BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Jan ŠUŠTERŠIČ
RAZNOLIKOST GENSKIH VIROV LISTNEGA OHROVTA (Brassica oleracea L.)
MAGISTRSKO DELO
Magistrski študij - 2. stopnja
Ljubljana, 2021
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Jan ŠUŠTERŠIČ
RAZNOLIKOST GENSKIH VIROV LISTNEGA OHROVTA (Brassica oleracea L.)
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
DIVERSITY OF GENETIC RESOURCES OF LEAFY KALE (Brassica oleracea L.)
M. SC. THESIS Master Study Programmes
Ljubljana, 2021
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa druge stopnje Biotehnologija. Delo je bilo opravljeno na Oddelku za poljedelstvo, vrtnarstvo, genetiko in žlahtnjenje na Kmetijskem inštitutu Slovenije.
Študijska komisija je za mentorja magistrskega dela imenovala izr. prof. dr. Vladimirja Megliča in za somentorja dr. Lovra Sinkoviča. Za recezentko je bila imenovana prof. dr.
Zlata Luthar.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik: prof. dr. Mojca NARAT
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko Član: izr. prof. dr. Vladimir MEGLIČ
Kmetijski inštitut Slovenije, Oddelek za poljedelstvo, vrtnarstvo, genetiko in žlahtnjenje
Član: dr. Lovro SINKOVIČ
Kmetijski inštitut Slovenije, Oddelek za poljedelstvo, vrtnarstvo, genetiko in žlahtnjenje
Član: prof. dr. Zlata LUTHAR
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo
Datum zagovora: 15.7.2021
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2
DK UDK 582.683.211.4:635.347:577.21:631.52:581.4:547.972(043.2)
KG listni ohrovt, rastlinski genski viri, deskriptor, morfološka raznolikost, bioaktivne spojine, genetska raznolikost
AV ŠUŠTERŠIČ, Jan
SA MEGLIČ, Vladimir (mentor), SINKOVIČ, Lovro (somentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Magistrski študijski program druge stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN RAZNOLIKOST GENSKIH VIROV LISTNEGA OHROVTA (Brassica oleracea L.)
TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja) OP X, 73 str., 10 pregl., 28 sl., 106 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Listni ohrovt (Brassica oleracea L.) je manj razširjena vrtnina, ki v zadnjem času vse bolj pridobiva na pomenu kot del zdrave prehrane, saj vsebuje številne zdravju koristne snovi. Namen magistrskega dela je bil preučiti raznolikost 18 genskih virov listnega ohrovta iz genskih bank v jugovzhodne Evrope. Na morfološkem nivoju smo raznolikost določali z uporabo 36 IBPGR deskriptorjev v vegetativni in generativni fazi rasti. Na biokemijskem nivoju smo raznolikost ovrednotili z meritvami vsebnosti skupnih fenolnih spojin s pomočjo Folin-Ciocalteu reagenta, antioksidacijskega potenciala po DPPH metodi in vsebnosti skupnih flavonoidov z aluminijevim kloridom. Stopnjo genetske raznolikosti smo določili z uporabo mikrosatelitnih markerjev. Pri vsakem obravnavanem genskemu viru smo v sklopu morfološke karakterizacije v vegetativni fazi rasti izmerili 9 numeričnih morfoloških parametrov, v generativni fazi pa ovrednotili 18 opisnih in izmerili 9 numeričnih morfoloških parametrov. Na podlagi rezultatov smo genske vire razvrstili in opisali glede na morfološke značilnosti. Največjo raznolikost na biokemijskem nivoju smo opazili pri antioksidacijskem potencialu in najmanjšo pri vsebnosti skupnih flavonoidov. Z mikrosateliti smo določili stopnjo raznolikosti med posameznimi genskimi viri listnega ohrovta in oblikovali tri genetske skupine. Pridobljene informacije in rezultati magistrskega dela bodo osnova za opis genskih virov listnatega ohrovta v različnih bazah podatkov ter uporabni pri nadaljnjih programih žlahtnjenja.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 582.683.211.4:635.347:577.21:631.52:581.4:547.972(043.2)
CX leafy kale, plant genetic resources, descriptor, morphological diversity, bioactive compounds, genetic diversity
AU ŠUŠTERŠIČ, Jan
AA MEGLIČ, Vladimir (supervisor), SINKOVIČ, Lovro (co-advisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Master Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI DIVERSITY OF GENETIC RESOURCES OF LEAFY KALE (Brassica oleracea L.)
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes) NO X, 73 p., 10 tab., 28 fig., 106 ref.
LA sl AL sl/en
AB Leafy kale (Brassica oleracea L.) is a less common vegetable that is recently gaining in importance as part of a healthy diet since it contains many health-promoting substances. The purpose of the master's thesis was to examine the diversity of 18 genetic resources of leafy kale from gene banks of South-Eastern Europe. At the morphological level, diversity was determined using 36 IBPGR descriptors during the vegetative and generative growth phases. At the biochemical level, diversity was evaluated by measuring the content of total phenolic compounds using Folin- Ciocalteu reagent, antioxidant potential according to the DPPH method and the content of total flavonoids using aluminium chloride. Genetic diversity was determined using microsatellite markers. Within the morphological characterisation, 9 numerical morphological parameters were measured for each genetic resource in the vegetative growth phase, and 18 descriptive and 9 numerical morphological parameters were described/measured in the generative phase. Based on the results, genetic resources were classified and described according to morphological characteristics. At the biochemical level, the highest diversity was observed for antioxidant potential and the lowest for the total flavonoid content. Genetic diversity between individual genetic resources of leafy kale was determined using microsatelites and three genetic groups were formed. The information obtained and the results of the master's thesis will be the basis for the description of genetic resources of leafy kales in databases and useful in further breeding programes.
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO PREGLEDNIC VII
KAZALO SLIK VIII
OKRAJŠAVE IN SIMBOL X
1 UVOD 1
1.1 NAMEN DELA 2
1.2 DELOVNE HIPOTEZE 2
2 PREGLED OBJAV 3
2.1 GENSKI VIRI IN RASTLINSKE GENSKE BANKE 3
2.2 OPIS RASTLINE 3
2.1.1 Taksonomija rastline 4
2.1.2 Rastne razmere, tehnološki ukrepi in oskrba rastlin 6
2.2 MORFOLOGIJA IN MORFOLOŠKI DESKRIPTORJI 7
2.3 BIOAKTIVNE SPOJINE 8
2.3.1 Antioksidanti 8
2.3.2 Fenolne spojine in flavonoidi 9
2.3.3 Meritve bioaktivnih spojin 10
2.4 GENETSKE ANALIZE 12
2.4.1 Genetske analize z različnimi DNA markerji 13 2.4.2 Uporaba SSR markerjev v genetskih analizah 14
2.4.3 Novejše genetske analize 16
3 MATERIALI IN METODE 18
3.1 RASTLINSKI MATERIAL 18
3.2 MORFOLOŠKI PARAMETRI 19
3.2.1 Vrednotenje rastlin listnega ohrovta z numeričnimi morfološkimi
parametri 20
3.2.2 Vrednotenje rastlin listnega ohrovta z opisnimi morfološkimi parametri 21
3.5 DOLOČANJE VSEBNOSTI BIOAKTIVNIH SPOJIN 25
3.5.1 Določanje antioksidacijskega potenciala 26
3.5.2 Določanje skupnih fenolnih spojin 27
3.5.3 Določanje skupnih flavonoidov 28
3.6 ANALIZA GENETSKE RAZNOLIKOSTI 29
3.6.1 Izolacija DNA 29
3.6.2 Genotipizacija 31
3.6.3 Kvalitativna obravnava PCR fragmentov 33
3.7 STATISTIČNA OBDELAVA REZULTATOV 35
4 REZULTATI 36
4.1 VREDNOTENJE LISTNEGA OHROVTA Z NUMERIČNIMI
MORFOLOŠKIMI PARAMETRI 36
4.2 VREDNOTENJE LISTNEGA OHROVTA Z OPISNIMI MORFOLOŠKIMI
PARAMETRI 45
4.3 BIOKEMIJSKO VREDNOTENJE 52
4.4 VREDNOTENJE GENETSKE RAZNOLIKOSTI 54
5 RAZPRAVA 56
5.1 VREDNOTENJE GENSKIH VIROV LISTNEGA OHROVTA Z
NUMERIČNIMI IN OPISNIMI MORFOLOŠKIMI PARAMETRI 56
5.2 BIOKEMIJSKA ANALIZA 58
5.3 GENETSKA ANALIZA 60
6 SKLEPI 62
7 POVZETEK 64
8 VIRI 66
ZAHVALA
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Genski viri listnega ohrovta vključeni v morfološko, biokemijsko in
genetsko vrednotenje 18
Preglednica 2: PCR postopek piquemal za genotipizacijo genskih virov listnega ohrovta 32 Preglednica 3: PCR postopek ssr-tail za genotipizacijo genskih virov listnega ohrovta 32 Preglednica 4: Seznam uporabljenih markerjev za genotipizacijo genskih virov listnega
ohrovta 33
Preglednica 5: Osnovni statistični parametri za 9 numeričnih morfoloških parametrov
listnega ohrovta vrednotenih med vegetativno fazo 37
Preglednica 6: Numerični morfološki parametri (povprečna vrednost ± standardni odklon) vrednoteni med vegetativno fazo za preučevane genske vire listnega ohrovta 39 Preglednica 7: Osnovni statistični parametri za 9 numeričnih morfoloških parametrov listnega ohrovta vrednotenih med cvetenjem ter na plodovih (luskih) in semenih 42 Preglednica 8: Numerični morfološki parametri (povprečna vrednost ± standardni odklon) vrednoteni med cvetenjem, na plodovih (luskih) in semenih za preučevane genske vire
listnega ohrovta 44
Preglednica 9: Osnovni statistični parametri za antioksidacijski potencial, vsebnosti
skupnih fenolov in skupnih flavonoidov v genskih virih listnega ohrovta 53 Preglednica 10: Antioksidacijski potencial, vsebnosti skupnih fenolov in skupnih
flavonoidov v posameznem genskem viru listnega ohrovta 54
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Raznolikost rastlin listnega ohrovta v času vegetativne rasti 4 Slika 2: Trikotnik, ki predstavlja genome in genomsko povezanost najpomembnejših vrst
iz rodu Brassica (Koh in sod., 2017) 6
Slika 3: Osnovna struktura flavonoidov (Kumar in Pandey, 2013) 10 Slika 4: Mehanizma delovanja antioksidantov (Liang in Kitts, 2014) 10 Slika 5: Vezava antioksidanta na DDPH molekulo in sprememba barve (Nabeelah Bibi in
sod., 2020) 11
Slika 6: Meritve višine in širine rastline listnega ohrovta (prirejeno po IBPGR, 1990) 20 Slika 7: Meritve na listu listnega ohrovta (prirejeno po IBPGR, 1990) 21 Slika 8: Meritve na lusku listnega ohrovta (prirejeno po IBPGR, 1990) 21 Slika 9: Položaj luskov na rastlini listnega ohrovta (prirejeno po IBPGR, 1990) 24 Slika 10: Zunanja površina luskov listnega ohrovta (prirejeno po IBPGR, 1990) 24 Slika 11: Umeritvena krivulja za določanje AOP z DDPH• testom 27 Slika 12: Umeritvena krivulja za določanje TPC po Folin-Ciocalteujevi metodi 28 Slika 13: Umeritvena krivulja za določanje TFC z uporabo AlCl3 29 Slika 14: Plošče z odpipetiranim supernatantom in ostalimi reagenti 30 Slika 15: Princip delovanja MagMAX ™ Exppress (QiaGen, 2016) 30 Slika 16: Mikrocentrifugirke z genomsko DNA, raztopljeno v pufru TE 31 Slika 17: Pomnoženi fragmenti DNA listnega ohrovta z mikrosatelitnimi markerji s
sistemoma GeneGenius in GeneSnap (Syngene) 34
Slika 18: Polno razviti listi 18 genskih virov listnega ohrovta v vegetativni fazi rasti 40 Slika 19: Razporeditev genskih virov listnega ohrovta v razrede na podlagi štirih opisnih
parametrov, ki opisujejo cvetno steblo 46
Slika 20: Razporeditev genskih virov listnega ohrovta v razrede na podlagi opisnih
parametrov barva cvetov in cvetni vonj 47
Slika 21: Raznolikost cvetov 18 genskih virov listnega ohrovta v fazi polnega cvetenja v
letu 2020 47
Slika 22: Razporeditev genskih virov listnega ohrovta v razrede na podlagi opisnega
parametra barva luskov pred zorenjem 48
Slika 23: Raznolikost luskov 18 genskih virov listnega ohrovta v fazi pred zorenjem v letu
2020 49
Slika 24: Razporeditev genskih virov listnega ohrovta v razrede na podlagi opisnih
parametrov, ki opisujejo luske 50
Slika 25: Raznolikost luskov 18 genskih virov listnega ohrovta v fazi polne zrelosti v letu
2020 51
Slika 26: Raznolikost semen 18 genskih virov listnega ohrovta pobrana iz zrelih luskov v
letu 2020 51
Slika 27: Razporeditev genskih virov listnega ohrovta v razrede na podlagi opisnih
parametrov primarna barva semen in število semen v lusku 52 Slika 28: Genetska povezanost genskih virov listnega ohrovta določena z 12
visokopolimorfnimi mikrosatelitnimi markerji 55
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
A absorbanca
AOP antioksidacijski potencial bp bazni par (angl. base pair) DPPH 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil
ET prenos elektrona (angl. electron transfer)
FAO Organizacija združenih narodov za prehrano in kmetijstvo HAT prenos H-atoma (angl. hydrogen atom transfer)
IBPGR mednarodni urad za rastlinske genske vire (angl. international board for plant genetic resources or bioversity international)
NTC slepi vzorec (angl. no-template control)
PCR verižna reakcija s polimerazo (angl. polymerase chain reaction)
PIC informacijska vrednost polimorfizma (angl. polymorphic information content) ROS reaktivne kisikove zvrsti
SSR enostavna sekvenčna ponovitev (angl. simple sequence repeat) TFC vsebnost skupnih flavonoidov
TPC vsebnost skupnih fenolov
1 UVOD
Kapusnice (Brassica oleracea L.) so del velike družine imenovane križnice (Brassicaceae).
Pogosti predstavniki kapusnic so zelje, ohrovt, cvetača, brokoli in druge vrste. Kapusnice, ki jih pridelujemo v današnjem času naj bi izvirale iz različnih oblik divjega zelja (Brassica oleracea L. var. oleracea), ki je uspevalo ob obalah Sredozemskega morja in Atlantika.
Različne vrste zelja naj bi pridelovali že Rimljani (Hahn in sod., 2016).
Listni ohrovt je manj razširjena vrsta kapusnic, ki pa v zadnjih letih pridobiva vse bolj na pomenu kot del zdrave prehrane. Je tradicionalna vrsta predvsem na Primorskem in v Istri, medtem ko je drugje po Sloveniji manj poznana rastlinska vrsta. Pridelovalne površine z ohrovtom se v svetovnem merilu povečujejo, tradicionalno pa je prisoten v pridelavi zlasti na manjših vrtovih. Razlog za vse večjo razširjenost je v enostavni pridelavi in vsebnosti številnih zdravju koristnih snovi, kot so glukozinolati, polifenoli, karotenoidi in terpenoidi.
Listni ohrovt navadno uživamo kot samostojno jed, dodatek solatam ali pa iz njih pripravimo sokove in smutije. Uporablja se v različnih omletah, juhah ali kot dodatek glavnim jedem.
Liste lahko uporabimo tudi za izdelavo čipsa (posušeni ali ocvrti listi), vendar sušenje poslabša hranilno vrednost. Semena se lahko uporabljajo za proizvodnjo olja, vendar je izplen količine olja zelo majhen. Novejši način priprave za prehrano so fermentirani listi listnega ohrovta, pri čemer pa se mora raziskati še odziv potrošnikov, saj ima takšna hrana značilno drugačen okus (Šamec in sod., 2018).
Glede na vrsto in pomembnost v kmetijski pridelavi Organizacija združenih narodov za prehrano in kmetijstvo (FAO) deli kapusnice v dve veliki skupini. V prvo skupino sodita cvetača in brokoli, v drugo pa zelje in ostale vrste iz rodu Brassica. V to skupino med drugim uvrščamo tudi listni ohrovt (Faostat, 2020). Listni ohrovt je dvoletna rastlina, na kateri v prvem letu rasti, kot pridelek pobiramo liste ali pa celotno rozeto. Rastlina lahko v optimalnih pogojih zraste tudi do višine 2 metra, običajno pa razvije zelene nakodrane ali gladke liste. V drugem letu rasti iz pazduh listov odženejo cvetna stebla z rahlo grozdastimi socvetji. Cvetovi so rumeni in značilne oblike za družino križnic. Plod imenujemo lusk, semena so jajčaste oblike in običajno rjave barve (Matotan, 2019).
Kmetijstvo se sooča z nenehnimi okoljskimi izzivi kot so podnebne spremembe, degradacija kmetijskih zemljišč, rast števila prebivalstva, izguba biodiverzitete, rastlinski škodljivci in bolezni, na katere se mora hitro prilagoditi. Uporaba različnih rastlinskih genskih virov ima pri prilagoditvi na tovrstne spremembe pomembno vlogo v kmetijstvu in proizvodnji hrane.
Z načrtnim žlahtnjenjem in selekcijo lahko ublažimo posledice takšnih sprememb ali se jim vsaj prilagodimo. S selekcijo običajno izgubljamo genetsko raznolikost znotraj populacije, vendar lahko to izgubo nadoknadimo z ustreznimi agrotehnološkimi ukrepi, ki pa niso nujno okolju prijazni. Za povečanje genetske raznolikosti znotraj populacij je pomembno ohranjanje rastlinskih genskih virov, predvsem starih sort in divjih populacij, s katerimi se
genski sklad bistveno razširi. Ohranjanje rastlinskega genetskega materiala je naloga genskih bank. Akcesija je enota genskega materiala v zbirki rastlinskih genskih virov. Z opisom morfoloških lastnosti, genetskimi in biokemijskimi analizami rastlinskega genetskega materiala znotraj genskih bank ter ureditvijo zbirk, pridobimo pomembne zbirke podatkov. Te zbirke podatkov nam lahko služijo za hitro in enostavno izbiro rastlinskega genskega vira, ki ga bomo danes ali nekoč v prihodnosti uporabili, morda celo nujno potrebovali, v programih žlahtnjenja in/ali selekcije.
1.1 NAMEN DELA
Genski viri listnega ohrovta, ki so zbrani v genskih bankah so večinoma slabo raziskani. V našem delu smo se osredotočili na morfološko, biokemijsko in genetsko karakterizacijo izbranih genskih virov listnega ohrovta iz genskih bank jugovzhodne Evrope. Opisali smo morfološke lastnosti različnih genskih virov z uporabo mednarodno priznanih morfoloških deskriptorjev in jih primerjali med seboj. V sklopu biokemijskega vrednotenja bomo s spektrofotometričnimi metodami določili vsebnost skupnih fenolnih spojin, vsebnost skupnih flavonoidov in antioksidacijski potencial v listih obravnavanih genskih virov listnega ohrovta. Za preučevanje genetske raznolikosti smo uporabili molekulske markerje, v našem primeru mikrosatelite. Pridobljene podatke smo zbrali in analizirali s programi za vizualizacijo podatkov.
1.2 DELOVNE HIPOTEZE
Na podlagi morfoloških lastnosti in molekulskih markerjev bo možno razdeliti genske vire listnega ohrovta v posamezne skupine.
Med genskimi viri listnega ohrovta bo velika morfološka in genetska variabilnost.
Biokemijska analiza bo pokazala razlike med preučevanimi genskimi viri listnega ohrovta.
2 PREGLED OBJAV
2.1 GENSKI VIRI IN RASTLINSKE GENSKE BANKE
Podnebne in okoljske spremembe vse bolj vplivajo na sodobno kmetijstvo. Panoga se na te spremembe prilagaja z ustreznimi agrotehnološkimi ukrepi in uvajanjem novih, prilagojenih sort kmetijskih rastlin. Z načrtnim žlahtnjenjem in selekcijo se v novejših sortah izgublja velika genetska raznolikost, s tem pa povečuje odvisnost pridelka od agrotehnoloških ukrepov, kot so gnojenje in uporaba pesticidov, ki pa imajo lahko na okolje negativni vpliv.
Z uporabo starih sort in divjih sorodnikov gojenih rastlin lahko v postopkih žlahtnjenja in selekcije ponovno povečamo raznolikost genskega sklada znotraj posamezne rastlinske vrste in s tem poskrbimo za prilagoditev na okoljske razmere ter stabilen pridelek (Dullo, 2019).
Rastlinski genski viri so kakršen koli genski material rastlinskega izvora, ki ima pomembno vlogo v prehrani in kmetijstvu (Šuštar Vozlič, 2019). Rastlinske genske vire so Zaid in sod.
(1999) definirali kot generativni oz. vegetativni razmnoževalni material naslednjih kategorij rastlin:
- trenutno gojene sorte in sorte v preizkušanju (angl. cultivated varieties (cultivars) in current use and newly developed varieties),
- zastarele sorte (angl. obsolete cultivars),
- populacije (angl. primitive cultivars – landraces),
- bližnji sorodniki gojenih sort (divje sorte, pleveli) (angl. wild and weed species, near relatives of cultivated varieties) in
- poseben genetski material – žlahtniteljske linije in mutanti (angl. special genetic stocks – including elite and current breeder's lines and mutants).
Za ohranitev rastlinskih genskih virov so bile ustanovljene rastlinske genske banke (Peres, 2016). Rastlinska genska banka je zbirka rastlinskega materiala, ki hrani semena, gomolje ali rastline. Namen genske banke je zbiranje, vrednotenje in shranjevanje rastlinskega materiala ex situ. Imajo pomembno vlogo pri ohranjanju rastlinskih genskih virov, predvsem starejših sort in populacij (Dullo, 2019). Posamezno enoto genskega materiala, ki ga hranimo v zbirki rastlinskih genskih virov imenujemo akcesija.
2.2 OPIS RASTLINE
Listni ohrovt je nezahtevna kapusnica s kratko rastno dobo, ki jo pridelujemo zaradi listov ali listne rozete. Je dvoletna rastlina, ki v prvem letu tvori listno maso, v drugem letu pa cveti in tvori semena. Znanih je več tipov listnega ohrovta, in sicer kodrolistni, gladkolistni, strženasti ter okrasni (Slika 1). Za prehrano so primerni tako mladi kot polno razviti listi.
Listi razvijejo najboljši okus po prvih jesenskih slanah, ko se škrob spremeni v sladkor.
Starejši listi so pogosto precej grenki. Odpornost na nizke temperature je odvisna od sorte, nižje so navadno odpornejše kot visoke (Sinkovič in sod., 2018). Na hranilno vrednost
pomembno vpliva zlasti čas spravila. Fadigas in sod. (2010) so ugotovili, da imajo rastline ohrovta ob spravilu v zimskem času več mikrohranil (npr. Fe, Zn, Mn) in makrohranil (npr.
Ca, Mg) v primerjavi z listi pobranimi v poletnem času.
Slika 1: Raznolikost rastlin listnega ohrovta v času vegetativne rasti
V prvem letu oz. v času vegetativne rasti lahko steblo rastline listnega ohrovta v optimalnih pogojih zraste celo do višine 2 metra. Na njem se razvijejo posamezni, običajno bolj ali manj skodrani ali gladki listi. Po višini rastlin lahko listni ohrovt delimo na nizki, srednje visok in visok. Listi so običajno različnih odtenkov zelene barve, lahko pa vsebujejo tudi antociane, ki so odgovorni za modre, rdeče ali vijolične barvne odtenke. So spiralno razporejeni, listne žile pa močno izražene. Rastlina v vegetativni fazi ne oblikuje glave kot zelje ali popkov kot brstični ohrovt, njene korenine pa so globlje kot pri ostalih kapusnicah (Matotan, 2019;
Uzgoj lisnatog kelja ..., 2021). Raznolikost rastlin listnega ohrovta v času vegetativne rasti je prikazana na sliki 1.
V drugem letu oz. v času vegetativne rasti se iz pazduh listov pojavijo cvetne veje z rahlo grozdastimi socvetji. Cvetovi so rumene barve in značilne oblike za družino križnic, sestavljeni iz štirih čašnih in štirih venčnih listov. Prašnikov je šest, od katerih imata dva krajše niti, plodnica pa je nadrasla. Plod je dvopredalasta glavica imenovana lusk ali lušček, dolžine okoli 12 cm. Semena so nekoliko jajčaste oblike, rjave barve pogosto tudi z odtenki rdeče in modre, njihov premer pa je okoli 3 mm. Masa 1000-semen je običajno od 3 do 4 g (Matotan, 2019).
2.1.1 Taksonomija rastline
Listni ohrovt poznamo pod različnimi poimenovanji, tako da enotnega imena ni. Sistematika in taksonomija družine križnic je zelo kompleksna in kot pomoč pri določanju pravilne vrste se uporabljajo različne podatkovne zbrike kot sta BrassiBase in Germplasm Resources Information Network (GRIN). V teh dveh zbirkah so zbrani različni podatki o posameznih
vrstah, njihovem imenu, izgledu, filogenetska drevesa, itd. (Kiefer in sod., 2014; Germplasm ..., 2020).
BrassiBase (2017) in GRIN (Germplasm ..., 2020) navajta za listni ohrovt dva latinska sinonima Brassica oleracea L. var. viridis L. in Brassica oleracea L. var. acephala DC.
Mednarodni urad za rastlinske genske vire (IBPGR) listni ohrovt latinsko poimenuje kot Brassica oleracea var. acephala (angl. kale), mednarodna zveza za varstvo novih sort rastlin (UPOV) pa kot Brassica oleracea L. convar. acephala (DC.) Alef. V slovenščini lahko poleg poimenovanja listni ohrovt zasledimo tudi imena kodrolistni ohrovt, kodrolistnati ohrovt ali listnati ohrovt. Kodrolistni ohrovt je v bazi GRIN latinsko poimenovan kot Brassica oleracea L. var. sabellica L. (sinonim je Brassica oleracea L. var. acephala auct.) ali kot Brassica oleracea L. var. selenisia L. Urad skupnosti za rastlinske sorte (CPVO) in IBPGR uporabljata latinsko poimenovanje Brassica oleracea L. var. sabellica L. (angl. curly kale, collard). V Pravilniku o trženju semena zelenjadnic (2005) pa je kodrolistni ohrovt latinsko poimenovan kot Brassica oleracea L. convar. acephala (DC) Alef. var sabellica L., kar ustreza poimenovanju po UPOV, ki uporablja enako latinsko ime, v angleščini pa je poimenovan kot »curly kale«.
Taksonomske študije znotraj družine Brassicaceae potekajo že dolgo, saj so bile prve opravljene že v letu 1919. Rod Brassica je sestavljen iz številnih vrst in podvrst, od katerih je za kmetijstvo in pridelavo hrane pomembnih šest vrst: Brassica oleracea L. (zelje, ohrovt, koleraba, brokoli in cvetača), Brassica rapa L. (kitajsko zelje, strniščna repa in oljne sorte), Brassica napus L. (vrsta je alopoliploid, nastal s križanjem vrst Brassica oleracea in Brassica rapa in kasnejšo podvojitvijo genoma; predstavnik je oljna ogrščica), Brassica nigra L. Koch (črna gorčica), Brassica juncea L. Czern. (vrsta je alopoliploid, nastal s križanjem vrst Brassica rapa in Brassica nigra; predstavnik je rjava gorjušica) in Brassica carinata A. Braun. (vrsta je alopoliploid, nastal s križanjem vrst Brassica nigra in Brassica oleracea; predstavnik je etiopska gorjušica) (Maggioni, 2015). Prikaz genetske povezanosti šestih najpomembnejših vrst iz rodu Brassica je prikazan na sliki 2.
Slika 2: Trikotnik, ki predstavlja genome in genomsko povezanost najpomembnejših vrst iz rodu Brassica (Koh in sod., 2017)
Morfološko je pogosto težko opredeliti, kako poimenovati posamezno vrsto rastlin ali križance rastlin znotraj rodu Brassica. Imajo namreč veliko podobnih morfoloških parametov, tako, da razvrščanje v taksonomske razrede glede na fenotip ni možno. Za podrobnejšo taksonomsko razvrstitev se uporabljajo različne metode, kot so fluorescenčna in situ hibridizacija (angl. fluorescent in situ hybridization – FISH), metode mikrosatelitnih markerjev (angl. short sequence repeats – SSR), polimorfizem enega nukleotida (angl. single nucleotide polymorphism – SNP), multipleks verižna reakcija s polimerazo (angl. multiplex polymerase chain reaction – MPCR), metode preučevanja kloroplastne DNA in proteinske sestave ter druge metode. Z ustrezno metodo se lahko genske vire uspešno razvrsti v pravilno vrsto ali podvrsto (Maggioni, 2015; Koh in sod., 2017).
2.1.2 Rastne razmere, tehnološki ukrepi in oskrba rastlin
Listni ohrovt lahko sejemo direktno na mesto pridelave ali presajamo predhodno vzgojene podtaknjence ali sadike. Sejemo lahko od februarja (na toplejših območjih) pa vse do oktobra. Prve zimske slane za rastline niso škodljive, s prehranskega stališča celo koristijo, saj izboljšajo okus listov. Hude dolgotrajne zmrzali pa rastline težje prenesejo. Listni ohrovt uspeva v vseh tipih tal, najbolj mu ustrezajo lahka s hranili dobro založena in odcedna tla (Coolong in sod., 2014).
Za uspešno pridelavo je pomembno, da je setvena priprava tal ustrezna in so le-ta dobro obdelana. Vrednost pH tal mora biti okoli 6,5, če so bolj kisla, jih po potrebi ustrezno apnimo. Kolobar mora biti zelo širok, kar pomeni, da si kapusnice, tudi križnice, sledijo le na vsakih nekaj let (Sinkovič in sod., 2018). Pri gnojenju upoštevamo odvzem hranil s pridelkom in rezultate analize tal. Z ustrezno tehnološko opremo in znanjem lahko bistveno
povečamo pridelek. Pomembno je upoštevati navodila in slediti dobrim kmetijskim praksam (Tehnološka ..., 2020).
2.2 MORFOLOGIJA IN MORFOLOŠKI DESKRIPTORJI
Morfologija je veda, ki se ukvarja z vidnimi oblikami organizma ter z razvojem in evolucijskimi procesi, ki pripeljejo do teh oblik (Ločniškar, 1999). Rastline so kompleksen organizem in za lažje razločevanje njihovih lastnosti uporabljamo morfološke deskriptorje.
Cilj uporabe deskriptorjev je opis rastlinskega genskega materiala za potrebe nadaljnjega dela. Različne zbirke deskriptorjev vsebujejo posamezne deskriptorje, ki so ponavadi pod neko številčno kodo in vključujejo metode za opisovanje ali merjenje teh deskriptorjev.
Deskriptor je definiran kot lastnost, ki se jo da opisati ali izmeriti na rastlinskih genskih virih.
Elementi posameznega deskriptorja so ime, stanje oz. izgled in metoda, ki opiše kako naj se deskriptor oceni.
Pri ocenjevanju izgleda si lahko pomagamo z referenčnimi vzorci in tako zmanjšamo subjektivnost ocene. Metoda ocenitve vsebuje tarčno mesto rastline (npr. steblo, list, cvet), pogoje ocenjevanja (npr. ko steblo oleseni, ob razvoju prvih listov, ob cvetenju) in postopek ocenitve. Poznamo numerične oz. kvantitativne in opisne oz. kvalitativne deskriptorje.
Zraven opisnega deskriptorja je običajno napisana še koda (številka), s katero lažje in hitreje uredimo ter pregledamo podatke. Za opisovanje morfoloških lastnosti rastlin se uporabljajo zbirke deskriptorjev, ki so mednarodno priznane in urejene po določenem redu. Namen standardizacije zbirk deskriptorjev je neodvisno enakovredno vrednotenje genskih virov, ustrezna izmenjava informacij in lažja uporaba le teh (Bioversity International, 2007).
Z oceno morfoloških lastnosti lahko razdelimo sorte listnega ohrovta v različne skupine.
Morfološka ocena je pomembna, saj jo upoštevamo pri nadaljnji selekciji in žlahtnjenju rastlin. Videz rastline na trgovski polici lahko potrošnike močno pritegne ali pa odvrne od nakupa. Z ocenitvijo morfoloških lastnosti lahko odberemo tiste genske vire, ki se nam zdijo primerni za nadaljnje žlahtnjenje ali ponudbo na trgu. Balkaya in sod. (2005) so ugotovili, da barva listov močno vpliva na odločitev potrošnikov o nakupu.
Morfološke deskriptorje za karakterizacijo križnic pripravljajo naslednje organizacije:
- IBPGR (angl. International Board for Plant Genetic Resources) je mednarodna organizacija ustanovljena leta 1974 z namenom shranjevanja rastlinskega materiala in ohranjanja raznolikosti. Sprva je delovala pod okriljem FAO, od leta 1990 pa deluje kot samostojna organizacija, ki tesno sodeluje s FAO in ostalimi organizacijami, ki se ukvarjajo s hranjenjem rastlinskega materiala (Engels in Thormann, 2000). Od leta 2006 se imenuje Bioversity International.
- CPVO (angl. Community Plant Variety Office) je urad skupnosti za rastlinske sorte, ki je neodvisen organ Evropske unije s sedežem v Angersu v Franciji. Ustanovljen
je bil z namenom upravljanja sistema žlahtniteljskih pravic EU v skladu z Uredbo Sveta (ES) 2100/94. CPVO sprejema postopke za preizkušanje razločljivosti, izenačenosti in nespremenljivosti (RIN) sort. Sestavni del postopkov preizkušanja za posamezne rastlinske vrste so tehnični vprašalniki (CPVO, 2020).
- UPOV (angl. International Union for the Protection of New Varieties of Plants) je mednarodna zveza za varstvo novih sort rastlin in medvladna organizacija s sedežem v Ženevi v Švici. Ustanovljena je na podlagi Mednarodne konvencije o varstvu novih sort rastlin sprejete v Parizu leta 1961. Za rastlinske vrste, za katere CPVO postopki še niso sprejeti, se uporabljajo UPOV smernice za preizkušanje RIN sort (UPOV, 2011).
Morfološke analize na genskih virih listnega ohrovta so bile dosedaj opravljene le na določenih lokalnih populacijah z uporabo IBPGR in UPOV morfoloških deskriptorjev. V zbirki deskriptorjev IBPGR lahko največjo raznolikost morfotipov opišemo v času polne vegetativne zrelosti (IBPGR, 1990). Raziskave so pokazale velika morfološka odstopanja med posameznimi populacijami, tudi znotraj istega območja, kar lahko izkoristimo za nadaljnje delo na področju žlahtnjenja (Cartea in sod., 2003; Balkaya in sod., 2005; Batelja in sod., 2009; Sefo in sod., 2010).
2.3 BIOAKTIVNE SPOJINE
Bioaktivne spojine so snovi, ki so v hrani prisotne v majhnih količinah in živilom dajejo dodatno hranilno vrednost, saj lahko pozitivno vplivajo na naše zdravje. Te snovi lahko zmanjšujejo oksidativni stres, imajo pozitiven vpliv na zaščito pred rakom, uravnavanje metabolizma, imajo pa tudi številne druge zdravju koristne lastnosti. Kemijska struktura bioaktivnih spojin je zelo raznolika, kar vpliva na dostopnost le-teh v našem telesu in njihov biološki učinek (Santos in sod., 2019).
2.3.1 Antioksidanti
V prehrani so antioksidanti definirani kot snovi, ki so v majhnih količinah sposobne zmanjšati ali ustaviti oksidacijo lahko oksidativnih molekul, npr. maščob. V živilski industriji nekateri antioksidante enačijo z inhibitorji verižnih reakcij lipidne peroksidacije.
V bioloških sistemih so antioksidanti molekule v nizkih koncentracijah glede na količino molekul, ki se lahko oksidirajo in zmanjšajo ali preprečijo oksidacijo. Gre za širšo definicijo, kot je prva, saj antioksidanti preprečujejo tudi oksidacijo DNA, proteinov, ali pa inhibirajo delovanje oksidativnih encimov. Mehanistična definicija antioksidanta pravi, da je to molekula, ki je sposobna oddati vodikov atom ali elektron. Vse tri definicije so pravilne in skupaj opišejo lastnosti antioksidantov (Atta in sod., 2017).
Živi organizmi imajo učinkovite antioksidacijske obrambne mehanizme. Antioksidante lahko razdelimo v več skupin na podlagi različnih lastnosti. Lahko jih delimo na encimske in neencimske. Encimski vključujejo superoksid dismutazo, katalazo in glutation peroksidazo. Neencimski obrambni mehanizem pa se še naprej razdeli na molekule z nizko molekulsko maso: askorbinska kislina ali vitamin C, glutation, prolin, karotenoidi, fenolne kisline, flavonoidi, vitamin E; in molekule z visoko molekulsko maso: tanini, albumin.
Poznamo tudi delitev antioksidantov na vodotopne (npr. vitamin C), ki se običajno nahajajo v citosolu, in topne v maščobah (npr. vitamin E), ki se običajno nahajajo znotraj celičnih membran (Kasote in sod., 2015; Nimse in Pal, 2015). Pomembno vlogo imajo pri zmanjševanju učinka oksidativnega stresa. Oksidativni stres nastane, ko produkcija reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) preraste antioksidacijski obrambni mehanizem. Reaktivne kisikove zvrsti imajo pomembno vlogo kot sporočevalci v različnih znotrajceličnih signalnih kaskadah in pomagajo pri vzdrževanju homeostaze rastline v danem okolju. Pri povišanem nivoju ROS pride do sprememb molekul kot so proteini, lipidi in nukleinske kisline (Burton in Jauniaux, 2011). Poleg zaščite pred prostimi radikali, imajo omenjeni antioksidanti, še posebej pa polifenoli in karotenoidi, tudi druge biološke funkcije. Delujejo protivnetno, protibakterijsko in protivirusno, učinkovito pa delujejo tudi pri rakavih obolenjih (Xu in sod., 2017).
2.3.2 Fenolne spojine in flavonoidi
Fenolne spojine uvrščamo med sekundarne metabolite. Obstaja več kot 8000 različnih spojin, katerim skupen je vsaj en aromatski obroč z vsaj eno hidroksilno (–OH) funkcionalno skupino. V rastlinah nastanejo po poti šikiminske kisline, pri kateri dobimo fenilalanin, ki služi kot prekurzor vsem fenolnim spojinam (Cartea in sod., 2011). Poleg prekurzorja fenilalanina je možno fenolne spojine sintetizirati tudi iz aminokisline tirozin (Margna in sod., 1985).
Glede na število aromatskih obročev in število –OH skupin fenolne spojine uvrščamo v različne razrede kot so enostavni fenoli, fenolne kisline, flavonoidi, lignani, lignini, stilbeni, tanini in ostali (Balasundram in sod., 2006). Flavonoidi so skupaj s karotenoidi in klorofili prisotni v različnih tkivih rastlin ter odgovorni za številne barvne odtenke tkiv kot so modra, vijolična, rumena, oranžna in rdeča (Khoddami in sod., 2013). Flavonoidi imajo številne pozitivne lastnosti na zdravje. Njihova najpomembnejša lastnost je antioksidativni učinek, saj varujejo pred škodljivim oksidativnim stresom, srčnimi obolenji in pred različnimi oblikami raka (Cartea in sod., 2011).
Flavonoidi so spojine, ki imajo skupaj 15 C-atomov in osnovno strukturo (C6-C3-C6), ki se imenuje flavan oz. 2-fenilbenzopiran (Slika 3). Flavonoidi so zelo razširjena skupina vodotopnih fenolnih spojin. Med njimi je največ antocianov, katehinov, procianidinov, flavonov in flavonolov, poznamo pa še druge podskupine. V naravi se molekule flavonoidov
običajno nahajajo kot 3-O-glikozidi, kar pomeni, da so na C-3 atomu vezani različni sladkorji. Nastanek glikozidov je pomemben za rastlino, ker se s tem zmanjša toksičnost, poveča pa topnost fenolne spojine v vodi. Nesladkorni del molekule v taki spojini imenujemo aglikon. V skupino flavonoidov prištevamo tudi halkone, dihidrohalkone in avrone, ki strukturno sicer niso flavonoidi, pač pa so njim zelo sorodne spojine, tako kemično kot biosintetsko (Abram in Simčič, 1997). Vsebnost flavonoidov v rastlinah iste vrste je odvisna od genetske raznolikosti, bioloških in okoljskih razmer (Aryal in sod., 2019).
Slika 3: Osnovna struktura flavonoidov (Kumar in Pandey, 2013)
2.3.3 Meritve bioaktivnih spojin
Antioksidacijski potencial (AOP) nam pove sposobnost antioksidanta, da poišče in nevtralizira radikal, npr. z donacijo vodika. Poznanih je več metod za merjenje AOP, ki jih lahko glede na mehanizem delovanja antioksidantov razdelimo v dve skupini, tj. prenos H- atoma (angl. hydrogen atom transfer) in prenos elektrona (angl. electron transfer) (Liang in Kitts, 2014). Metode prenosa H-atoma delujejo na principu sposobnosti antioksidanta, da radikalu donira vodik. Gre za premik protona in elektrona v enem koraku, antioksidant sicer postane radikal, vendar je stabilnejši od prvotnega radikala. Metode prenosa elektrona pa delujejo na principu prenosa elektronov, s katerim antioksidant onesposobi radikal.
Antioksidant prostemu radikalu donira elektron, sam pa postane radikalni kation (Prior in sod., 2005).
Slika 4: Mehanizma delovanja antioksidantov (Liang in Kitts, 2014)
Mehanizma delovanja antioksidantov v večini primerov potekata istočasno z različno hitrostjo (Slika 4). Vrednost AOP v splošnem pove koliko molekul, ki so sposobne oksidacije, imamo v našem vzorcu. Pogoji, ki določajo antioksidativno sposobnost molekul, so struktura antioksidantov, pH reakcijskega medija, trajanje analize, itd. (Abramovič in sod., 2018). Zelo velik vpliv na končni rezultat AOP ima izbira topila in njegova polarnost (Kowalczyk in sod., 2013; Ayshwarya in Sudha Rameshwari, 2015). Pri reakcijah prenosa H-atoma je pomembna predvsem energija disociacije vezi, pri reakcijah prenosa elektrona pa ima najpomembnejšo vlogo ionizacijski potencial (Liang in Kitts, 2014).
DPPH• metoda merjenja AOP temelji na reakciji med stabilnim radikalom DPPH in antioksidantom. Antioksidant odda vodikov atom in DPPH• preide v nereaktivno obliko DPPH-H. Radikal DPPH• ima maksimum absorbcije svetlobe pri 517 nm. Učinek preiskovanih antioksidantov na vsebnost radikala pri različnih koncentracijah antioksidanta določimo spektrofotometrično tako, da merimo znižanje absorbance pri izbrani valovni dolžini. Posledica spremembe barve iz vijolične v rumeno je znižanje absorbance pri 517 nm, ko radikal DPPH• preide v stabilno molekulo DPPH-H. Večje kot je znižanje absorbance, večji AOP ima vzorec. Slika 5 prikazuje spremembe na molekuli DPPH•, ki se zgodijo, ko z njo reagira antioksidant in poteče mehanizem reakcije. Kot standard se najpogosteje uporabljajo galna kislina, Trolox, katehin ali askorbinska kislina (Abramovič in sod., 2018).
Slika 5: Vezava antioksidanta na DDPH molekulo in sprememba barve (Nabeelah Bibi in sod., 2020)
Metoda določanja skupnih fenolnih spojin (TPC) temelji na tvorbi modro obarvanega kompleksa fenolnih spojin s Folin-Ciocalteujevim reagentom. Dejansko metoda opiše redukcijsko sposobnost antioksidanta, saj temelji na sposobnosti preiskovane spojine, da odda elektron, ki reducira molibden v kompleksu fosfomolibden/fosfovolfram. Donor elektrona je fenoksidni anion (AOˉ), ki nastane pri bazičnih pogojih po deprotonaciji –OH skupine v molekuli fenolne spojine. Reducirana oblika kompleksa, ki modro obarva
reakcijsko zmes, ima absorbcijski maksimum pri valovni dolžini 765 nm. Višja vrednost absorbance pokaže na boljšo redukcijsko sposobnost preiskovanih antioksidantov. Kot standard se najpogosteje uporablja galna kislina (Everette in sod., 2010).
Postopek kvantifikacije vsebnosti skupnih flavonoidov (TFC) temelji na reakciji med flavonoidi in aluminijevim kloridom, pri čemer se tvori kompleks, ki obarva raztopino rumeno in ima absorpcijski maksimum pri valovni dolžini 415 nm. Z metodo aluminijevega klorida (AlCl3) pri valovnih dolžinah okoli 425 nm običajno zaznamo flavone in flavonole (Woisky in Salatino, 1998; Popova in sod. 2004; Pękal in Pyrzynska, 2014). Kot standard se najpogosteje uporablja rutin, galangin, katehin ali kvercetin (Pękal in Pyrzynska, 2014).
Kvercetin spada med flavonole in je pogosto prisoten v rastlinah znotraj družine Brassicacea, tudi v listnem ohrovtu (Podsędek, 2007; Olsen in sod., 2009; Cartea in sod., 2011).
2.4 GENETSKE ANALIZE
Genotipizacija je skupek laboratorijskih metod, s katerimi določamo posamezne genetske variante ali posamezne genetske dele, ki jih posameznik ima ali nima. Na podlagi genotipizacije lahko identificiramo sorte, preučujemo genetsko raznolikost rastlin, določamo izvor in sorodnost sort znotraj posamezne vrste (Štajner, 2010).
Morfološka in biokemijska karakterizacija rastlin nam podata prvo oceno o genetski raznolikosti populacije. Ker pa je takšna karakterizacija močno odvisna od biotskih in abiotskih dejavnikov je pogosto manj natančna. Za namene odkrivanja genetske raznolikosti se zato običajno uporabljajo različni DNA markerski sistemi (Adu in sod., 2019). Z genetskimi analizami pridobljene podatke je potrebno ustrezno analizirati. To pomeni, da si s podatki pomagamo pri odgovarjanju na vprašanja kot so kakšna je raznolikost med posameznimi preučevanimi osebki in kako je ta raznolikost porazdeljena znotraj populacije.
Če raznolikosti znotraj vrste oz. populacije ni, potem je izboljšanje posamezne lastnosti zelo težko (Govindaraj in sod., 2015).
Pri raziskavah genetskih analiz razlikujemo med dvema pojmoma: genetska variabilnost (angl. genetic variability) in genetska raznolikost (angl. genetic diversity). Variabilnost so variante alelov posameznega gena, raznolikost pa je širši pojem, njeno vrednost predstavlja število genov. Če ta dva pojma združimo skupaj, ugotovimo, da je genetska variabilnost sestavni del genetske raznolikosti. Raznolikost v rastlinskih genskih virih je pomembna za žlahtnitelje, da izboljšajo ali vnesejo želene lastnosti v že uveljavljene rastlinske linije.
Takšne lastnosti so količina pridelka, velikost semen, odpornost na bolezni, itd. Naravno prisotna genetska raznolikost (npr. divje vrste, sorodne vrste, mutanti) in žlahtnjenje skupaj s selekcijo, omogočajo izbor želenega genotipa oz. rastlin, ki se jih lahko uporabi v nadaljnjih programih žlahtnjenja (Bhandari in sod., 2017).
2.4.1 Genetske analize z različnimi DNA markerji
Pri uporabi RAPD (angl. random amplified polymorphic DNA) markerjev gre za metodo z verižno reakcijo s polimerazo (angl. polymerase chain reaction – PCR), pri kateri uporabljamo kot marker naključno pomnoženo polimorfno DNA in se uporablja pri določanju diverzitete rastlin. Princip metode je uporaba poljubnih kratkih začetnih oligonukleotidov običajno dolgih 10 bp. Segmenti, ki jih ti začetni oligonukleotidi pomnožijo, so naključni in razpršeni po celotnem genomu. Rezultat analize je lahko prisotnost pomnožka, ki ga vidimo na gelu ali njegova odsotnost (Liu in Cordes, 2004).
Okomus in Balkaya (2007) sta opravila raziskavo na 20 populacijah listnega ohrovta z uporabo RAPD markerjev z namenom odkriti genetsko raznolikost lokalnih populacij listnega ohrovta na obmčju Črnega morja. Hkrati sta opravila morfološke analize in primerjala rezultate genetske in morfološke analize. Genetsko razdaljo med posameznimi akcesijami sta izračunala s pomočjo Jaccardov-ega koeficienta, glede na prisotnost ali odsotnost posameznih pomnožkov na gelu. Ugotovila sta, da je za genetsko sorodnost pomembnejši geografski izvor kot morfološka podobnost. Margalé in sod. (1995) so opravili raziskavo z uporabo RAPD markerjev na območju Francije na treh različnih varietetah listnega ohrovta. Z uporabo samo RAPD markerjev niso mogli razločiti med dvema varietetama, zato je bila potrebna morfološka analiza. Genetska raznolikost med varietetami je bila nizka, kar pripisujejo dejstvu, da gre za ekstenzivno gojeno zelenjadnico in ni bilo prisotnega žlahtnjenja. V raziskavi so ugotovili, da se skupine, razporejene glede na RAPD analizo skladajo s skupinami razporejenimi glede na morfologijo, RAPD markerji pa so pomagali morfološko skupino razdeliti na podskupine.
Pri uporabi AFLP (angl. amplified fragment length polymorphism) markerjev gre za PCR metodo, kjer se kot marker uporablja polimorfizem dolžin pomnoženih fragmentov. Z uporabo restrikcijskih encimov DNA razrežemo, dodamo adapterje in začetne oligonukleotide, ter s PCR tehnologijio pomnožimo odseke, kjer so se začetni oligonukleotidi vezali (Liu in Cordes, 2004). Christensen in sod. (2010) so v raziskavi uporabili AFLP markerje za ugotavljanje genetske raznolikosti med in znotraj gojenih ter divjih populacij listnega ohrovta. Z AFLP markerji niso mogli določiti kraja izvora, prav tako niso opazili razlik med gojenimi in divjimi populacijami listnega ohrovta. Z analizo molekularne variance (angl. analysis of molecular variance – AMOVA) so ugotovili 62 % genetsko raznolikost znotraj populacije. El-Esawi in sod. (2015) so raziskovali genetsko raznolikost 25 genskih virov Brassica oleracea L. Z uporabljenimi AFLP markerji so uspeli razlikovati med posameznimi vrstami. Študija je pokazala, da sta cvetača in zelje genetsko bolj povezana med seboj kot pa z listnim ohrovtom. Dokazali so večjo genetsko raznolikost znotraj genskih virov in manjšo raznolikost med genskimi viri. Maggioni in sod. (2014) so s pomočjo AFLP markerjev prišli do podobnih ugotovitev glede genetske raznolikosti med in znotraj posameznega genskega vira. Poleg tega so se divje populacije genetsko jasno
razlikovale od gojenih populacij. Z uporabo AFLP markerjev niso mogli določiti geografskega izvora akcesij.
Polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov (angl. restriction fragment length polymorphism – RFLP) je bil prvi uporabljen molekulski marker, še pred tehnologijo PCR.
Princip metode je razrez genomske DNA z uporabo restrikcijskih encimov, nanos na gel in prenos na najlonsko ali nitrocelulozno membrano oz. Southern-ov prenos, kjer na fragmente prilegajo fluorescentno označene sonde (Liu in Cordes, 2004). Song in sod. (1988) so opravili analizo z RFLP markerji na različnih vrstah rodu Brassica. Ugotovili so, da naj bi Brassica oleracea izvirala iz divjega prednika ali zelo sorodne vrste z devetimi kromosomi.
Z RFLP analizo so razločili posamezne vrste med seboj in znotraj vrst določili posamezne podskupine. Ugotovili so, da so vse tri alotetraploidne vrste na filogenetskem drevesu locirane med diploidni vrsti, iz katerih izhajajo. V drugi raziskavi so Song in sod. (1988) izhajali iz prve raziskave in ugotovili, da imajo genski viri s podobno morfologijo podobne vzorce pri RFLP analizi. Prišli so do sklepa, da je filogenetska razvrstitev genskih virov na podlagi samo ene kombinacije encimov in označevalnih sond nepopolna, saj imajo nekateri fragmenti večji vpliv na filogenetsko razvrstitev kot drugi. V tretji raziskavi so Song in sod.
(1990) raziskovali evolucijo genoma in filogenetsko razvrstitev več vrst rodu Brassica s pomočjo RFLP markerjev. Ugotovili so, da gojene akcesije vrste Brassica oleracea izhajajo iz skupnega divjega prednika, kot možnost skupnega prednika pa omenjajo še Brassica aboglabra ali kitajski ohrovt. Različne podvrste ohrovtov sestavljajo visoko raznoliko skupino in predstavljajo začetne morfotipe iz katerih predvidevajo, da so se razvili brokoli, cvetača in ostale podvrste. Ugotovili so, da je zelje genetsko bolj sorodno ohrovtu, cvetača pa brokoliju. Rezultati omenjene raziskave kažejo, da sta za diploidne vrste možne dve različni evolucijski poti.
2.4.2 Uporaba SSR markerjev v genetskih analizah
Mikrosateliti ali kratke tandemske ponovitve (angl. short tandem repeats) oz. enostavne sekvenčne ponovitve (angl. simple sequence repeats – SSRs) so 2–10 bp dolga ponovljiva nukleotidna zaporedja, ki so sestavni del genoma (Ciofi in sod., 1998). Pomembna lastnost mikrosatelitov, ki jih loči od večine molekulskih markerjev je ta, da se v PCR pomnožujejo predhodno poznane sekvence (lokusi) DNA, ki so določene z nukleotidnim zaporedjem začetnih oligonukleotidov. Odlikuje jih visoka pogostnost pojavljanja in enakomerna razporejenost v genomih evkariontov, so kodominatni, hipervariabilni, visoko polimorfni in zato tudi zelo informativni (Štajner, 2010). Prednosti so še, da je pridobivanje genetskega materiala neinvazivno, prav tako že obstaja veliko različnih PCR protokolov, ki so v splošni uporabi. Uporabljamo lahko označene ali neoznačene začetne oligonukleotide, za prikaz PCR rezultatov pa se uporablja elektroforeza (Ciofi in sod., 1998).
Mikrosatelite delimo na popolne (sestavljeni samo iz enega motiva osnovne ponovitve, ki se ponavlja brez prekinitve, npr.: ctctctctctctctctctctct), nepopolne (ena ali več ponovitev vsebuje bazo, ki ne odgovarja osnovnemu motivu ponovitve, npr.: ctctctctgtctctct), prekinjene (vsebujejo krajšo insercijo baznih parov, ki se ne ujemajo z osnovnim motivom ponovitve, npr.: ctctctctctgggctctctct) in sestavljene (vključujejo dva ali več mikrosatelitov, ki pa se med seboj razlikujejo po tipu ali motivu ponovitve, npr.: ctctctctctctgatgatgatgat) (Štajner, 2010).
Ničti aleli in homoplazija onemogočajo genotipizacijo z uporabo mikrosatelitnih markerjev.
V obrobnih regijah mikrosatelitskih lokusov pogosto nastajajo mutacije in posledica tega je lahko nastanek ničtih alelov. Lažna smrt mikrosatelita se lahko pojavi kadarkoli in je posledica nukleotidnih substitucij, insercij ali delecij, ki nastanejo v obrobnih regijah, zaradi česar začetni oligonukleotidi ne prepoznajo mest prileganja. Rezultat takšnega procesa so ničti aleli, ki se lahko ustalijo v populaciji. Posledica lažne smrti mikrosatelita so številni na videz neuspeli poskusi pomnoževanja lokusov med vrstami. Obstoj ničtih alelov lahko dokažemo tako, da naredimo nove začetne oligonukleotide, ki se prilegajo na drugem mestu obrobne regije mikrosatelita, ki ni bil podvržen mutaciji ali pa ga lahko odkrijemo z analizo segregacije križancev (Štajner, 2010). V populacijskih študijah uporabljamo Hardy- Weinberg-ovo pravilo za iskanje ničtih alelov, vendar je to samo ocena, so še drugi razlogi za pojave odstopanja od pričakovanj pojava alelov (Chapuis in Estoup, 2007).
Mikrosateliti so običajno na osnovi različne strukture in zgodovine nastanka različno dolgi, vendar pa obstajajo tudi aleli enake dolžine, ki so strukturno in evolucijsko popolnoma različni. Ta pojav imenujemo homoplazija. Na genskem nivoju je homoplazija torej pojav, ko sta dva alela identična po svoji pojavni obliki oz. dolžini, ne pa tudi po izvoru (Estoup in sod., 2002). Problem je v tem, da se variabilnost mikrosatelitov običajno vrednoti po dolžinah pomnoženih PCR fragmentov. Tako lahko gre pri alelih enake dolžine bodisi za homoplastične, bodisi za homologne alele, kar iz same dolžine ni moč razbrati. Seveda pa je pri potencialni zamenjavi pojava interpretacija rezultatov lahko napačna (Štajner, 2010).
Lotti in sod. (2018) so opravili raziskave s SSR markerji na listnem ohrovtu iz območja južne Italije. Uporabili so 12 SSR markerjev in določili genetsko raznolikost. Na podlagi rezultatov so ugotovili, da so opazovane in pričakovane heterozigotne vrednosti približno enake, kar ustreza dejstvu, da je listni ohrovt tujeprašna rastlina in ima majhen inbriding.
Prav tako so poročali o večji genetski raznolikosti znotraj genskega vira kot med njimi.
Raznolikost med genskimi viri lahko nakazuje na fiksacijo nekaterih alelov znotraj posameznega genskega vira. Sarikamis in sod. (2010) so uporabili samo en SSR marker imenovan O112FO2. Marker naj bi pomnoževal odsek DNA, pomemben za tvorbo metilsulfonilalkil glukozinolatov in naj bi bil uporaben pri selekciji s pomočjo markerjev (angl. marker assisted selection – MAS). Rezultati analize so pokazali, da je marker O112FO2 polimorfen in pričakovane dolžine 200–250 bp. Nekateri genski viri imajo le po
eno obliko markerja, nekateri obe obliki in te so določili kot heterozigotne za uporabljen marker. Omenili so možnost, da se lahko zaradi velike sorodnosti znotraj rodu Brassica ta marker uporablja tudi pri drugih vrstah. El-Esawi in sod. (2016) so uporabili 12 različnih SSR markerjev na različnih podvrstah Brassica oleracea. Dokazali so, da je znotraj genskih virov višja heterozigotnost kot med njimi. Z uporabo SSR markerjev so lahko razlikovali med posameznimi genskimi viri in podvrstami. Opazovana heterozigotnost je bila višja od pričakovane pri vseh genskih virih. Informacijska vrednost polimorfizma (angl.
polymorphic information content – PIC) ovrednoti informativnost markerja. Gre za izračunano vrednost, pri kateri z markerjem nedvoumno določimo genetsko identiteto posameznika, vključuje pa tako število alelov odkritih na posameznem lokusu kot tudi frekvence posameznih alelov (Štajner, 2010). V raziskavi so potrdili, da je 10 SSR markerjev primernih za razločevanje med akcesijami Brassica oleracea, saj je bil PIC > 0,5 (El-Esawi in sod., 2016). Sicer je bila tudi na KIS opravljena doktorska disertacija, kjer so z uporabo 45 SSR markerjev vrednotili genetsko raznolikost vseh pojavnih oblik vrste Brassica napus in njenih spolno kompatibilnih sorodnikov v Sloveniji (Pipan, 2013).
2.4.3 Novejše genetske analize
Naslednja generacija sekvenciranja (angl. next generation sequencing – NGS) ali druga generacija sekvenciranja so različne metode hkratnega (angl. massively parallel analysis) sekvenciranja več tisoč ali milijonov kratkih molekul DNA (Liu in sod., 2012). Metode temeljijo na sekvenciranju s sintezo (angl. sequencing by synthesis – SBS), kar pomeni, da zaznavamo posamezne dodane baze. Prevladujejo tri različne metode: pirosekvenciranje, sekvenciranje z ligazo in ciklična reverzibilna terminacija s fluorescenčno označenimi nukleotidi (Shendure in sod., 2017). Dolžina odčitkov je od 35 do 400 bp (Pareek in sod., 2011). Ko so zbrani vsi odčitki molekule DNA imamo dve možnosti, lahko jih poravnamo z že znano sekvenco ali pa s kratkimi prekrivajočimi odčitki sestavimo genom. Kljub visoki natančnosti prebranih oz. določljivih sekvenc, težko sestavimo daljše sekvence DNA v območjih, kjer se neka sekvenca ponavlja, saj zaradi kratke dolžine odčitkov ne poznamo točnega prekrivanja posameznih odčitkov in tako težko določimo točno dolžino sekvence.
Deli DNA z nizko ali visoko vsebnostjo nukleotiodv G in C se slabše pomnožujejo in tako imamo lahko zmotno predstavitev o dolžini ali prisotnosti takih sekvenc (Metzker, 2010).
Najnovejše je sekvenciranje tretje generacije. To je sekvenciranje DNA molekule brez predhodne PCR pomnožitve (Schadt in sod., 2010). Prevladujeta dva pristopa sekvenciranja:
tehnologija sekvenciranja eno-molekulske DNA v realnem času (angl. single-molecule real- time sequencing – SMRT) in sekvenciranje z nanoporami. Odčitki so daljši od 1000 bp, tako da je sestavljanje genoma lažje (Schadt in sod., 2010; Shendure in sod., 2017). Referenčni genom so z uporabo NGS najprej določili pri kitajskem zelju Brassica rapa (Wang in sod., 2011), kasneje pa še pri glavnatem zelju Brassica oleracea var. capitata (Liu in sod., 2014).
Genom Brassica oleracea je v primerjavi z genomom Brassica rapa večji, prav tako vsebuje
več protein kodirajočih genov (Sharma in sod., 2014). S pomočjo NGS metod in ustrezne analitike rezultatov so do sedaj uspeli odkriti veliko število mikrosatelitnih markerjev, ki bi bili primerni za razlikovanje med vrstami in podvrstami ter bi lahko pomagali pri selekciji z uporabo markerjev (Li in sod., 2010; Izzah in sod., 2014; Ding in sod., 2015; Taheri in sod., 2018).
3 MATERIALI IN METODE 3.1 RASTLINSKI MATERIAL
Zbirka rastlin listnega ohrovta uporabljena v magistrskem delu je obsegala 18 genskih virov listnega ohrovta (Brassica oleracea L.). Kmetijski inštitut Slovenije je 17 genskih virov pridobil iz dveh nacionalnih rastlinskih genskih bank jugovzhodne Evrope: iz genske banke Inštituta za jadranske kulture in melioracijo krasa, Split, Hrvaška (4 genski viri) in iz genske banke Inštituta za genske vire Univerze v Banja Luki, Banja Luka, Republika Srbska/Bosna in Hercegovina (13 genskih virov). Poleg tega smo v karakterizacijo dodatno vključili slovensko sorto listnega ohrovta 'Kodrolistni ohrovt' (Semenarna Ljubljana, Slovenija). Vsi obravnavani genski viri listnega ohrovta so predstavljeni v preglednici 1.
Preglednica 1: Genski viri listnega ohrovta vključeni v morfološko, biokemijsko in genetsko vrednotenje
Oznaka Vrsta Ime sorte/genskega vira Geografski izvor
KIS19_R1 Brassica oleracea L. var. sabellica Kodrolistni ohrovt (Semenarna
Ljubljana) Slovenija
KIS19_R4 Brassica oleracea L. var. acephala IJK-134 Hrvaška KIS19_R5 Brassica oleracea L. var. acephala IJK-135 Hrvaška KIS19_R6 Brassica oleracea L. var. acephala IJK-136 Hrvaška KIS19_R9 Brassica oleracea L. var. acephala IJK-Srijane Hrvaška
KIS19_R11 Brassica oleracea L. var. acephala GB00036 Bosna in Hercegovina KIS19_R14 Brassica oleracea L. var. acephala GB00039 Bosna in Hercegovina KIS19_R15 Brassica oleracea L. var. acephala GB00040 Bosna in Hercegovina KIS19_R16 Brassica oleracea L. var. acephala GB00041 Bosna in Hercegovina KIS19_R17 Brassica oleracea L. var. acephala GB00042 Bosna in Hercegovina KIS19_R18 Brassica oleracea L. var. acephala GB00043 Bosna in Hercegovina KIS19_R19 Brassica oleracea L. var. acephala GB01185 Bosna in Hercegovina KIS19_R20 Brassica oleracea L. var. acephala GB01186 Bosna in Hercegovina KIS19_R22 Brassica oleracea L. var. acephala GB01188 Bosna in Hercegovina KIS19_R23 Brassica oleracea L. var. acephala GB01189 Bosna in Hercegovina KIS19_R24 Brassica oleracea L. var. acephala GB01190 Bosna in Hercegovina KIS19_R25 Brassica oleracea L. var. acephala GB01191 Bosna in Hercegovina KIS19_R26 Brassica oleracea L. var. acephala GB01192 Bosna in Hercegovina
Vzgoja sadik in izvedba poljskega poskusa je potekala na poskusnem polju Infrastrukturnega centra Jablje na KIS. Po šest semen vsakega genskega vira listnega ohrovta smo posejali 8. marca 2019 v stiroporne gojitvene plošče napolnjene s šoto. Sadike smo vzgojili v ogrevanem rastlinjaku in jih 8. maja 2019 ročno presadili na poskusno polje. Priprava tal je bila opravljena v skladu s postopki uveljavljene kmetijske prakse, tik pred presajanjem pa sta bila čez tla položena črna polietilenska (PE) folija in namakalni sistem. Poljski poskus je bil izveden s štirimi individualnimi rastlinami za posamezen genski vir na razdalji 50 × 50 cm med posameznimi rastlinami.
Tekom rasti rastlin smo v ustreznih razvojnih fazah ocenjevali posamezne morfološke lastnosti in povzorčili liste za nadaljnje biokemijske ter genetske analize. Vzorce listov vsakega genskega vira v treh bioloških ponovitvah (vzorčenje treh individualnih rastlin znotraj posameznega genskega vira) smo zamrznili s tekočim dušikom, jih liofilizirali (Christ Gamma 1-20) in homogenizirali z laboratorijskim krogličnim mlinom (Retch MM400; 30 Hz/2 min). Tako pripravljen liofilizirani material smo shranili do izvedbe nadaljnjih analiz.
3.2 MORFOLOŠKI PARAMETRI
Za opis morfoloških parametrov, ki smo jih vrednotili v okviru magistrske naloge, smo uporabili deskriptorje iz zbirke IBPGR (1990). V prvem letu rasti, rastna sezona 2019, smo ocenili deskriptorje povezane z vegetativno fazo rasti, v drugem letu rasti, rastna sezona 2020, pa deskriptorje povezane z generativno fazo rasti (opis cvetenja, luskov in semen).
Rezultati 18 numeričnih in 18 opisnih morfoloških parametrov so podani kot skupna povprečna vrednost vseh rastlin genskih virov ali kot povprečna vrednost vseh 4 rastlin posameznega genskega vira.
Ovrednotili smo naslednje numerične morfološke parametre:
- Višina rastline (angl. plant height), - Premer rastline (angl. plant diameter),
- Razmerje višina/premer rastline (angl. plant height/diameter ratio), - Dolžina lista (angl. leaf length),
- Širina listne ploskve (angl. leaf blade width),
- Razmerje širina listne ploskve/dolžina lista (angl. leaf blade width/leaf length ratio), - Dolžina listnega peclja (angl. petiole length),
- Širina listnega peclja (angl. petiole width),
- Razmerje dolžina/širina listnega peclja (angl. petiole length/width ratio), - Število dni do cvetenja (angl. mean days to flowering),
- Dolžina cvetnega stebla (angl. flower stalk length), - Število dni do zrelosti luskov (angl. days to maturity), - Dolžina luska (angl. silique length),
- Širina luska (angl. silique width),
- Dolžina peclja luska (angl. beak length),
- Razmerje dolžina/širina luska (angl. silique length/width ratio), - Masa 1000-semen (angl. 1000-seed weight) in
- Število semen v lusku (angl. number of seeds per silique).
Ocenili smo naslednje opisne morfološke parametre:
- Vegetacijska sezona rastline v običajnih pogojih pridelave (angl. flowering behaviour under normal cropping conditions),
- Barva cvetnega stebla (angl. flower stalk colour), - Poprh na cvetnem steblu (angl. flower stalk bloom), - Dolžina cvetnega stebla (angl. flower stalk length),
- Dolžina internodija na cvetnem steblu (angl. flower stalk internode length), - Razvejanost cvetnega stebla (angl. flower stalk branching habit),
- Togost cvetnega stebla (angl. flowering plant, stalk stiffness), - Dlakavost cvetnega stebla (angl. flowering plant hairiness),
- Izenačenost barve cvetov (angl. flower colour variability in the crop), - Barva cvetov (angl. petal colour),
- Cvetni vonj (angl. flower scent),
- Barva luskov pred zorenjem (angl. silique colour before drying), - Položaj luskov na rastlini (angl. silique attitude),
- Zunanja površina luskov (angl. silique surface outline), - Dlakavost luskov (angl. silique hairines),
- Pokanje/odpiranje luskov (angl. silique shattering),
- Primarna barva semena (angl. primary seed coat colour - after drying), - Število semen v lusku (angl. number of seeds per silique).
3.2.1 Vrednotenje rastlin listnega ohrovta z numeričnimi morfološkimi parametri Numerične morfološke parametre smo ocenjevali po IBPGR (1990) deskriptorjih. V prvem letu, faza vegetativne rasti rastlin, smo v jesenskem času (4. oktobra 2019) pred prvimi slanami z navadnim metrom natančnosti 0,1 mm izmerili parametre: višina in premer rastlin (Slika 6), dolžina lista in širina listne ploskve (Slika 7), ter dolžino in širino listnega peclja (Slika 7). Iz pridobljenih podatkov smo izračunali parametre: razmerje višina/premer rastline, razmerje širina listne ploskve/dolžina lista, in razmerje dolžina/širina listnega peclja.
Slika 6: Meritve višine in širine rastline listnega ohrovta (prirejeno po IBPGR, 1990)
Slika 7: Meritve na listu listnega ohrovta (prirejeno po IBPGR, 1990)
V drugem letu, faza generativne rasti, smo najprej določili datum cvetenja in izračunali število dni potrebnih od setve do cvetenja. V času cvetenja smo izmerili parameter dolžina cvetnega stebla. Ko so rastline odcvetele in tvorile luske, znotraj katerih so se razvila semena, smo izvedli vrednotenje in meritve parametrov:
- Določitev števila dni od setve do zrelosti luskov, kar smo izračunali s pomočjo datumov;
- S kljunastim merilom smo izmerili dolžino in širino luska ter dolžino peclja (Slika 8).
Meritve smo izvajali na 10 luskih posameznega genskega vira in iz izmerjenih podatkov izračunali parameter razmerje dolžina/širina luska.
Slika 8: Meritve na lusku listnega ohrovta (prirejeno po IBPGR, 1990)
Vsakega od 10 luskov, na katerih smo izvedli meritve, smo nato ročno odprli in iz njega pobrali semena. Prešteli smo semena v posameznem lusku in zapisali število semen na lusk.
Vse luske na rastlinah posameznega genskega vira smo nato ročno zdrobili, prepihali, očistili in zbrali vsa semena za namene merjenja parametra masa 1000-semen. S pomočjo naprave za avtomatsko štetje semen (angl. condator electronic seed counter) smo v štirih ponovitvah prešteli tisoč semen posameznega genskega vira in s tehtnico natančnosti 0,01 g določili maso 1000-semen.
3.2.2 Vrednotenje rastlin listnega ohrovta z opisnimi morfološkimi parametri
Opisne morfološke parametre smo ocenjevali po IBPGR deskriptorjih, ki so razdeljeni v različne razrede in označeni s številko ali pa s kombinacijo barv. Nekateri genski viri so pri opisu določenih opisnih morfoloških parametrov spadali v več različnih razredov znotraj enega deskriptorja, zato smo za takšne genske vire opredelili dodatne razrede, tako da smo
združili posamezne razrede znotraj opisnega morfološkega parametra. Vrednotenje opisnih morfoloških parametrov pri preučevanih 18 genskih virih listnega ohrovta je potekalo v fazi generativne rasti v spomladanskem času v letu 2020. Skupno smo obravnavali 18 opisnih morfoloških parametrov pri vsakem genskem viru.
V času cvetenja in zorenja luskov (april 2020) smo določali naslednje opisne morfološke parametre:
Vegetacijska sezona rastline v običajnih pogojih pridelave, je obsegala tri razrede:
1 enoletna;
2 dvoletna; in 3 trajna.
Barva cvetnega stebla, je obsegala 7 razredov:
1 bela;
2 rumeno zelena;
3 zelena;
4 rdeče zelena;
5 rdeča;
6 vijolična; in 7 ostale barve.
Poprh na cvetnem steblu, je obsegal 4 razrede:
0 brez poprha;
3 malo poprha;
5 srednji poprh; in 7 veliko poprha.
Dolžina cvetnega stebla (vizualna ocena), je obsegala 3 razrede:
3 kratek;
5 srednje dolg; in 7 dolg.
Dolžina internodija na cvetnem steblu, je obsegala 3 razrede:
3 kratek;
5 srednje dolg; in 7 dolg.
Razvejanost cvetnega stebla, je obsegala 3 razrede:
3 majhna;
5 srednja; in 7 obilna.
Togost cvetnega stebla, je obsegala 3 razrede:
3 nizka/obrnjeno navzdol;
5 srednje upognjeno; in 7 togo/pokončeno.
Dlakavost cvetnega stebla, je obsegala 4 razrede:
0 brez dlak;
3 malo;
5 srednje; in 7 močno.
Izenačenost barve cvetov, je obsegala 3 razrede:
3 uniformna;
5 srednja; in 7 večbarvna.
Barva cvetov, je obsegala 8 razredov:
1 bela;
2 svetlo rumena;
3 rumena;
4 oranžno rumena;
5 roza;
6 rdeča;
7 vijolična; in 8 ostale barve.
Cvetni vonj, je obsegal 4 razrede:
0 brez vonja;
3 nežen;
5 srednje močan; in 7 močan.
Barva luskov pred polno zrelostjo, je obsegala 6 razredov:
1 rumeno zelena;
2 zelena;
3 rdeče zelena;
4 vijolično zelena;
5 vijolična; in 6 ostale barve.
Rastline so v juniju 2020 dosegle polno zrelost, to je čas, ko so bili vsi luski zreli, seme pa polno razvito in trdo. Počakali smo, da so rastline prešle v fenofazo staranja, in pobrali luske, znotraj katerih je bilo seme. Na zrelih luskih in semenih smo določili naslednje opisne morfološke parametre:
Položaj luskov na rastlini, je obsegal 3 razrede (Slika 9):
1 pokončen;
2 viseč; in
3 obrnjen navzdol.
Slika 9: Položaj luskov na rastlini listnega ohrovta (prirejeno po IBPGR, 1990)
Zunanja površina luskov, je obsegala 3 razrede (Slika 10):
3 gladek;
5 valovit; in
7 balonasto napihnjen.
Slika 10: Zunanja površina luskov listnega ohrovta (prirejeno po IBPGR, 1990)
