UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO
MAGISTRSKO DELO
Aleksandra Uzar
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO
MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE BIOKEMIJA
Priprava in biokemijska karakterizacija rekombinantnih egerolizinov s podaljšanim N-koncem
MAGISTRSKO DELO
Aleksandra Uzar
MENTOR: prof. dr. Gregor Anderluh SOMENTOR: doc. dr. Miha Pavšič
Ljubljana, 2021
IZJAVA O AVTORSTVU
magistrskega dela
Spodaj podpisana Aleksandra Uzar sem avtorica magistrskega dela z naslovom: Priprava in biokemijska karakterizacija rekombinantnih egerolizinov s podaljšanim N-koncem.
S svojim podpisom zagotavljam, da:
je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof. dr.
Gregorja Anderluha in somentorstvom doc. dr. Miha Pavšiča;
sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;
se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorskih in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3), Ur. l. RS, št. 16/2007);
sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;
je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.
V Ljubljani, 05.12.2021 Podpis avtorice:
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Biokemija.
Delo je bilo opravljeno na Kemijskem inštitutu pod skrbništvom Tomaža Šviglja, mag.
biotehnol.
Senat UL FKKT je za mentorja imenoval prof. dr. Gregorja Anderluha in za somentorja doc. dr. Miho Pavšiča.
Recenzenta: doc. dr. Gregor Gunčar; izr. prof. dr. Marko Dolinar
Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela Predsednik komisije: izr. prof. dr. Marko Dolinar,
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Član: doc. dr. Gregor Gunčar,
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Član: doc. dr. Miha Pavšič,
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo
Član: prof. dr. Gregor Anderluh, Kemijski inštitut
Zahvala mentorju prof. dr. Gregorju Anderluhu za številne nasvete, vodenje pri opravljanju magistrskega dela ter kritičen in temeljit pregled končnega magistrskega dela.
Zahvala delovnemu mentorju Tomažu Šviglju za pomoč in vodenje med laboratorijskim delom, nezamenljive strokovne napotke in dragocen čas, ki je bil namenjen pomoči in vodenju. Zahvala recenzentoma izr. prof. dr. Marku Dolinarju in doc. dr. Gregorju Gunčarju za pregled magistrskega dela.
Navsezadnje hvala družini in prijateljem za podporo in spodbudo med študijem.
Priprava in biokemijska karakterizacija rekombinantnih egerolizinov s podaljšanim N-koncem
POVZETEK
Egerolizini so relativno majhni proteini (15–20 kDa) z značilnim zvitjem s prevladujočimi β-strukturami. Predstavniki družine so prisotni v mnogih taksonomskih skupinah, največ pa jih najdemo pri glivah. Kljub relativno široki taksonomski porazdelitvi je le nekaj egerolizinov natančno raziskanih.
Biološka vloga egerolizinov pri glivah še vedno ni popolnoma razjasnjena. Trenutno obstaja le hipotetičen nabor možnih bioloških vlog. Glede na znane podatke verjetno delujejo med rastjo in razvojem organizma ali igrajo pomembno vlogo pri obrambi in preživetju organizmov. Značilnost nekaterih egerolizinov je, da delujejo hemolitično in citolitično, a v nekaterih primerih do aktivnosti pride šele ob vezavi partnerskega proteina MACPF. Opažena je bila še sposobnost vezave lipidov, pri tem pa se specifičnost vezave na določeno vrsto lipida med različnimi egerolizini razlikuje.
V sklopu tega dela smo obravnavali štiri egerolizine z neobičajnim N-končnim podaljškom iz različnih glivnih organizmov. Zanimivi so predvsem zato, ker so na podlagi zaporedja drugačni kot večina ostalih egerolizinov. Raziskovali smo, kako N- končni podaljšek vpliva na strukturo in funkcijo egerolizinov. Rezultate smo primerjali z znanim egerolizinom OlyA (ostreolizin A) in z aktinoporinom EqtII (ekvinatoksin II), katerega N-končno zaporedje z motivom α-vijačnice pomembno vpliva na njegovo citolitično aktivnost.
Z bioinformacijsko analizo smo napovedali in preučili strukturne modele tarčnih egerolizinov ter nekatere druge biokemijske lastnosti. Predvideli smo, da imajo štirje egerolizini: fusver, fusgra, phiatt in traver podaljšan N-konec z napovedano strukturo α- vijačnice. Ta je pri egerolizinih fusver, fusgra, phiatt amfipatična in bi lahko služila vezavi v membrano. Pripravili smo vse štiri egerolizine in pokazali, da noben od njih ni hemolitičen, niti se ne veže na različne liposome. Za namen določitve strukture, smo egerolizine poskusili kristalizirati, kar nam v izbranem naboru kristalizacijskih pogojev ni uspelo.
Ključne besede: egerolizin, podaljšan egerolizin, lipidne membrane, bioinformacijska analiza, ostreolizin A, ekvinatoksin II
Preparation and biochemical characterization of recombinant aegerolysins with an N-terminal extension
ABSTRACT
Aegerolysins are relatively small proteins (15–20 kDa) with characteristic β-structural fold. Representatives of the aegerolysin protein family are found in many taxonomic groups; however, they are most commonly found in fungi. Despite a relatively broad taxonomic distribution, only a few aegerolysin-like proteins have been thoroughly researched.
The biological role of aegerolysins in fungi is still not fully elucidated. Currently, there is only a hypothetical set of possible biological roles. According to known data, they are likely to act during the growth and development of the organism and/or they play an important role in the defence and survival of the organisms. Some aegerolysins are known to have hemolytic and cytolytic activity, but in most cases that activity occurs only upon interaction with a partner MACPF-domain protein. The ability to bind lipids has also been observed, but the specificity of binding to a particular type of lipid varies between representative proteins.
As part of this work, we considered four fungal aegerolysins with a specific N-terminal extension. They are interesting mainly because of their difference from most aegerolysins in terms of the sequence. We investigated how the N-terminal extension affects the structure and function of aegerolysins. The results were compared to the known aegerolysin OlyA (ostreolysin A) and to actinoporin EqtII (equinatoxin II), whose N- terminal α-helix structure significantly affects its cytolytic activity.
Using bioinformaticc analysis, we predicted and studied structural models of target aegerolysins and some other biochemical properties. We predicted that four aegerolysins:
fusver, fusgra, phiatt, and traver have an elongated N-terminus with a predicted α-helix structure. This is amphipathic in the case of aegerolysin fusver, fusgra, phiatt and could potentially bind to the membrane. We prepared and purified all four aegerolysins and showed that none of them were hemolytic, nor did they bind to different liposomes. For the purposes of determining the structure, we tried to crystallize aegerolysins. We were not able to achieve the aegerolysins crystallization in the selected set of crystallization conditions.
Keywords: aegerolysin, extended aegerolysin, lipid membranes, bioinformatic analysis, ostreolysin A, equinatoxin II
KAZALO
1 UVOD ... 1
1.1 POROTVORNITOKSINI ... 1
1.1.1 Egerolizinska družina proteinov ... 1
1.1.2 Naddružina proteinov MACPF/CDC ... 6
1.1.3 Aktinoporini ... 7
1.2 LIPIDNEMEMBRANEINNASTANEKPORE ... 7
1.2.1 Zgradba in funkcije lipidnih membran ... 7
1.2.2 Eritrocitna membrana ... 8
1.2.3 Liposomi ... 9
1.2.4 Nastanek in lastnosti por ... 10
1.3 BIOTEHNOLOŠKIPOTENCIALEGEROLIZINOV ... 12
2 NAMEN DELA IN HIPOTEZE ... 13
3 MATERIALI ... 15
3.1 MATERIALIZAIZVEDBOMOLEKULSKEGAKLONIRANJA ... 15
3.1.1 Vektorji in oligonukleotidi... 15
3.1.2 Encimi ... 18
3.1.3 Agaroza in elektroforezni standard ... 19
3.1.4 Kompleti reagentov ... 20
3.1.5 Pomembnejša laboratorijska oprema za izvedbo molekulskega kloniranja ... 20
3.2 MATERIALIZADELOZBAKTERIJSKIMIKULTURAMI ... 21
3.2.1 Bakterijske kulture in sevi ... 21
3.2.2 Bakterijska gojišča ... 21
3.2.3 Kemikalije za delo z bakterijskimi kulturami ... 22
3.2.4 Pomembnejša laboratorijska oprema za delo z bakterijskimi kulturami ... 22
3.3 MATERIALIZAANALIZOIZRAŽANJAINIZOLACIJOREKOMBINANTNIH PROTEINOV ... 22
3.3.1 Materiali za NaDS-PAGE ... 22
3.3.2 Materiali za afinitetno kromatografijo in gelsko filtracijo ... 23
3.3.3 Pomembnejša laboratorijska oprema izolacijo rekombinantnih proteinov ... 24
3.4 MATERIALIZAFUNKCIJSKEINSTRUKTURNEŠTUDIJE/TESTE ... 24
3.4.1 Materiali za teste hemolize ... 24
3.4.2 Materiali za pripravo MLV in proteinski sedimentacijski test ... 24
3.4.3 Aparatura za merjenje cirkularnega dikroizma ... 25
3.4.4 Materiali za kristalizacijo proteinov ... 25
4 METODE ... 27
4.1 BIOINFORMACIJSKAANALIZA ... 27
4.2 MOLEKULSKOKLONIRANJE... 29
4.2.1 Izolacija plazmidne DNA ... 29
4.2.2 Rezanje vektorjev pET-24a-egerolizin z restrikcijskimi endonukleazami ... 29
4.2.4 Ligacija izoliranih fragmentov DNA v pET-24a-TEV ... 30
4.2.5 Restrikcijska analiza pET24a-egerolizin in pET-24a-TEV-egerolizin ... 31
4.2.6 Določanje nukleotidnega zaporedja ... 31
4.3 DELOZBAKTERIJSKIMIKULTURAMI ... 32
4.3.1 Prekonočna kultura ... 32
4.3.2 Transformacija kemično kompetentnih bakterijskih celic ... 32
4.3.3 Indukcija izražanja rekombinantnih proteinov z IPTG ... 32
4.3.4 Priprava vzorcev za analizo izražanja in izolacijo proteinov ... 33
4.4 ANALIZAIZRAŽANJAINIZOLACIJAREKOMBINANTNIHPROTEINOV .... 33
4.4.1 Ločevanje in detekcija rekombinantnih proteinov z NaDS-PAGE ... 33
4.4.2 Izolacija rekombinantnih proteinov z nikljevo afinitetno kromatografijo ... 34
4.4.3 Proteolitična cepitev rekombinantnih proteinov s proteazo TEV ... 35
4.4.4 Čiščenje rekombinantnih proteinov z gelsko filtracijo ... 36
4.5 FUNKCIJSKEŠTUDIJE ... 36
4.5.1 Priprava eritrocitov in protokol testa hemolize ... 36
4.5.2 Priprava MLV in proteinski sedimentacijski test ... 38
4.5.3 Test temperaturne stabilnosti z merjenjem cirkularnega dikroizma ... 39
4.5.4 Kristalizacija proteinov in kristalizacijske raztopine... 39
5 REZULTATI IN RAZPRAVA ... 41
5.1 BIOINFORMCIJSKAANALIZA ... 41
5.2 MOLEKULSKOKLONIRANJE... 49
5.2.1 Restrikcijska analiza prisotnosti vključkov v vektorjih ... 49
5.3 ANALIZAIZRAŽANJAINIZOLACIJAREKOMBINANTNIHEGEROLIZINOV ... 51
5.3.1 Izolacija rekombinantnega egerolizina fusver ... 51
5.3.2 Izolacija rekombinantnega egerolizina traver ... 54
5.3.3 Izolacija rekombinantnega egerolizina phiatt ... 58
5.3.4 Izolacija rekombinantnega egerolizina fusgra ... 61
5.4 REZULTATIFUNKCIJSKIHŠTUDIJ ... 64
5.4.1 Rezultati testa hemolize ... 64
5.4.2 Rezultati vezave rekombinantnih egerolizinov na pripravljene MLV... 66
5.4.3 Rezultati testa temperaturne stabilnosti in cirkularnega dikroizema ... 71
5.4.4 Rezultati kristalizacije rekombinantnih egerolizinov ... 73
6 ZAKLJUČEK ... 77
7 LITERATURA ... 79
8 PRILOGE ... 83
8.1 SHEMEVEKTORJEV ... 83
8.2 NUKLEOTIDNOZAPOREDJEVEKTORJA PET-24A-TEV ... 84
8.3 NAPOVEDANISTRUKTURNIMODELI ... 86
SEZNAM UPORABLJENIH KRATIC IN SIMBOLOV
× g mnogokratnik gravitacijskega pospeška A280 absorbanca pri valovni dolžini 280 nm A630 absorbanca pri valovni dolžini 630 nm AGE agarozna gelska elektroforeza
angl. angleško
bp bazni par
CD cirkularni dikroizem
CDC od holesterola odvisni citolizin; angl. cholesterol dependent cytolysin CPE ceramid fosfoetanolamin
DNA deoksiribonukleinska kislina DTT 1,4-ditiotreitol; C4H10O2S2
E. coli Escherichia coli
EDTA etilendiaminotetraocetna kislina EqtII ekvinatoksin II
FPLC hitra proteinska tekočinska kromatografija; angl. fast protein liquid chromatography
Gene ID dostopna koda podatkovne baze GenBank HDL lipoproteini visoke gostote
His6 histidinska oznaka; zaporedje šestih histidinov IPTG izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid
kDa kilodalton; dalton je enota za molekulsko maso, ki je enaka 1/12 mase atoma izotopa C12
LB gojišče 'lysogeny broth' LDL lipoproteini nizke gostote
mA miliamper; enota električnega toka
MACPF kompleks membranskega napada/perforin; angl. Membrane Attack Complex/Perforin
MCS poliklonsko mesto, ang. multiple cloning site MES 2-(N-morfolin) etansulfonska kislina
MLV multilamelarni vezikli, liposomi MPa megapascal; enota za tlak
MQ Milli-Q voda, filtrirana ultračista voda
NaDS natrijev dodecilsulfat, NaC12H25SO4; angl. SDS
OD600 optična gostota vzorca, merjena pri valovni dolžini 600 nm OlyA ostreolizin A
OlyA6 ostreolizin A6; izooblika proteina OlyA PAGE poliakrilamidna gelska elektroforeza
PCR verižna reakcija s polimerazo; angl. polymerase chain reaction PEG polietilenglikol
PFT porotvorni toksini; angl. pore-forming toxins PlyA plevrotolizin A
PlyB plevrotolizin B
POPC fosfolipid 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholin RNA ribonukleinska kislina
rpm število vrtljajev na minuto; angl. revolutions per minute SM sfingomielin
TBE pufer Tris-borat-EDTA TCEP tris(2-karboksimetil)fosfin
TEV virus jedkanja tobaka; angl. tobacco etch virus Tm temperatura tališča
Tris 2-amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiol
U encimska enota
UV ultravijolična svetloba V volt; enota napetosti
Δε delta epsilon; molarni cirkularni dikroizem
1 UVOD
1.1 POROTVORNI TOKSINI
Porotvorne proteine najdemo v vseh kraljestvih življenja in v večini primerov delujejo kot porotvorni toksini (PFT; ang. pore-forming toxins), torej v napadu na druge organizme ali kot obramba pred njimi. Prisotni so pri mnogih patogenih bakterijah, kot tudi v raznih živalskih strupih. PFT-ji so največja skupina bakterijskih toksinov in so velik razred porotvornih proteinov. Netoksični PFT-ji običajno (so)delujejo v različnih fizioloških procesih, in sicer lahko zagotavljajo funkcionalnost imunskega sistema, živčnega sistema in prebavo hranil [1], [2].
Kljub temu da so bili PFT-ji v začetku raziskav poznani kot proteini, ki preprosto tvorijo pore, so naslednja desetletja raziskav razkrila mnoge podrobnosti in presenetljivo kompleksnost njihove zgradbe ter molekulske dinamike [1]. Patogeni organizmi jih izločajo v vodotopni obliki, ki se veže na tarčno celico in oligomerizira v neaktiven kompleks predpore. Ta se nato vstavi v membrano tarčne celice in tvori poro. Zmožnost pretvorbe iz vodotopne v transmembransko obliko je ena pomembnejših lastnosti PFT- jev [3]. V vseh dokumentiranih primerih prepoznajo tarčno celico preko vezave na specifične receptorje, kot so na primer določeni sladkorji, proteini ali lipidi. PFT-je lahko razdelimo na dve večji skupini glede na lastnosti sekundarne strukture elementov, ki se vstavijo v membrano. Tako ločimo α-PFT-je (α-vijačna struktura elementov, ki tvorijo poro) in β‑PFT-je (membranski element, ki tvori poro, je večinoma β-sodček) [1]. Med pomembnejše družine spadajo aktinoporini, hemolizini, proteini CDC, aerolizini, proteini MACPF itn. [1], [2].
Poleg naštetih družin poznamo tudi nekatere druge družine proteinov, ki kažejo porotvorno aktivnost in med te prištevamo določene predstavnike egerolizinov [4], [5].
Ravno ti so v magistrskem delu obravnavani kot glavni proteini.
1.1.1 Egerolizinska družina proteinov
Egerolizini so relativno na novo klasificirana družina proteinov, ki je bila prvič definirana in podrobneje opisana leta 2002. V začetku je nabor teh proteinov vključeval le nekaj proteinskih predstavnikov z določenimi zaporedji in nekaj genomskih transkriptov. Prvi izoliran egerolizinom podoben protein z določenim aminokislinskim zaporedjem je bil Asp-hemolizin [6].
Taksonomska porazdelitev egerolizinov
Napredki v analizi genomskih podatkov omogočajo hitrejšo in preglednejšo primerjavo ter klasifikacijo možnih egerolizinom podobnih proteinov, zato se nabor novih verjetnih
znotraj posameznih vrst. Po letih raziskovanja egerolizinov in bioinformacijskih analiz je do sedaj znanih in klasificiranih že več kot 350 predstavnikov družine (Pfam: PF06355, InterPro: IPR009413). Njihove primarne strukture so kljub temu niso zelo ohranjene [4].
Predstavniki družine egerolizinov so prisotni v mnogih taksonomskih skupinah, tako evkariontskih kot tudi bakterijskih. Njihova porazdelitev je znotraj nekaterih taksonomskih skupin presenetljivo neenakomerna, predvsem to velja za glive [7]. Pri rastlinah, praživalih (protozoa) in insektih je bilo zaenkrat dokumentiranih le nekaj primerov [4].
Egerolizine najdemo v zelo širokem spektru organizmov, ki bivajo znotraj raznolikih ekoloških niš. Tem organizmom tako ne moremo pripisati splošnih skupnih lastnosti v načinu življenja. Izkazalo se je, da se pri glivah egerolizini pojavljajo še posebej pogosto.
V kraljestvu gliv so organizmi, pri katerih najdemo egerolizine, karakterizirani kot rastlinski patogeni (Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum), živalski patogeni (A.
fumigatus, ki povzroča aspergilozo), talne glive (Aspergillus niger) in tudi užitne gobe (Pleurotus ostreatus – bukov ostrigar), kar kaže na precejšnjo raznolikost vrst [4].
Kljub relativno široki taksonomski porazdelitvi je le nekaj egerolizinskih predstavnikov raziskanih podrobneje. Po letih raziskav pa njihova biološka vloga pri glivah še vedno ni popolnoma razjasnjena. Trenutno obstaja le hipotetičen nabor možnih bioloških vlog, ki so jih določili na podlagi znanih podatkov [8].
Biofizikalne lastnosti egerolizinov
Proteini egerolizinske družine imajo značilno nizko molekulsko maso (15–20 kDa) in nizko izoelektrično točko. Stabilnost proteinov se kaže v širokem območju pH (3–10), temperaturno so najbolj stabilni do 60 oziroma 65 °C [6], [9]. Za egerolizine je značilno zvitje z β-strukturnimi elementi. Strukturna poravnava nekaterih egerolizinov je prikazana na sliki 1. Primarna struktura je sestavljena iz relativno velikega deleža negativno nabitih aminokislin, kar se odraža pri vrednosti izoelektrične točke, precej je tudi aromatskih aminokislin (triptofanske regije) [6]. Ohranjena sta dva cisteinska aminokislinska ostanka [7].
Slika 1 prikazuje omenjeno strukturno podobnost znotraj egerolizinske družine.
Predstavljene so strukture nekaterih zgoraj opisanih egerolizinov. Vidna je skoraj popolna strukturna poravnava, ki prikaže strukturno podobnost znotraj egerolizinske družine proteinov. Opazimo, da so strukture sestavljene večinoma iz zvitja β-sendviča z manjšimi razlikami v N-koncu in C-koncu strukture.
Strukturno gledano so si egerolizini med seboj podobni, a do razlik prihaja v načinu delovanja, aktivnosti in vezavi na membrane. Velja, da egerolizini lahko delujejo v monomerni obliki (Asp-hemolizin), medtem ko novejše študije odkrivajo vse več primerov dvokomponentnih proteinskih sistemov (OlyA/PlyB). Za omenjene sisteme velja, da sta za litično delovanje potrebni obe komponenti [5].
Biološka vloga in aktivnost egerolizinov
V raziskavah sta se na podlagi znanih karakteristik vzpostavili dve splošni hipotezi o biološki vlogi egerolizinov: (i) delujejo med rastjo in razvojem organizma in/ali (ii) igrajo pomembno vlogo pri obrambi in preživetju organizmov [8]. Nekateri egerolizini delujejo hemolitično in citolitično [10]. Obstajajo tudi primeri, ko sam egerolizin ne kaže teh aktivnosti, a do aktivnosti pride v kombinaciji s proteini MACPF [7]. Opažena je bila tudi sposobnost vezave na lipide, a se specifičnost vezave na določeno vrsto lipida med predstavniki razlikuje [7], [11], [12].
Hemolitična aktivnost
Hemolitična aktivnost nekaterih egerolizinov je posledica prepoznave specifičnih membranskih elementov, ki ji sledi vezava in tvorba pore v membrani eritrocitov.
Rezultat tega je inducirana hemoliza, ki poteče preko koloidno-osmotskega mehanizma.
Po tem mehanizmu deluje protein Asp-hemolizin in para PlyA/PlyB [6] ter OlyA/PlyB [13]. Pri paru PlyA/PlyB je hemolitična aktivnost največja v molarnem razmerju proteinov 3 : 1, pri čemer se v membrani tvori pora, ki je pod elektronskim mikroskopom vidna kot obročasta struktura [5].
Slika 1: Prikaz superpozicije proteinov Cry34ab (rumena; PDB: 4JOX), OlyA6 (zelena; PDB:
6MYI), plevrotolizina A (turkizna; PDB: 4OEB) in egerolizina (vijolična; PBD: 5V3S).
Superpozicija na sliki B je rotirana za 45 ° v primerjavi s strukturo na sliki A (rotacija okoli osi y). Modeli so pridobljeni iz baze PDB ter prikazani s programom Chimera.
A B
~
Egerolizini na eritrocite različnih živali delujejo različno. Asp-hemolizin deluje bolj hemolitično na človeške in kokošje eritrocite kot na eritrocite glodalcev in dvoživk [14].
Hemoliza, ki poteče preko vezave ostreolizina, je podobno učinkovita na človeških, govejih in ovčjih eritrocitih, manjša pa je aktivnost na eritrocitih psa in glodalcev, kar lahko upravičimo z različno lipidno sestavo membrane [6].
Citolitična aktivnost in toksičnost za organizme
Citolitična aktivnost poteka po podobnih mehanizmih kot hemolitična. Do razlik prihaja v vrstah tarčnih celic. Citolitična aktivnost egerolizinov je glavni vzrok njihove toksičnosti za nekatere eksperimentalne živalske modele, saj na določene celične linije delujejo citolitično. Tako so citolitično aktivnost proteina Asp-hemolizin pokazali na človeških levkocitih in alveolarnih makrofagih morskega prašička [6], aktivnost OlyA/PlyB pa na človeških venskih endotelijskih celicah in celični liniji A10 (gladkih mišičnih celicah) podgane [13]. Poleg tega je poznanih še mnogo patofizioloških efektov omenjenega proteinskega para, od sporadičnih akutnih intoksikacij in hitrega padca arterijskega krvnega tlaka do zapore dihal in hipoksije v sekundah po zaužitju gobe Pleurotus ostreatus, ki vsebuje OlyA/PlyB [13]. Citotoksičnost je dokazana tudi na nekaterih insektih (koruzni hrošč, koloradski hrošč), pri katerih je izpostavljenost ostreolizinskemu kompleksu OlyA/PlyB vzrok za pogin insektov in predstavlja potencial za razvoj alternativnih insekticidov [11].
Vpliv na aktivnost
Hemolitična in citolitična aktivnost sta odvisni od mnogih okoljskih faktorjev.
Pomembnejši so pH [9], lipidna sestava membrane [5], prisotnost nekaterih dvovalentnih ionov [6]. Egerolizini lahko ohranjajo membransko aktivnost v širokem območju pH, in sicer od 3,5 do 10,5 [6], pri čemer je za nastanek pore optimalen pH med 7 in 8 [9].
Ugoden pH ne pogojuje vedno vezave in tvorbo pore, saj je ta odvisna od lipidne sestave tarčne membrane. Različni predstavniki egerolizinov se vežejo na raznolike lipidne profile, znano pa je, da pomembno vlogo igra prisotnost sfingomielina v kombinaciji s holesterolom. Sestava take membrane je podobna nanodomenski strukturi membranskih raftov [4]. V kasnejših raziskavah so raziskali tudi pomembnost membran CPE (ceramid fosfoetanolamin)/holesterol, na katere se na primer veže protein OlyA6 [11]. Asp- hemolizin ob prisotnosti dvovalentnih ionov živega srebra, bakra, železa in svinca izgubi litično aktivnost, ki se povrne ob dodatku β-merkaptoetanola ali cisteina, ki je ključen za hemolitično aktivnost proteina [6]. Omenjeni ioni (razen svinčevega) inhibirajo tudi hemolizo preko OlyA [15], podobno pa velja tudi za nekatere druge predstavnike egerolizinov.
Glavni predstavniki egerolizinov
Nabor poznanih egerolizinov je precej širok, a podrobneje raziskanih proteinov je relativno malo. Za razumevanje in raziskovanje egerolizinov so pomembni predvsem
proteini egerolizin, Asp-hemolizin, llizin A, ostreolizin in Cry34ab1. V nadaljevanju so opisane nekatere njihove glavne značilnosti.
Egerolizin
Po egerolizinu, izoliranem iz užitne gobe Agrocybe aegerina, je imenovana celotna družina proteinov. Kodiran je na genu Aa-Pri1, za katerega je značilno izražanje med začetkom razvoja gobe iz micelija. Egerolizin je hidrofilen 16 kDa velik protein z značilnim 20 aminokislin dolgim hidrofobnim motivom in N-končnim zaporedjem s strukturo α-vijačnice. Na goveje eritrocite deluje hemolitično. Na podlagi tega proteina so z bioinformacijsko analizo identificirali mnoge homologne proteine [10].
Asp-hemolizin
Asp-hemolizin je bil izoliran iz nitaste glive Aspergillus fumigatus. Aminokislinsko zaporedje kaže visoko homologijo s prej omenjenim egerolizinom – 39,1-odstotno identičnost zaporedja [10]. Hemoliza, ki je inducirana preko Asp-hemolizina, je inhibirana ob prisotnosti oksidiranega LDL, saj se protein nanj veže in tako ne deluje hemolitično. Ob prisotnosti acetiliranega LDL, HDL, acetiliranega HDL ali oksidiranega HDL hemoliza poteče nemoteno [16].
Plevrotolizin A in ostreolizin A
Plevrotolizin A (PlyA; 17 kDa) spada med bolj raziskane egerolizine, saj so strukturno zvitje proteina rešili relativno hitro (PDB: 4OEB). Izolirali so ga iz užitne gobe Pleurotus ostreatus, ki na genomu zapisuje še protein ostreolizin A (OlyA; 15 kDa). Vsak zase v monomerni obliki nista hemolitična ali citotoksična in šele v kombinaciji s plevrotolizinom B (PlyB; 59 kDa) postaneta aktivna in z njim v membrani tvorita poro.
Vezava obeh proteinov na membrano je pogojena z ustrezno lipidno sestavo membrane oziroma membranskih raftov. OlyA se veže na membrane z visoko vsebnostjo SM in holesterola [10]. Nedavno so odkrili, da se OlyA6 veže tudi na membrane z visoko vsebnostjo CPE/holesterola, ki so značilne za celice nevretenčarjev [11]. Na sliki 2A je predstavljena struktura proteina OlyA, s katere je razvidno zvitje β-sendviča s krajšo vmesno regijo z eno α-vijačnico.
Cry34ab1
Protein so izolirali iz bakterije Bacillus thuringiensis in šteje za prvo rešeno strukturo (PDB: 4JOX) predstavnika egerolizinske družine proteinov [17]. Z molekulsko maso 14 kDa spada med manjše egerolizine. Biološko aktivnost izraža v kombinaciji s proteinom Cry35ab1, s katerim tvori membransko poro. Ta par proteinov je zanimiv predvsem z vidika biotehnološke uporabe, saj kaže obetavno pesticidno aktivnost. Dokazano je, da na koruznega hrošča deluje insekticidno [17].
Glavne lastnosti najbolj raziskanih egerolizinov, ki so opisani v zgornjih odstavkih, kažejo na raznolikost egerolizinske družine proteinov. Ravno to nam otežuje natančnejšo določitev njihove primarne biološke vloge. Kot že omenjeno, so pomemben faktor pri podrobnejši karakterizaciji egerolizinov še partnerski proteini iz družine proteinov MACPF.
1.1.2 Naddružina proteinov MACPF/CDC
Gre za proteine, ki vsebujejo domeno MACPF (kompleks membranskega napada/perforin) ali domeno CDC (od holesterola odvisni citolizin). Med raziskavami so povezali, da sta domeni strukturna homologa in skupaj tvorita omenjeno naddružino porotvornih proteinov [18]. Ti proteini predastavljajo velik del bakterijske patogeneze in imunskega sistema, pri čemer preko membranskih interakcij tvorijo transmembranske pore. Proteini z domeno CDC se večinoma pojavljajo pri grampozitivnih bakterijah, medtem ko je razširjenost proteinov MACPF precej večja (glive, evkarionti, bakterije ...).
Domena MACPF je sestavljena iz številnih β-trakov ter α-vijačnic, pri čemer sta pomembna predvsem dva para vijačnic, ki sodelujeta pri tvorbi pore [18].
Znotraj naddružine je zanimiva predvsem manjša skupina glivnih proteinov – PlyB podobni proteini. Glavni predstavnik je 59 kDa velik protein plevrotolizin B (PlyB), naravno prisoten v užitni gobi Pleurotus ostreatus. Za citolitično aktivnost proteina je potrebna interakcija z enim od egerolizinov, OlyA ali PlyA. N-končni del strukture proteina PlyB predstavlja domena MACPF. Tej domeni sledijo trije manjši motivi z β- zvitjem, združeni v večjo C-končno domeno PlyB [19], ki je skupna omenjeni manjši skupini proteinov. Ta domena je pomembna za interakcijo med proteinoma PlyA/PlyB v procesu tvorbe pore. PlyB podobnih proteinov, ki imajo na C-koncu to specifično
Slika 2: A) Strukturni model proteina OlyA6 (PDB: 6MYI) in B) strukturni model proteina EqtII (PDB: 1IAZ). Modela sta pridobljena iz baze PDB ter prikazana s programom Chimera. N-konec proteina je obarvan temno modro, C-konec rdeče. C) Superpozicija proteinov OlyA6 (vijolična) in EqtII (turkizna) kaže na podobnost struktur z vidika β-
sredice, α-vijačnici sta značilni za EqtII oz. aktinoporine.
A B C
domeno, je po pregledu podatkovnih baz relativno malo. Posledično je pri glivah znanih le malo funkcionalnih parov egerolizina in PlyB podobnega proteina [5].
1.1.3 Aktinoporini
Aktinoporini so najpogostejši PFT-ji, ki jih najdemo pri ožigalkarjih (Cnidaria), in so nasploh ena izmed najbolj preiskanih družin PFT-jev. Prvič so jih opazili pri morskih vetrnicah, po katerih so tudi poimenovani. Najbolj raziskani so proteini ekvinatoksin II (EqtII), stiholizin I in II ter fragaceatoksin C [2].
Aktinoporini so majhni topni monomerni proteini z molekulsko maso ~20 kDa in se iz ožigalkarja izločajo v relativno majhnih količinah. Strukturno so dobro opisani, saj so mnogim monomernim oblikam že določili proteinsko strukturo. V stanju tvorbe pore je rešenih precej manj struktur [2]. Skoraj vsi aktinoporini so bazični, saj so vrednosti izoelektričnih točk praviloma nad 9. Sestavljeni so iz 175–179 aminokislin in ne vsebujejo cisteina [20], [21]. Dobro raziskan je aktinoporin ekvinatoksin II (EqtII) s strukturo β-sendviča v sredici proteina in dvema α-vijačnicama na vsaki strani sredice.
Struktura iz podatkovne baze PDB je prikazana na sliki 2B. Struktura je pomembna za aktivnost proteina, ki deluje citolitično in hemolitično. Ob vezavi membranskih lipidov (specifično SM) oligomerizira in tvori poro [10]. Nastanek pore je podrobneje obravnavan v poglavju 1.2.4.
S strukturnega vidika je pomembno omeniti, da so si egerolizini in aktinoporini med seboj precej podobni. Predvsem jim je skupna sredica v zvitju β-sendviča [10]. Do razlik lahko pride v številu posameznih β-trakov znotraj sredice, a zvitje ostaja enako. To je razvidno tudi na sliki 2C, ki prikazuje strukturno poravnavo egerolizina OlyA in aktinoporina EqtII. Zvitje sredice je zelo dobro poravnano, medtem ko sta regiji z α-vijačnicama prisotni le pri EqtII.
1.2 LIPIDNE MEMBRANE IN NASTANEK PORE
1.2.1 Zgradba in funkcije lipidnih membran
Celična membrana je tanka plast fosfolipidnih molekul in proteinov, ki obdaja celico in ločuje znotrajcelično okolje od zunajceličnega. Predstavlja glavno obrambo celice pred zunanjimi vplivi in hkrati sodeluje pri mnogih drugih bioloških procesih. V evkariontskih celicah so prisotni organeli (jedro, mitohondrij, lizosomi), ki so prav tako obdani z membranami [22]. Funkcija in biološka vloga ostajata podobni celični membrani.
Fizikalno-kemijske lastnosti lipidov so vzrok za spontan nastanek lipidnega dvosloja celičnih membran, ki ima običajno presek debel 5–8 nm. Membranski lipidi so amfipatske molekule s hidrofobnim nepolarnim delom in hidrofilnim delom, ki interagira z vodo.
Spontana interakcija lipidov in tvorba različnih membran sta posledici hidrofobnega
efekta. Polarna hidrofilna domena je pri tem usmerjena proti molekulam vode, s katerimi interagira, in je energetsko stabilna v vodnem okolju [23].
Membrane so običajno sestavljene iz nabora različnih lipidov. Njihova porazdelitev med zunanjim in notranjim slojem je asimetrična. Evkariontski membranski lipidi so glicerofosfolipidi, sfingolipidi in steroli. Pri sesalcih večinsko najdemo le eno vrsto sterolov – holesterol. Vsebnost holesterola med drugim najbolj vpliva na fluidnost membrane [23].
Na membranah potekajo številni celični procesi in mehanizmi, ki so predvsem posledica prisotnosti proteinov. Proteini z membrano lahko interagirajo na različne načine, pri čemer so asimetrično porazdeljeni. Lahko so periferni (vezani na površino membrane), interkalirani (interakcija z enim lipidnim slojem) ali transmembranski (prebadajo membrano). Masni delež proteinov v membrani je odvisen od vrste in specifičnih funkcij membrane ter se giblje med 20 in 80 %. Proteini poleg lipidov pomembno prispevajo k strukturni asimetriji membran [22], [23].
Biološke membrane sodelujejo pri različnih bioloških funkcijah. Med pomembnejše spadajo vzdrževanje elektrokemijskega membranskega potenciala, upravljanje transmembranskega transporta molekul, zagotavljanje mehanske bariere med zunanjim in notranjim okoljem, posredovanje pri celični signalizaciji in adhezivne lastnosti za vezavo sosednjih celic, proteinov in drugih molekul ter proizvajanje energije [22].
Lipidna membrana je neprepustna za ione in večje molekule, preko lipidnih slojev pa lahko prehajajo manjše nepolarne molekule, plini in manjše nenabite polarne molekule.
Večje molekule in ioni skozi membrano prehajajo s pomočjo ionskih kanalov ali drugih transportnih proteinov [24]. Kompleksnost lipidne sestave zagotavlja stabilnost in robustnost membrane, ki tudi ob manjših lokalnih spremembah v sestavi, pH in osmolarnosti ostane selektivno prepustna [23].
Pri zgradbi membrane je pomemben koncept membranskih lipidnih raftov. Te dinamične membranske nanostrukture so obogatene s sfingolipidi in vsebujejo urejene sklope specifičnih proteinov. Predstavljajo pomemben člen celične signalizacije, endocitoze in postgolgi transporta. Lipidi znotraj lipidnih raftov imajo pogosto daljši in bolj nasičen skelet ter vsebujejo hidroksilirane ceramidne verige [23].
1.2.2 Eritrocitna membrana
Strukturna organizacija membrane človeških eritrocitov je zasnovana tako, da celici dovoljuje relativno velike reverzibilne deformacije, pri katerih lahko vzdržuje integriteto strukture. Linearno se lahko celica podaljša do 250 %, a hkrati le 3–4-odstotno povečanje površine povzroči lizo celice. Za vzdrževanje velikosti površine sta zelo pomembna sestava membrane in omrežje skeletnih proteinov, povezanih s citoplazemskimi domenami transmembranskih proteinov ter direktno z anionskimi fosfolipidi. Lipidni
dvosloj je sestavljen iz enakega utežnega deleža holesterola in fosfolipidov. Holesterol je med dvema slojema enakomerno razporejen, štirje glavni fosfolipidi pa so razporejeni asimetrično. Fosfatidilholin in sfingomielin sta večinsko prisotna v zunanjem sloju, fosfatidiletanolamin in fosfatidilserin pa v notranjem sloju. Za zagotavljanje in vzdrževanje asimetrije so potrebni različni tipi fosfolipidnih transportnih proteinov.
Asimetrična sestava je pomemben faktor, ki vpliva na možnost vezave nekaterih ključnih proteinov. Lipidni rafti z visoko vsebnostjo holesterola in sfingomielin so povezani z vezavo stomatina, G-proteinov in β-adrenergičnih receptorjev [25], hkrati pa zaradi sestave omogočajo vezavo tudi nekaterim porotvornim proteinom (EqtII) [26] in proteinom, ki sodelujejo pri nastanku por (OlyA) [27].
1.2.3 Liposomi
Liposomi so majhni okrogli lipidni vezikli, katerih lastnosti se razlikujejo glede na lipidno sestavo, površinski naboj, velikost in metodo priprave. Od sestave je odvisna tudi rigidnost in fluidnost lipidnih slojev. Velikost liposomov variira v območju od 0,025 µm do 2,5 µm in so sestavljeni iz enega ali več lipidnih dvoslojev. Glavni tipi liposomov so multilamelarni vezikli (MLV), veliki unilamelarni vezikli (LUV) in majhni unilamelarni vezikli (SUV). Multilamelarni vezikli imajo koncentrično razporejenih več lipidnih dvoslojev, ki so med seboj ločeni z vodno raztopino (hidrofilno) [28].
Lastnosti liposomov so ustrezne za uporabo kot dostavni sistem različnih snovi (zdravila, hranila, pesticidi, kozmetika) v biološki sistem. Sredico liposomov lahko napolnimo s hidrofilnimi molekulami, ki zaradi hidrofobnega ovoja težko zapustijo liposom, hidrofobne molekule pa se zadržujejo/raztopijo v lipidnem dvosloju. Tako je sistem uporaben za širok spekter molekul. Na mestu delovanja, kamor usmerjajo ligandi na površini, se liposomi zlijejo z membrano tarčne celice in vsebina se sprosti [29].
Poleg dostavnega sistema so liposomi zelo uporabni za preučevanje delovanja celic.
Pripravimo lahko zelo raznolike lipidne profile, ki služijo kot modelni sistem specifične celice. Preiskujemo lahko, na kakšne lipidne profile se vežejo posamezni proteini, in na podlagi tega sklepamo, na kakšne celice delujejo [28]. Tako se egerolizini in aktinoporini dokazano vežejo na membrane z visoko vsebnostjo SM/holesterola, dodatno pa se nekateri egerolizini (npr. OlyA) vežejo tudi na membrane z relativno visoko vsebnostjo CPE/holesterola [13]. Podobne lipidne profile najdemo pri celicah nevretenčarjev (npr.
insektih), pri katerih je v membranah v visokem deležu prisoten CPE [12].
SM in CPE spadata med sfingolipide, tj. raznolika skupina pretežno evkariontskih lipidov. Amfipatske molekule imajo skupno osnovo. Sfingozin, katerega hidroksilna in aminska funkcionalna skupina sta lahko kemijsko modificirani, je osnova za širok spekter sfingolipidov. CPE je s fosfoetanolaminsko skupino strukturni analog SM, ki ima fosfoholinsko skupino [12].
1.2.4 Nastanek in lastnosti por
Porotvorni proteini so v osnovi topni proteini, ki se vežejo na membrano, oligomerizirajo in se pretvorijo v membransko poro s premerom od 1 do 50 nm. Velikost pore je odvisna od strukture proteina in števila podenot, ki sestavljajo poro [19].
Za namen naloge je pomembno razumevanje nastanka in delovanja pore, ki nastane s posredovanjem egerolizinov v paru s proteinom MACPF (OlyA/PlyB, PlyA/PlyB).
Proteina PlyA in PlyB skupaj tvorita pore v obliki rozete z različnimi simetrijami, najpogostejša je 13-kratna simetrija (75 %). Dimer proteina PlyA se preko zank zvitja β- sendviča po prepoznavi SM veže na membrano liposoma s sestavo SM/holesterol. Z nasprotnimi zankami β-sendviča interagira s C-končno domeno proteina PlyB. Sledita stopnji zgodnje in pozne predpore, znotraj katerih poteče vrsta konformacijskih sprememb, ki povzročijo strukturno preoblikovanje proteina z domeno MACPF, PlyB.
Struktura enega dela domene MACPF z več β-trakovi in dvema α-vijačnicama se preoblikuje v štiri dolge β-trakove, ki so urejeni v antiparalelno β-ploskev, preko katere se vgradijo v lipidno membrano. Ob oligomerizaciji 13 podenot nastane membranska pora. β-plošče se povežejo v velik β-sodček z 52 trakovi [19]. Notranji premer take pore meri 8 nm, višina pa preko 10 nm. Strukturni model opisane pore je prikazan na sliki 3 (PDB: 4V2T).
Glede na to, da so egerolizini strukturno podobni aktinoporinom, ki tvorijo pore preko α- vijačne sredice, lahko za primerjavo pogledamo primer pore proteina EqtII. Tvorba pore je tudi v tem primeru večstopenjski proces, katerega sosledje opisujejo različni modeli. V nadaljevanju je opisan tradicionalni model tvorbe aktinoporinske pore [21].
Slika 3: Struktura membranske pore PlyA/PlyB (PDB: 4V2T). A) Pogled na membransko poro s citosolne strani. Vidna je 13-kratna simetrija (podenote so različno obarvane, puščica označuje
eno podenoto). Krožna struktura v sredini je sredica pore – β-sodček. B) Stranski pogled na strukturo pore z urejenim β-sodčkom, ki predstavlja sredico pore. Shematsko je na model umeščena membrana (vijolično). Primer ene podenote je obarvan z rdečo: modra puščica kaže
protein PlyB, ki se razteza v notranjost pore, rdeči puščici pa proteina PlyA, ki tvorita dimer.
Modela sta pridobljena iz baze PDB ter prikazana s programom Chimera.
A B
Vezavo proteina EqtII na membrano omogočajo C-končna α-vijačnica in skupek aromatskih aminokislinskih ostankov na dnu β-sendviča. Vezava proteina je pogojena predvsem s prisotnostjo SM v lipidni membrani, kar je najpogosteje na območju membranskih raftov. Po vezavi membrane sledi premik N-končne α-vijačnice na površino membrane, ki vpliva na konformacijsko preureditev in podaljšanje α-vijačnice. Sočasno se vijačnica vgradi v membrano, oligomerizira z drugimi monomernimi proteinskimi enotami in tvori poro [21]. Fleksibilnost in različna konformacijska stanja N-končne α- vijačnice so ključnega pomena za uspešno tvorbo pore in litično aktivnost. V primeru delecije, mutacij ali dodatka fuzijskih oznak na N-končno zaporedje protein izgubi sposobnost hemolize/tvorbe pore [10]. Po oligomerizaciji so v membrani α-vijačnice razporejene skoraj pravokotno na membrano, pri čemer so hidrofobni ostanki usmerjeni proti membrani, hidrofilni aminokislinski ostanki pa so orientirani proti lumnu pore.
Negativno nabiti ostanki, usmerjeni proti lumnu pore, delujejo rahlo selektivno za katione [21].
Pri aktinoporinskih porah je znanih več simetrij. Tri oziroma štiri monomerne enote lahko tvorijo toroidno poro, pri kateri stene pore verjetno stabilizirajo glave lipidov. Pri tem je premer zunajceličnega dela večji od citosolnega dela pore. Drugi je oktamerni model, pri katerem poro tvori osem monomernih aktinoporinskih enot. V tem primeru notranjost pore gradijo povezane α-vijačnice in vključenost lipidov je precej manjša. Oktamerni model so dokazali na osnovi kristalne strukture pore proteina fragaceatoksina C z osmimi monomernimi enotami [21].
1.3 BIOTEHNOLOŠKI POTENCIAL EGEROLIZINOV
Egerolizini imajo zaradi bioloških učinkov in lastnosti precejšen potencial za uporabo v nekaterih bioloških in biotehnoloških procesih.
i) Možna je uporaba za sledenje lipidov v membranah. Zaradi afinitete do membranskih nanodomen, bogatih s SM/holesterolom, bi egerolizine lahko uporabljali za vizualizacijo membran. Protein OlyA, ki je na C-koncu fluorescenčno označen s proteinom mCherry, so uporabljali za preučevanje distribucije s SM/holesterolom bogatih membranskih domen. Lastnosti vezave so bile podobne neoznačenemu proteinu OlyA. Dodatno se OlyA in PlyA vežeta tudi na membrane, ki vsebujejo CPE/holesterol, in bi ju lahko uporabljali za sledenje prisotnosti CPE v bioloških membranah [10].
ii) Egerolizinske gene lahko uporabljamo kot biomarkerje glivičnih bolezni. Pri invazivni aspergilozi je kljub učinkoviti diagnozi težavna določitev specifične vrste Aspergillus. Za zaznavanje A. fumigatus predlagajo PCR v realnem času, s katerim kvantificiramo transkripcijo egerolizina aspHS, ki se med infekcijo in vivo povečano izraža [7].
iii) Določeni egerolizini bi bili lahko osnova za razvoj nove generacije biopesticidov.
Egerolizini v kombinaciji s proteinom PlyB (iz gliv rodu Pleurotus), ki se vežejo na CPE v membranah, kažejo specifično toksičnost za larve koloradskega hrošča in koruznega hrošča. Nova generacija biopesticidov bi temeljila na gensko spremenjenih rastlinah, ki bi pesticid izločale in se tako zaščitile pred določenimi insekti. Tarčno mesto prepoznave in delovanja so specifični lipidi v membrani, in ne insektni proteini. Proteini lahko lažje mutirajo, s čimer insekti lahko pridobijo rezistenco na določen pesticid. V primeru lipidov je kemijska modifikacija manj verjetna, saj so ti ključni za vzdrževanje integritete membrane, ki je za organizme nujna [11].
iv) Pri nekaterih egerolizinih so zaznali antibakterijsko in antitumorsko aktivnost, delujejo tudi kot zaviralci celične delitve [6].
2 NAMEN DELA IN HIPOTEZE
Predhodna bioinformacijska analiza proteinov s potencialno egerolizinsko domeno je pokazala, da ima nekaj predstavnikov neobičajno podaljšan N-konec zaporedja. Ta bi morda lahko omogočal tvorbo pore v odsotnosti partnerskega proteina MACPF. Zgradba egerolizinov je precej podobna zgradbi aktinoporinov, ki preko N-končne α-vijačnice v membranah, ki vsebujejo sfingomielin, tvorijo pore. Egerolizini te α-vijačnice večinoma nimajo in sami le redko tvorijo pore, kljub temu pa v membranah prepoznajo sfingolipide, sfingomielin (SM) ali ceramid fosfoetanolamin (CPE). Veliko vprašanje je, kako se je razvila družina aktinoporinov – predvidevamo, da so se razvili iz egerolizinov.
Štiri izbrane kandidatne gene smo želeli izraziti v heterolognih sistemih za pripravo rekombinantnih proteinov, jih očistiti z različnimi kromatografskimi metodami in jim določiti biokemijske in biofizikalne lastnosti. Preveriti smo želeli, ali proteini v membranah človeških in govejih eritrocitov lahko tvorijo pore, in proučiti njihovo vezavo na liposome z različno vsebnostjo SM, CPE, POPC in holesterola. Predstavnike smo želeli pripraviti v večjih količinah in jih za namen določanja 3D-strukture poskusili tudi kristalizirati. Opraviti smo želeli še širšo strukturno bioinfomatsko analizo predstavnikov.
Na podlagi podobnosti in znanja o egerolizinih in aktinoporinih smo postavili hipotezo, da imajo kandidatni egerolizini na N-končnem zaporedju podaljšek, ki ima strukturo α- vijačnice, preko katere lahko tvori poro v odsotnosti partnerskega proteina. Druga hipoteza je, da imajo kandidatni egerolizini sposobnost prepoznave in vezave specifičnih sfingolipidov (CPE in SM).
3 MATERIALI
3.1 MATERIALI ZA IZVEDBO MOLEKULSKEGA KLONIRANJA
3.1.1 Vektorji in oligonukleotidi Vektor pET-24a
Vektor za kloniranje in izražanje pET-24a je dolg 5310 bp. Vektor vsebuje gen za odpornost proti antibiotiku kanamicinu, kar omogoča selekcijo bakterijskih celic, ki vsebujejo vektor, saj te rastejo na gojišču ob prisotnosti kanamicina. Geni, ki jih vstavljamo v vektor, se izražajo pod kontrolo močnega promotorja T7. Princip prepisovanja temelji na vezavi RNA-polimeraze T7 na promotor T7. Prepisovanje uravnavamo z indukcijo preko operatorja lac, na katerega je v odsotnosti induktorske molekule (naravni: alolaktoza; sintetični: IPTG) vezan represor lac, ki onemogoča vezavo in delovanje RNA-polimeraze T7. Ob dodatku induktorja se ta veže na represor lac in povzroči njegovo inaktivacijo ter posledično omogoči vezavo RNA-polimeraze T7. Na vektorju je zapisana tudi C-končna histidinska oznaka (His6) – zaporedje šestih histidinov. Pomembna je v fazi izolacije izbranega proteina in pri imunodetekciji. Vektor vsebuje še MCS, znotraj katerega sta pomembni prepoznavni mesti za restrikcijski
Slika 4: Shematski prikaz vektorja pET-24a (+). Predstavljeni so pomembni elementi: gen za rezistenco proti kanamicinu (KanR), gen za lac represor (lacI), mesto začetka podvojevanja (f1
ori, ColE1 origin), pomembnejša mesta za restrikcijske endonukleaze, T7 promotor, mesto afinitetnih oznak (oznaka T7 in oznaka His).
endonukleazi NdeI in HindIII, ki vektor režeta natanko enkrat. Glavni elementi zaporedja vektorja so shematsko prikazani na sliki 4.
Vektorji pET-24a-egerolizin
Uporabljali smo štiri različne vektorje. Vsak vektor vključuje zapis za enega izmed izbranih genov, ki zapisujejo protein iz egerolizinske družine proteinov. Zapisi so bili vstavljeni v osnovni vektor pET-24a preko prepoznavnih zaporedij za restriktazi NdeI in HindIII. Tako končni proteini vsebujejo C-končno oznako His6. Vektorji z vključkom so dolgi od 5662 bp do 5779 bp, odvisno od dolžine zaporedja posameznega gena. Vsebujejo glavne karakteristike osnovnega izhodnega vektorja pET-24a, ki so opisane v prejšnjem odstavku. Shema odseka vektorja z genom za egerolizin (insertom) je prikazana na sliki 5.
Shema celotnega vektorja z vstavljenim genom je v prilogi 8.1 na sliki 44.
Inserti v vektorjih so zaporedja, ki kodirajo proteine – predvidene egerolizine. Predhodne bioinformacijske analize so napovedale, da imajo predvideni proteini ohranjeno egerolizinsko domeno, hkrati pa imajo na N-končnem delu zaporedja neobičajen podaljšek. Imena proteinov so določena iz izhodnega organizma (iz začetnih treh črk vsake besede latinskega poimenovanja organizma) in so enaka za protein in pripadajoči gen. Podjetje, ki je sintetiziralo gene, je naredilo tudi optimizacijo kodonov za izražanje v E. coli. V nadaljevanju so zaporedja genov egerolizinov, ki so v plazmid vstavljeni na zgoraj označeno območje (slika 5).
Nukleotidna zaporedja genov ter aminokislinska zaporedja za egerolizine:
- Fusgra (izvorni organizem Fusarium graminearum) – dolžina nukleotidnega zaporedja je 411 bp, dolžina aminokislinskega zaporedja je 137 ostankov.
ATGTCGCCTC TTGATGCTTT CTATAGCGAT GCGGCGTCTT TTGCTAAGAC GGGGTTGGAC 60 TTGATCAACC CAGATCGTGC AGTTGTGGTT TGGTTTATGA ACAATACGGA CCAAGAGCTT 120 ACTTGGTCCG ACTCGGGCGT AGACCACGGC GAACGGTCAC AATTAGCGCC TGATACGATC 180 GCGCCACGCC AATGGGGCAA GTGGGCGTTG GAAAGTTGCG GTTTTGAAAC TGGTTGCGAA 240 GGTTGGATGA CATGGGTGTT TAATGATGGG ACAAAAGTTG AACTTGGCTA CGATAATCCG 300 TATTACGGTA GTAATTCATA TTCTTGTTCG GTTGGCAGCA GCTCATATAC AATTAACCGC 360 GAAGGTGGGG ATGGTAACGT GACGTTAGTA AAATTCATTC TTAATCAAAA C
MSPLDAFYSDAASFAKTGLDLINPDRAVVVWFMNNTDQELTWSDSGVDHGERSQLAPDTI 60 APRQWGKWALESCGFETGCEGWMTWVFNDGTKVELGYDNPYYGSNSYSCSVGSSSYTINR 120 EGGDGNVTLVKFILNQN 137
Slika 5: Odsek na vektorju pET-24a-egerolizin, znotraj katerega je vstavljen gen za egerolizin (rdeča puščica). Predstavljeni so začetni kodon za metionin, splošno zaporedje gena, dodatni
povezovalni kodoni na vektorju, zaporedje z afinitetno oznako in stop kodon.
- Fusver (izvorni organizem Fusarium verticillioides) – dolžina nukleotidnega zaporedja je 429 bp, dolžina aminokislinskega zaporedja je 143 ostankov.
ATGACTATTT TCGACGATAT TGGCGACGCC TTCGGTTCGG CGGCTAAGGC AGTCTCGAGC 60 ACAATCATCT CGGAAGCTGA CACGAGCCCG CGTCGGATCG CCGTTTCGTT AGTGAATAAC 120 ACACAGCAAA CACTTACCTG GGTAGATAGC GGCGTAGACC ATGGCACTCG CGATGACCAC 180 GCTCCTGATA CTATCGGGCC TCGCGACACT GGCAAATGGT CGCTGAAGTC GGCAGGTTTT 240 CAGACAGGCT GCGAAGGTTG GATGAAATGG CGCATTGGTG ATAATGGCCC GATTGTGCGC 300 TTGGACTATG ACAACCCTTA CGTCGGCAGT AATAGTTACA GTTGTTCAGT CGACAGTGCC 360 AAGTATAACG TCGAGCGGGA GGGCGGCAGC GGGGATAACG CCACAGTTAA GTTCATTGTG 420 TCAAATAAA
MTIFDDIGDAFGSAAKAVSSTIISEADTSPRRIAVSLVNNTQQTLTWVDSGVDHGTRDDH 60 APDTIGPRDTGKWSLKSAGFQTGCEGWMKWRIGDNGPIVRLDYDNPYVGSNSYSCSVDSA 120 KYNVEREGGSGDNATVKFIVSNK 143
- Traver (izvorni organizem Trametes versicolor) – dolžina nukleotidnega zaporedja je 522 bp, dolžina aminokislinskega zaporedja je 174 ostankov.
ATGAATTTCG AGCTCGCACA CCCGTCGCGC CCGATTGCTG AAGGTATCTG TGTTACCGAA 60 GACGTTCGGA CCTCTGAAGA CTTTGTGGTA TCAGACAATG ACGACCGCCA TCGCGCTTAC 120 GCCCAGTGGG TAAGCATCGA GATTATCAAT TACGGGCCTC GTCCGGTAAA AATCAAAAAT 180 GTATATCGCA GTTGGGGTAA ACTTTACATT GAGGGTAACA AAGATAAAGA GGTGTCACCA 240 TCATATTTCG AGAATACCAC AATCAACCCA AACGGTACAT TAACAATTGC CGGTTGCGGT 300 CGGTCTAACG CGTCCTCAGG CACTGAAGGC GGTTTTAACA TCGTTGATCC TTCGCGGGGC 360 GACGATATTA TTCGGTCAGT ATATTGGGAC TGTCCGTGGG GTTCAAAAAC AAATAAATGG 420 TCCGTGTCTG GTAGCTTGTC CGGCTGGGAC GTTTATGATA AAGGGGCAAA TATTGATTCC 480 GGCGCCTTGG GTAATATTAC TATTGAGACC GTCTATAAAG GT
MNFELAHPSRPIAEGICVTEDVRTSEDFVVSDNDDRHRAYAQWVSIEIINYGPRPVKIKN 60 VYRSWGKLYIEGNKDKEVSPSYFENTTINPNGTLTIAGCGRSNASSGTEGGFNIVDPSRG 120 DDIIRSVYWDCPWGSKTNKWSVSGSLSGWDVYDKGANIDSGALGNITIETVYKG 174
- Phiatt (izvorni organizem Phialophora attae) – dolžina nukleotidnega zaporedja je 528 bp, dolžina aminokislinskega zaporedja je 176 ostankov.
ATGGCCCAGG CAGCGATTGC CGCCGGTACT GCAGCTGTTG ACGTAGCAAA AGGTTTGTTC 60 ACTGAAATGA ACAATCGGAA AGGTGGGGAC TCAGCGCGGT CCATGCAGGT GGTTATTCGG 120 AATACAACCG GTGAGAAACT TGTACGGTCG CATCACGAGT CCCACTATGG GAAGTGGACG 180 TCCGGGCTCG AACCTTTACC GGAAATCGAC GCCGAAACCG CCAGTGGGTT TATGCTTGAA 240 TCACATGGTT TAATGACCGG TTGTGGGGGG ATGGCATCGT ACGAAATTGG CGACTCCGGC 300 GAAAAACTTC GCGTAAGCGT CAGTGTTCCG TATGCTGGGG CTAATTCGAA TAGCGCAAAC 360 GTAGAAGGTG GCTCGCGGTA CAAAGTGTCA GCAGAGGGTG GTGGCGGTAA CAATGCAACT 420 TATAGCTTAA AGCTCGAGGA CACGCAGAAG GGCCAGGACG AGGGCGATGA GGACGAGGAA 480 GGTGGCGGCA ACGATGATGA ACGCAACGGG AACGACGACG AAGAAGAG
MAQAAIAAGTAAVDVAKGLFTEMNNRKGGDSARSMQVVIRNTTGEKLVRSHHESHYGKWT 60 SGLEPLPEIDAETASGFMLESHGLMTGCGGMASYEIGDSGEKLRVSVSVPYAGANSNSAN 120 VEGGSRYKVSAEGGGGNNATYSLKLEDTQKGQDEGDEDEEGGGNDDERNGNDDEEE 176
Vektor pET-24a-TEV
Vektor pET-24a-TEV je izveden iz vektorja pET-24a. Na Odseku za molekularno biologijo in nanobiotehnologijo na Kemijskem inštitutu so osnovni vektor pET-24a modificirali za potrebe izražanja genov in izolacije proteinov (zaporedje modificiranega vektorja je prikazano v prilogi 8.2). Vektor ohranja glavne lastnosti osnovnega pET-24a, a se razlikuje v zaporedju na območju med prepoznavnima zaporedjema za restrikcijski endonukleazi NdeI in NotI. Opravljena je bila večinska delecija zaporedja med prepoznavnima zaporedjema NdeI in HindIII, ki vektorju izbriše štiri restrikcijska mesta in oznako T7. Med prepoznavni restrikcijski zaporedji HindIII in NotI je vstavljen insert, ki pri izražanju genov proteinu na C-koncu doda prepoznavno aminokislinsko zaporedje za vezavo in proteazno aktivnost TEV proteaze. Ta nam omogoča morebitno odstranitev oznake His6 s C-konca proteina. Shema spremenjenega zaporedja je prikazana na sliki 6.
Shema celotnega vektorja po vstavljanju izbranega gena je prikazana v prilogi 8.1 na sliki 45.
Oligonukleotidi
Uporabljali smo dva začetna oligonukleotida, ki smo ju potrebovali za določitev nukleotidnega zaporedja.
- T7 promotorski oligonukleotid: smerni oligonukleotid, ki se veže na zaporedje promotorja T7 z zaporedjem 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’.
- T7 terminatorski oligonukleotid: protismerni oligonukleotid, ki se veže na zaporedje terminatorja T7 z zaporedjem 5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’.
3.1.2 Encimi
Restrikcijske endonukleaze
Med molekulskim kloniranjem smo uporabljali dve restrikcijski endonukleazi (NEB, ZDA). Izbrani sta bili na podlagi predhodnega pregleda restrikcijskih mest na vektorju in želenih lastnosti proteinov. Uporabljali smo jih 20-krat redčene.
Slika 6: Odsek na vektorju pET-24a-TEV, znotraj katerega je vstavljeno zaporedje, ki po translaciji tvori značilno prepoznavno mesto za TEV proteazo (temnomodra puščica).
Predstavljena so še prepoznavna mesta za restrikcijske endonukleaze, s pomočjo katerih smo gen za egerolizin lahko vstavljali v vektor. Svetlomodra puščica kaže na odsek z oznako His6.
Tabela 1: Založne raztopine uporabljenih restrikcijskih endonukleaz s prepoznavnim zaporedjem in ustreznim pufrom.
DNA-ligaza
Uporabljali smo DNA-ligazo T4 (U/µl) (NEB, ZDA) iz bakteriofaga T4 in pripadajoči 10× ligazni pufer (NEB, ZDA). Reakcija ligacije je potekala 30 minut pri sobni temperaturi.
3.1.3 Agaroza in elektroforezni standard
Pri posameznih korakih molekulskega kloniranja smo velikosti fragmentov preverjali z agarozno gelsko elektroforezo (AGE). Za natančno določitev smo uporabljali vnaprej pripravljen elektroforezni standard.
Materiali za pripravo agaroznega gela
Za postopek AGE smo uporabljali agarozo (Sigma Aldrich, Nemčija), etidijev bromid (BDH Chemicals, Združeno kraljestvo), 6× vijolični nanašalni pufer (NEB, ZDA) ter 1×
TBE pufer (0,089 M Tris baza, 0,089 M borova kislina, 0,002 M EDTA).
Elektroforezni standard
Uporabljali smo dolžinski standard λ DNA-HindIII (pripravljen v Laboratoriju za molekularno biologijo in nanobiotehnologijo), ki ga dobimo z rezanjem DNA bakteriofaga lambda z restriktazo HindIII. Rezultat rezanja je osem fragmentov z dolžinami od 125 bp do 23.130 bp. Standard je prikazan na sliki 7 [30].
Restrikcijska endonukleaza
Koncentracija [U/µl]
Kompatibilni pufri
Prepoznavno zaporedje
NdeI 20 1× CutSmart 5’..C A↓T A T G..3’
3’..G T A T↑A C..5’
HindIII-HF 20 1× CutSmart 5’..A↓A G C T T..3’
3’..T T C G A↑A..5’
3.1.4 Kompleti reagentov
Pri pripravljanju konstruktov DNA smo uporabljali dva kompleta reagentov:
- Monarch Plasmid Miniprep Kit (NEB, ZDA) – za izolacijo plazmidne DNA iz bakterijskih celic;
- Monarch DNA Gel Extraction kit (NEB, ZDA) – za izolacijo DNA iz agaroznega gela.
3.1.5 Pomembnejša laboratorijska oprema za izvedbo molekulskega kloniranja Nenadomestljiv je bil komplet pipet Eppendorf Reseach (Eppendorf, Nemčija) različnih volumnov. Za pripravo vzorcev smo poleg reagentov potrebovali centrifugo Eppendorf Centrifuge 5415 R (Eppendorf, Nemčija), mešalnik Vibromix 10 (Tehtnica, Slovenija) in termoblok CH-100 (Biosan, Latvija). Za AGE smo gele pripravili v kadičkah Wide Mini- Sub Cell GT (BIO-RAD, ZDA) in rezultate preverjali s transiluminatorjem iBright (Thermo Scientific, ZDA). Koncentracije DNA smo preverjali s spektrofotometrom NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 (Thermo Scientific, ZDA). Med pripravo vzorcev, pufrov in gojišč smo uporabljali deionizirano ultračisto vodo MQ, pridobljeno z napravo za pripravo ultračiste vode MilliQ RG (Merck Millipore, ZDA). Voda se med drugimi filtrira skozi 0,22 µm membranski filter.
Slika 7: Elektroforezni standard velikosti λ DNA-HindIII. Predstavljen na 1-% agaroznem gelu z maso 0,5 µg/progo v 1× pufru TAE [30].
3.2 MATERIALI ZA DELO Z BAKTERIJSKIMI KULTURAMI
3.2.1 Bakterijske kulture in sevi
Pri laboratorijskem delu smo uporabljali dva različna seva bakterij Escherichia coli. Na podlagi namena postopka smo določili, kateri sev je primernejši. Seva imata točno določen genotip in lastnosti, zaradi katerih sta primerna za transformacijo z vektorjem.
Escherichia coli DH5α
DH5α je sev, ki ga uporabljamo za kloniranje in je najpogosteje uporabljen sev pri postopkih rutinskega kloniranja. Značilno je, da ima precej visoko učinkovitost transformacije. Uporabljali smo ga med molekulskim kloniranjem za pridobivanje večjih količin vektorjev in za kasnejšo izolacijo vektorskih konstruktov. Zaradi mutacij v zapisih za rekombinazo recA je zmanjšana možnost rekombinacij; dodatno so uvedene mutacije v zapisih za nukleazi endA in hsd, kar zmanjša razgrajevanje odvečne DNA.
Escherichia coli BL21[DE3]
E. coli BL21[DE3] je sev za izražanje rekombinantnih Na genomu ima zapis za bakteriofagno RNA-polimerazo T7, ki zagotavlja specifično izražanje genov pod promotorjem T7 na vektorju. Pomembne so tudi mutacije v določenih proteazah, ki zmanjšajo verjetnost razgradnje proteinov.
3.2.2 Bakterijska gojišča
Za gojenje bakterij smo uporabljali kompleksno gojišče LB. V nekaterih primerih je bil gojišču dodan antibiotik ali/in agar.
Tekoče gojišče LB je bogato kompleksno gojišče. Sestava omogoča rast bakterij in je v splošnem bogata s peptidi, vitamini, minerali in elementi v sledeh (žveplo, magnezij, dušik). Priprava: 10 g NaCl, 5 g kvasnega ekstrakta in 10 g peptona, voda MQ do 1000 ml. Pred uporabo avtoklaviramo.
Tekoče gojišče LBK smo pripravili tako, da smo v gojišče LB dodali antibiotik kanamicin. Shranjen je v založni koncentraciji 30 mg/ml, pri čemer je priporočena končna koncentracija v gojišču LBK, s katerim delamo, 30 µg/ml. Sestava: 400 ml gojišča LB, 400 µl založne raztopine kanamicina. Pomembno je aseptično dodajanje antibiotika.
Trdno gojišče LBK smo pripravili na enak način kot tekoče gojišče LB s to razliko, da smo pred avtoklaviranjem dodali še agar. Sestava: 1,5 g agarja in 100 ml gojišča LB avtoklaviramo in ohladimo na 50 °C. Aseptično dodamo 100 µl založne raztopine kanamicina in še nestrjeno gojišče v sterilni komori (Wesemann Laboreinrichtungen, Nemčija) prelijemo v petrijevke.
3.2.3 Kemikalije za delo z bakterijskimi kulturami
Kemikalije, pomembne pri delu z bakterijskimi kulturami, so bile agar (Sigma Aldrich, Nemčija), IPTG (GBT, ZDA), kanamicin (GBT, ZDA), pepton (Oxoid, Velika Britanija), kvasni ekstrakt/Bacto Yeast Extract (BD, ZDA), natrijev klorid (Merck, ZDA), voda MQ in pufer Tris/HCl (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4).
3.2.4 Pomembnejša laboratorijska oprema za delo z bakterijskimi kulturami Med pomembnejšo opremo, ki smo jo potrebovali pri delu z bakterijskimi kulturami, štejemo tehtnico 0,01 mg–220 g (Mettler Toledo, Švica), vodno kopel tipa 1013 (GFL, Nemčija), napravo za merjenje celične gostote ULTROSPEC 10 (Biochrom, Združeno kraljestvo), kivete za merjenje celične gostote 1,5 ml (BRAND, Nemčija), stresalnika ISF-1-V (AdolfKuhner Ag, Švica) in Kambič IS-200K (Kambič, Slovenija), centrifugi Rotina 35 R in Rotina 38 R (Hettich, Nemčija), sonikator Ultrasonic Processor (Cole- Parmer, ZDA), filtri za brizge 0,22 μm in 0,45 µm (Millipore, Irska), magnetno mešalo (Biosan, Latvija) in magneti za mešanje (različni proizvajalci).
3.3 MATERIALI ZA ANALIZO IZRAŽANJA IN IZOLACIJO REKOMBINANTNIH PROTEINOV
3.3.1 Materiali za NaDS-PAGE
Za NaDS-poliakrilamidno gelsko elektroforezo smo uporabljali vnaprej pripravljene poliakrilamidne gele NuPAGE Bis-Tris Mini Gel (Thermo Scientific, ZDA), ki so ustvarjeni za optimalno ločevanje in ločljivost manjših in srednje velikih proteinov (1,5–
300 kDa). Uporabljali smo gele z gradientno zamreženostjo 4–12 %, debelino 1,0 mm ter 12 nanašalnimi žepki/kanali. Elektroforeza je potekala v pufru 1× MES (Sigma, ZDA) Za učinkovito nanašanje vzorcev smo jim dodali 1 µl 500 mM DTT (Sigma Aldrich, Nemčija) in 4× NuPAGE LDS Sample Buffer (Thermo Scientific, ZDA), ki zagotovi, da se vzorec posede v žepek. Prav tako vsebuje barvili Coomassie G250 in fenol rdeče, s katerima lahko sledimo poteku elektroforeze. Po končani NaDS-PAGE smo gele spirali z vodo MQ in barvali z barvilom ProBlue SafeStain (Giotto Biotech, Italija). Razbarvanje je potekalo v vodi MQ. Gele smo razbarvali s spiranjem v vodi MQ.
Za uspešno NaDS-PAGE in analizo rezultatov je potreben velikostni proteinski standard, s katerim lahko ocenimo velikosti posameznih proteinskih linij. Uporabljali smo Novex®
Sharp Unstained Protein Standard (Thermo Scientific, ZDA), ki vsebuje proteine velikosti 3,5–260 kDa (slika 8) [31].
3.3.2 Materiali za afinitetno kromatografijo in gelsko filtracijo
Aminokislinsko zaporedje rekombinantnih proteinov je načrtovano tako, da ima na C- koncu dodano histidinsko oznako His6. To nam omogoča izolacijo proteinov z nikljevo afinitetno kromatografijo. Za izolacijo smo uporabljali 10-mililitrsko kolono z nosilcem Ni-NTA (Quiagen, Nemčija) s sefaroznim nosilcem z imobiliziranimi Ni2+ ioni. Za vezavo smo uporabljali vezavni pufer in pufer za spiranje.
- Vezavni pufer: 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4
- Pufer za spiranje: 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 7,4 - Dializni pufer: 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4 (enak vezavnemu pufru) Po kromatografiji smo proteine dodatno očistili z gelsko filtracijo, ki je potekala v vezavnem pufru. Vzorec za gelsko filtracijo smo nanašali na kolono Superdex 200 26/60 (GE Healthcare, ZDA) oz. Superdex 75 16/300 (GE Healthcare, ZDA). Koloni ločujeta proteine v območju velikosti 10–600 kDa oziroma 3–70 kDa. Uporabljali smo vezavni pufer.
Kemikalije in aparature za pripravo pufrov so: HCl (Sigma Aldrich, Nemčija), imidazol (Sigma, ZDA), NaCl (Merck, Nemčija), Tris baza (Sigma, ZDA), PES membranski filtri 0,22 μm – Exspress@PLUS (Millipore, Irska), pH-meter Seven easy (Mettler Toledo, ZDA).
Slika 8: Proteinski standard Novex Sharp Unstained Protein Standard (10 µl), predstavljen na 4–12-% Bis-Tris gelu v 1-% pufru MES [31].
