo (Roberts in Walter, 2017).
Ko mRNA vstopijo v citoplazmo, so prepisane, shranjene za kasnejšo translacijo ali degradirane (Shyu in sod., 2008). mRNA pri poti iz jedra spremljajo razni proteini in majhne nekodirajoče RNA (microRNA ali miRNA) in tako sestavljajo informacijski ribonukleoproteinski delec (ang. messenger ribonucleoprotein particle ali mRNP).
Kombinacija spremljajočih faktorjev določa, kaj se bo zgodilo z mRNA v citoplazmi, urejajo njeno subcelično lokalizacijo, translacijo in razgradnjo (Moore, 2005).
Največ regulacije je na prvi stopnji, ko se ribosomske podenote 40S z metionil tRNA, specializirano za iniciacijo (Met-tRNAi), vežejo na začetni kodon in nastane preiniciacijski kompleks (PIC). Strukture RNA, ki ovirajo nastanek PIC, tako zmanjšajo učinkovitost iniciacije. Ključni za aktivacijo vezave PIC so evkariontski iniciacijski faktorji (eIF), ki prepoznajo strukturo kape na 5’ koncu ali poli(A) repa na 3’ koncu. Na tem koraku lahko zmanjšamo translacijo z inaktivacijo eIF. Še eden od možnih mehanizmov preprečevanja iniciacije translacije je zmanjšanje aktivnosti eIF, ki stimulirajo prihod Met-tRNAi do 40S podenote (Sonenberg in Hinnebusch, 2009).
Dva od regulatornih mehanizmov, ki določata usodo mRNA, sta nesmiselni mRNA razpad (angl. nonsense-mediated decay ali NMD) in microRNA-posredovano utišanje ekspresije gena (Shyu in sod., 2008). NMD je kontrolna pot, ki selektivno degradira RNA, ki vsebuje zgodnji terminacijski kodon (angl. premature termination codon ali PTC) ali drug signal, ki aktivira sistem (npr. nenavadno dolge 3’UTR regije) in jih odstrani iz transkriptoma. Proces vodi od RNA odvisna helikaza in ATPaza, ki se veže na mRNA na tarče NMD (Kurosaki in sod., 2019). Translacijo lahko regulirajo tudi miRNA, ki so pomembni regulatorji genske ekspresije in funkcije na posttranskripcijskem nivoju. miRNA se združi s proteinskim kompleksom, kar skupaj imenujemo z RNA-inducirani kompleks utišanja genov (RISC), ki tarčno inhibira ekspresijo proteinov (Sonenberg in Hinnebusch, 2009). Poleg regulacije ekspresije preko inhibicije translacije lahko povzročijo tudi hitro razgradnjo tarčne mRNA in tako indirektno zmanjšajo količino proteina (Shyu in sod., 2008).
Eden od pomembnih vplivov na ekspresijo mRNA ima poli(A) rep. Po eni strani izboljša stabilnost mRNA in s tem produkcijo proteina, na drugi strani pa deadenilacija (skrajšanje poli(A) repa) upočasni translacijo ali jo celo popolnoma prepreči. Pri evkariontih lahko najdemo več različnih deadenilaz (Wiederhold in Passmore, 2014).
2.7.2 Dosedanji uspehi z elektroporacijo CAR mRNA in uporabo le-te
V študiji iz leta 2010 (Zhao in sod.) so preverjali učinkovitost CAR T celic, pripravljenih z elektroporacijo avtolognih limfocitov T z IVT mRNA. Ugotovili so, da je receptor možno zaznati do enega tedna po GET. Študijo so opravili na laboratorijskih miših z intraperitonealnimi tumorji, kjer so pripravljene terapevtske celice vbrizgavali na par dni, direktno v tumor, dvakrat tedensko, dva tedna. Čeprav so opazili znatno zmanjšanje tumorja, se je sčasoma ponovno pojavil. Kljub ponovnemu tretiranju s celicami je tumor vseeno napredoval.
Maus in sod. so leta 2013 izvedli prvo humano študijo za testiranje varnosti na mezotelin usmerjenih CAR T celic, ki so jih pripravili z elektroporacijo mRNA. CAR se iz mRNA izraža samo prehodno, saj se ne vgradi v genom in se lahko tako v primeru negativnih učinkov samo ustavijo infuzije ter posledično vsi učinki izzvenijo. V raziskavi so sodelovale 4 osebe. Od vseh 21 infuzij terapevtskih celic v 4 paciente so bile vse, razen ene, dobro sprejete. Po eni od infuzij je pri pacientu prišlo do anafilaktičnega šoka.
Leta 2011 je bila objavljena študija Almåsbak in sod., v kateri so prav tako preučevali transformacijo T-celic s CAR mRNA. Pridobili so periferne krvne limfocite iz pacientov z levkemijo in limfomom, ter levkemično celično linijo SupB15. Izolirane celice so ekspandirali in pripravili za elektroporacijo z mRNA z zapisom za CD19 CAR. Več kot 94
% preživelih elektroporiranih celic je izražalo ta receptor. Aktivnost transformiranih celic so nato testirali na celični liniji SupB15. Celice so pokazale tarčno specifičnost proti CD19+
celicam.
3 MATERIAL IN METODE 3.1 MATERIAL
3.1.1 Laboratorijska oprema
Preglednica 1: Uporabljena laboratorijska oprema in proizvajalci
Aparature in pripomočki Proizvajalec
Celični inkubator HERAcell Inkubator
Celični inkubator
Mikrobiološka zaščitna komora Brezprašna komora (VR1) Hladilnik (4 °C)
Zamrzovalnik (–20 °C) Zamrzovalnik (–20 °C) Zamrzovalnik (–80 °C) Centrifuga
Centrifuga s hlajenjem (CR4i Jouan) Mikrocentrifuga
Stresalnik (vorteks)
Stresalnik (MaxQ™ 4000 Benchtop Orbital Shaker) Invertni mikroskop
Invertni fluorescenčni mikroskop s kamero Nikon eclipse Ti-S Spektrofotometer
Tehtnica
Mikrocentrifugirke 0,2 ml, 0,5 ml, 1,5 ml in 2 mL Centrifugirke 15 mL in 50 ml
Pipete (0,1–2,5 μl, 1 – 10 μl, 10 – 100 μl, Pipetni nastavki
Kivete Steklene čaše Erlenmajerice
Steklenice s pokrovi 150ml
Hemocitometer z objektnim steklom Mikrovalovna pečica
Zaščitna halja Sterilne rokavice Kadička za elektroforezo Plastični glavnik za elektroforezo Elektroforeza
PCR-naprava (96-well thermal cycler) Stojalo za centrifugirke
Gojitvene posode s filtri (površina 25 in 75 cm^2) Gojitvene plošče s 6,12 in 24 vdolbinami
pH-meter sterilne škarje sterilna pinceta permanentni marker
Pretočni citometer CYTEK Aurora Thermo shaker
UVP BioDoc-It Imager
HERAcell – thermoscientific Thermo electron coorporation Panasonic
Iskra pio d. o. o.
Holten LaminAir Sanyo Electric Co Sanyo Biomedical Freezer Angelantoni industrie
Panasonic ultra low temp freezer Eppendorf
Thermo Electron Industries SAS Eppendorf
IKA
Thermofisher Scientific Olympus optical co, ltd.
Nikon Eppendorf Tehtnica železniki Eppendorf VWR Eppendorf Eppendorf Eppendorf Simax Simax Wheaton Bright-Line Zanussi Medical MaiMed BIO-RAD Bio-rad Bio-rad
Applied Biosystems – Veriti Eppendorf
Sigma VWR
Mettler Toledo ZTM
ZTM Pilot Cytek Biosan Analytik Jena
3.1.2 Kemikalije in spojine
Preglednica 2: Uporabljene kemikalije in njihovi proizvajalci
Kemikalija Proizvajalec
LB dH2O Agar Agaroza
Sodium chloride (natrijev klorid)
Tryptone enzymatic digest from casein (tripton) Select Yeast extract (kvasni ekstrakt)
10-kratni TAE
Barvilo Midori Green Advance Komplet Qiagen Plasmid Midi
Komplet FastGene Gel/PCR extraction kit
Komplet za čiščenje PCR produktov – Wizard SV Gel and PCR Cleanup system
Q5 polimeraza Q5 reakcijski pufer dNTP
Sterilna voda brez nukleaz Restrikcijski encim NruI NEBuffer 3.1 (10 x) Komplet RNeasy
Komplet za in vitro transkripcijo (Mix T7 RNA polimerase.
2xARCA/dNTP mix, DNase I, Poly(A) polimerase, Poly(A) polimerase reaction buffer, LiCl)
70-odstotni etanol RPMI
penicilin streptomicin DMEM tripsin 1-kratni PBS FBS
L-glutamin DMSO
0,2-odstotni Nigrozin Barvilo 7-ADD
Humano protitelo (IgG) proti človeškemu IgG (H+L) Alexa Fluor 488 (koncentracija 2mg/ml)
RNAzap RNA ladder FastRuler HR
6-kratni Purple DNA dye 2-kratni RNA dye
Sigma Aldrich ZTM
Sigma Aldrich Sigma Aldrich Sigma
Fluka analytical Sigma
invitrogen Nippon genetics Qiagen
Nippon Genetics Promega NEB NEB NEB NEB NEB NEB Qiagen NEB
ZTM Gibco Sigma Sigma ZTM Gibco ZTM Gibco Gibco Gibco ZTM invitrogen invitrogen NEB NEB
ThermoFisher NEB
NEB
3.1.3 Plazmidi
Pri delu smo uporabljali plazmide na osnovi vektorja pcDNA3, ki smo jih dobili iz Odseka za sintezno biologijo in imunologijo na Kemijskem inštitutu v Ljubljani. Eden od plazmidov je imel zapis za drugo generacijo CAR (CD19), drug pa zapis za zeleni fluorescentni protein
(GFP). Plazmid pcDNA3-CAR je velikosti 6,9 kb, medtem ko je plazmid z zapisom za GFP nekoliko manjši – približno 6,1 kb. Mapa plazmida pcDNA3-CAR je prikazana na sliki 5.
Glavni del plazmida, relevanten za našo delo, se nahaja od T7 promotorja (označen z rdečo puščico) do prvega terminatorja (označen z modro puščico).
Slika 5: Mapa plazmida pcDNA3-CAR (SnapGene, 2021).
3.1.4 Celice
Pri delu smo uporabljali celično linijo Jurkat, ki smo jih dobili iz Kemijskega Inštituta v Ljubljani. Celična linija Jurkat je ena od levkemičnih celičnih linij, producirana v Centru za raziskovanje raka Fred Hutchinson v ZDA. Gillis in Watson sta odkrila, da so celice Jurkat robustni proizvajalci IL-2 po stimulaciji s fitohemaglutininom. Celični klon E6-1, ki je
sčasoma postal standardna celična linija Jurkat, sta pridobila Weiss in Stobo (Abraham in Weiss, 2004). Prednost uporabe celičnih linij v raziskavah je njihova homogenost in ponovljivost doseženih rezultatov (Segeritz in Vallier, 2017). Uporabljajo se za študije T- celičnega signaliziranja in levkemij ter spadajo med celične linije, ki jih je težje transformirati (Jordan in sod., 2008).
3.2 METODE
3.2.1 Gojenje kultur 3.2.1.1 Priprava gojišč
Za gojenje celične linije Jurkat smo uporabljali kompletno gojišče RPMI. Za pripravo gojišča z 10-odstotnim FBS smo zmešali 103,5 ml nekompletnega gojišča RPMI-1640, 11,5 ml FBS, 1,2 ml L-glutamina in 0,4 ml vsakega od dveh antibiotikov - penicilina in streptomicina. Gojišče z 20-odstotnim FBS je vsebovalo 91,5 ml nekompletnega gojišča, 23,5 ml FBS in enake količine L-glutamina ter antibiotikov kot pri gojišču z 10-odstotnim FBS. Takoj pred uporabo gojišč smo le-te ogreli na 37 °C.
3.2.1.2 Odmrzovanje
Odmrzovanje celic je potekalo sterilno v brezprašni komori. Pred odmrzovanjem celic smo za vsako ampulo v sterilno 50 ml centrifugirko pripravili 20 ml hladnega, za celico ustreznega, nekompletnega gojišča. Ob komori smo pripravili čašo z vodo, ki je imela 37
°C. Ampulo z zamrznjenimi celicami smo delno potopili v mlačno vodo in jih s krožnimi gibi talili toliko časa, da je v sredini ampule ostal majhen kos še vedno zamrznjenih celic.
Ampulo smo razkužili z etanolom in jo vnesli v aseptični prostor komore. S pipeto smo vsebino ampule prenesli v prej pripravljeno centrifugirko. Preostali košček zamrznjenih celic smo raztopili z 1 ml nekompletnega gojišča in tako iz ampule prenesli čim več celic.
Falkonko smo centrifugirali 6 minut pri 1500 rpm in nato odstranili supernatant. S tem postopkom odstranimo krioprotektant DMSO, ki je toksičen za celice pri daljši izpostavljenosti na 37 °C (Hunt, 2019). Pelet smo resuspendirali v ustreznem volumnu kompletnega gojišča. Za gojitveno posodo s filtrom in s površino 25 cm2 smo uporabili 7 ml gojišča. Celice smo pogledali pod invertnim mikroskopom in jih prešteli, da smo preverili uspešnost odmrznitve. Gojili smo jih v inkubatorju s 37 °C in 5 % CO2 atmosfero ter po potrebi precepljali na dva do tri dni.
3.2.1.3 Štetje
Za štetje celic smo uporabljali hemocitometer, ki je sestavljen iz steklene ploščice ter krovnega stekla (slika 6). Ploščica ima dve števni komori, ki imata narisano mrežo za štetje celic. Mreža je sestavljena iz devetih kvadratov s površino 1 mm2. Ko števno komoro
pokrijemo s krovnim steklom na pritrdilne nosilce, je le-ta 0,1 mm nad mrežo, kar nam da volumen posameznega kvadrata 10-4 ml. Celice štejemo samo v kotnih kvadratih, ki so sestavljeni iz 16 manjših kvadratov. Pri tem pazimo na celice, ki so na robovih kvadratov – upoštevamo le dva robova od štirih in pri tem so števne le celice, ki so na izbranih dveh robovih (slika 7). Za štetje celice barvamo z 0,2-odstotnim barvilom Nigrozin in jih pri tem tudi ustrezno redčimo. Barvilo prehaja le v mrtve celice, ki se pri tem temno obarvajo.
Redčitev je števna in najbolj zanesljiva, če je celokupno število celic v 16 manjših kvadratih med 50 in 200 (Caprette, 2006).
Slika 6: Shema hemocitometra z označenimi deli in lokacijo nanosa vzorca (Caprette, 2006).
Slika 7: Shema mreže v števni komori na hemocitometru (lastni vir, program InkScape). Celice štejemo samo v rumeno obarvanih kvadratih, sestavljenih iz 16 manjših. Štejejo samo celice, ki se dotikajo oziroma ležijo na zgornjem in levem robu kvadrata (odebeljena črta). Celic, ki ležijo na spodnjem in desnem robu (črtkana črta) ne upoštevamo.
Celice v gojišču najprej dobro premešamo, nato pa sterilno odvzamemo vzorec za štetje (0,5 ml). Na podlagi pričakovane koncentracije celic vzorec ustrezno redčimo z 0,2-odstotnim Nigrozinom. Mešanico dobro premešamo nato pa nanesemo 10 μl na vsako stran hemocitometra. S tipsom pipete se naslonimo na rob krovnega stekla in počasi iztisnemo vzorec. Zaradi kapilarnega toka se naš vzorec enakomerno porazdeli po prostoru med krovnim steklom in števno površino ploščice. Celice smo prešteli pod mikroskopom in izračunali koncentracije po spodnjih formulah.
cž = (∑nž/8) × R × 104 … (1)
