UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Mirna URAN
PROUČEVANJE INTERAKCIJ MED RASTLINAMI IN PATOGENI NA NIVOJU MIKRO RNA
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Mirna URAN
PROUČEVANJE INTERAKCIJ MED RASTLINAMI IN PATOGENI NA NIVOJU MIKRO RNA
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
STUDY OF MICRO RNA MEDIATED PLANT-PATHOGEN INTERACTIONS
B. SC. THESIS Academic Study Programmes
.
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.
Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala izr. prof. dr. Natašo Štajner.
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednik: prof. dr. Mojca NARAT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: izr. prof. dr. Nataša ŠTAJNER
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: doc. dr. Jernej OGOREVC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko
Datum predstavitve: 3. 9. 2021
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 606:632:602.68:602.6:582.5/.9(043.2)
KG mikro RNA, odpornost na bolezni, izražanje genov, imunost, rastlinski obrambni mehanizem
AV URAN, Mirna
SA ŠTAJNER, Nataša (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN PROUČEVANJE INTERAKCIJ MED RASTLINAMI IN PATOGENI NA NIVOJU MIKRO RNA
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja) OP VIII, 18 str., 1 pregl., 4 sl., 43 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Rastline so vir hrane za številne organizme, med drugim tudi za rastlinske patogene.
Patogeni povzročajo razvoj bolezni rastlin, s čimer zmanjšujejo letno proizvodnjo rastlinskega pridelka. Patogeni se razvijajo in postajajo odporni na tradicionalne načine njihovega zatiranja, zato potrebujemo nove metode, da ohranimo dovoljšno količino hrane za vse organizme. Interakcija med patogeni in rastlinami se dogaja tudi na nivoju malih RNA, med katere sodijo tudi mikro RNA. Z njimi lahko potencialno pridemo do cilja, ki je zvišanje odpornosti rastlin na patogene na okolju prijazen način. Mikro RNA vpliva na fiziološko zgradbo rastline, morfologijo in predvsem na obrambni mehanizem. Obrambno delujejo s posttranskripcijskim mehanizmom utišanja informacijske RNA, ki so lahko tudi patogenskega izvora. Odkrili so, da se mikro RNA nahaja tudi v patogenih organizmih, ki pa imajo obraten učinek od gostiteljskih, in sicer zavirajo izražanje obrambnih genov rastline. Nove tehnologije z uporabo mikro RNA nas lahko privedejo do zadostnega in trajnostnega prehranjevalnega sistema.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 606:632:602.68:602.6:582.5/.9(043.2)
CX micro RNA, disease resistance, gene expression, immunity, plant defense AU URAN, Mirna
AA ŠTAJNER, Nataša (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI STUDY OF MICRO RNA MEDIATED PLANT-PATHOGEN INTERACTIONS DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes)
NO VIII, 18 p., 1 tab., 4 fig., 43 ref.
LA sl AL sl/en
AB Plants are a source of food for countless organisms, which includes plant pathogens.
Pathogens are the cause of plant disease, which reduces the yearly plant produce.
Pathogens are constantly evolving and becoming resistant to traditional ways of suppression like the use of pesticides. That is why we need new methods and solutions to produce sustainable food system. We discovered small RNA and with them micro RNA, which might be an answer for our problem. Our goal is to raise plant resistance to pathogens, whilst doing as little harm to the environment as possible. Micro RNA effects plant physiology, morphology and defense mechanism. Their defense pathway includes posttranscription messenger RNA silencing mechanism that can silence the transcription of pathogen messenger RNA. It was found that pathogen micro RNA has the opposite effect of host micro RNA and it silences the expression of plant defense genes. The new technology using micro RNA can lead us to a sufficient and sustainable food system.
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO PREGLEDNIC VI
KAZALO SLIK
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
VI VII
1 UVOD ... 1
1.1 NAMEN ... 2
2 MIKRO RNA ... 2
2.1 BIOGENEZA MIKRO RNA V RASTLINAH ... 2
2.2 GENOMIKA MIKRO RNA V RASTLINAH ... 4
2.2 VPLIV MIKRO RNA NA IZRAŽANJE RASTLINSKIH GENOV ... 4
2.4 VPLIV MIKRO RNA NA PATOGENE ... 4
2.5 TRANSPORT MIKRO RNA ... 5
3 RASTLINSKI PATOGENI ... 5
3.1 BOLEZENSKI KROG ... 5
3.2 EPIDEMIJA RASTLINSKIH BOLEZNI ... 6
3.3 INTERAKCIJE MED RASTLINAMI IN PATOGENI V RIZOSFERI ... 7
3.4 VLOGA MIKRO RNA V OBRAMBI PROTI GLIVNIM OKUŽBAM ... 8
3.5 NEMATODE ... 9
3.6 BAKTERIJE ... 9
3.7 VIRUSI ... 10
3.8 VIROIDI ... 11
4 MIKRO RNA KOT OSREDNJA MOLEKULA ZA INTERAKCIJE MED RASTLINAMI IN PATOGENI ... 12
4.1 IZRAŽANJE UMETNIH MIKRO RNA V TRANSGENI RASTLINI Arabidopsis thaliana ... 12
5 UPORABA V PRIHODNOSTI ... 13
5.1 TVEGANJA ... 13
6 ZAKLJUČEK ... 14
7 VIRI ... 15
VI
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Primeri dokazanih interakcij med rastlinami in patogeni, posredovanih
z mikro RNA. 13
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Bolezenski trikotnik, ki predstavlja bolezen kot interakcijo med gostiteljem
in patogenom v nekem okolju. 2
Slika 2: Biosinteza mikro RNA. Začne se v jedru celice s prepisom pri-mikro RNA iz DNA z RNA polimerazo II. Pri-mikro RNA se pretvori s pomočjo encima Drosha vezanega s kofaktorjem DGCR8 v pre-mikro RNA. Pre-mikro RNA se prenese iz celičnega jedra v citoplazmo preko eksportina-5. V citoplazmi pre-mikro RNA encim Dicer pretvori v mikro RNA-mikro RNA* dupleks, ki z RISCom tvori miRISC kompleks. Aktivna mikro RNA povzroči razgradnjo mRNA ali njejo translacijsko represijo.
3
Slika 3: Znaki virusa ToBRFV na listih (A-C), zametkih plodov (D) in plodovih paradižnika (E-I) (Luria in sod., 2017)
Slika 4: Shematični prikaz interakcij med rastlinami in različnimi patogeni (bakterije, virusi, nematode, glive …) v rizosferi. Signali patogenov in EV z mikro RNA potujejo v smeri rastlinskega koreninskega sistema, medtem ko rastlinski rizodepoziti potujejo od korenin k patogenom. Med patogeni potekajo tudi medsebojne interakcije.
7 9
VII
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI DNA - deoxyribonucleic acid, deoksiribonukleinska kislina mRNA - messenger RNA, informacijska RNA
sRNA - small RNA, mala RNA
siRNA - small interfering RNA, mala interferenčna RNA
vsRNA - viroid specific RNA, viroidna specifična ribonukleinska kislina miRNA - micro RNA, mikro RNA
milRNA - micro like RNA, mikro RNA podobna molekula pri-miRNA - primary micro RNA, primarna mikro RNA
pre-miRNA - precursor micro ribonucleic acid, prekurzorska mikro RNA amiRNA - artificial micro RNA, umetna mikro RNA
RISC - RNA induced silencing complex, RNA induciran utiševalni kompleks
miRISC - RNA induced silencing complex loaded with micro RNA, RNA induciran utiševalni kompleks z mikro RNA
UTR - untranslated region, neprevedena regija Ago - agronaute proteins, argonaut proteini
DGCR8 - DiGeorge syndrome critical region gene 8, DiGeorge sindrom kritične regije 8 PAMP - pathogen-associated molecular pattern, s patogeni povezani molekularni vzorci PRR - pattern recognition receptors, receptorji za prepoznavo vzorcev
PTI - pattern triggered immunity, imunost sprožena z vzorci R protein - resistance proteins, rezistenčni proteini
Avr - avirulence genes, avirulenčni geni
EV - extracellular vesicles, esktracelularni vezikli SA - salicylic acid, sialična kislina
ABA - abscisic acid, abscizinska kislina EBV - Epstein-Barr virus, Epstein-Barr virus DLC1 - dicer-like 1 enzyme, dicer like 1 encim HEN1 - Hua enhancer 1, Hua ojačevalec 1 Aux- auxin, avksin
IAA - indoleacetic acid, indolocetna kislina TuMV - turnip mosaic virus, mozaični virus repe
ToBRFV - tomato brown rugose fruit virus, virus rjave grbančavosti plodov PTGS - posttranscriptional gene silencing, posttranskripcijsko gensko utišanje
VIII
1 1 UVOD
Rastline so pomemben in zelo razširjen vir hrane za številne organizme. Tako predstavljajo prehramben vir tudi različnim patogenom, kot so glive, bakterije, virusi in drugi paraziti. Hkrati pa ti povzročajo ekonomsko nezanemarljive rastlinske bolezni. Patogeni so tekom evolucije razvili sposobnost preživetja preko izrabljanja hranilnih snovi, ki jih proizvedejo rastline (Agrios, 2005). Kot odziv na njih so rastline razvile strukturno in kemično obrambo, hipersenzitivni odziv, sistemsko pridobljeno odpornost in med drugim raznolike male RNA (sRNA). Male RNA se delijo na mikro RNA in na male interferenčne RNA (siRNA). Mikro RNA so male nekodirajoče RNA, dolge od dvajset do štiriindvajset nukleotidov, katerih funkcija je regulacija izražanje genov preko utišanja tarčne informacijske RNA (mRNA).
Rastlinske mikro RNA regulirajo tarčne gene s posttranskripcijsko translacijsko represijo in s cepljenjem mRNA transkriptov. Mikro RNA je vpletena pri večih različnih rastlinskih procesih, kot sta rast ter sam razvoj fiziologijo rastline. Mikro RNA lahko preko vezave s tarčno mRNA regulira gensko izražanje, na način, da ji običajno zniža raven izražanja (Rogers in Chen, 2013;
Islam in sod., 2018). Mikro RNA lahko regulirajo izražanje genov tudi preko metilacije DNA in modifikacij histonov (Khraiwesh in sod., 2008).
Raziskave interakcij med rastlinami in patogeni so namenjene izboljšanju sposobnosti preživetja rastlin v neugodnih okoljih. Zaradi dejavnikov, kot so bolezni in rastlinski škodljivci, letno izgubimo do 40 % svetovnih prehranskih pridelkov. Po ocenah zaradi rastlinskih bolezni samih pa vsako leto izgubimo do 14,1 % svetovnih prehranskih pridelkov. To še posebej prizadene prebivalstvo manj razvitih držav. Na nekatere dejavnike, kot so npr. suša, poplave, toča, zmrzali in podobno, težje vplivamo. Preko mikro RNA tehnologije lahko zvišamo odpornost rastlinam na patogene, ki povzročajo bolezni. Naš smoter je, da z uporabo rastlinske patologije proizvedemo čim več hrane za prebivalstvo in živali ter rastline z najmanj negativnimi posledicami na okolje. S kontrolo in omejevanjem širjenja rastlinskih bolezni se pridelovalci in znanstveniki ukvarjajo že dolgo. Uporaba pesticidov, kot so baktericidi in fungicidi, ni optimalna rešitev. Zaradi pojava vrste patogenov, odpornih na antibiotike, potrebujemo vedno nove strategije v borbi proti njim. Prav tako pesticidi močno onesnažujejo in obremenjujejo okolje, zato je potrebno njihovo uporabo znižati na najmanjšo še sprejemljivo raven in jo nadomestiti z drugimi pristopi (Agrios, 2005).
Temeljni koncept rastlinske patologije je bolezenski trikotnik (slika 1), v katerem je bolezen rezultat interakcije med gostiteljskim organizmom in patogenom. Da razširimo dojemanje razsežnosti interakcije med organizmi, moramo v bolezenski trikotnik vpeljati komponento kompleksa gostitelj-patogen. Kompleks gostitelj-patogen predstavlja tako seštevek obeh organizmov ob uspešni okužbi kot tudi spremembe, ki nastanejo v organizmih ob medsebojnih interakcijah v določenem okolju. Patogeni so organizmi ali virusi, ki lahko povzročijo bolezen v določenem organizmu. Patogeneza pa je celoten proces razvoja bolezni od prvotne okužbe gostitelja do izražanja bolezenskih znakov (Lucas, 1998).
2
Slika 1: Bolezenski trikotnik, ki predstavlja bolezen kot interakcijo med gostiteljem in patogenom v nekem okolju.
1.1 NAMEN
Namen naloge je bil analizirati interakcije med rastlinami in patogeni na nivoju mikro RNA in raziskati vpliv gostiteljske mikro RNA na patogeni organizem. Zanimalo nas je, kako vpliva patogena mikro RNA na gostiteljski organizem, glede na to da komunikacija preko mikro RNA ne poteka samo enosmerno.
Razvijanje novih tehnologij, ki temeljijo na mikro RNA, nam bo v prihodnosti pomagalo pri reševanju problemov pojava rastlinskih bolezni.
2 MIKRO RNA
2.1 BIOGENEZA MIKRO RNA V RASTLINAH
Mikro RNA so lahko kodirane v lastnih genih ali pa v intronih kodirajočih regij (Yin in sod., 2012). Mikro RNA nastane z RNA polimerazo II odvisno transkripcijo (slika 2). Mikro RNA iz enoverižnega prekurzorja z lasnično zanko izreže Dicer-like 1 encim (DCL1), ki ga 2’-O metilira Hua ojačevalec (HEN1) (Lee in sod., 2004; Liu in sod., 2013). Potlej se mikro RNA dupleks naloži v Argonaut (Ago) komponento RNA-induciranega utiševalnega kompleksa (RISC). Na celotno biogenezo mikro RNA vplivajo številni cis in trans faktorji, med katere sodijo transkripcijski faktorji (Arnold in sod., 2013).
3
Slika 2: Biosinteza mikro RNA. Začne se v jedru celice s prepisom pri-mikro RNA iz DNA z RNA polimerazo II. Pri-mikro RNA se pretvori s pomočjo encima Drosha vezanega s kofaktorjem DGCR8 v pre-mikro RNA.
Pre-mikro RNA se prenese iz celičnega jedra v citoplazmo preko eksportina-5. V citoplazmi pre-mikro RNA encim Dicer pretvori v mikro RNA-mikro RNA* dupleks, ki z RISCom tvori miRISC kompleks. Aktivna mikro RNA povzroči razgradnjo mRNA ali njejo translacijsko represijo.
Geni, ki kodirajo mikro RNA, se prepišejo v enoverižne RNA s pomočjo RNA polimeraze II.
Nastala enoverižna RNA se zloži v dvoverižno primarno mikro RNA (pri-mikro RNA). Encim Drosha se v celičnem jedru veže s kofaktorjem DiGeorge sindrom kritična regija 8 (DGCR8).
V jedru Drosha in DGCR8 spreminjata primarno mikro RNA v prekurzorsko mikro RNA (pre- mikro RNA), dolgo od 70-100 baznih parov s karakteristično lasnično zanko. Pre- mikro RNA se prenese preko eksportina 5 iz celičnega jedra v citoplazmo, kjer pride v kontakt z encimom Dicer. RNaza III endonukleazni Dicer protein naredi mikro RNA- mikro RNA* dupleks, ki je dvoverižna RNA molekula, ki vsebuje eno zrelo molekulo mikro RNA in eno komplementarno verigo. Dupleks se razdeli na obe molekuli in običajno se mikro RNA prenese na Argonaut proteine na RISC kompleksu in s tem tvori miRISC kompleks. Vežejo se s 3’ neprevedeno regijo (3’ UTR) tarčne mRNA. miRISC se potem veže s tarčno mRNA in povzroči bodisi translacijsko represijo bodisi mRNA razgradnjo (Winter in sod., 2009).
4 2.2 GENOMIKA MIKRO RNA V RASTLINAH
Rastlinske mikro RNA se izražajo endogeno in so dolge približno dvaindvajset nukleotidov.
Tekom evolucije so se te molekule ohranjale. Iz raziskav je razvidno, da tako kot pri živalih, se tudi pri rastlinah velik delež regulacije opravlja preko mikro RNA molekul in ne proteinov.
Odkritje mikro RNA v rastlinah in živalih kaže na to, da nekodirajoče RNA regulirajo gensko izražanje vsaj od zadnjega skupnega prednika. Če se je sistem mikro RNA razvil posebej v vsakem kraljestvu, se je moral razviti dovolj zgodaj za zagotovitev razvojnega reguliranja večceličnega sistema. Rastlinska in živalska mikro RNA se razlikujeta med seboj, kar pripisujemo razlikam v biogenezi. Največjo razliko v biogenezi opazimo v mikro RNA lasnični zanki, ki se pri rastlinah zvije v veliko različnih dolžin, ki so navadno daljše od živalskih mikro RNA (Reinhart in sod., 2002). Prekurzorji mikro RNA imajo zelo raznolike strukture in so različnih velikosti, zato predstavlja identifikacija novih mikro RNA genov zahteven izziv. Za identifikacijo uporabljajo računalniške programe, njihove rezultate pa potem eksperimentalno potrdijo ali ovržejo (Rhoades in Bartel, 2002).
2.3 VPLIV MIKRO RNA NA IZRAŽANJE RASTLINSKIH GENOV
Na izražanje določenega rastlinskega gena preko prepoznavanja transkriptov vpliva mikro RNA, ki jo usmerjajo miRISCi. Potek uravnavanja genov potrebuje več komplementarnih dogodkov za zagotovitev mikro RNA regulatornih vplivov na gensko izražanje. Na razkroj mikro RNA vplivata komplementarnost ter razpoložljivost tarčnih determinant. Ob končani razgradnji tarčne molekule se lahko miRISC kompleks razgradi ali pa z obnovitveno sposobnostjo tvori nov kompleks in cepi novo tarčno molekulo. Hitrost cepitve tarčne molekule je odvisna od komplementarnosti z mikro RNA (Catalanotto in sod., 2016).
2.4 VPLIV MIKRO RNA NA PATOGENE
Aktivacija mikro RNA se začne s prepoznavanjem patogenskih molekularnih zaporedij (PAMPs), ki sprožijo primarni imunski odziv. Kot odziv na primarni imunski sistem rastlin so patogeni razvili specifične efektorje, ki onemogočijo primarno obrambno linijo rastlin s prekinitvijo prenosa signala PAMP. Signal PAMP sproži rastlinske prepoznavne receptorje za vzorce (PRR), kar omogoča sprožitev PRR imunosti (PTI) (Thomma in sod., 2011).
Zato so rastline morale prilagoditi obrambno strategijo in razviti sekundarno obrambo, imenovano efektorsko sprožena imunost, ki je regulirana z raznimi rezistenčnimi proteini (R proteini). R proteini so bolj natančni v zaustavljanju rasti bakterijskih patogenih efektorjev, kot so avirulenčni proteini (avr) (Hurley in sod., 2014).
Kot odziv na patogene se mikro RNA inducirajo ali zavirajo, da uravnavajo izražanje genov na transkripcijskem ali posttranskripcijskem nivoju. Neposredno uravnavajo izražanje genov za dodatno natančnejšo regulacijo s spremembo ravni hormonov, med katere sodijo avksin, abscizinska kislina (ABA) in jasmonska kislina (JA). Rastlinski hormoni sodelujejo v rastlinski imunosti, odkrili so povezavo med mikro RNA in fitohormonskim odzivom. Mikro RNA so povezane z regulacijo avksinske signalne poti preko aktivne kontribucije k PTI. Avksin je zelo odziven na abiotski in biotski stres rastlin (Islam in sod., 2018).
5 2.5 TRANSPORT MIKRO RNA
Višje rastline imajo floem in ksilem, ki sta dve specializirani tkivi, ki prenašata vodo in hranilne snovi med koreninami in poganjki. Ksilem je sestavljen iz odmrlih celic, medtem ko je floem iz živih celic, preko katerih se lahko selektivno vanj nalagajo različne molekule, kot so ogljikovi hidrati, proteini, aminokisline in hormoni. Poleg vseh drugih prej omenjenih molekul se preko floema lahko na dolge razdalje prenašajo tudi RNA molekule in med njimi tudi mikro RNA.
Večina mikro RNA se sintetizira v poganjkih in transportira v koreninski sistem, kjer se nahaja njihovo tarčno mesto delovanja. Poznanih je tudi nekaj primerov prenosa iz korenin v poganjek (Kehr in Kragler, 2018).
3 RASTLINSKI PATOGENI
Različni patogeni imajo različne rastne pogoje, zato so omejeni na specifične gostitelje.
Razlikujejo se v tem, katere rastlinske vrste, organe in tkiva lahko okužijo. Starost in splošno stanje rastline prav tako vplivata na uspešnost okužbe. Patogene najdemo na koreninah, steblu, listih ali na sadežih (Agrios, 2005). Rastlinske bolezni povzroča več skupin organizmov.
Delimo jih na parazitske angiosperme, glive, nematode, alge, oomicete, plazmodioforomicete, tripanosomatide, bakterije, fitoplazme, virusi in viroidi. Nevarnost rastlinskih bolezni in ovrednotenje njihovih posledic presojamo s socioekonomskega vidika (Strange, 2003).
Rastlinski patogeni tekmujejo z nami za hrano in preživetje. So povzročitelji podhranjenosti, stradanja in revščine.
Patogene delimo glede na odnos do gostitelja na biotrofe in nektrotrofe. Nekrotrofi so patogeni, ki napadejo rane in oslabljena tkiva ali pa mlade rastline. Rastejo in razmnožujejo se v medceličnini, kjer proizvajajo citolitične faktorje, s katerimi ubijejo gostitelja, ki ga potlej izrabijo kot vir hranil. Biotrofi pa so patogeni, ki svojega gostitelja ne ubijejo, temveč so odvisni od preživetvene sposobnosti gostitelja za zaključek njihovega razvoja (Lucas, 1998).
3.1 BOLEZENSKI KROG
Bolezenski krog zaobjema inokulacijo, penetracijo, infekcijo, kolonizacijo, rast in reprodukcijo patogena. Inokulacija je prvotni kontakt med rastlino in patogenom. Poteka na mestu rastline, kjer je možna infekcija. Katerikoli delček patogena, ki je v kontaktu z rastlino in jo je sposoben inficirati, se imenuje inokulum. Glivni patogeni okužujejo rastline s sporami in micelijem, medtem ko bakterije in virusi lahko okužijo rastlino le z enim samim celim patogenom.
Inokulum pride v kontakt z rastlino ponavadi preko vetra, vode ali stika z insekti. Patogeni v zemlji pa verjetno privlačijo snovi, ki jih rastline izločajo v rizosfero. Penetracija poteka direktno čez celično steno, čez naravne odprtine ali preko poškodovanega tkiva. Nekateri patogeni uporabljajo le eno od prej omenjenih metod za doseg penetracije, drugi pa več ali vse.
Bakterije se večinoma poslužujejo metode penetracije preko poškodovanega tkiva. Virusi in viroidi prav tako vstopajo na enak način, le da poškodbe povzročijo vektorji. Nematode prodirajo v gostitelja preko direktne penetracije celične stene, redkeje preko naravnih odprtih poti. Prodor patogena ne povzroči nujno okužbe, v kolikor je patogen penetriral v gostiteljski organizem, ki ni dovzeten za okužbo z njim. Patogeni, ki ne sprožijo okužbe, odmrejo brez povzročitve bolezni. Okužba je proces, s katerim patogeni preko kontakta z dovzetnimi celicami pridobivajo potrebna hranila. Hrano črpajo iz živih ali mrtvih celic. Po okužbi patogen
6
raste in se množi po rastlini. Okužba je lahko latentna ali pa so bolezenski znaki vidni takoj.
Patogeni izločajo različne snovi, kot so encimi in toksini, ki sprožijo imunski odziv rastline.
Rastline imajo razvite različne poti obrambnih mehanizmov, ki jih zaščitijo do različnih stopenj, torej morajo biti patogeni sposobni se integrirati v rastlino, pridobiti hranilne snovi in nevtralizirati gostiteljske obrambne sisteme (Agrios, 2005).
3.2 EPIDEMIJA RASTLINSKIH BOLEZNI
Epidemija je pojav razširjenja patogena na veliko posameznikov znotraj populacije na relativno velikem območju v razmeroma kratkem času. Epidemije rastlinskih bolezni se pojavljajo vsako leto. Epidemiologija je veda, ki se ukvarja z bolezenskim trikotnikom z namenom obvladovanja širjenja bolezni. Epidemije lahko povzročijo precejšnjo škodo, nekatere se razrešijo po naravni poti, v druge pa je potrebno poseči z aktivnimi metodami obvladovanja bolezni. Občasno se epidemije nenadoma pojavijo in hitro razširijo po celem svetu. Razvijejo se kot posledica časovne uskladitve dovzetne gostiteljske rastline, virulentnega patogena in ustreznih okoljskih pogojev. Ljudje smo lahko povzročitelji epidemij, ali pa lahko pripomoremo k njihovim zajezitvam; nastale posledice nas lahko bolj ali manj prizadenejo. Na nastanek epidemije vplivajo odpornost gostitelja, vrsta in starost rastline, stopnja genetske raznolikosti gostiteljske rastline, nivo virulenčnosti patogena, velikost inokuluma, ekologija patogena, način razmnoževanja in širjenja patogena in okoljski dejavniki, kot sta temperatura in zračna vlaga.
Svetovne povezave, kot so množična potovanja in mednarodna trgovina, vodijo v širjenje patogenov v nove okoliše, kje rastline niso prilagojene na te patogene, kar lahko vodi v epidemije (Agrios, 2005).
Trenutno spremljamo, kako se širi virus rjave grbančavosti plodov paradižnika (ToBRFV), ki so ga leta 2014 odkrili v Izraelu. ToBRFV je nov, visoko virulenten in agresiven virus, ter zato zelo nevaren. Hitro in enostavno se širi z okuženimi semeni ali sadikami, orodjem, obleko in obutvijo delavcev v nasadih, prenašajo ga lahko tudi žuželke. ToBRFV spada v rod Tobamovirus in je zelo stabilen virus, ki lahko preživi dolgo obdobje v ostankih okuženih rastlin, v prsti ali na okuženih površinah. Glavni gostiteljski rastlini virusa sta paradižnik in paprika. Virus ToBRFV lahko inficira različne plevele, ki pogosto ne kažejo bolezenskih znakov, in tako predstavljajo nezaznan vir za nove okužbe. Močno ogroža komercialno pridelavo paradižnika in paprike. Plodovi okuženih rastlin (slika 3) imajo rumene ali rjave lise, so drobnejši, ob močni okužbi tudi zgrbančeni in niso primerni za prodajo na trgu. Zaradi tega lahko bolezen povzroči veliko gospodarsko škodo (Bautman in sod., 2020). Da bi preprečili vnos in širjenje bolezni, so v Evropski uniji hitro sprejeli nove ukrepe, ki jih določa Izvedbeni sklep Komisije (EU) 2020/1191. Ukrepi zajemajo sistematično testiranje rastlin na navzočnost virusa ToBRFV, testiranje zadevnih semen v Evropski uniji in vsaka oseba, ki sumi na pojav virusa, ga je dolžna prijaviti pristojnemu organu (Uredba Komisije (EU) 2020/1191, 2020).
Kljub vsem preventivnim ukrepom so v avgustu 2021 odkrili prvo okužbo z virusom rjave grbančavosti plodov paradižnika tudi v Sloveniji.
Z in silico analizami znanstveniki raziskujejo paradižnikov genom za morebitne mikro RNA s tarčo na ToBRFV genomu. Na podlagi izvedenih analitskih metod napovedujejo, da je možno razviti paradižnik, ki bi bil rezistenčen na virus ToBRFV (Gaafar in Ziebell, 2020).
7
Slika 3: Znaki virusa ToBRFV na listih (A-C), zametkih plodov (D) in plodovih paradižnika (E-I) (Luria in sod., 2017)
3.3 INTERAKCIJE MED RASTLINAMI IN PATOGENI V RIZOSFERI
Mikroorganizmi, povezani z rastlinami, imajo kritično vlogo v razvoju, prehranjevanju in povečujejo rastlinam odpornost na različne tipe stresov. Rizosfera je obogateno okolje, ki obdaja koreninski sistem rastline z raznolikimi kulturami mikroorganizmov (Bordenstein in Theis, 2015). Med gostiteljsko rastlino in prisotnimi mikroorganizmi se informacije neprestano izmenjujejo in za to nalogo so mikro RNA dobro prilagojene. RNA je dobra komunikacijska molekula, saj je prisotna v vseh organizmih, ki uporabljajo regulacijo na osnovi RNA. RNA zagotavlja konzerviran in stabilen način komunikacije, ki ni omejen le na eno tkivo, organ ali organizem (Nelson in sod., 2017). Mikro RNA, ki so v vlogi mediatorjev, se transportirajo s pomočjo nanoveziklov, ki so splošno poimenovani ekstracelularni vezikli (EV). EV so nujni za zaščito RNA, proteinov in lipidov, ki se v vezikle nalagajo selektivno (Choi in sod., 2017).
Rastlinska mikro RNA je tkivno specifična in več sto se jih najde v koreninskem tkivu, zato se zelo verjetno več različnih mikro RNA sprošča iz rizosfere v obliki rizodepozitov preko EV (slika 4) (Breakfield in sod., 2011). Mikro RNA je sposobna regulacije večih genov kot odgovor na eksogene signale. Več molekul mikro RNA in malih RNA lahko hkrati vpliva na isto tarčno molekulo za natančno regulacijo. Mikro RNA se izločajo v rizosfero z namenom vzpostavitve med vrstne in med kraljevske komunikacije (Choi in sod., 2017).
8
Slika 4: Shematični prikaz interakcij med rastlinami in različnimi patogeni (bakterije, virusi, nematode, glive …) v rizosferi. Signali patogenov in EV z mikro RNA potujejo v smeri rastlinskega koreninskega sistema, medtem ko rastlinski rizodepoziti potujejo od korenin k patogenom. Med patogeni potekajo tudi medsebojne interakcije.
3.4 VLOGA MIKRO RNA V OBRAMBI PROTI GLIVNIM OKUŽBAM
Glive lahko producirajo ogromne količine spor, kar zagotavlja dovoljšno količino inokuluma za okužbo nadaljnjih rastlin. Imajo kratko latentno dobo in njihove spore se lahko prenašajo po zraku ali vodi. Glede na spolne strukture delimo glive na hitridiomicete, zigomicete, deuteromicete, askomicete in bazidiomicete. Patogene glive se nahajajo v vseh prej omenjenih delitvah (Strange, 2003).
9
Odkrili so mikro RNA podobne molekule v glivah (milRNA). Sledili so specifičnim rastlinskim mikro RNA in glivnim milRNA in odkrili njihovo tarčo. Rastlinska mikro RNA ima tarčo v virulenčnih genih glive, medtem ko milRNA vpliva na obrambne geni rastline. Večina rastlinam patogenih gliv formira hife, ki se širijo apikalno in tvorijo splet hif, ki se imenuje micelij. Apikalna rast glivnih orgnaizmov jim daje prednost, saj lahko s hifami prodirajo skozi zemljo, rastlinske ostanke ali živo tkivo. Patogene glive se prehranjujejo preko hif. Hife izločajo ekstracelularne encime, ki razgradijo kompleksne molekule. Hranilne snovi potlej hifa vsrka, in ko izrabi vse uporabne snovi, raste proti novem neizrabljenem prostoru. Spore patogenih gliv germinirajo in nastane micelij, ki ali okuži gostiteljsko rastlino ali proizvede infektivno strukturo, ki se imenuje haustorium. Za germinacijo so potrebne ugodne okoljske razmere, kot sta primerna temperatura in visoka zračna vlaga (Agrios, 2005).
Enake mikro RNA imajo različne funkcije pri različnih rastlinskih vrstah, ki so pod stresom zaradi različnih patogenskih okužb (Yin in sod., 2012). Še vedno je veliko število mikro RNA, ki se branijo pred različnimi glivnimi patogeni, neznanih. Glive proizvajajo fitotoksične spojine in encime, ki uničujejo mehansko strukturo rastline.
3.5 NEMATODE
Nematode so skupina rastlinskih parazitskih organizmov, ki povzročajo propad rastlin z neposredno parazitsko aktivnostjo neposredno na rastlini in hkrati posredno s prenašanjem rastlinskih virusov. Le dva razreda nematod vsebujeta rastlinske patogene in sicer, Tylenchida in Dorylaimida (Strange, 2003). Nematode se izležejo iz jajčec, za kar potrebujejo ugodne okoljske razmere. Ko se izležejo, lahko penetrirajo rastlino ali pa se razvijejo v odrasle nematode. Rastlinski koreninski sistem ima specifične faktorje, kot so ogljikov dioksid in aminokisline, ki so povezane z rastjo korenin, ki privlačijo nematode. Ti faktorji difundirajo več centimetrov stran od rizosfere. Nematode privlačijo gostiteljske in negostiteljske rastline, čeprav obstaja nekaj potrjenih primerov, ko jih bolj privlačijo gostiteljske rastline (Agrios, 2005).
3.6 BAKTERIJE
Glede na to, da je poznanih veliko različnih bakterij, jih je relativno majhno število opisanih kot rastlinskih patogenov. Večina rastlinam patogenih bakterij je enoceličnih, imajo flagelo in se delijo z binarno cepitvijo, redko pa se spolno razmnožujejo. Imajo sposobnost transdukcije, transformacije in konjugacije. Pri večini patogenov celice delujejo neusklajeno in neodvisno, razen pri Aktinomicetah ter Streptomicetah. Celice patogena se lahko razširijo po celotnem sistemu gostitelja ali pa na celoten organ. Bakterijski patogeni rastlin so omejeni pri razgradnji polimerov celične stene, saj večina nima genov za lignolitične ter celulolitične encime.
Namesto teh encimov se za prehranjevanje poslužujejo pektolitičnih encimov, ki razgrajujejo pektin v osrednji lameli. Razgradnja pektina služi bakteriji kot hranilo in ji hkrati omogoča prosto pot med celicami (Lucas, 1998).
10
3.6.1 Vloga mikro RNA v obrambi proti bakterijskim okužbam
Specifične mikro RNA so sposobne utišati avksinske signale s stabilizacijo Aux/IAA proteinov z usmeritvijo na družino F-box proteinov. Utišanje signalizacije avksinov je povezano tudi z nastankom salicilne kisline (SA), ki neposredno pripomore k antibakterijski obrambi rastlin.
Večina mikro RNA, odkritih pri okužbi rastline z vrstami Pseudomonas in Arabidopsis, je povezanih s produkcijo in signalizacijo hormonskih sinteznih poti kot sta SA in abscizinska kislina (ABA). Signalne poti SA uravnavajo obrambo proti biotrofnim patogenom v rastlinah.
ABA ima lahko negativne ali pozitivne vplive na obrambo proti različnim patogenom. Mikro RNA torej vplivajo na imunski sistem posredno in ne direktno; razvite so za natančno uravnavanje obrambnih odzivov (Islam in sod., 2018).
3.7 VIRUSI
Struktura virusov je preprosta, in sicer sestoji iz jedrne nukleinske kisline, ki je obdana s proteinskim plaščem ali kapsido. V okuženih celicah so prisotni v obliki kristaliničnih agregatov ali pa kot neodvisni delci. Metode prenosa virusov med gostitelji so zelo raznolike.
Učinkovito vzpostavljajo podvajanje v dovzetnih gostiteljskih celicah. Virus je vključen v presnovo celice gostitelja. Ob vstopu v gostiteljsko celico se virusna nukleinska kislina sprosti iz proteinskega plašča ter se razmnoži preko gostiteljskega transkripcijskega in translacijskega mehanizma. Novonastala nukleinska kislina in proteini se združijo v nov virus. V nasprotju z glivami in bakterijami, virusi ne napadajo strukturnega sistema rastline, temveč spodkopavajo sintetični mehanizem celice gostitelja. Virusi so preprosti paraziti, ampak imajo širok razpon struktur, morfologij in mehanizmov podvojevanja (Lucas, 1998). Virusi kot del njihove strategije okužbe rastline izkoriščajo gostiteljske nukleinske kisline. Nekatere rastlinske mikro RNA so prisotne v celici pred kontaktom s patogenom in služijo kot takojšna zaščita v primeru virusne invazije. Tako kot rastline uporabljajo mehanizem mikro RNA kot neko osnovno zaščito pred virusi, pa virusi uporabljajo strategijo z mikro RNA za slabšanje obrambe gostiteljskih rastlin (Lu in sod., 2008). Bitka proti virusnim obolenjem rastlin se bo nadaljevala po celem svetu. Nedavne študije se osredotočajo na identificiranje mikro RNA kot molekule za zdravljenje virusnih bolezni. Mikro RNA uporabljamo lahko tudi kot biomarkerje za sledenje virusom. Z razvojem novih tehnologij in splošnim napredkom na tem področju se število virusnih mikro RNA povečuje. Več dokazov potrjuje hipotezo, da le DNA virusi proizvajajo mikro RNA. Potrebnih je precej raziskav za to, da bomo zmožni izkoristiti celoten terapevtski potencial mikro RNA (Mishra in sod., 2020).
3.7.1 Virusna mikro RNA
Virusno mikro RNA (v-miRNA) so identificirali leta 2004 v Epstein-Barr virusu (EBV) s kloniranjem malih RNA izoliranih iz z EBV okuženih Burtkitt limfičnih celičnih linij. Odkrili so gene s karakteristikami mikro RNA. EBV ima v genih zapis za do zdaj odkritih štiriinštirideset virusnih mikro RNA. Domnevamo, da ostali DNA virusi prav tako proizvajajo mikro RNA (Pfeiffer in sod., 2004). Virusne mikro RNA v RNA virusu niso bile potrjene, kar lahko pripišemo replikaciji, ki poteka v citoplazmi in je oddaljena od mehanizmov, pomembnih za sintezo mikro RNA, ki se nahajajo v jedru gostiteljske celice (Neumann in sod., 2004). Izrez prekurzorskih pre-mikro RNA iz primarnega transkripta ni primeren produkcijski način, saj bi se lahko virusni RNA virulenčni geni uničili med procesom. Prav tako bi se lahko virusna mikro
11
RNA vezala na sam virusni genom, kar bi rezultiralo v cepitvi virusne informacije (Cullen, 2010). Glavna vloga virusne mikro RNA je regulacija genov, ki kontrolirajo latentnost. Mikro RNA sproži prehod iz latence v aktivno obliko (Neumann in sod., 2004). Virusna mikro RNA lahko tudi vpliva na gostiteljske gene, ki so nujno potrebni za rast ali ohranjanje latence virusa.
Torej modulirajo imunski odziv gostitelja, da omogočijo ugodno znotrajcelično okolje (Mishra in sod., 2020). Domnevamo, da imajo od neantigenih mikro RNA več koristi virusi, ki so dlje časa v latentni fazi kot tisti s kratko litično replikacijo. Glede na velikost in mutabilnost mikro RNA vsaka stopnja evolucijske ohranjenosti nakazuje na pomembno selektivno prednost.
Ohranjanje zaporedja sekvence, ki kodira mikro RNA, nakazuje na obstoj celičnih in ne virusnih tarč na mRNA, saj bi se lahko slednje razvijalo skupaj z virusno mikro RNA. Trenutno še ne znamo pojasniti, kako se virusi spopadajo s potencialno zaviralnimi učinki velikega števila gostiteljske celične mikro RNA, ki imajo potencialno tarčo v virusnem genomu ali virusni mRNA. Zanima nas ali so se razvili tako, da zavirajo delovanje te mikro RNA, ali pa zmanjšajo število vezavnih mest za mikro RNA, ki se izražajo v okuženih celicah. Obstaja tudi možnost, da so začeli izrabljati gostiteljske celične mikro RNA sebi v prid (Cullen, 2010). Uporaba mikro RNA je dobra virusna strategija, ker je majhna in zavzema zelo majhen delež genskega zapisa, ni imunogena in ima več funkcij (Roberts in Jopling, 2010).
3.7.2 Vloga mikro RNA v obrambi proti virusnim okužbam
Virusi lahko proizvajajo mikro RNA s tarčo v lastni virusni mRNA ali pa v gostiteljski celični mRNA. Torej patogeni proizvajajo mikro RNA z namenom zagotovitve ugodnega okolja za nadaljevanje življenskega cikla ali pa za regulacijo življenskega cikla (Roberts in Jopling, 2011). Rastline pa proizvajajo lastne mikro RNA, da bi se lahko branile proti okužbi. Nekatere so prisotne v celici in druge se sintetizirajo ob stiku s patogenom. Mikro RNA, ki so prisotne pred stikom predstavljajo neko bolj splošno obrambo, med tem ko tiste, ki se sintetizirajo po interakciji s patogenom so bolj specifične (Lu in sod., 2008). Virusna mikro RNA se sintetizira po podobnem postopku kot rastlinska mikro RNA, mikro RNA postane aktivna v citoplazmi, medtem ko mRNA, iz katere se je prepisala, ostane v jedru gostiteljske celice. Prostorska ločitev virusne mikro RNA in mRNA preprečuje inhibicijo lastne virusne mRNA po principu komplementarnosti (Broderick in Zamore, 2011). Vedno več dokazov kaže na to, da utišanje virusnih genov ojača rastlinsko imunost (Mishra in sod., 2020).
3.8 VIROIDI
Viroidi so zelo podobni virusom, le da je njihova RNA molekula krajša in nimajo proteinskega plašča. Imajo krožno RNA molekulo velikosti približno 300 nukleotidov, medtem ko imajo tipični RNA virusi RNA molekulo veliko približno 3000 nukleotidov. Domnevamo, da se iz viroidne RNA ne proizvede noben protein ali encim (Lucas, 1998). Viroidi so zelo podobni mikro RNA po njihovi strukturi in biološki funkciji. Viroidi se v jedru ali v kloroplastih rastlin podvajajo. Po delitvi se viroidni prekurzorji prenesejo iz mesta nastanka. Njihovo delovanje je podobno mikro RNA. Iz viroidne RNA molekule se prevedejo viroidne specifične RNA (vsRNA), ki podobno kot mikro RNA ne nosijo zapisa za sintezo beljakovin in se nereverzno prepisujejo med podvajanjem DNA. Sintezo mikro RNA sprožajo jih različni okoljski dejavniki in stres. Glede na velikost, strukturo, procesiranje in zmožnost medceličnega transporta so podobni mikro RNA (Diener, 2003).
12
4 MIKRO RNA KOT OSREDNJA MOLEKULA ZA INTERAKCIJE MED RASTLINAMI IN PATOGENI
Različni raziskovalci so dokazali interakcije med rastlinami in patogeni na nivoju mikro RNA na mnogih primerih (Preglednica 1). Izmenjava mikro RNA poteka med rastlinami in patogenimi glivami, oomicetami, nematodami, živalmi in virusi. Iz preglednice 1 je razvidno, da se mikro RNA signali med organizmi prenašajo v tudi bolj oddaljenih vejah kraljestev.
Preglednica 1: Primeri dokazanih interakcij med rastlinami in patogeni, posredovanih z mikro RNA.
4.1 IZRAŽANJE UMETNIH MIKRO RNA V TRANSGENI RASTLINI Arabidopsis thaliana
Znanstveniki so razvili tehnologijo, ki temelji na sintezi umetnih mikro RNA (amiRNA) v rastlinah. Rastlinski genski zapis so raziskovalci za potrebe raziskav amiRNA spremenili, tako da so zamenjali gene za naravno mikro RNA z amiRNA. Gensko spremenjena rastlina je pridobila odpornost na specifične transkripte, česar naravno ni imela. Uporabili so dvestotriinsedemdeset baznih parov dolg zapis za pri-miRNA159a . Iz prekurzorja je transgena rastlina sintetizirala pre-miRNA159 . Novo nastala amiRNA je komplementarna na sekvenco za nastanek proteinskega plašča mozaičnega virusa repe (TuMV). Raziskali in oblikovali so amiRNA z ustreznimi oligonukleotidnimi začetniki. Z direktno mutagenezo so zamenjali že obstoječo sekvenco miR159 s sintetično sekvenco z zapisom za amiRNA. V rastlino so preko transformacije vnesli plazmide s konstrukti za amiRNA komplementarne tarčne virusne
13
mRNA. Preverjali so ali je amiRNA zmožna razrezati tarčne mRNA virusa TuMV. V trinajstih analiziranih rastlinah od skupno šestnajstih so dokazali razrez na pričakovani poziciji virusne mRNA. Preverili so tudi, da do razreza v netransgenih rastlinah ob vnosu tarčne virusne mRNA ni prišlo. Ta poizkus dokazuje interakcijo med rastlinami in patogeni na nivoju mikro RNA. V drugem poizkusu so okužili tako transgene kot netransgene rastline s TuMV. Rezultati so pokazali, da so rastline z vnešenim genom za amiRNA postale odporne na TuMV, medtem ko so vse netransgene rastline kazale bolezenske znake. Konstrukt za amiRNA mora ustrezati parametrom za vstavitev sekvence v genom in ne sme biti komplementaren z lastno mRNA, da ne povzroči inhibicije translacije ali razreza lastne mRNA. Dokazali so, da je amiRNA učinkovita metoda za zvišanje odpornosti rastline na tarčne viruse (Niu in sod., 2006).
5 UPORABA V PRIHODNOSTI
Tehnologija za zvišanje odpornosti rastlin z uporabo mikro RNA ima ogromen potencial za zvečanje donosnosti in kakovosti pridelka. Predstavlja nov nabor transgenih organizmov.
Mirko RNA lahko pozitivno vplivajo na odziv rastlin na stres iz okolja, kot so okužbe s patogeni, pomanjkanje hranil, oksidativni stres, suša ali temperaturni stres, itd. (Khraiwesh in sod., 2008). Manipulacija mikro RNA v transgenih rastlinah lahko vodi v nov, spremenjen razvoj rastlin z drugačno rastlinsko arhitekturo, ki lahko proizvede večjo biomaso, kar zviša produktivnost v kmetijstvu. Razvili so različne strategije za gensko modificiranje rastlin na osnovi mikro RNA tehnologije, kar so predstavili v različnih rastlinskih vrstah. Med strategije sodijo prekomerno izražanje mikro RNA, znižanje ravni izražanja mikro RNA tarč in amiRNA tehnologija (Zhou in Luo, 2013). Strategijo prekomernega izražanje mikro RNA lahko uporabimo, kadar mikro RNA deluje kot pozitivni regulator stresa in se ne pojavljajo negativne lastnosti kot so stranski produkti pleiotropnega gena (Yang in sod., 2013). Prekomerno izražanje mikro RNA rezistenčnih tarč uporabimo v primeru, ko mikro RNA deluje kot negativni regulator stresa (Li in sod., 2008). Tehnologija amiRNA je novo področje raziskav, ki deluje po principu posttranskripcijskega genskega utišanja (PTGS). Raziskovalci nadomestijo naravne gene za mikro RNA sekvenco s sintetično proizvedenimi geni za amiRNA. Transgen se stabilno deduje, ostane aktiven v potomcih in ohranja imunost (Khraiwesh in sod., 2008). Mikro RNA se lahko uporabi kot biomarker za odpornost na določene bolezni v rastlinskih žlahtnjiteljskih programih (Islam in sod., 2018). Zaradi univerzalnosti mikro RNA, stabilnosti in sposobnosti konzerviranja ima mikro RNA tehnologija ogromen potencial v kmetijstvu, gozdarstvu in okoljski remediaciji (Christou in Twyman, 2004).
5.1 TVEGANJA
Tveganja, ki jih prinaša vpeljava nove mikro RNA tehnologije, zajemajo vse od zavračanja gensko spremenjenih organizmov do negativnega vpliva na okolje. Prav tako lahko mikro RNA vpliva na sestavo človeške črevesne mikrobiote. Tveganja z mikro RNA genskim modificiranjem lahko predstavljajo izven-tarčni učinki na druge gene gostitelja, na mikroorganizme, transgena introgresija in tveganje povezano z varnostjo hrane. S tehnologijo, ki uporablja male RNA, se lahko pojavi problem nenamernih sekundarnih učinkov, še posebej ob uporabi tehnologije za ustvarjanje širokega spektra odpornosti na patogene (Ramesh, 2013).
Prav tako obstaja možnost, da transgena rastlina z rezistenco na virus sproži horizontalni genski prenos v druge mikroorganizme v zemlji (Fuchs in Gonsalves, 2007). Rastline same po sebi
14
vsebujejo mikro RNA, v katerih se pojavlja tudi sekvenčna homologija s človeškimi geni, kar nam ne povzroča težav. Sklepamo, da prisotnost amiRNA ne vpliva na varnost prehranjevanja z gensko spremenjenimi organizmi (Ramesh, 2013). Do zdaj ni znano ali tehnologija prekomernega izražanja določene mikro RNA lahko povzroča težave za uporabo rastline v prehrani.
6 ZAKLJUČEK
Različni patogeni nenehno ogrožajo svetovno pridelavo rastlinskih pridelkov. Nova dognanja na področju raziskav v rastlinski biologiji so razkrila novo strategijo v boju proti patogenom z uporabo mikro RNA tehnologij, ki se odzovejo na napad patogenov. Z razvojem novih strategij in njihovo vpeljavo v proizvodnjo lahko bolj obvladujemo širjenje bolezni in vplivamo na kakovost pridelka.
Mikro RNA se lahko uporabi kot biomarker odpornosti na določene bolezni. Rastlinska odpornost, ki temelji na mikro RNA, je ključnega pomena za rastlinsko imunost. Trenutno razumevanje področja je dobra podlaga za razvoj molekularnih orodij za povečanje kmetijske proizvodnje. Potrebnih bo še precej poglobljenih raziskav o biokemičnih encimih in mikro RNA posredovanem mehanizmu (Islam in sod., 2018).
Zaradi univerzalnosti, stabilnosti in sposobnosti ohranjanja ima mikro RNA tehnologija ogromen potencial v agrokulturi, gozdarstvu in okoljski remediaciji. Kljub trenutni zadostni varnosti globalne prehrane obstajajo tveganja, da v prihodnosti proizvodnja ne bo zadostila naraščajočim potrebam (Christou in Twyman, 2004).
Veliki problemi se pojavljajo predvsem v revnejših državah in v državah v razvoju, ki nimajo vzpostavljene zanesljive pridelave hrane. Vse strategije za reševanje tega prehranjevalnega problema morajo vsebovati zvišan dohodek pridelovalcev preko zvišanja produktivnosti kmetijskih rastlin (Christou in Twyman, 2004). Tehnologija na osnovi mikro RNA ni le nov vir kandidatov transgenih organizmov, temveč je lahko navdih za razvoj novih tehnologij, kot je amiRNA. Študije interakcij na nivoju mikro RNA nam odkrijejo vpogled v mehanizme posttranskripcijske genske regulacije in rastlinske molekularne poti odzivov na stres (Zhou in Luo, 2013). Mikro RNA ima potencial postati novo biotehnološko orodje. Ovira so stranski učinki, kot so npr. pleiotropske spremembe rastlinske morfologije in razvoja. Pomembno je, da detektiramo vse povezane mehanizme, da lahko razvijemo pravilno transgeno strategijo, s katero dosežemo želeno lastnost (Li in sod., 2008).
15 7 VIRI
Agrios G. 1978. Plant pathology. 5th ed. Cambridge, Elsevier: 952 str.
Arnold N., Koppula P. R., Gul R., Luck C., Pulakat L. 2014. Regulation of cardiac expression of the diabetic marker MicroRNA miR-29. PloS One, 9, 7: e103284, doi:
10.1371/journal.pone.0103284: 11 str.
Bautman O., Yilmaz S., Roberts P., McAvoy E., Hutton S., Dey K., Adkins S. 2020. Tomato brown rugose fruit virus (ToBRFV): A potential threat for tomato production in Florida.
Plant Pathology.
https://edis.ifas.ufl.edu/publication/PP360 (25. avg. 2021)
Bordenstein S. R., Theis K. R. 2015. Host biology in light of the microbiome: ten principles of holobionts and hologenomes. PLoS Biology, 13, 8: e1002226, doi:
10.1371/journal.pbio.1002226: 23 str.
Broderick J. A., Zamore P. D. 2011. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy, 18, 12: 1104- 1110
Thomma B. P., Nurnberger T., Joosten M. H. 2011. Of PAMPs and effectors: the blurred PTI- ETI dichotomy. The Plant Cell, 23, 1: 4-15
Catalanotto C., Cogoni C., Zardo G. 2016. MicroRNA in control of gene expression: an overview of nuclear functions. International Journal of Molecular Sciences, 17, 10: 1712, doi: 10.3390/ijms17101712: 17 str.
Christou P., Twyman R. M. 2004. The potential of genetically enhanced plants to address food insecurity. Nutrition Research Reviews, 17, 1: 23-42
Choi J. W., Um J. H., Cho J. H., Lee H. J. 2017. Tiny RNAs and their voyage via extracellular vesicles: secretion of bacterial small RNA and eukaryotic microRNA.
Experimental Biology and Medicine, 242, 15: 1475-1481
Diener T. O. 2003. Discovering viroids - a personal perspective. Nature Reviews Microbiology, 1, 1: 75-80
Fuchs M., Gonsalves D. 2007. Safety of virus-resistant transgenic plants two decades after their introduction: lessons from realistic field risk assessment studies. Annual Review of Phytopathology, 45: 173-202
Gaafar Y. Z. A., Ziebell H. 2020. Novel targets for engineering Physostegia chlorotic mottle and tomato brown rugose fruit virus-resistant tomatoes: in silico prediction of tomato microRNA targets. The Journal of Life and Environmental Sciences, 8: e10096, doi:
10.7717/peerj.10096: 21 str.
Hurley B., Subramaniam R., Guttman D. S., Desveaux D. 2014. Proteomics of effector- triggered immunity (ETI) in plants. Virulence, 5, 7: 752-760
Hutvágner G., Zamore P. D. 2002. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science, 297, 5589: 2056-2060
Ibrahim H. M., Alkharouf N.W., Meyer S. L. F., Aly M. A. M., El A., Gamal El-Din K.Y., Hussein E. H. A., Matthews B.F. 2011. Post-transcriptional gene silencing of root-knot nematode in transformed soybean roots. Experimental Parasitology, 127, 1: 90-99
16
Islam W., Qasim M., Noman A., Adnan M., Tayyab M., Farooq T. H., Wang L. 2018. Plant microRNAs: Front line players against invading pathogens. Microbial Pathogenesis, 1, 118: 9–17
Jopling C.L., Schütz S., Sarnow P. 2008. Position-dependent function for a tandem
microRNA miR-122-binding site located in the hepatitis C virus RNA genome. Cell Host and Microbe, 4, 1: 77-85
Kehr J., Kragler F. 2018. Long distance RNA movement. New Phytologist, 218, 1: 29-40 Khraiwesh B., Ossowski S., Weigel D., Reski R., Frank W. 2008. Specific gene silencing by
artificial microRNAs in Physcomitrella patens: an alternative to targeted gene knockouts.
Plant Physiology, 148, 2: 684-693
Koch A., Kumar N., Weber L., Keller H., Imani J., Kogel K. H. 2013. Host-induced gene silencing of cytochrome P450 lanosterol C14α-demethylase-encoding genes confers strong resistance to Fusarium species. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110, 48:
19324-19329
Lee Y., Kim M., Han J., Yeom K. H., Lee S., Baek S. H., Kim V. N. 2004. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO Journal, 23, 20: 4051-4060
Li W. X., Oono Y., Zhu J., He X. J., Wu J. M., Iida K., Lu X. Y., Cui X., Jin H., Zhu J. K.
2008. The Arabidopsis NFYA5 transcription factor is regulated transcriptionally and posttranscriptionally to promote drought resistance. The Plant Cell, 20, 8: 2238-2251 Liew P. S., Hair-Bejo M. 2015. Farming of plant-based veterinary vaccines and their
applications for disease prevention in animals. Advances in Virology, 2015, doi:
10.1155/2015/936940, 12 str.
Lu M., Zhang Q., Deng M., Miao J., Guo Y., Gao W., Cui Q. 2008. An analysis of human microRNA and disease associations. PloS One, 3, 10: e3420, doi:
10.1371/journal.pone.0003420: 5 str.
Lucas J. A. 1998. Plant pathology and plant pathogens. 3rd ed. Oxford, Blackwell Publishing:
845 str.
Niu Q. W., Lin S. S., Reyes J.L., Chen K. C., Wu H. W., Yeh S. D., Chua N. H. 2006.
Expression of artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nature Biotechnology, 24, 11: 1420-1428
Nelson J. W., Atilho R. M., Sherlock M. E., Stockbridge R. B., Breaker R. R. 2017.
Metabolism of free guanidine in bacteria is regulated by a widespread riboswitch class.
Molecular Cell, 65, 2: 220-230
Neumann G., Brownlee G. G., Fodor E., Kawaoka Y. 2004. Orthomyxovirus replication transcription and polyadenylation. Biology of Negative Strand RNA Viruses: The Power of Reverse Genetics, 283: 121-143
Pfeffer S., Zavolan M., Grässer F. A., Chien M., Russo J. J., Ju J., John B., Enright A. J., Marks D., Sander C., Tuschl T. 2004. Identification of virus-encoded microRNAs.
Science, 304, 5671: 734–736
17
Pitino M., Coleman A.D., Maffei M. E., Ridout C. J., Hogenhout S.A. 2011. Silencing of Aphid genes by dsRNA feeding from plants. Plos One, 6, 10: e25709, doi:
10.1371/journal.pone.0025709: 8 str.
Ramesh S. V. 2013. Non-coding RNAs in crop genetic modification: considerations and predictable environmental risk assessments (ERA). Molecular Biotechnology, 55, 1: 87- 100
Reinhart B. J., Weinstein E. G., Rhoades M. W. 2002. MicroRNAs in plants. Genes and Development, 16, 13: 1616-1626
Roberts A. P., Jopling C. L. (2010). Targeting viral infection by microRNA inhibition.
Genome Biology, 11, 1: 1-4
Shahid N., Daniell H. 2016. Plant-based oral vaccines against zoonotic and non-zoonotic diseases. Plant Biotechnology Journal, 14, 11: 2079-2099
Strange R. 2003. Introduction to Plant Pathology. 1st ed. West Sussex, John Wiley and Sons:
464 str.
Uredba Komisije (EU) št. 2020/1191 z dne 11. avgusta 2020o vzpostavitvi ukrepov za preprečevanje vnosa virusa rjave grbančavosti plodov paradižnika (virusa ToBRFV) v Unijo in njegovega širjenja znotraj Unije ter razveljavitvi Izvedbenega sklepa (EU) 2019/1615. 2020. Uradni list Evropske unije, L 262/6
Vega-Arreguín J. C., Jalloh A., Bos J. I., Moffett P. 2014. Recognition of an Avr3a homologue plays a major role in mediating nonhost resistance to Phytophthora capsici in Nicotiana species. Molecular Plant Microbe Interact, 27, 8: 770-780
Wang B., Sun Y., Song N., Zhao M., Liu R., Feng H., Wang X., Kang Z. 2017. Puccinia striiformis f. sp. tritici microRNA-like RNA 1 (Pst-milR1) an important pathogenicity factor of Pst, impairs wheat resistance to Pst by suppressing the wheat pathogenesis-related 2 gene. New Phytologist, 215, 1: 338-350
Winter J., Jung S., Keller S., Gregory R. I., Diederichs S. 2009. Many roads to maturity:
microRNA biogenesis pathways and their regulation. Nature Cell Biology, 11, 3: 228-234 Yang C., Li D., Mao D., Liu X. U. E., Ji C., Li X., Zhao X., Cheng Z., Chen C., and Zhu L.
2013. Overexpression of micro RNA 319 impacts leaf morphogenesis and leads to enhanced cold tolerance in rice (O ryza sativa L.). Plant Cell and Environment, 36, 12:
2207-2218
Yin Z., Li Y., Han X., Shen F. 2012. Genome-wide profiling of miRNAs and other small non- coding RNAs in the Verticillium dahliae-inoculated cotton roots. PloS One, 7, 4: e35765, doi: 10.1371/journal.pone.0035765: 10 str.
Zhang Y. Y., Hong Y. H., Liu Y. R., Cui J., Luan Y. S. 2021. Function identification of miR394 in tomato resistance to Phytophthora infestans. Plant Cell Reports, 40, 8: 1-14 Zhou M., Luo H. 2013. MicroRNA-mediated gene regulation: potential applications for plant
genetic engineering. Plant Molecular Biology, 83, 2: 59-75
18 ZAHVALA
Zahvaljujem se svoji mentorici izr. prof. dr. Nataši Štajner za vso ljubeznivost in pripravljenost za pomoč.
Hvala moji družini, ki verjame vame in me podpira na moji poti.
