UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Ina TREFALT
MEHANIZMI DELOVANJA PROTIMIKROBNIH UČINKOVIN NARAVNEGA IZVORA NA BAKTERIJE VRSTE CAMPYLOBACTER JEJUNI
DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana
Ljubljana, 2022
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Ina TREFALT
MEHANIZMI DELOVANJA PROTIMIKROBNIH UČINKOVIN NARAVNEGA IZVORA NA BAKTERIJE VRSTE CAMPYLOBACTER
JEJUNI
DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana
THE MECHANISM OF ANTI-CAMPYLOBACTER JEJUNI ACTION OF NATURAL ANTIMICROBIAL AGENTS
B. SC. THESIS
Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition
Ljubljana, 2022
Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študijskega programa 1. stopnje Živilstvo in prehrana.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje Oddelka za živilstvo je za mentorico diplomskega dela imenovala izr. prof. dr. Anjo Klančnik in za recenzentko doc. dr. Nežo Čadež.
Mentorica: izr. prof. dr. Anja KLANČNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Recenzentka: doc. dr. Neža ČADEŽ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik:
Mentorica:
Recenzentka:
Datum zagovora:
Ina Trefalt
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 579.24/.26:547.9(043)=163.6
KG Campylobacter jejuni, protimikrobne učinkovine naravnega izvora, odpornost proti antibiotikom, biofilm, mehanizmi delovanja
AV TREFALT, Ina
SA KLANČNIK, Anja (mentorica), ČADEŽ, Neža (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2022
IN MEHANIZMI DELOVANJA PROTIMIKROBNIH UČINKOVIN NARAVNEGA
IZVORA NA BAKTERIJE VRSTE CAMPYLOBACTER JEJUNI TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja Živilstvo in prehrana) OP VII, 25 str., 7 pregl., 3 sl., 49 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Bakterije vrste C. jejuni so najpogostejše povzročiteljice kampilobakterioze ter gastroenteritisov pri človeku. Za svoje razmnoževanje in rast potrebujejo optimalne pogoje, zato so znani kot zelo zahtevni in občutljivi mikroorganizmi. Sposobnost tvorbe biofilmov jim omogoča večjo odpornost na protimikrobne učinkovine ter s tem lažje preživetje. Nadzor bakterij v odporni obliki biofilmov zahteva uporabo še večjih koncentracij antibiotikov. Problem naraščajoče odpornosti bakterij zato zahteva vpeljavo novih alternativnih strategij za nadzor nad odpornimi sevi in odpornimi oblikami biofilma. Ena od alternativnih strategij je uporaba protimikrobnih učinkovin naravnega izvora in sicer v njihovih sub-inhibitornih koncentracijah. V teh koncentracijah učinkovine ne vplivajo na rast, ampak na druge lastnosti bakterij in tako ne povzročajo razvoja odpornosti. Namen naloge je bil: (i) predstaviti različne učinkovine naravnega izvora in njihovo dokazano delovanje na inhibicijo tvorbe in redukcijo nastalega biofilma bakterij C. jejuni, (ii) opisati mehanizme delovanja na različnih celičnih nivojih C. jejuni ter (iii) primerjati tarčno delovanje antibiotikov in učinkovin naravnega izvora pri bakterijah C. jejuni. V zaključku naloge smo opisali modulacijo genov oz- proteinov, ključnih za nastanek biofilma ter vključene v mehanizme gibljivosti, adhezije in medcelične komunikacije, v celicah tretiranimi z učinkovinami naravnega izvora. Na ta način smo dokazali tarčne mehanizme delovanja protimikrobnih učinkovin naravnega izvora na C. jejuni.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 579.24/.26:547.9(043)=163.6
CX Campylobacter jejuni, natural antimicrobial agents, antibiotic resistance, biofilm, mechanisms of action
AU TREFALT, Ina
AA KLANČNIK, Anja (supervisor), ČADEŽ, Neža (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology
PY 2022
TI THE MECHANISM OF ANTI-CAMPYLOBACTER JEJUNI ACTION OF NATURAL ANTIMICROBIAL AGENTS
DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes: Field Food Science and Nutrition) NO VII, 25 p., 7 tab., 3 fig., 49 ref.
LA sl AL sl/en
AB Bacteria of the species C. jejuni are the most common causative agents of campylobacteriosis and gastroenteritis in humans. They require optimal conditions for their replication and growth, which is why they are known to be very fastidious and sensitive microorganisms. The ability to form biofilms makes them more resistant to antimicrobial agents and thus more survivable. To control bacteria in the resistant form of biofilms require the use of even higher concentrations of antibiotics.
Therefore increasing bacterial resistance requires the introduction of new alternative strategies to combat resistant strains and resistant forms of biofilms. One of these alternative strategies is the use of antimicrobial agents of natural origin at their subinhibitory concentrations. At these concentrations, the agents do not affect the growth but other properties of the bacteria and thus do not lead to development of resistance. The purpose of this thesis was: (i) to present different compounds of natural origin and to demonstrate their ability to inhibit biofilm formation or reduce the formed biofilm of C.jejuni, (ii) to describe the mechanisms of action at different cellular levels of C. jejuni, and (iii) to compare the target effect of antibiotics and compounds of natural origin on C. jejuni. At the end, we described the modulation of genes or proteins crucial for biofilm formation and their involvement in the mechanisms of motility, adhesion and intercellular communication, in cultures treated with natural antimicrobial agents. In this way, we have explained the target mechanisms of action of antimicrobial agents of natural origin in C. jejuni cells.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO PREGLEDNIC ... VII KAZALO SLIK ... VII
1 UVOD ... 1
1.1 ALTERNATIVNE STRATEGIJE NADZORA BAKTERIJ CAMPYLOBACTER JEJUNI Z UPORABO UČINKOVIN NARAVNEGA IZVORA ... 1
1.2 NAMEN, CILJI IN HIPOTEZE NALOGE ... 1
1.2.1 Namen naloge ... 1
1.2.2 Cilji naloge ... 1
1.2.3 Hipoteze naloge ... 2
2 PREGLED OBJAV ... 3
2.1 BAKTERIJE VRSTE CAMPYLOBACTER JEJUNI ... 3
2.2 NARAVNI HABITATI BAKTERIJ C. JEJUNI ... 4
2.3 MEHANIZMI ODPORNOSTI PROTI ANTIBIOTIKOM BAKTERIJ C. JEJUNI ... 4
2.3.1 Modifikacije proteinov bakterijske DNA ... 5
2.3.2 Prepustnost membrane ... 5
2.3.3 Sistem izlivnih črpalk ... 5
2.3.4 Encimska inaktivacija antibiotikov ... 6
2.4 BIOFILM BAKTERIJ C. JEJUNI TER STOPNJE NASTANKA BIOFILMA ... 6
2.4.1 Biofilm bakterij C. jejuni ... 6
2.4.2 Reverzibilna pritrditev celic na podlago ... 7
2.4.3 Ireverzibilna pritrditev celic na podlago ... 8
2.4.4 Kolonizacija površine ... 8
2.4.5 Tvorba zunajceličnega matriksa ... 8
2.4.6 Komunikacija med celicami ... 8
2.5 PROTIMIKROBNE UČINKOVINE NARAVNEGA IZVORA S PROTIBIOFILMSKIM DELOVANJEM PROTI BAKTERIJAM C. JEJUNI ... 9
2.5.1 Evgenol ... 11
2.5.1.1 Protibiofilmsko delovanje evgenola ... 11
2.5.1.2 Mehanizem delovanja evgenola ... 12
2.5.2 Resveratrol ... 12
2.5.2.1 Protibiofilmsko delovanje resveratrola ... 12
2.5.2.2 Mehanizem delovanja resveratrola ... 13
2.5.3 Karvakrol ... 13
2.5.3.1 Mehanizem delovanja karvakrola ... 13
2.5.4 Linalool ... 13
2.5.4.1 Mehanizem delovanja linaloola ... 13
2.6 DELOVANJE NARAVNIH UČINKOVIN NA INHIBICIJO NASTANKA BIOFILMA TER REDUKCIJO NASTALEGA BIOFILMA ... 14
2.6.1 Mehanizem adhezije bakterij C. jejuni ... 14
2.6.2 Mehanizem gibljivosti bakterij C. jejuni ... 14
2.6.3 Mehanizem medcelične signalizacije bakterij C. jejuni ... 15
2.6.4 Modifikacija površine celic ... 16
2.6.5 Odgovor na dejavnike stresa ... 16
2.7 PRIMERJAVA TARČNIH MEHANIZMOV UČINKOVIN NARAVNEGA IZVORA IN ANTIBIOTIKOV ... 17
3 POVZETEK ... 20
4 VIRI ... 21 ZAHVALA
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1: Antibiotiki, njihove tarčne molekule ter mehanizem odpornosti celic ... 4 Preglednica 2: Protimikrobne učinkovine naravnega izvora, uporabljene koncentracije, metode ter dokazano delovanje ... 10 Preglednica 3: Učinkovine naravnega izvora, njihov učinek na gene in proteine, ki so vključeni v mehanizem adhezije... 14 Preglednica 4: Učinkovine naravnega izvora, njihov učinek na gene in proteine, ki so vključeni v mehanizem gibljivosti bakterij ... 15 Preglednica 5: Učinkovine naravnega izvora, njihov učinek na gene in proteine, ki so vključeni v mehanizem medcelične signalizacije ... 15 Preglednica 6: Učinkovine naravnega izvora, njihov učinek na gene in proteine, ki so vključeni v mehanizem modifikacije površine celic ... 16 Preglednica 7: Učinkovine naravnega izvora, njihov učinek na gene in proteine, ki so vključeni v mehanizme celičnih odgovorov na dejavnike stresa ... 17
KAZALO SLIK
Slika 1: Bakterija vrste Campylobacter jejuni (CDC, 2021) ... 3 Slika 2: Prva faza razvoja biofilma (narejeno z BioRender.com) ... 7 Slika 3: Primerjava tarčnega delovanja učinkovin naravnega izvora in antibiotikov
(narejeno z BioRender.com) ... 18
1 UVOD
1.1 ALTERNATIVNE STRATEGIJE NADZORA BAKTERIJ CAMPYLOBACTER JEJUNI Z UPORABO UČINKOVIN NARAVNEGA IZVORA
Bakterije Campylobacter jejuni so najpogostejši povzročitelji gastroenteritisov in kampilobakterioze pri ljudeh pogosto zaradi uživanja neustrezno toplotno obdelanega piščančjega mesa. Kampilobakterioza, ki se zdravi z antibiotiki, lahko ob okužbi povzroči bruhanje, drisko ali vročino. Antibiotiki zavirajo rast bakterij, zato bakterije vzpostavijo obrambne mehanizme, s katerimi modificirajo celično površino, zavrejo delovanje antibiotika ali ga izločijo s pomočjo izlivne črpalke. Takšne lastnosti jim omogočajo boljše preživetje v okolju, tvorbo odpornih oblik biofilmov in lažji medsebojni prenos virulentnih genov. S tvorbo biofilmov se poveča odpornost proti različnim dejavnikom stresa, med katerimi so tudi protimikrobne učinkovine.
Novo možnost preprečevanja nastanka biofilma in redukcijo nastalega biofilma pa omogočajo učinkovine naravnega izvora, ki delujejo na več različnih celičnih tarč bakterij C. jejuni, kot so modulacija adhezije, gibljivosti, odgovor stresa celic ter medcelična komunikacija preko sistema signalizacije. Alternativne strategije ne vključujejo koncentracij, s katerimi vplivamo na rast bakterij, ampak sub-inhibitorne koncentracije, s katerimi vplivamo na druge celične lastnosti. Ker so koncentracije manjše, ne povzročajo razvoja odpornosti (Klančnik in sod., 2021).
1.2 NAMEN, CILJI IN HIPOTEZE NALOGE 1.2.1 Namen naloge
Namen dela je predstaviti mehanizme delovanja protimikrobnih učinkovin naravnega izvora, ki delujejo na različnih celičnih nivojih bakterij C. jejuni na nastanek biofilma ter zmanjšujejo že nastale biofilme (protibiofilmsko delovanje). V nalogi smo se prav tako usmerili ter primerjali znane mehanizme odpornosti bakterij proti antibiotikom ter odpornosti s prehodom v biofilm. V zaključku smo predstavili učinkovine naravnega izvora kot dober alternativni način nadzora nastajanja odpornih oblik ter biofilmov z manjšo zmožnostjo razvoja odpornosti.
1.2.2 Cilji naloge
- Raziskati molekularne mehanizme delovanja učinkovin naravnega izvora ter njihov vpliv na različne faze tvorbe biofilma bakterij C. jejuni na različnih površinah.
- Preko analize literature raziskati:
(i) katere protimikrobne učinkovine naravnega izvora imajo dokazano delovanje na posamezne faze nastanka biofilmov ali že nastalega biofilma.
(ii) način delovanja teh učinkovin na nivoju nukleinskih kislin/proteinov.
(iii) ugotoviti ali so specifični inducirani geni/proteini vključeni v adhezijo, komunikacijo z drugimi mikroorganizmi, gibljivost, kemotakso ali tvorbo adhezinov na površini.
(iv) podrobneje opisati mehanizme odpornosti proti antibiotikom, ter odpornosti bakterijskih celic v biofilmu. Na koncu še primerjati novejše mehanizme delovanja protimikrobnih učinkovin naravnega izvora in antibiotikov znotraj celice.
- V zaključku narediti izbor proteinov/genov, ki so posledica delovanja protimikrobnih učinkovin naravnega izbora ter predstaviti potencialne mehanizme, v katere so vključeni.
Slednji bodo predstavljali tarče alternativne strategije nadzora preko preprečevanja nastanka ali zmanjševanja že nastalega biofilma.
1.2.3 Hipoteze naloge
Glavna hipoteza predpostavlja, da bomo izpostavili gene/proteine, na katere delujejo protimikrobne učinkovine naravnega izvora in so vključeni v več mehanizmov delovanja protimikrobnih učinkovin v bakterijski celici, in sicer na nivojih znotraj celice (metabolizem, osnovne funkcije celic), membrane (transport in adhezini) ali so vključeni v nastanek biofilma (gibljivost, adhezija in komunikacija).
2 PREGLED OBJAV
2.1 BAKTERIJE VRSTE CAMPYLOBACTER JEJUNI
Bakterije C. jejuni so gibljivi, nesporogeni, majhni in spiralno zaviti gramnegativni bacili.
Široki so približno od 0,2 μm do 0,9 μm in dolgi od 0,5 μm do 5,0 μm. Rastejo v obliki verige ali v parih. Slika 1 prikazuje njihovo značilno spiralno obliko S (Ammar in sod., 2021;
Goni in sod., 2017; Silva in sod., 2018).
Slika 1: Bakterija vrste Campylobacter jejuni (CDC, 2021)
Zaradi zahtevnih in specifičnih pogojev, ki jih potrebujejo za rast in razmnoževanje, so znani kot občutljivi mikroorganizmi (Ammar in sod., 2021). Eden od teh pogojev je rast v mikroaerofilnem okolju z deležem kisika od 3 % do 15 %, ogljikovega dioksida od 3 % do 10 % in dušika 85 % (Ammar in sod., 2021; Goni in sod., 2017). Optimalno rast in razmnoževanje teh termotolerantnih bakterij omogoča temperatura 42 °C ter vrednost pH med 5,5 ter 8,0, saj je preveč kislo ali bazično okolje za njih uničujoče. Za pridobitev energije ne morejo izkoristiti enostavnih sladkorjev preko fermentacije ali celičnega dihanja.
Namesto tega uporabijo aminokisline in intermediate Krebsovega cilka (Ammar in sod., 2021).
Pri analizi biokemijskih lastnostih so bakterije C. jejuni oksidaza pozitivni, katalaza pozitivni, ureaza negativni ter ne tvorijo indolovega obroča (Ammar in sod., 2021; Goni in sod., 2017).
2.2 NARAVNI HABITATI BAKTERIJ C. JEJUNI
Bakterije C. jejuni so komensali črevesnega prebavnega trakta goveda, prašičev, perutnine, mačk in psov zaradi njihove ugodne ter rahlo povišane telesne temperature. V primeru okužbe z bakterijami C. jejuni je izvor ali vzrok težje ugotoviti zaradi mnogih gostiteljev (Ammar in sod., 2021; Skarp in sod., 2016). Z nepopolnim vzdrževanjem higiene med predelavo kontaminiranega mesa ter neustrezno toplotno obdelavo je velika možnost okužbe, ki povzroča črevesno bolezen kampilobakteriozo.
S suhimi toplotnimi postopki obdelave živil, kot so cvrenje, praženje in pasterizacija, je bakterije C. jejuni možno povsem uničiti. Občutljivost celic izkoristimo pri inaktivaciji celic z uporabo različnih stresorjev, kot so sevanje, razkuževanje, zmrzovanje, kislost, sušenje in uporaba toplote. Njihov dedni zapis ne vsebuje gena za sintezo proteinov hladnega šoka, kar pomeni nezmožnost preživetja pri temperaturah nižjih od 30 °C in pod vodno aktivnostjo 0,987. Kljub občutljivosti pri teh specifičnih pogojih lahko preživijo tudi pri 13 °C, če tvorijo biofilm (Ammar in sod., 2021; Micciche in sod., 2019). Sposobnost tvorbe biofilmov jim omogoča bistveno lažje preživetje pri pogojih z neustreznim temperaturnim režimom in višjim parcialnim/delnim tlakom kisika. Omogoča jim tudi boljšo odpornost na protimikrobne učinkovine in večjo pojavnost na površinah s stikom proizvodnje živil.
2.3 MEHANIZMI ODPORNOSTI PROTI ANTIBIOTIKOM BAKTERIJ C. JEJUNI Namen študija mehanizmov vključenih v razvoj odpornosti proti antibiotikom je izpostavitev ključnih tarčnih mest delovanja antibiotikov znotraj celic bakterij C. jejuni; ter raziskava/primerjava ali so isti mehanizmi vključeni pri razvoju odpornosti celic znotraj biofilma.
V preglednici 1 so zbrane znotrajcelične tarče, ki so v literaturi izpostavljene kot pomembne pri razvoju odpornosti proti antibiotikom skupin fluorokinoloni, makrolidi ter ß-laktami.
Posamezni tarčni mehanizmi bakterij C. jejuni so v nadaljevanju naloge podrobneje opisani.
Preglednica 1: Antibiotiki, njihove tarčne molekule ter mehanizem odpornosti celic
Skupina antibiotikov Tarčna molekula Tarčni mehanizem/spremembe
Fluorokinoloni Giraza DNA Mutacija gena gyrA
Makrolidi (eritromicin) Ribosomska podenota 50S Sprememba tarčnega proteina, izlivne črpalke, sprememba
permeabilnosti membrane ß-laktami (cefalosporini,
penicilini, karbapenemi
Peptidoglikanske transpeptidaze
Sinteza encima ß-laktamaza
Odpornost proti antibiotikom vključuje več mehanizmov. V nalogi so podrobneje raziskani mehanizmi: proteini bakterijske DNA, permeabilnost membrane ter izlivne črpalke. V
nadaljevanju so opisani tudi posamezni tarčni mehanizmi, vključeni v odpornost proti različnim antibiotikom.
2.3.1 Modifikacije proteinov bakterijske DNA
V skupino fluorokinolonov spadajo antibiotiki ciprofloksacin in nalidiksična kislina. Vzrok povečane odpornosti bakterij C. jejuni proti fluorokinolonom je predvsem prepogosta uporaba v mesni industriji z zdravljenjem živali in pri zdravljenju bolnikov. Mehanizmi odpornosti bakterij inaktivirajo fluorokinolone znotraj celice z mehanizmom modifikacije tarčnega proteina giraza DNA, vključenega v mehanizem prepisovanja DNA in aktivacijo izlivnih črpalk (Iovine, 2013). Tarčna spojina fluorokinolonov je giraza DNA, sestavljena iz proteinskih podenot proteinov GyrA ter GyrB, ki ju kodirata gena gyrA in gyrB. Ko fluorokinoloni vstopijo v celico, spodbudijo nastanek kompleksa encima giraze DNA in bakterijske DNA, posledica pa je inhibicija podvajanja in prepisovanja DNA ter smrt celice (Iovine, 2013; Shea in Hiasa; 1999; Willmott in sod., 1994). Pri razvoju odpornosti pa pride do specifične nadomestitve kodona 86 ter substitucije izolevcina ter treonina pri prepisu aminokisline na kodirajoči regiji gena gyrA. Tako celica pridobi odpornost proti nalidiksični kislini in ciprofloksacinu. Ta mutacija tudi onemogoči nastanek kompleksa med encimom girazo DNA ter bakterijsko DNA (Kurinčič, 2011). Izlivna črpalka aktivno črpa fluorokinolone iz celice ter tako zmanjšuje njihovo znotrajcelično koncentracijo ter tako zmanjšuje vpliv na tarčne mehanizme.
2.3.2 Prepustnost membrane
V skupino makrolidov spada antibiotik eritromicin. Makrolidi so antibiotiki, ki inhibirajo sintezo bakterijskih proteinov preko reverzibilne vezave na ribosomsko podenoto 50S.
Glavni mehanizmi odpornosti proti makrolidom bakterij C. jejuni so modifikacija genov, ki kodirajo rRNA, aktivacija izlivnih črpalk in sprememba permeabilnosti membrane. V odpornost proti makrolidom so vključene tarčne mutacije rRNA na mestih genov 2075 in 2074 23S (Luangtongkum in sod., 2009). Tretji mehanizem opisuje spremembo permeabilnosti membrane s povečanim izražanjem porinov, proteinov zunanje membrane, ki jih kodira gen porA. Porini bakterije C. jejuni tvorijo transmembranske pore v zunanji membrani, preko katerih je mogoča pasivna difuzija majhnih hidrofilnih molekul v zunajcelično okolje (Iovine, 2013). Pore s svojo velikostjo in nabojem preprečujejo prehod visoko molekularnih in negativno nabitih antibiotikov, kot so makrolidi v notranjost celic (Iovine, 2013; Page in sod., 1989).
2.3.3 Sistem izlivnih črpalk
Sistem izlivnih črpalk sestavljajo proteini zunanje membrane, ki nespecifično črpajo fluorokinolone, makrolide, tetracikline ter ß-laktame iz celice v zunajcelično okolje. Izlivne črpalke spadajo med transporterje, ki se nahajajo v citoplazemski membrani (Jubair in sod., 2021). Ena izmed glavnih je izlivna črpalka CmeABC. To je pomembni celični mehanizem
obrambe, ki se vklopi ob vstopu visokih koncentracij antibiotika v notranjost celice (Jubair in sod., 2021). Preko operona cmeABC se sintetizirajo trije proteini izlivne črpalke (CmeA, CmeB, CmeC), ki oblikujejo membranski kanal. Na delovanje in izražanje operona vpliva transkripcijski represor CmeR, ki se veže na operator in inhibira transkripcijo. Možnost izboljšanja odpornosti proti protimikrobnim učinkovinam predstavlja insercijska mutageneza na genu cmeR, s katero lahko vplivamo na zmanjšano vezavo proteina CmeR na operator in na povečano izražanje izlivne črpalke (Lin in sod., 2005).
Poleg odpornosti proti antibiotikom izlivna črpalka CmeABC pripomore k odpornosti proti žolčnim solem. Druge pomembne izlivne črpalke, vključene v mehanizme odpornosti so CmeDEF in CmeG (Iovine, 2013; Lin in sod., 2002).
2.3.4 Encimska inaktivacija antibiotikov
Antibiotiki penicilini, cefalosporini, imipenem, ampicilin in karbapenemi so kemijsko sestavljeni iz stranskih verig in ß-laktamskega obroča, ki ima protimikrobne lastnosti.
Vežejo se na peptidoglikanske transpeptidaze, ki katalizirajo zadnjo fazo izgradnje celične stene. S tem porušijo strukturiranost in integriteto celičnih sten ter povečajo občutljivost na ozmotski stres (Iovine, 2013; Giesbrecht in sod., 1998). Mehanizem odpornosti bakterij C.
jejuni proti spojinam z ß-laktamskim obročem omogoči sintezo lastnih ß-laktamaz, ki preko hidrolize ß-laktamskega obroča inaktivira antibiotik. Pri tem celice C. jejuni v odpornost proti ß-laktamskim antibiotikom vključijo še uporabo transmembranskih por ter sistem izlivnih črpalk (Iovine, 2013; Page in sod., 1989).
2.4 BIOFILM BAKTERIJ C. JEJUNI TER STOPNJE NASTANKA BIOFILMA 2.4.1 Biofilm bakterij C. jejuni
Pomembna lastnost bakterij C. jejuni je premik iz planktonskega načina rasti v statičen, odpornejši način rasti, imenovan biofilm (Guzmán-Soto in sod., 2021). To je kompleksno organizirana struktura bakterijskih celic, ujetih v zunajcelični matriks, pritrjena na površino (Guzmán-Soto in sod., 2021; Costerton in sod., 1999). S spremembo načina rasti celice spremenijo tudi izražanje genov, metabolizem in fenotipske lastnosti in se tako prilagajajo pomanjkanju hranil. Poveča se odpornost proti protimikrobnim učinkovinam in neugodnim pogojem okolja. Dobri pogoji za razvoj biofilmov so dostopnost hranil, vlaga in primerna temperatura. Eden od gostiteljev je tudi človek.
Biofilme lahko sestavlja ena sama vrsta mikroorganizmov ali več različnih kultur, ki jih sestavljajo več vrst, sevov ali taksonomskih razredov. Kljub takšni raznovrstnosti so mehanizmi in stopnje tvorbe biofilma precej podobne med vrstami mikroorganizmov (Guzmán-Soto in sod., 2021).
2.4.2 Reverzibilna pritrditev celic na podlago
Prva stopnja nastanka biofilma vključuje reverzibilno pritrjanje in adsorpcijo z nespecifičnimi interakcijami planktonskih celic na živo ali neživo površino (Guzmán-Soto in sod., 2021, Bos in sod., 1999). Na to kako močno se bodo celice pritrdile na površino, narekuje vsota privlačnih in odbijajočih sil, mikrobna vrsta, tip površine in medij rasti.
Površina bakterijskih celic je opremljena s flagelami in fimbriji, filamentoznimi strukturami, ki zagotavljajo premikanje, preživetje in ustrezno interakcijo s površino v prvi stopnji (Guzmán-Soto in sod., 2021). Flagele vplivajo na natančno usmerjeno gibanje celic proti višji koncentraciji hranil (kemotakso), medtem ko fimbriji, beljakovinski polimeri, obdajajo celično steno in delujejo kot virulentni faktorji med okužbo (Guzmán-Soto in sod., 2021).
Po vezavi z nespecifičnimi vezmi (van der Waalsovimi, elektrostatskimi ter kislinsko- bazičnimi interakcijami) na površino se pojavijo kratkotrajne specifične ali nespecifične interakcije, s katerimi se celice vežejo na površino. Celice s flagelami in fimbriji zaznavajo in raziskujejo lokalno območje, kar jim omogoča prilagajanje okolju z modulacijo izražanja genov (Guzmán-Soto in sod., 2021; Li in sod., 2012). Slika 2 prikazuje prvo fazo nastanka biofilma z reverzibilnim pritrjanjem bakterijskih celic in delovanjem nespecifičnih vezi.
Slika 2: Prva faza razvoja biofilma (narejeno z BioRender.com)
2.4.3 Ireverzibilna pritrditev celic na podlago
Druga stopnja nastanka biofilma je ireverzibilna pritrditev celic na površino. V tej fazi sodeluje izražanje adhezinov, sinteza proteinov in lipopolisaharidov ter preureditev flagel, kar vpliva na spremenjeno orientacijo mikrobnih celic za lažjo adhezijo (Guzmán-Soto in sod., 2021). Večino takšnih procesov modulira molekula ciklični dimerni gvanozin monofosfat (c-di-GMP), ki zmanjša gibljivost celic in prispeva k boljši adheziji na površino.
Druga ključna signalna molekula je ciklični adenozin monofosfat (cAMP), ki služi kot sredstvo za ohranjanje spomina samih procesov in faz med tvorbo biofilma (Guzmán-Soto in sod., 2021, Lee in sod., 2018). Temu sledi aktivacija metabolnih procesov in izražanje virulentnih faktorjev za krepitev odpornosti bakterijskih celic proti dejavnikom stresa.
Virulentni geni, ki se izražajo tekom tvorbe biofilmov, so odgovorni za gibljivost celic (geni flaA, flaB, flaC, flaG, fliS in flhA), spremembo celične površine (geni peb4, pgp1 in waaF), medcelično komunikacijo (gen luxS) in odgovor na dejavnike stresa (geni ppk1, spoT, cj1556 in cosR) (García-Sánchez in sod., 2019; Turonova in sod., 2015).
2.4.4 Kolonizacija površine
Po ireverzibilni pritrditvi sledi tretja stopnja nastanka biofilma, to je formacija mikrokolonij z binarno fisijo ali asimetrično delitvijo bakterijskih celic, čemur sledi poliferacija in kolonizacija površine. Aktivira se sinteza zunajceličnega matriksa in sekundarnih signalnih molekul. Prva faza mikrokolonij je tvorba začetne enoslojne plasti biofilma. Druga faza nastane ob delitvi celic, pri kateri se ena od njiju odcepi in se pritrdi na nastalo enoslojno plast celic ali pa ostane v planktonski rasti in kolonizira druge površine z namenom širitve biofilma (Guzmán-Soto in sod., 2021).
2.4.5 Tvorba zunajceličnega matriksa
Bakterijske celice se med seboj zlepljajo s pomočjo fimbrijev, flagel, proteinov M, ogljikovih hidratov ter zunajcelične molekule DNA, ki se lahko v nekaterih primerih obnaša kot aglutinin (Guzmán-Soto in sod., 2021). Z vsemi združenimi mehanizmi se tvorijo majhne mikrokolonije in večplastni sloji celic, obdani z zunajceličnim matriksom, ki služi kot sredstvo podpore biofilma ter prenosa kemičnih signalov. To predstavlja četrto stopnjo nastanka biofilma. Sestava zunajceličnega matriksa močno variira v odvisnosti od temperature, mehanskega stresa in celičnih interakcij. Poleg vode, ki zastopa približno 97 % celotne sestave, vsebuje polisaharide, kamor spadajo zunajcelični polisaharidi in celuloza, proteine, zunajcelično DNA ter ione (Guzmán-Soto in sod., 2021)
2.4.6 Komunikacija med celicami
Ključen je način komuniciranja med bakterijskimi celicami, imenovan 'quorum sensing', ki združuje različne procese in vzorce, kot so bioluminiscenca, virulenca, konjugacija, sporulacija in gibljivost celic (Ćirić in sod., 2019). Ti procesi nastopijo v peti stopnji
nastanka biofilma in se lahko opazijo pri mono- ali mešani kulturi bakterijskih celic z izločanjem avtospodbujevalcev, ki se akumulirajo v notranjosti biofilma. V to skupino spada signalna molekula aciliran homoserinlakton, ki z aktivnim ali pasivnim transportom prehaja v celico skozi celično membrano in se veže na aktivator transkripcije. Ta vezava v kompleks aktivira promotorsko regijo in izražanje genov za gibljivost ter sintezo zunajceličnih polisaharidov (Ćirić in sod., 2019).
Manjše mikrokolonije začenjajo agregirati, tvorijo makrokolonije in povečajo debelino biofilma. Struktura se stabilizira pod delovanjem QS sistema in doseže se najvišja celična gostota (Guzmán-Soto in sod., 2021).
2.5 PROTIMIKROBNE UČINKOVINE NARAVNEGA IZVORA S
PROTIBIOFILMSKIM DELOVANJEM PROTI BAKTERIJAM C. JEJUNI
V literaturi smo spremljali in definirali dve vrsti protibiofilmskega delovanja učinkovin in sicer:
(i) inhibicijo tvorbe biofilma ter (ii) redukcijo nastalega biofilma.
Fitokemikalije so naravne učinkovine, ki jih rastline sintetizirajo kot sekundarne metabolne produkte za zaščito proti patogenim mikroorganizmom. Zaradi protimikrobnega potenciala so se v preteklosti pogosto uporabljale za zdravljenje različnih okužb (Wagle in sod., 2019;
Borges in sod., 2016). Takšne bioaktivne komponente vsebujejo tudi sadje, zelenjava, stročnice, semena, oreški in čaj (Klančnik in sod., 2021).
Podrobneje smo opisali učinkovine evgenol, resveratrol, karvakrol ter linalol. Evgenol, karvakrol in linalol imajo v Združenih državah Amerike pridobljen status GRAS (angl.
Generally Recognized as Safe), ki ga podeljuje ameriška Uprava za hrano in zdravila. Lahko se uporabljajo kot dodatki k živilom kot konzervansi in ojačevalci okusa (Liu in sod., 2021).
V Evropski Uniji pa je njihova uporaba kot dodatek k živilom prepovedana. Osredotočili smo se na njihovo delovanje ter ga povezali z mehanizmi delovanja na molekularnem nivoju. V preglednici 2 so zbrane protimikrobne učinkovine naravnega izvora, njihove uporabljene koncentracije in metode; ter njihovo dokazano delovanje.
Preglednica 2: Protimikrobne učinkovine naravnega izvora, uporabljene koncentracije, metode ter dokazano delovanje
Učinkovine/vir Koncentracija Metoda Dokazano delovanje
Amentoflavon (Klančnik in sod.,
2018)
1 mg/mL Adhezija na polistirenskih mikrotitrskih ploščah
Inhibicija tvorbe biofilma preko inhibicije adhezije
za 65 %.
Eterično olje koriandra (Duarte in sod.,
2016)
C. jejuni ATCC 33560:
2 μg/mL (4 × 𝑀𝐼𝐾) C. jejuni 225421:
4 μg/mL (4 × 𝑀𝐼𝐾)
Inhibicija tvorbe biofilma z dodatkom učinkovine v MHB
ter inkubacijo (48 ur, 37 °C)
Inhibicija tvorbe biofilma za 75 % in 85 %.
Redukcija nastalega biofilma za 77 % in 85 %.
Evgenol (Wagle in sod.,
2019)
0,61 – 60,90 mM Inhibicija tvorbe biofilma za 48 ur. Redukcija nastalega biofilma po inkubaciji (48 ur,
37 °C ali 20 °C, 1 – 10 min).
Redukcija nastalega biofilma na ploščicah nerjavečega jekla pod 7,0 log CFU/mL po inkubaciji
(20 °C, 5 min, najvišja koncentracija) . Karvakrol
(Wagle in sod., 2019)
0,13 – 66,56 mM Inhibicija tvorbe biofilma z dodatkom ter inkubacijo (48
ur, 37 °C ali 20 °C, 1 – 10 min).
Redukcija nastalega biofilma na ploščicah nerjavečega jekla pod 7,0 log CFU/mL po inkubaciji
(20 °C, 5 min, najvišja koncentracija).
Resveratrol/
ciklodekstrin (Duarte in sod.,
2015)
1,024 mg/mL (4 × 𝑀𝐼𝐾) Inhibicija tvorbe biofilma v polistirenskih mikrotitrskih ploščah po inkubaciji (48 ur,
37 °C, mikroaerofilno)
Inhibicija tvorbe biofilma od 62 % do 78 %.
Redukcija nastalega biofilma za 60 %.
Linalool (Duarte in sod.,
2016)
C. jejuni ATCC 33560:
2 μg/mL (4 × 𝑀𝐼𝐾) C. jejuni 225421:
4 μg/mL (4 × 𝑀𝐼𝐾)
Inhibicija tvorbe biofilma z dodatkom v MHB v mikrotitrskih ploščah in inkubacija (48 ur, 37 °C).
Inhibicija tvorbe biofilma bakterij od 43 % do 77 %.
Redukcija nastalega biofilma za 75 %.
Papain (Song in sod.,
2020)
5 μg/mL Inhibicija tvorbe biofilma na ploščah nerjavečega jekla po
inkubaciji (2 uri, 37 °C, mikroaerofilno)
Inhibicija tvorbe biofilma za 23,9 % in 22,2 %.
Resveratrol (Duarte in sod.,
2015)
200 μg/mL (2 × 𝑀𝐼𝐾) Inhibicija tvorbe biofilma v polistirenskih mikrotitrskih ploščah po inkubaciji (48 ur,
37 °C, mikroaerofilno)
Inhibicija tvorbe biofilma od 63 % do 94 %.
Redukcija nastalega biofilma za 80 %.
Trans- cinamaldehid (Wagle in sod.,
2019)
0,75 – 75,64 mM Inhibicija tvorbe biofilma po inkubaciji (48 ur). Redukcija nastalega biofilma bakterij C.
jejuni, ki se je razvil v 48 urah po inkubaciji (37 °C ali 20 °C,
1 – 10 min).
Redukcija nastalega biofilma na ploščicah nerjavečega jekla pod 7,0 log CFU/mL po inkubaciji
(20 °C, 5 min, najvišja koncentracija učinkovine).
2.5.1 Evgenol
Evgenol je aktivna spojina olja nageljnovih žbic. Ameriška organizacija Uprava za hrano in zdravila (angl. Food and Drug Administration, FDA) je dovolila dodatek evgenola v živila.
Dodan je lahko v skladu z dobro proizvodno prakso in sicer v minimalnih količinah za dosego željenega senzoričnega učinka (povzeto po FDA, 2021).
2.5.1.1 Protibiofilmsko delovanje evgenola
Evgenolu so Wagle in sod. (2019) najprej določili protimikrobno delovanje preko ovrednotenja minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) (angl. Minimal inhibitory concentration, MIC), torej najnižja koncentracija, ki je zavrla rast bakterij C. jejuni.
Koncentracija MIK je bila 1,83 mM.
Wagle in sod. (2019) so ovrednotili učinek evgenola na inhibicijo tvorbe biofilma in redukcijo nastalega biofilma bakterij vrste C. jejuni NCTC 11168 pri 37 in 20 °C na površini nerjavečega jekla ter polistirena. Za inhibicijo tvorbe biofilma so izbrali 0,61 mM sub- inhibitorno koncentracijo evgenola, torej koncentracijo, ki ni vplivala na rast bakterij.
Biofilm bakterij C. jejuni je na obeh površinah rastel 48 ur ob prisotnosti te učinkovine ter inhibicijo so izmerili po 24 urnem intervalu. Za analizo redukcije nastalega biofilma so na polistirenskih mikrotitskih ploščah in ploščicah iz nerjavečega jekla bakterije C. jejuni NCTC 11168 inkubirali 48 ur pri 20 °C in 37 °C v obogatitvenem gojišču za Campylobacter (angl. Campylobacter enrichment broth, CEB). Nastalim biofilmom so dodali najvišjo koncentracijo evgenola (60,90 mM) za 1, 5 in 10 minut ter kvantificirali redukcijo biofilma.
Učinek evgenola so tudi ovrednotili na nivoju izražanja genov in proteinov, ki so pomembni pri mehanizmih nastanka biofilma.
Sub-inhibitorna koncentracija evgenola (0,61 mM) je učinkovito inhibirala tvorbo biofilma na polistirenu za 0,5 log CFU/mL ter na nerjavečem jeklu za 0,7 log CFU/mL po inkubaciji 24 ur na 20 °C. Inhibicija tvorbe biofilma je tudi bila dokazana na polistirenu za 0,56 log CFU/mL ter na nerjavečemu jeklu za 0,6 log CFU/mL po inkubaciji 24 ur na 37 °C.
Wagle in sod. (2019) so ovrednotili redukcijo nastalega biofilma v obogatitvenem gojišču za Campylobacter z uporabo najvišje koncentracije evgenola (60,90 mM) pri različnih temperaturah (20 °C in 37 °C) in površinah (polistiren in nerjaveče jeklo) po določenem času izpostavljenosti. Najvišje koncentracije evgenola so po eni minuti izpostavljenosti na polistirenskih ploščah reducirale biofilm pod mejo zaznave (za več kot 7 log CFU/mL) pri 20 °C. Pri 37 °C pa je v desetih minutah 60,90 mM koncentracija evgenola reducirala biofilm za 3,84 log CFU/mL. Na ploščah iz nerjavečega jekla so pri 20 °C najvišje koncentracije evgenola (60,90 mM) reducirale rast biofilma pod mejo zaznave v eni minuti izpostavljenosti. Podobni rezultati so bili doseženi pri 37 °C, kjer je 60,90 mM koncentracija evgenola učinkovito znižala število bakterijskih kolonij pod mejo zaznave po eni minuti izpostavljenosti.
2.5.1.2 Mehanizem delovanja evgenola
Pri analizi izražanja genov so ugotovili vpliv evgenola na zmanjšano izražanje genov, vključenih v mehanizem gibljivosti (geni flaA, flaB, flaG, flgA, waaF, cosR in ahpC). Geni flaA, flaB in flaG so pomembni za sintezo flagelinov FlaA, FlaB in FlaG, ključnih v začetnih fazah tvorbe biofilma in tudi pri mehanizmu pritrjevanja na površino. Gen waaF kodira protein WaaF, ki je pomemben za tvorbo biofilma in ščiti bakterijsko celico proti dejavnikom stresa. (Wagle in sod., 2019).
Upadhyay in sod. (2017) so z analizo izražanja genov z metodo PCR v realnem času dokazali učinek 0,01 % koncentracije evgenola na mehanizme gibljivosti in adhezivnosti sevov C. jejuni NCTC 11168 in C. jejuni 81-176 na črevesno sluznico. Evgenol je v koncentraciji 0,01 % na bakterije C. jejuni NCTC 11168 vplival na zmanjšano izražanje gena, vključenega v mehanizem gibljivosti (motA) ter gena, vključenega v mehanizem adhezije (cadF). Pri bakterijah C. jejuni 81-176 je evgenol povečal izražanje genov motA, motB in cadF.
2.5.2 Resveratrol
Resveratrol spada v polifenolno skupino stilbenov, ki vsebujejo dva fenolna obroča, povezana z etilno skupino. Je antioksidant, prisoten v kožici grozdja, vinu, arašidih in soji.
Prisoten je lahko v dveh izomernih oblikah, cis- in trans-resveratrol, pri čemer je v naravi pogostejša slednja oblika (Salehi in sod., 2018). Slabost učinkovine je slabša stabilnost in topnost v vodnem okolju, zato se enkapsulira v večjo molekulo ciklodekstrin (Duarte in sod., 2015). To lahko potencialno vpliva na izboljšane protibiofilmske lastnosti, zaščito pred temperaturo, svetlobo in spremenjeno vrednostjo pH. Ima dobro protimikrobno delovanje, zato jo dodajajo izdelkom z namenom podaljšanja roka uporabnosti in povečanja varnosti mesnih izdelkov (Duarte in sod., 2015).
2.5.2.1 Protibiofilmsko delovanje resveratrola
Duarte in sod. (2015) so raziskovali vpliv resveratrola in enkapsuliranega resveratrola na inhibicijo tvorbe in redukcijo nastalega biofilma na polistirenskih mikrotitrskih ploščah. Pri koncentraciji 1024 μg/mL (4 x MIK) inkluzijskega kompleksa resveratrola in ciklodekstrina so dokazali inhibicijo tvorbo biofilma za 62 % do 78 % celotne biomase. Najvišja koncentracija kompleksa je reducirala biofilm za 60 % biomase. Resveratrol je v koncentraciji 200 μg/mL (2 x MIK) inhibiral tvorbo biofilma za 63 % do 94 % ter reduciral biofilm za 80 %
Nižja učinkovitost kompleksa je lahko zaradi počasnejšega sproščanja resveratrola, nižje razpoložljivosti aktivne učinkovine in slabše protibiofilmske lastnosti.
2.5.2.2 Mehanizem delovanja resveratrola
Duarte in sod. (2015) so dokazali inhibitorno delovanje resveratrola na medcelično signalizacijo z inhibicijo rasti biosenzorskega seva Chronobacterium violaceum in njegovo produkcijo pigmenta volaceina. Sklepali so, da preko takšnega mehanizma resveratrol reducira že nastale biofilme. Dokazana je bila tudi inhibicija tvorbe biofilma z mehanizmom preprečevanja adhezije na polistirenu (Klančnik in sod., 2017).
2.5.3 Karvakrol
Karvakrol je fenolna komponenta začimbe in olja origana (lat. Origanum vulgare), ki je znana po številnih antimikrobnih, protivnetnih in antioksidativnih lastnostih (Liu in sod., 2021).
2.5.3.1 Mehanizem delovanja karvakrola
Wagle in sod. (2019) so raziskovali vpliv sub-inhibitornih koncentracij karvakrola (ter evgenola in trans-cinamaldehida) na gibljivost in adhezijo celic vrste C. jejuni NCTC 11168 na epitelij človeških črevesnih celic. PCR v realnem času, s katerim so analizirali izražanje genov, je pokazal, da je sub-inhibitorna koncentracija 0,002 % spojine karvakrola zmanjšala izražanje genov za gibljivost (motA), adhezijo (cadF) in sintezo CDT toksina (cdtA, cdtB).
2.5.4 Linalool
Linalool je dišeča komponenta naravnih eteričnih olj z antioksidativnim in antimikrobnim učinkom, ki ima potencial zamenjave sintetičnih antioksidantov, ki se dodajajo k živilskim izdelkom.
2.5.4.1 Mehanizem delovanja linaloola
Duarte in sod. (2016) so želeli ugotoviti protibiofilmsko aktivnost izolirane učinkovine linalool in eteričnega olja koriandra proti bakterijam vrste C. jejuni ATCC 33560 in C. jejuni 225421. Analizirali so še njun vpliv na medcelično signaliziranje celic v biofilmu. Opazili so od 75 % do 85 % inhibicijo tvorbe biofilma obeh sevov z uporabo 4-kratne minimalne inhibitorne koncentracije koriandrovega eteričnega olja. Dodatek 4-kratne minimalne inhibitorne koncentracije komponente linalool pa je inhibiral tvorbo biofilma od 43 % do 77
% celotne biomase. Učinek uporabe najvišje koncentracije koriandrovega eteričnega olja na redukcijo nastalega biofilma je znašal od 77 % do 87 %, spojine linalool pa okoli 75 %.
Eterično olje je imelo višjo in boljšo inhibicijo tvorbe biofilma ter redukcijo nastalega biofilma kot čista spojina linalool. V literaturi so razlage usmerjene v potencialno sinergistično delovanje različnih komponent med seboj, ki tako zajamejo več različnih znotrajceličnih tarč.
Sklepali so, da takšno učinkovitost eteričnega olja in spojine proti nastalim biofilmom povzroča njihov vpliv na medcelično signaliziranje. Preko raziskave so ugotovili uspešno inhibicijo volaceina – pigmenta, katerega sintezo regulira sistem medcelične signalizacije.
Pokazali so, da imata obe učinkovini naravnega izvora potencial za uporabo v živilski industriji kot inhibitorja tvorbe biofilma in medceličnega signaliziranja (Duarte in sod., 2016).
2.6 DELOVANJE NARAVNIH UČINKOVIN NA INHIBICIJO NASTANKA BIOFILMA TER REDUKCIJO NASTALEGA BIOFILMA
V nadaljevanju so podrobneje izpostavljene naravne učinkovine ter mehanizem njihovega delovanja. Pri tem smo izpostavili tudi gene in proteine, ki so glede na literaturo najpogostejše potencialne tarče učinkovin naravnega izvora.
2.6.1 Mehanizem adhezije bakterij C. jejuni
Adhezija je pomemben mehanizem, ki ga izkoriščajo bakterije C. jejuni v začetnih fazah kolonizacije človekovega prebavnega trakta in tudi neživih površin pred tvorbo biofilmov.
Kot je prikazano v preglednici 3, gen cadF kodira zunanji periplazemski protein CadF, s katerim se celica veže na črevesne epitelne celice (Krause-Gruszczynska in sod., 2007).
Preglednica 3: Učinkovine naravnega izvora, njihov učinek na gene in proteine, ki so vključeni v mehanizem adhezije
Gen Protein Učinkovina Vpliv Vir
cadF CadF (zunanji periplazemski
protein)
Trans- cinamaldehid
Zmanjšana adhezija Upadhyay in sod., 2017
Učinkovina, najdena v cimetu (trans-cinamaldehid), lahko vpliva na zmanjšano izražanje tega gena in preprečuje začetne faze nastanka biofilmov.
2.6.2 Mehanizem gibljivosti bakterij C. jejuni
Mehanizem gibljivosti je eden kompleksnejših sistemov (preglednica 4). Proteina MotA in MotB sestavljata statični del flagelarnega motorja. Z uporabo motorja se lahko biček vrti v smeri urinega kazalca ali nasprotni smeri. MotA je sestavljen iz petih različnih proteinov, ki oblikujejo obroč okoli dveh proteinov MotB. Po vezavi na aspartatni ostanek MotB1 se proton prenese preko protonskega kanalčka in sproži gibanje v smeri urinega kazalca.
Možnost gibanja celici omogoča premikanje proti ugodnejšim in izogibanje dejavnikom stresa. Z delovanjem evgenola in karvakrola je slabša sposobnost gibljivosti in kemotakse ter počasnejše širjenje biofilma (Chang in sod., 2021).
Preglednica 4: Učinkovine naravnega izvora, njihov učinek na gene in proteine, ki so vključeni v mehanizem gibljivosti bakterij
Gen Protein Učinkovina Vpliv Vir
motA MotA (flagelarni motor)
Karvakrol in evgenol
Zmanjšano izražanje gena za gibljivost
Upadhyay in sod., 2017 motB MotB Karvakrol, trans-
cinamaldehid in evgenol
Povečano izražanje gena za gibljivost
Upadhyay in sod., 2017
fliA FliA Trans-cinamaldehid Zmanjšano izražanje gena za gibljivost
Upadhyay in sod., 2017 flaA Flagelin A Trans-cinamaldehid,
karvakrol
Sub-inhibitorna koncentracija je zmanjšala izražanje gena za
sintezo proteina, ki gradi flagele
Wagle in sod., 2019
flaB Flagelin B Trans-cinamaldehid, karvakrol
Zmanjšano izražanje gena za sintezo proteina, ki gradi
flagele
Wagle in sod., 2019
flaG Flagelin G Evgenol Zmanjšano izražanje gena za sintezo flagelarnega proteina
Wagle in sod., 2019 flgA FlgA Trans-cinamaldehid,
karvakrol
Zmanjšano izražanje gena za sintezo periplazemskega proteina, ki sestavlja flagele
Wagle in sod., 2019
Trans-cinamaldehid in karvakrol vplivata na zmanjšano izražanje genov flaA, flaB in flgA.
Proteina FlaA in FlaB sta flagelina, ki polimerizirata in tvorita filamente bička, medtem ko je protein FlgA ključen za sintezo bička (Wagle in sod., 2019).
2.6.3 Mehanizem medcelične signalizacije bakterij C. jejuni
Bakterije C. jejuni nosijo v svojem dednem zapisu gen luxS za sintezo encima S-ribozil- homocisteinaze (LuxS). Vključena je v proces ciklizacije avtospodbujevalcev preko molekule 4,5-dihidroksi-2,3-pentandion (DPD). Bakterijske celice v biofilmu sintetizirajo avtospodbujevalce, signalne molekule, ki se akumulirajo v zunajceličnem okolju. Prehajajo skozi celično membrano in se po dosegu kritične znotrajcelične koncentracije vežejo na transkripcijski aktivator (Plummer, 2012; Bassler, 1999). Z vezavo vplivajo na spremembe izražanja genov, odgovornih za gibljivost bakterij, tvorbo biofilmov, izražanje virulentnih genov in kolonizacijo prebavnega trakta živali in človeka (preglednica 5).
Preglednica 5: Učinkovine naravnega izvora, njihov učinek na gene in proteine, ki so vključeni v mehanizem medcelične signalizacije
Gen Protein Učinkovina Vpliv Vir
luxS LuxS Karvakrol Inhibicija medcelične
signalizacije, ki igra pomembno vlogo pri rasti biofilma
Wagle in sod., 2019
Duarte in sod. (2016) so ovrednotili vpliv koriandrovega olja in njegove komponente linalool na inhibicijo medceličnega signaliziranja preko inhibicije sinteze pigmenta volaceina. Služi kot biosenzor za detekcijo N-acilhomoserin laktonov in posledično sistema medceličnega signaliziranja. Uporabili so bakterijo C. violaceum, ki sintetizira volacein. Visoki koncentraciji koriandrovega olja in učinkovine linalool sta pokazali zmanjšanje medceličnega signaliziranja za 90 %.
2.6.4 Modifikacija površine celic
Evgenol vpliva na zmanjšano izražanje gena waaF, ki kodira lipopolisaharid heptozil transferazo II (preglednica 6). Encim prispeva k sintezi lipooligosaharidne bakterijske kapsule in tako spremeni celično površino, da se bakterijske celice lažje pripnejo na površino in okužijo gostitelja. Delovanje evgenola prepreči sintezo kapsule in onemogoči pripenjanje celic na živo ali neživo površino (Wagle in sod., 2019).
Preglednica 6: Učinkovine naravnega izvora, njihov učinek na gene in proteine, ki so vključeni v mehanizem modifikacije površine celic
Gen Protein Učinkovina Vpliv Vir
waaF Lipopolisaharid heptozil transferaza II
Evgenol Zmanjšanje izražanja gena za modifikacijo površine celic
Wagle in sod., 2019
2.6.5 Odgovor na dejavnike stresa
Bakterije C. jejuni so občutljive na atmosferski kisik, saj se ob njegovi prisotnosti generirajo reaktivni radikali, kot so superoksidni anion, vodikov peroksid in hidroksilni radikal. Za zaščito proti oksidativnemu stresu predstavlja encim periplazemska nitritna reduktaza (NapA), ki lahko reducira nitrat in deluje kot končen akceptor elektronov za rast bakterij C.
jejuni. Encim tudi sodeluje pri detoksifikaciji škodljivih reaktivnih dušikovih spojin. Z delovanjem karvakrola in trans-cinamaldehida se utiša gen napA za sintezo encima (preglednica 7). To vpliva na slabo izkoriščanje dušika in nastajanje reaktivnih spojin (Pittman in sod., 2006).
Preglednica 7: Učinkovine naravnega izvora, njihov učinek na gene in proteine, ki so vključeni v mehanizme celičnih odgovorov na dejavnike stresa
Gen Protein Učinkovina Vpliv Vir
cosR CosR Evgenol Zmanjšano izražanje genov, ki kodirajo odgovor na dejavnike stresa in so odgovorni za nadaljnjo zorenje biofilma
Wagle in sod., 2019
ahpC Alkil hidroperoksid
reduktaza
Evgenol Zmanjšano izražanje genov, ki kodirajo odgovor na oksidativni stres
Wagle in sod., 2019
napA NapA Trans-
cinamaldehid, evgenol in
karvakrol
Zmanjšano izražanje gena za sintezo encima periplazemska nitratna reduktaza,
s katerim bakterije izkoriščajo nitrat kot vir energije
Wagle in sod., 2019
dnaK DnaK Trans-
cinamaldehid in karvakrol
Zmanjšano izražanje gena za sintezo proteina, ki vpliva na gibljivost in
odgovor na dejavnike stresa
Wagle in sod., 2019
Z izražanjem superoksidne dismutaze (SodB), katalaze (KatA) in hidroperoksid reduktaze (AhpC) se bakterije zaščitijo proti oksidativnemu stresu ter morebitnim poškodbam nukleinske kisline (Hwang in sod., 2011). Protein CosR je regulatorni protein, ki vpliva na izražanje drugih genov oksidativnega stresa (regulira izražanje genov sodB in ahpC) ter izražanje genov, ki kodirajo proteine, vključene v procese metabolizma energije in biosinteze številnih makromolekul (Hwang in sod., 2011). Holmes in sod. (2005) so opazili, da se sam protein veže na promotorsko regijo genov sodB in ahpC. Tako poveča izražanje proteina AhpC in zmanjša izražanje proteina SodB. Vzpostavi se zelo učinkovita odpornost na različne vrste in oblike reaktivnih radikalov. Kljub optimiziranim procesom učinkovina evgenol dobro premaga ovire z utišanjem gena cosR in sintezo CosR proteina. Bakterije C.
jejuni postanejo občutljive na več vrst škodljivih radikalov in opažena je inhibicija tvorbe in redukcija nastalega biofilma.
2.7 PRIMERJAVA TARČNIH MEHANIZMOV UČINKOVIN NARAVNEGA IZVORA IN ANTIBIOTIKOV
V tarčne mehanizme delovanja smo vključili vse učinkovine naravnega izvora, ki so imele dokazano protibiofilmsko delovanje, ter so vplivale na gene in proteine iz Preglednice 2.
Ugotovili smo, da so vse navedene učinkovine pokazale protibiofilmsko delovanje na več različnih tarč znotraj bakterijske celice, ki so pomembne pri tvorbi ter nadaljnji širitvi biofilma. Te zajemajo gibljivost, adhezijo, modifikacijo celičnih površin, medcelično komunikacijo in odgovor na dejavnike stresa. Na sliki 3 je prikazano tarčno delovanje učinkovin naravnega izvora (evgenol, trans-cinamaldehid in karvakrol) in antibiotikov (fluorokinoloni, cefalosporini, karbapenemi).
Slika 3: Primerjava tarčnega delovanja antibiotikov ter učinkovin naravnega izvora (narejeno z BioRender.com)
Tarčno delovanje učinkovine evgenol vključuje gibljivost bakterijskih celic z zmanjšanjem izražanja genov motA, motB in flaG, modifikacijo površine celic s preprečevanjem sinteze pomembnega gradnika bakterijske kapsule, ter poveča občutljivost celic za oksidativni stres z utišanjem gena cosR.
Trans-cinamaldehid preprečuje začetne faze tvorbe biofilma z zmanjšanjem gibljivosti bakterijskih celic v biofilmu z zmanjšanjem izražanja genov fliA, flaA, flaB in flgA, moti adhezijo celic z inhibicijskim učinkom na gen cadF ter z zmanjšanjem sinteze periplazemske nitritne reduktaze izpostavi celice raznim dejavnikom stresa.
Karvakrol je prav tako pokazal inhibicijo tvorbe biofilma in redukcijo nastalega biofilma z zmanjšanjem izražanja genov motA, motB, flaA, flaB in flgA, uspešno inhibicijo medcelične signalizacije preko gena luxS ter oslabljeno prilagoditev celic na oksidativni stres.
Učinkovina evgenol ima podoben mehanizem delovanja kot antibiotiki cefalosporini, karbapenemi in penicilin, saj tarčno delujejo na celično steno in celično površino. Antibiotiki delujejo na peptidoglikanske transpeptidaze, evgenol pa na lipopolisaharid heptozil transferazo II.
Razlika v delovanju med antibiotiki ter učinkovinami naravnega izvora je, da imajo antibiotiki predvidoma eno tarčo delovanja. To je giraza DNA, ki jo ciljajo fluorokinoloni ali peptidoglikanske transpeptidaze, ki jih ciljajo penicilini, karbapenemi ali cefalosporini.
Z zaviranjem rasti bakterijskih celic in tarčnega delovanja lahko celice hitro razvijejo odpornost proti antibiotikom. Učinkovine naravnega izvora pa imajo več različnih tarč in delovanj znotraj celice, kar omogoča učinkovito inhibicijo tvorbe biofilma in redukcijo nastalega biofilma. Visoka koncentracija antibiotikov zavira rast bakterijskih celic in povzroča nevarnost odpornosti, sub-inhibitorne koncentracije učinkovin naravnega izvora pa ne zavirajo rasti bakterijskih celic, a inhibirajo tvorbo biofilma posredno preko inhibicije adhezije, gibljivosti, medcelične signalizacije ter odgovorov na dejavnike stresa.
3 POVZETEK
Bakterije C. jejuni so najpogostejši povzročitelji gastroenteritisov pri človeku. Pogost vzrok je nepopolna toplotna obdelava piščančjega mesa ali neustrezno vzdrževanje higiene med pripravo mesa. Konvencionalni način zdravljenja proti bakterijam C. jejuni je uporaba antibiotikov. S prepogosto uporabo antibiotikov pri zdravljenju ljudi ter zdravljenju živali se povečuje razvoj odpornosti proti antibiotikom.
Biofilm predstavlja veliko težavo v obratih živilske industrije, saj povečuje nevarnost kontaminacije izdelkov, kar predstavlja tveganje za varnost potrošnika. Bakterije C. jejuni so sposobne tvoriti biofilm, znotraj katerega preživijo in perzistirajo v okolju proizvodnje živil. Preko izražanja specifičnih genov in virulentnih dejavnikov tudi povečajo odpornost proti neugodnim stresnim pogojem in protimikrobnim učinkovinam, ki so prisotne tekom živilske proizvodno-distribucijske verige, kot so antibiotiki, žolčne soli, razkužila, stabilizatorji izdelkov in druge naravne protimikrobne učinkovine.
V diplomski nalogi smo se osredotočili na stopnje nastanka biofilma ter izražanje genov in proteinov na molekularnem nivoju. Z opisom stopenj nastanka biofilma smo nato raziskali naravne protimikrobne učinkovine, ki so v različnih literaturah pokazale protibiofilmsko delovanje na bakterije C. jejuni ter podrobneje opisali njihove dokazane mehanizme delovanja. Nato smo raziskali vpliv naravnih protimikrobnih učinkovin na izražanje določenih genov, vključenih v mehanizme adhezije, gibljivosti, medcelične signalizacije, modifikacije površine ter odgovore na dejavnike stresa biofilmskih celic C. jejuni. V preglednicah smo zbrali gene in proteine, na katere so delovale učinkovine naravnega izvora, jih povezali v mehanizme delovanja in s tem postavljeno hipotezo potrdili.
Poleg raziskave mehanizmov delovanja naravnih protimikrobnih učinkovin ter njihovega vpliva na izražanje genov smo opisali znano tarčno delovanje antibiotikov ter mehanizme odpornosti bakterij C. jejuni proti antibiotikom. Nato smo primerjali tarčno delovanje antibiotikov in učinkovin naravnega izvora ter ugotovili, da imajo antibiotiki drugačno delovanje ter vpliv na celice C. jejuni. Delujejo tako, da zavirajo njihovo rast in imajo samo eno tarčo delovanja, medtem ko naravne protimikrobne učinkovine delujejo na več različnih znotrajceličnih tarč ter delujejo preko inhibicije mehanizmov adhezije, gibljivosti, medcelične signalizacije in odgovorov na dejavnike stresa.
4 VIRI
Ammar M. A., El-Naenaeey Y. E., El-Hamid A. I. M., El-Gedawy A. A., El-Malt S. M. R.
2021. Campylobacter as a major foodborne pathogen: A review of its characteristics, pathogenesis, antimicrobial resistance and control. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences, 10, 4: 609-619
Bassler B. 1999. How bacteria talk to each other: regulation of gene expression by quorum sensing. Current Opinion in Microbiology, 2, 6: 582-587
Borges A., Abreu A. C., Dias C., Saavedra M. J., Borges F., Simões M. 2016. New perspectives on the use of phytochemicals as an emergent strategy to control bacterial infections including biofilms. Molecules, 21, 7: 877, doi: 10.3390/molecules21070877:
41 str.
CDC. 2021. Campylobacter (Campylobacteriosis). Washington, Centers for Disease Control and Prevention: 1 str.
https://www.cdc.gov/campylobacter/index.html (september, 2021)
Chang Y., Carroll L. B., Liu J. 2021. Structural basis of bacterial flagellar motor rotation and switching. Trends in Microbiology, 29, 11: 1024-1033
Costerton W. J., Stewart S. P., Greenberg P. E. 1999. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science, 284, 5418: 1318-1322
Ćirić D. A., Petrović D. J., Glamočlija M. J., Smiljković S. M., Nikolić M. M., Stojković S.
D., Soković D. M. 2019. Natural products as biofilm formation antagonists and regulators of quorum sensing functions: A comprehensive review update and future trends. South African Journal of Botany, 120: 65-80
Duarte A., Alves C. A., Ferreira S., Silva F., Domingues C. F. 2015. Resveratrol inclusion complexes: Antibacterial and anti-biofilm activity against Campylobacter spp. and Arcobacter butzleri. Food Research International, 77: 244-250
Duarte A., Luís Â., Oleastro M., Domingues C. F. 2016. Antioxidant properties of coriander essential oil and linalool and their potential to control Campylobacter spp. Food Control, 61: 115-122
FDA. 2020. Food aditives permitted for direct addition to food for human consumption:
Synthetic flavoring substances and adjuvants. Code of Federal Regulations, 21 CFR 172.515.
García-Sánchez L., Melero B., Jaime I., Rossi M., Ortega I., Rovira J. 2019. Biofilm formation, virulence and antimicrobial resistance of different Campylobacter jejuni isolates from a poultry slaughterhouse. Food Microbiology, 83: 193-199
Giesbrecht P., Kersten T., Maidhof H., Wecke J. 1998. Staphylococcal cell wall:
morphogenesis and fatal variations in the presence of penicillin. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62: 1371-1414
Goni D. M., Muhammad J. I., Goje M., Abatcha G. M., Bitrus A. A., Abbas A. M. 2017.
Campylobacter in dogs and cats; Its detection and public health significance: A review.
Advances in Animal and Veterinary Sciences, 5, 6: 239-248
Guzmán-Soto I., McTiernan C., Gonzalez M., Ross A., Gupta K., Suuronen E. J., Mah T.
F., Griffith M., Alarcon E. I. 2021. Mimicking biofilm formation and development:
Recent progress in in vitro and in vivo biofilm models. iSCIENCE, 24, 5: 102443, doi:
10.1016/j.isci.2021.102443: 51 str.
Holmes K., Mulholland F., Pearson M. B., Pin C., McNicholl-Kennedy J., Ketley M. J., Wells M. J. 2005. Campylobacter jejuni gene expression in response to iron limitation and the role of Fur. Microbiology, 151: 243-257
Hwang S., Kim M., Ryu S., Jeon B. 2011. Regulation of oxidative stress response by CosR, an essential response regulator in Campylobacter jejuni. PLoS ONE, 6, 7: e22300, doi:
10.1371/journal.pone.0022300: 13 str.
Iovine N. 2013. Resistance mechanisms in Campylobacter jejuni. Virulence, 4, 3: 230-240 Jubair N., Rajagopal M., Chinnappan S., Abdullah N. B., Fatima A. 2021. Review on the
antibacterial mechanism of plant-derived compounds against multidrug-resistant bacteria (MDR). Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2021:
ID3663315, doi: 10.1155/2021/3663315: 30 str.
Klančnik A., Šikić Pogačar M., Trošt K., Tušek Žnidarič M., Mozetič Vodopivec B., Smole Možina S. 2017. Anti-Campylobacter activity of resveratrol and an extract from waste Pinot noir grape skins and seeds, and resistance of Camp. jejuni planktonic and biofilm cells, mediated via the CmeABC efflux pump. Journal of Applied Microbiology, 122:
65-77
Klančnik A., Šimunović K., Sterniša M., Ramić D., Smole Možina S., Bucar F. 2021. Anti- adhesion activity of phytochemicals to prevent Campylobacter jejuni biofilm formation on abiotic surfaces. Phytochemistry Reviews, 20: 55-84
Klančnik A., Zorko Š., Toplak N., Kovač M., Bucar F., Jeršek B., Smole Možina S. 2018.
Antiadhesion activity of juniper (Juniperus communis L.) preparations against Campylobacter jejuni evaluated with PCR-based methods. Phytotherapy Research, 32:
542-550
Krause-Gruszczynska M., van Alphen B. L., Oyarzabal A. O., Alter T., Hänel I., Schliephake A., König W., van Putten P. M. J., Konkel E. M., Backert S. 2007. Expression patterns and role of the CadF protein in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. FEMS Microbiology Letters, 274: 9-16
Kurinčič M. 2011. Mehanizmi odpornosti bakterij Campylobacter jejuni in Campylobacter coli proti izbranim antimikrobnim snovem. Doktorska disertacija. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 4-25
Lee C. K., De Anda J., Baker A. E., Bennett R. R., Luo Y., Lee E. Y., Keefe J. A., Helali J.
S, Ma J., Zhao K., Golestanian R., O'Toole G. A., Wong G. C. L. 2018. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. Proceedings of the National Academy of Sciences, 115: 4471-4476
Li G., Brown P. J B., Tang J. X., Xu J., Quardokus E. M., Fuqua C., Brun Y. V. 2012.
Surface contact stimulates the just-in-time deployment of bacterial adhesins. Molecular Microbiology, 83: 41-51
Lin J., Akiba M., Sahin O., Zhang Q. 2005. CmeR functions as a transcriptional repressor fort he multidrug efflux pump CmeABC in Campylobacter jejuni. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49, 3: 1067-1075
Lin J., Michel L. O., Zhang Q. 2002. CmeABC functions as a multidrug efflux system in Campylobacter jejuni. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 46: 2124-2131
Liu T., Feng C., Li Z., Gu Z., Ban X., Hong Y., Cheng L., Li C. 2021. Efficient formation of carvacrol inclusion complexes during ß-cyclodextrin glycosyltransferase-catalyzed cyclodextrin synthesis. Food Control, 130: 108296, doi:
10.1016/j.foodcont.2021.108296: 10 str.
Luangtongkum T., Jeon B., Han J., Plummer P., Logue M. C., Zhang Q. 2009. Antibiotic resistance in Campylobacter: emergence, transmission and persistence. Future Microbiology, 4, 2: 189-200
Melo T. R., Mendonça P. E., Monteiro P. G., Siqueira C. M., Pereira B. C., Peres M. B. A.
P., Fernandez H., Rossi A. D. 2017. Intrinsic and extrinsic aspects on Campylobacter
jejuni biofilms. Frontiers in Microbiology, 8: 1332, doi: 10.3389/fmicb.2017.01332: 15 str.
Micciche A., Rothrock Jr. J. M., Yang Y., Ricke C. S. 2019. Essential oils as an intervention strategy to reduce Campylobacter in poultra production: a review. Frontiers in Microbiology, 10: 1058, doi: 10.3389/fmicb.2019.01058: 22 str.
Page W. J., Huyer G., Huyer M., Worobec E. A. 1989. Characterization of the porins of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli and implications for antibiotic susceptibility. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 33, 3: 297-303
Pittman M. S., Elvers K. T., Lee L., Jones M. A., Poole R. K., Park S. F., Kelly D. J. Growth of Campylobacter jejuni on nitrate and nitrite: electron transport to NapA and NrfA via NrfH and distinct roles for NrfA and the globin Cgb in protection against nitrosative stress. Molecular Microbiology, 63, 2: 575-590
Plummer J. P. 2012. LuxS and quorum-sensing in Campylobacter. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2 22, doi: 10.3389/fcimb.2012.00022: 9 str.
Salehi B., Prakash Mishra A., Nigam M., Sener B., Kilic M., Sharifi-Rad M., Valere Tsouh Fokou P., Martins N., Sharifi-Rad J. 2018. Resveratrol: A double-edged sword in health benefits. Biomedicines, 6, 3: 91, doi: 10.3390/biomedicines6030091: 20 str.
Shea M. E., Hiasa H. 1999. Interactions between DNA helicases and frozen topoisomerase IV-quinolone-DNA ternary complexes. Journal of Biological Chemistry, 274, 32:
22747-22754
Shrestha S., Wagle R. B., Upadhyay A., Arsi K., Upadhyaya I., Donoghue J. D., Donoghue M. A. 2019. Edible coatings fortified with carvacrol reduce Campylobacter jejuni on chicken wingettes and modulate expression of select virulence genes. Frontiers in Microbiology, 10: 583, doi: 10.3389/fmicb.2019.00583: 12 str.
Silva C. W., Targino N. B., Gonçalves G. A., Silva R. M., Hungaro M. H. 2018.
Campylobacter: an important food safety issue. V: Food safety and preservation: modern biological approaches to improving consumer health. Grumezescu A., Holban A. M.
(ur.). London, Academic Press: 391-430
Skarp A. P. C., Hänninen L.-M., Rautelin K. I. H. 2015. Campylobacteriosis: the role of poultry meat. Clinical Microbiology and Infection, 22, 2: 103-109
Song J. Y., Yu H. H., Kim J. Y., Lee N.-K., Paik H.-D. 2020. The use of papain for the removal of biofilms formed by pathogenic Staphylococcus aureus and Campylobacter
jejuni. LWT – Food Science and Technology, 127: 109383, doi: 10.1016/j.lwt.2020.109383: 4 str.
Sterniša M., Klančnik A., Smole Možina S. 2019. Spoilage Pseudomonas biofilm with Escherichia coli protection in fish meat at 5 °C. Journal of the Science of Food and Agriculture, 99, 10: 4635-4641
Šimunović K., Ramić D., Xu C., Smole Možina S. 2020. Modulation of Campylobacter jejuni motility, adhesion to polystyrene surfaces, and invasion of INT407 cells by quorum-sensing inhibition. Microorganisms, 8, 104, doi:
10.3390/microorganisms8010104: 14 str.
Upadhyay A., Arsi K., Wagle B. R., Upadhyaya I., Shrestha S., Donoghue A. M., Donoghue D. J. 2017. Trans-cinnamaldehyde, carvacrol, and eugenol reduce Campylobacter jejuni colonization factors and expression of virulence genes in vitro.
Frontiers in Microbiology, 8: 713, doi: 10.3389/fmicb.2017.00713: 12 str.
Wagle B. R., Upadhyay A., Upadhaya I., Shrestha S., Arsi K., Liyanage R., Venkitanarayanan K., Donoghue D. J., Donoghue A. M. 2019. Trans-cinamaldehyde, eugenol and carvacrol reduce Campylobacter jejuni biofilms and modulate expression of select genes and proteins. Frontiers in Microbiology, 10: 1837, doi:
10.3389/fmicb.2019.01837: 16 str.
Willmott C. J., Critchlow S. E., Eperon I. C., Maxwell A. 1994. The complex of DNA gyrase and quinolone drugs with DNA forms a barrier to transcription by RNA polymerase.
Journal of Molecular Biology, 242, 4: 351-363
ZAHVALA
Zahvaljujem se mentorici izr. prof. dr. Anji Klančnik za spodbudo in uporabne usmeritve med pisanjem naloge.
Prav tako se zahvaljujem recenzentki doc. dr. Neži Čadež za pregled diplomske naloge.
Za vso podporo, skrb in motivacijo pa sem hvaležna svoji družini in Janu, ki so mi tekom pisanja diplomske naloge stali ob strani.
