MAGISTRSKO DELO

U

L

F

MAGISTRSKO DELO

Mojca Bavčar

Ljubljana, 2021

U

L

F

MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM 2. STOPNJE KEMIJA

Vpliv temperature na ločbo bioloških makromolekul

MAGISTRSKO DELO

Mojca Bavčar

M

: prof. dr. Matevž Pompe

Ljubljana, 2021

IZJAVA O AVTORSTVU

magistrskega dela

Spodaj podpisana Mojca Bavčar sem avtorica magistrskega dela z naslovom: Vpliv temperature na ločbo bioloških makromolekul.

S svojim podpisom zagotavljam, da:

• je magistrsko delo rezultat mojega raziskovalnega dela pod mentorstvom prof.

dr. Matevža Pompeta;

• sem poskrbela, da so dela in mnenja drugih avtorjev, ki jih uporabljam v predloženem magistrskem delu, navedena oziroma citirana v skladu z navodili;

• se zavedam, da je plagiatorstvo, v katerem so tuje misli oziroma ideje

predstavljene kot moje lastne, kaznivo po zakonu (Zakon o avtorski in sorodnih pravicah – uradno prečiščeno besedilo (ZASP-UPB3) (Ur. list RS, št. 16/2007);

• sem poskrbela za slovnično in oblikovno korektnost magistrskega dela;

• je elektronska oblika magistrskega dela identična tiskani obliki magistrskega dela.

V Ljubljani, 6. 7. 2021 Podpis avtorice:

Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa 2. stopnje Kemija. Delo je bilo opravljeno na Fakulteti za kemijo in kemijsko tehnologijo UL.

Senat UL FKKT je za mentorja imenoval prof. dr. Matevža Pompeta.

Recenzenti: prof. dr. Aleš Podgornik, prof. dr. Franc Požgan

Komisija za oceno in zagovor magistrskega dela Predsednik komisije: prof. dr. Franc Požgan

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Član: prof. dr. Aleš Podgornik

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Član: prof. dr. Matevž Pompe

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Zahvala

Zahvaljujem se mentorju prof. dr. Matevžu Pompetu in delovni mentorici Anji Kristl za vso pomoč, ki sta mi jo nudila pri delu in pisanju, ter prof. dr. Alešu Podgorniku in prof.

dr. Francu Požganu za pregled mojega magistrskega dela. Zahvaljujem se tudi vsem, ki so me podpirali tekom študija.

Vpliv temperature na ločbo bioloških makromolekul

Povzetek: Reverznofazna kromatografija poleg analize proteinov omogoča tudi vpogled v mehanizem interakcije proteina s hidrofobno površino in ali ta vključuje procese, kot je sprememba njegove konformacije. Za štiri proteine (insulin, citokrom c, lizocim in BSA) sem preučila vpliv temperature na retencijsko obnašanje na reverznofazni koloni C18.

Analiza insulina v šestih kombinacijah organske (ACN, MeOH, EtOH) in vodne faze (0.1

% TFA, 0.1 M KCl) je pokazala, da ima izbira organske komponente mobilne faze največji vpliv na temperaturno odvisnost retencijskega časa. Primerjala sem retencijsko obnašanje insulina in citokroma c v dveh mobilnih fazah, 0.1 % TFA-ACN (70:30) in 0.1

% TFA-MeOH (44:56), pri konstantnem pretoku in tlaku. Van't Hoffovi grafi in iz njih izračunane termodinamske količine kažejo, da se v molekuli insulina v TFA-ACN pri ~ 53 °C začnejo večje konformacijske spremembe, medtem ko do teh v TFA-MeOH prihaja že pri nižjih temperaturah. Podobno so večje konformacijske spremembe citokroma c v TFA-ACN prisotne pri nižjih temperaturah, v TFA-MeOH pa do teh ne prihaja. Lizocim in BSA sem analizirala z gradientno metodo 0.1 % TFA-ACN. Trendi retencijskih časov kažejo, da tudi v teh dveh proteinih prihaja do konformacijskih sprememb.

Ključne besede: kromatografija proteinov, nelinearni van't Hoffov graf, insulin, citokrom, lizocim, BSA

Influence of temperature on separation of biological macromolecules

Abstract: In addition to protein analysis, reversed-phase chromatography also provides insight into mechanism of interaction between protein and hydrophobic surface and whether it includes processes such as change of protein conformation. I studied influence of temperature on retention behaviour of four proteins (insulin, cytochrome c, lysozyme and BSA) on reversed-phase C18 column. Analysis of insulin in six combinations of organic (ACN, MeOH, EtOH) and aqueous phases (0.1 % TFA, 0.1 M KCl) indicates that choice of organic component of mobile phase has greatest influence on temperature dependence of retention time. I compared retention behaviour of insulin and cytochrome c in two mobile phases, 0.1 % TFA-ACN (70:30) and 0.1 % TFA-MeOH (44:56) at constant flow and pressure. Van't Hoff plots and thermodynamic quantities calculated from them indicate that significant conformational changes in insulin molecule in TFA- ACN begin at ~ 53 °C, while these are already present at lower temperatures in TFA- MeOH. Similarly, significant conformational changes of cytochrome c in TFA-ACN are present at lower temperatures, but do not occur in TFA-MeOH. Lysozyme and BSA were analysed with gradient method 0.1 % TFA-ACN. Trends in retention times indicate that conformational changes occur in these two proteins as well.

Keywords: protein chromatography, non-linear van't Hoff plot, insulin, cytochrome, lysozyme, BSA

Kazalo

1 Uvod ... 1

1.1 Izbrani proteini ... 1

1.1.1 Insulin ... 2

1.1.2 Citokrom c ... 3

1.1.3 Lizocim ... 4

1.1.4 BSA ... 4

1.2 Kromatografija makromolekul ... 5

1.2.1 Reverznofazna kromatografija ... 6

1.2.2 Kromatografski parametri ... 8

1.3 Osnovne termodinamske zveze ... 10

1.4 Temperaturna odvisnost logaritma retencijskega faktorja... 12

1.4.1 Izpeljava van't Hoffove enačbe ... 12

1.4.2 Določanje termodinamskih količin iz nelinearnih van't Hoffovih grafov .. 14

1.5 Tlačna odvisnost logaritma retencijskega faktorja ... 16

2 Namen dela ... 17

3 Eksperimentalni del ... 19

4 Rezultati in razprava ... 23

4.1 Eksperimenti z insulinom v različnih mobilnih fazah ... 23

4.2 Korekcija tlaka zaradi spremembe viskoznosti mobilne faze ... 24

4.3 Vpliv temperature ... 28

4.3.1 Insulin ... 28

4.3.2 Citokrom ... 34

4.3.3 Lizocim in BSA ... 40

5 Zaključek ... 43

6 Literatura ... 47

Seznam uporabljenih kratic in simbolov

ACN Acetonitril

ACP Povprečni tlak v koloni (ang. average column pressure)

β Fazno razmerje

BSA Goveji serumski albumin (ang. bovine serum albumin) cS Molarna koncentracija analita v stacionarni fazi

cM Molarna koncentracija analita v mobilni fazi dc Notranji premer kolone

ΔC Sprememba toplotne kapacitete ΔG Sprememba Gibbsove proste energije

ΔH Sprememba entalpije

ΔS Sprememba entropije

ΔVm Sprememba molarnega volumna analita EEC Entropijsko-entalpijska kompenzacija

EDTA Etilendiamintetraocetna kislina (ang. ethylenediaminetetraacetic acid)

EtOH Etanol

F Pretok

ϕ Fazno razmerje

K Porazdelitvena konstanta

k Retencijski faktor

lc Dolžina kolone

MeOH Metanol

nS Množina analita v stacionarni fazi nM Množina analita v mobilni fazi

pi Vhodni tlak

po Izhodni tlak

R Splošna plinska konstanta

RPC Reverznofazna kromatografija (ang. reversed-phase chromatography)

T Temperatura

TFA Trifluoroocetna kislina (ang. trifluoroacetic acid)

tM Mrtvi čas

tR Retencijski čas

Tris Tris(hidroksimetil)aminometan

tS Čas, ki ga analit preživi v stacoinarni fazi Va Molski volumen analita v stacionarni fazi Vb Molski volumen analita v mobilni fazi VC Notranji volumen kolone

VM Volumen mobilne faze

VS Volumen stacionarne faze

1

1 Uvod

Biotehnološki produkti imajo raznoliko uporabo. Uporabljajo se lahko kot biokatalizatorji v kemijski industriji, kot orodja v trajnostni oskrbi z energijo in v bioremediaciji, predvsem pa so pomembni na področju farmacevtske industrije [1]. Raba derivatov bioloških makromolekul, npr. ogljikovih hidratov, nukleinskih kislin, oligonukleotidov in proteinov kot farmacevtskih učinkovin se povečuje [2]. Te spojine je pred uporabo potrebno očistiti. Zahtevana končna stopnja čistoče za biofarmacevtike je lahko > 99 %, medtem ko je za nekatere biokatalizatorje < 80 %. Proces izolacije in čiščenja biomolekul je pogosto najdražji in najzahtevnejši korak v proizvodnji teh spojin. Glavno orodje, ki se pri tem uporablja, pa je kromatografija [1].

Za razliko od spojin, ki se običajno ločujejo s kromatografijo, imajo biološke makromolekule pogosto ionsko naravo, hidrofobne in hidrofilne značilnosti ter višjo molekulsko maso [2]. Interakcije biomolekul s stacionarno fazo lahko povzročijo trajne konformacijske spremembe teh makromolekul in s tem spremembo njihove biološke aktivnosti [2, 3]. Vse te dejavnike je potrebno upoštevati pri procesu ločbe [2]. Zato je boljše razumevanje mehanizmov, ki vplivajo na retencijo proteinov v kromatografiji, velikega pomena za optimizacijo in kontrolo številnih industrijskih procesov, ki vključujejo preparativne kromatografske ločbe [3].

1.1 Izbrani proteini

Za preučevanje retencijskega obnašanja sem izbrala štiri proteine različnih velikosti:

insulin, citokrom c, lizocim in BSA. V tabeli 1 so navedene njihove izoelektrične točke, molekulske mase in število aminokislin, ki jih sestavljajo.

2 Tabela 1: Velikost in izoelektrična točka izbranih proteinov.

Velikost pI

Insulin 51 aminokislin [4, 5]

~ 6000 Da [4]

5.30–5.35 [4]

Citokrom c 104 aminokisline [6]

12 384 Da [7]

10.0–10.5 [7]

Lizocim 129 aminokislin

14 307 Da [8]

11.35 [8]

BSA 583 aminokislin

66 430 Da [9]

4.7–4.9 [9]

1.1.1 Insulin

Insulin je polipeptid, ki ga izločajo Langerhansovi otočki trebušne slinavke in ima ključno vlogo pri uravnavanju metabolnih procesov v številnih tkivih [5]. Je hormon, odgovoren za celični vnos, uporabo in shrambo glukoze, aminokislin in maščobnih kislin, medtem ko preprečuje razgradnjo glikogena, proteinov in maščobe [4].

Molekula človeškega insulina (slika 1) je sestavljena iz 51 aminokislinskih preostankov [4, 5] in dveh peptidnih verig (A in B). Verigo A sestavlja 21 aminokislinskih preostankov, verigo B pa 30. Veriga A je ugnezdena v krake bolj raztegnjene verige B [5]. Verigi povezujeta dve disulfidni vezi, še ena disulfidna povezava pa povezuje A6 in A11 znotraj verige A [5, 10, 11]. Med aminokislinami obeh verig so prisotne tudi številne nekovalentne interakcije [10]. Zaradi razporeditve verig cisteinska preostanka in alifatske stranske verige sestavljajo nepolarno jedro, površina pa je prekrita s polarnimi in nepolarnimi preostanki [11].

3

Slika 1: Molekula insulina (PDB: 3E7Y [12]). Veriga A je označena z rdečo, veriga B pa z modro barvo.

1.1.2 Citokrom c

Citokrom c je protein, ki posreduje pri prenosu elektronov med citokrom reduktazo in citokrom oksidazo v oksidativni fosforilaciji [6, 7, 13]. Ohlapno je vezan na zunanjo površino notranje mitohondrijske membrane [13].

Konjski citokrom c (slika 2) je majhen globularen protein [6, 13], sestavljen iz 104 aminokislinskih preostankov [6] v eni sami polipeptidni verigi [6, 7, 13] s slabo urejeno sekundarno strukturo. Sestavljajo jo trije glavni in dva manjša helična elementa [6].

V hidrofobnem žepu znotraj proteina je preko dveh tioetrskih povezav kovalentno vezana protoporfirinska IX hem prostetična skupina [6, 7, 13], ki vsebuje železov ion.

Sprememba med stanjem Fe(II) in Fe(III) citokromu c omogoča prenos elektronov [7].

Slika 2: Molekula citokroma c s hem skupino (PDB: 1HRC [6]).

4

1.1.3 Lizocim

Lizocim je encim, ki igra pomembno vlogo pri preprečevanju bakterijskih okužb [14], saj napade peptidoglikan, specifično komponento nekaterih bakterijskih celičnih sten [8, 14].

Kokošji lizocim (slika 3) je majhen globularen monomerni protein, sestavljen iz 129 aminokislinskih preostankov [8, 14, 15]. Sestavljata ga dve domeni, aktivno mesto encima pa se nahaja v razpoki med njima [14, 16]. Preostanki 1–35 in 85–129 tvorijo domeno α [16], ki vključuje pet vijačnic [15, 16]. Domena β pa vključuje preostanke 36–

85 [16] in vsebuje β-ploskev, kratko vijačnico in dolgo zanko [15, 16]. Domeni med seboj povezuje kratka β-ploskev [15, 16] in eden izmed štirih disulfidnih mostičkov [15]. Kisli in bazični preostanki ter preostali polarni preostanki (z dvema izjemama) so razporejeni po površini molekule, velika večina hidrofobnih stranskih verig pa je v notranjosti molekule [17].

Slika 3: Molekula lizocima (PDB: 3LYZ [18]). Domena α je označena z rdečo, domena β pa z modro barvo.

1.1.4 BSA

Serumski albumin je najpogostejši protein v krvni plazmi sesalcev [19]. Je transportni protein [19, 20], ki prenaša metabolite, hormone in farmacevtske učinkovine, ima pa tudi mesta za vezavo kovinskih kationov. Ligande lahko veže na okoli 21 vezavnih mest [19].

Goveji serumski albumin (bovine serum albumin, BSA) (slika 4) je protein srčaste oblike [19], ki obsega eno polipeptidno verigo 583 aminokislinskih preostankov [9, 20, 21].

Sestavljajo ga tri strukturno podobne domene (I, II in III) [19, 20, 21], vsako domeno pa

5

sestavljata dve poddomeni (A in B). Poddomena A vsebuje šest vijačnic, poddomena B pa štiri. V prostoru med domenami in poddomenami so žepi za različne ligande. Molekule albumina so zelo fleksibilne [19], interna struktura poddomen pa je rigidna zaradi 17 disulfidnih mostičkov [19, 20, 21]. Ti omogočajo precejšnje spremembe oblike in velikosti BSA zaradi sprememb pH in drugih vplivov [21].

Slika 4: Molekula BSA (PDB: 3V03 [22]). Domena I je označena z rdečo barvo, domena II z modro, domena III pa z zeleno.

1.2 Kromatografija makromolekul

Med najširše uporabljenimi načini ločbe je kromatografija [1, 2], saj je metoda z visoko resolucijo, ki jo lahko uporabimo tudi za večje količine vzorcev [1]. Obsega raznovrstno skupino tehnik, ki omogočajo ločbo komponent v kompleksnih mešanicah [1, 23] na osnovi majhnih razlik v njihovih fizikalnih in kemijskih lastnostih, kot so velikost, gostota naboja, hidrofobnost, hidrofilnost ali njihove kombinacije [1].

Pri vseh kromatografskih ločbah vzorec raztopimo v mobilni fazi, ki jo nato potisnemo čez stacionarno fazo, ki je fiksirana v koloni ali na trdni površini. Ti dve fazi sta izbrani tako, da se komponente vzorca porazdelijo med mobilno in stacionarno fazo v različni meri. Tiste komponente, ki se močno zadržujejo v stacionarni fazi, se počasi premikajo s tokom mobilne faze. Komponente, ki se šibko zadržujejo v stacionarni fazi, pa se premikajo hitreje [23, 24]. Zaradi te razlike v hitrosti migracije se komponente vzorca

6

ločijo v trakove oz. cone [23]. Graf, ki prikazuje odziv detektorja na koncu kolone v odvisnosti od časa ali volumna mobilne faze, imenujemo kromatogram [23, 24] in je uporaben za kvalitativno in kvantitativno analizo. Položaj vrhov na časovni osi lahko uporabimo za identifikacijo komponent, površine pod vrhovi pa kot kvantitativno mero za količino vsake komponente [23].

Običajno kromatografske metode delimo glede na vrste mobilne in stacionarne faze ter glede na vrsto interakcije, ki je vključena v porazdeljevanje komponent med fazama [23].

V odvisnosti od vrste analita, stacionarne in mobilne faze je retencija lahko posledica več vrst interakcij [24]. Ker se proteini zvijajo, lahko med kromatografsko ločbo pride do konformacijskih sprememb proteina, kar privede do drugačnega retencijskega mehanizma [25].

Kompleksnih mešanic običajno ne moremo ločiti z izokratsko elucijo (sestava mobilne faze se med ločbo ne spreminja), ker se ena komponenta mešanice pogosto sploh ne zadržuje na koloni, druga pa se veže zelo močno. Zato namesto tega uporabimo gradientno elucijo, pri kateri v korakih ali kontinuirno spreminjamo sestavo mobilne faze na vedno večjo elucijsko moč [1].

1.2.1 Reverznofazna kromatografija

Reverznofazna kromatografija (reversed-phase chromatography, RPC) je pomembna in pogosto uporabljena tehnika pri analizi in čiščenju proteinov [2, 24, 26]. V primerjavi z ionsko-izmenjevalno kromatografijo in kromatografijo hidrofobnih interakcij ima večjo resolucijo. Uporabo RPC za čiščenje proteinov omejujejo denaturacijski pogoji in drugi problemi, povezani z uporabo organskih topil, zato jo običajno uporabljamo le za proteine z manjšimi molekulskimi masami (< 25 000 Da), ki jih po ločbi lahko povrnemo v nativno konformacijo. Ionsko-izmenjevalna kromatografija ali kromatografija hidrofobnih interakcij imata večje izkoristke biološko aktivnega materiala in sta zato primernejši za vzorce z večjimi molekulskimi masami. Za ločbo makromolekul se uporabljata tudi velikostno izključitvena in afinitetna kromatografija [2].

Za RPC je značilno, da je stacionarna faza manj polarna od mobilne faze. Večina stacionarnih faz za RPC temelji na površinsko modificirani siliki: na silanolne skupine

7

zrnca silike so vezani n-alkilni silani [24]. Za ločbo proteinov se najpogosteje uporabljajo ligandi C4, C8 in C18, lahko pa tudi fenilne, cianopropilne, aminopropilne in CN skupine [2, 24, 26].

Do asociacije analita s stacionarno fazo lahko pride s porazdeljevanjem ali z adsorpcijo [24]. Za majhne molekule običajno predpostavljamo porazdelitveni mehanizem [25]. Pri RPC proteinov pa je prevladujoči mehanizem retencije adsorpcija [24, 25, 27], ker so proteini precej večji od ligandov in zato ne morejo biti potopljeni vanje [27]. Do adsorpcije pride zaradi hidrofobnih interakcij med analitom in stacionarno fazo [24, 25].

Nepolarna molekula analita z odstranjevanjem iz raztopine ali z asociacijo z drugimi nepolarnimi molekulami zmanjša svojo vodi izpostavljeno površino, kar imenujemo hidrofobni efekt [28]. Pri adsorpciji makromolekul iz raztopine te nadomestijo molekule topila, ki so bile prvotno adsorbirane na stacionarno fazo [3, 27, 29]. V tem procesu se sprosti tudi del molekul topila, ki tvori solvatacijski sloj okoli molekule proteina. Ta se zato lahko poruši [3, 29]. Proteini imajo številna mesta, preko katerih se lahko povežejo z adsorbirajočo površino. Zaradi tega lahko proces adsorpcije spremljajo številni drugi pojavi, kot je npr. molekularna agregacija [3].

Na retencijo vplivamo z močjo elucije mobilne faze, ki je pri RPC sestavljena iz vodne raztopine ali pufra in organskega topila, ki se meša z vodo [2, 24]. Retencija se zmanjšuje s povečanjem deleža organskega topila [24, 25]. Delež organskega topila malo vpliva na retencijo majhnih molekul [24], medtem ko ima sprememba deleža le nekaj odstotkov lahko velik vpliv pri večjih molekulah, kot so proteini [24, 26].

Pogosto rabljena organska topila po naraščajoči moči elucije so metanol, acetonitril, etanol, aceton, dioksan, izopropanol in tetrahidrofuran [2, 24]. V ločbi proteinov je največkrat v rabi acetonitril, ker ima nizko viskoznost in je zato bolj učinkovit [2, 24, 26].

Alkoholi, kot so metanol, etanol in izopropanol, se redkeje uporabljajo, ker njihova večja viskoznost povzroča višji tlak, imajo pa velik vpliv na selektivnost [2, 26] in so cenejši [26].

Mešanici acetonitrila ali metanola z vodo imata različno ureditev molekul [30]. Kemijo mešanic vode in metanola določa predvsem tvorba vodikovih vezi [30]. Acetonitril slabo tvori vodikove vezi in v nižjih koncentracijah tvori agregate ali slabo definirane skupke

8

[30, 31]. Zaradi teh razlik so molekule proteina in imobilizirani ligandi različno solvatirani, kar povzroča različno obnašanje proteinov [32].

Število in razporeditev nabojev proteina in s tem njegova polarnost se spreminja s pH, kar ima velik vpliv na retencijo in selektivnost. Pri kislih pH imajo kisli proteini manj naboja in zato večjo retencijo v RPC, podobno velja za bazične proteine v bazičnem [26].

Ker ima pH tako pomembno vlogo pri ločbi, se mobilni fazi pogosto dodaja pufre ali druge aditive. Pufer ima več vlog: ohranja izbrano pH vrednost, blokira preostale silanolne skupine (kationi pufra sodelujejo v ionsko-izmenjevalnih interakcijah z deprotoniranimi silanolnimi skupinami) in tvorijo ionske pare z analitom [24].

Najpogosteje rabljen aditiv k mobilni fazi je trifluoroocetna kislina (trifluoroacetic acid, TFA) [2, 26]. Ta zniža pH, zaradi česar so protonirani preostali površinski silanoli stacionarne faze [2, 24] in karboksilne skupine proteina, ter tvori ionske pare z amino skupinami. Tako protein nima več prostih nabojev in je zato skoraj nevtralen in bolj hidrofoben [24, 26], kar poveča njegovo retencijo [25].

1.2.2 Kromatografski parametri

Porazdelitveno ravnotežje med mobilno in stacionarno fazo za zvrst A lahko zapišemo:

𝐴_{𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑛𝑎} ↔ 𝐴𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟𝑛𝑎 (1)

Porazdelitveno konstanto K za porazdelitev analita A med tema dvema fazama lahko izrazimo [23, 33]:

𝐾 = 𝑐_𝑆

𝑐_𝑀 = 𝑛_𝑆⁄𝑉_𝑆 𝑛_𝑀⁄𝑉_𝑀 = 𝑛_𝑆

𝑛_𝑀 𝑉_𝑀

𝑉_𝑆 (2)

V enačbi (2) sta cS in cM molarni koncentraciji analita A v stacionarni in mobilni fazi, nS

in nM množini analita A v stacionarni in mobilni fazi ter VS in VM volumna stacionarne in mobilne faze [23, 33]. Porazdelitveno konstanto je težko izmeriti, zato jo določamo preko retencijskega faktorja, ki je lahko merljiv parameter [23, 33].

Retencijski faktor k je razmerje med časom, ki ga analit preživi v stacionarni fazi tS, in časom, ki ga preživi v mobilni fazi tM [23, 33]:

9

𝑘 = 𝑡_𝑆

𝑡_𝑀 = 𝑡_𝑅− 𝑡_𝑀

𝑡_𝑀 (3)

Mrtvi čas tM je čas, ki ga potrebujejo zvrsti, ki se ne zadržujejo na koloni, da dosežejo detektor. Retencijski čas tR pa je čas, ki ga potrebujejo analiti, da pridejo do detektorja.

Ta je daljši od tM, ker se analit nekaj časa tS zadržuje v stacionarni fazi [23].

Če je porazdelitvena konstanta neodvisna od koncentracije komponent vzorca, potem je retencijski faktor enak tudi razmerju med količino analita v stacionarni in mobilni fazi [33]:

𝑘 = 𝑛_𝑆

𝑛_𝑀 (4)

Za razliko od porazdelitvene konstante lahko retencijski faktor enostavno določimo (retencijski in mrtvi čas lahko preberemo iz kromatograma) [23, 33].

Razmerje med volumnom mobilne in stacionarne faze imenujemo fazno razmerje β oz. ϕ [33]:

𝛽 =𝑉_𝑀

𝑉_𝑆 (5)

𝜙 = 1 𝛽 = 𝑉_𝑆

𝑉_𝑀 (6)

Volumen mobilne faze lahko določimo na več načinov, npr. z merjenjem retencijskega časa nezadrževanega analita [23, 32]:

𝑉_𝑀 = 𝐹𝑡_𝑀 (7)

V enačbi (7) je F pretok. Volumen stacionarne faze lahko izračunamo kot del notranjega volumna kolone VC, ki ga ne zaseda mobilna faza [34]:

𝑉_𝑆 = 𝑉_𝐶− 𝑉_𝑀 (8)

Notranji volumen kolone lahko izračunamo iz podatkov za kolono, ki jih navaja proizvajalec:

10

𝑉_𝐶 = 0.25𝜋𝑑_𝑐²𝑙_𝐶 (9)

V enačbi (9) je dc je notranji premer kolone, lc pa njena dolžina. To je groba ocena, saj tako dobimo podobne (ali celo enake) vrednosti VS za stacionarne faze z različnimi gostotami vezave alkilnih verig ali za različne dolžine verig [34].

Če v enačbo (2) vstavimo enačbi (4) in (5) oz. (6) lahko porazdelitveno konstanto izrazimo z retencijskim faktorjem [23, 33]:

𝐾 = 𝑘𝛽 = 𝑘

𝜙 (10)

1.3 Osnovne termodinamske zveze

Entalpija prenosa analita v kromatografski ločbi ΔH je sprememba entalpije, do katere pride, ko se analit premakne iz mobilne v stacionarno fazo. Ker so tlaki in volumni pri kromatografski ločbi približno konstantni, velja, da je sprememba entalpije enaka toploti, sproščeni v procesu. Zato je entalpija merilo za razliko med veznimi interakcijami analita z mobilno fazo in njegovimi interakcijami s stacionarno fazo. Če v kromatografski ločbi pride do retencije, to pomeni, da ima analit nekaj afinitete do stacionarne faze. To kaže, da je v splošnem entalpija prenosa analita iz mobilne v stacionarno fazo ugodna [33].

Entropija prenosa analita v kromatografski ločbi ΔS je sprememba entropije, do katere pride, ko se analit prenese iz mobilne v stacionarno fazo. Entropija je merilo za spremembo urejenosti, mobilnosti oz. zmožnosti difuzije analita, bolj formalno pa predstavlja spremembo v številu sistemu dostopnih stanj. V splošnem se mobilnost analita zmanjša, ko preide iz mobilne v stacionarno fazo, zaradi česar je entropija prenosa neugodna [33].

Zgornji opisi entalpije in entropije prenosa analita med mobilno in stacionarno fazo v številnih primerih zajamejo velik delež termodinamike procesa. V sistemu pa so prisotne tudi druge interakcije, ki jih je potrebno upoštevati, npr. interakcije topila samega s sabo in interakcije, do katerih pride, ko analit nadomesti molekule topila, adsorbirane na stacionarno fazo [33].

11

Ali je proces v celoti gledano ugoden, lahko napovemo z Gibbsovo prosto energijo ΔG.

Če je njena vrednost negativna, je proces ugoden, če je pozitivna, pa ne. ΔG vključuje prispevek zaradi spremembe entalpije ΔH in prispevek zaradi spremembe entropije ΔS, odvisna pa je tudi od absolutne temperature T [33]:

𝛥𝐺 = 𝛥𝐻 − 𝑇𝛥𝑆 (11)

V tipični RPC sta vrednosti ΔH in ΔS negativni in je prva zato ugodna, druga pa ne. Pri nizkih temperaturah je ΔH negativna in prevladujoči člen, zato je ΔG negativna. Nižje temperature tako favorizirajo retencijo. Pri višjih temperaturah pa je prispevek člena – TΔS večji (ker je ΔS negativna) in je ΔG zato manj negativna, kar pomeni, da je retencija vedno manj favorizirana. Te termodinamske zveze razložijo, zakaj se retencija v splošnem zniža s temperaturo. Pri tem smo predpostavili, da sta ΔH in ΔS neodvisni od temperature in da se mobilna in stacionarna faza ne spreminjata s temperaturo [33].

Za sisteme, ki vključujejo številne šibke intermolekularne sile [31, 35], je značilna entropijsko-entalpijska kompenzacija (entropy-entalphy compensation, EEC) [31, 36].

Ta zveza se kaže kot linearna odvisnost entropije od pripadajoče entalpije [35, 36] pri spremembi eksperimentalne spremenljivke preučevanega procesa. Izbrana spremenljivka je lahko število ponavljajočih strukturnih elementov v skupini molekul (homologna vrsta), lastnost topila (npr. površinska napetost, dielektrična konstanta ali koncentracija komponent v mešanih topilih) ali temperatura [36]. EEC efekti so bili opaženi pri proteinih srednje molekulske mase v raztopini in vezanem stanju [30]. Izvor EEC je reorganizacija asociirane strukturirane vode med zvijanjem/razvijanjem proteina ali interakcijo protein-ligand [35]. EEC kaže, da bolj negativna ΔH pomeni močnejšo vezavo z bolj omejeno konfiguracijo proteina v vezanem stanju, kar pomeni sočasno bolj negativno ΔS [31, 32, 36]. V interakcijah protein-ligand EEC prispeva k stabilizaciji proteinov [31], saj spremembe v okolju lahko povzročijo velike spremembe ΔH in ΔS, vendar pa se ΔG relativno malo spremeni [31, 36]. Naklon EEC grafov je karakterističen za proces in ga imenujemo kompenzacijska temperatura Tc. Kemijske reakcije in ravnotežni procesi s podobnimi kompenzacijskimi temperaturami veljajo za sorodne [32, 35, 36].

12

Med termodinamskimi količinami, ki se pogosto določajo proteinom, je tudi toplotna kapaciteta ΔC. Pomeni povečanje energije (toplote) s temperaturo, pogosto rabljena definicija pa je tudi ΔC kot temperaturna odvisnost entropije [37]:

𝛥𝐶 =𝑑𝐻

𝑑𝑇 = 𝑇𝑑𝑆

𝑑𝑇 (12)

ΔC je sorazmerna dostopni površini proteina, ki sodeluje v porazdeljevanju ali adsorpciji [31, 35]. To površino lahko razdelimo na nepolarno (kjer je energetika asociacije z imobiliziranimi ligandi povezana z entropijsko vodenimi procesi zaradi hidrofobnega efekta [31, 35]) in polarno (kjer v energetiki asociacije sodelujejo vodikove vezi [31, 35]

ali elektrostatski prispevki [35]). Za interakcijo nepolarnih površin proteina z nepolarnimi ligandi je značilna velika in negativna ΔC [31, 35], za interakcijo polarnih delov površine z nepolarnim okoljem pa majhna in pozitivna ΔC [35].

Iz zgornjih ugotovitev in enačbe (12) lahko sklepamo, da polarne in nepolarne skupine različno vplivajo na temperaturno odvisnost entropije in entalpije zvijanja in vezave proteinov. V odvisnosti od vključenih polarnih/nepolarnih skupin se zato lahko proces spremeni iz entropijsko vodenega pri eni temperaturi v entalpijsko vodenega pri drugi [37].

1.4 Temperaturna odvisnost logaritma retencijskega faktorja

1.4.1 Izpeljava van't Hoffove enačbe

ΔG je s K povezan preko splošne plinske konstante R in absolutne temperature T:

𝛥𝐺 = −𝑅𝑇 ln 𝐾 (13)

S kombinacijo enačb (11) in (13) dobimo:

ln 𝐾 = −𝛥𝐻 𝑅𝑇 +𝛥𝑆

𝑅 (14)

Če v enačbo (14) vstavimo enačbo (10) in jo preuredimo, dobimo van't Hoffovo enačbo, kot jo uporabljamo v kromatografiji [33]:

13

ln 𝑘 = −𝛥𝐻 𝑅𝑇+𝛥𝑆

𝑅 + ln 𝜙 (15)

Enačba (15) je enačba premice, ki prikazuje odvisnost lnk od 1/T, njen naklon je – ΔH/R, začetna vrednost pa ΔS/R + lnϕ. Iz grafa, ki prikazuje to odvisnost, lahko iz naklona določimo ΔH prenosa analita iz mobilne v stacionarno fazo, iz začetne vrednosti pa ΔS tega prenosa, če poznamo tudi fazno razmerje ϕ [33].

Analiza van't Hoffovih grafov omogoča vpogled v vključene sekundarne ravnotežne procese, ki so odvisni od temperature [32]. Linearni van't Hoffovi grafi kažejo, da je mehanizem retencije analitov konstanten, tj. vrednosti ΔH, ΔS in ϕ so konstantne v opazovanem temperaturnem območju [38]. Linearne van't Hoffove zveze v splošnem dobimo za majhne organske molekule brez sekundarne ali terciarne strukture [39]. Če dobljeni van't Hoffov graf ni linearen, to kaže, da se v opazovanem temperaturnem intervalu ΔC, ΔH, ΔS in/ali ϕ spreminjajo [30, 36, 38], tj. retencijski mehanizem analita ni konstanten. Do tega lahko pride iz več razlogov [38].

Proteini imajo zvito strukturo, zato lahko med kromatografsko ločbo pride do konformacijskih sprememb, kar povzroči drugačen retencijski mehanizem [25]. Npr.

nepolarno okolje, kakršna je hidrofobna stacionarna faza, lahko inducira prehode iz naključnega zvitja v α-vijačnico [25, 30] ali β-ploskev [30]. Spremembo konformacije pri makromolekulah lahko povzroči tudi temperatura [38, 39].

Predpostavke, na katerih temelji izpeljava van't Hoffove enačbe, niso nujno izpolnjene.

Pri izpeljavi predpostavljamo, da je stacionarna faza homogena, čeprav ta v splošnem vsebuje mesta z različno afiniteto za dani analit. Predpostavljamo tudi, da se stacionarna in mobilna faza ne spreminjata s temperaturo, vendar je npr. dielektričnost vode različna pri različnih temperaturah. S povečevanjem temperature lahko pride do faznih prehodov v stacionarni fazi. Pri nižjih temperaturah je konformacija stacionarne faze podobna trdni fazi, pri višjih pa postane bolj podobna tekoči fazi. Pri tej spremembi se lahko spremenijo interakcije med analitom in stacionarno fazo [38].

Povečanje temperature bi lahko vplivalo na fleksibilnost imobiliziranih ligandov, kar bi povzročilo njihovo večjo solvatacijo in zmanjšanje volumna mobilne faze ter spremembo faznega razmerja kolone. Ker pa velja, da je fazno razmerje konstantno v širokem

14

temperaturnem območju, spremembe ΔH in ΔS pripišemo spremembi ΔC procesa, ki jo povzročijo spremembe lastnosti analitov ali mobilne faze [36].

Van't Hoffov graf je lahko tudi navidezno linearen. Odstopanja od linearnosti morda niso opažena, ker se ΔH, ΔS in ϕ medsebojno spreminjajo tako, da je neto efekt linearna zveza [38].

1.4.2 Določanje termodinamskih količin iz nelinearnih van't Hoffovih grafov

Spremembi entropije in entalpije sta s toplotno kapaciteto povezani z enačbama [32, 36]:

𝛥𝑆 = ∫(𝛥𝐶 𝑇⁄ ) 𝑑𝑇 (16)

𝛥𝐻 = ∫ 𝛥𝐶 𝑑𝑇 (17)

Če je toplotna kapaciteta ΔC neodvisna od temperature in za referenčni temperaturi vstavimo TS in TH, pri katerih sta ΔS in ΔH enaki nič, lahko odvisnost entropije in entalpije od temperature podamo kot [36]:

𝛥𝑆 = 𝛥𝐶 ln(𝑇 𝑇⁄ ) _𝑆 (18)

𝛥𝐻 = 𝛥𝐶 (𝑇 − 𝑇_𝐻) (19)

S kombinacijo enačb (15), (18) in (19) dobimo za temperaturno odvisnost logaritma retencijskega faktorja funkcijo s tremi parametri (logaritmična funkcija) [32, 36]:

ln 𝑘 =𝛥𝐶 𝑅 (𝑇_𝐻

𝑇 − ln𝑇_𝑆

𝑇 − 1) + ln 𝜙 (20)

Ker je naklon lnk v odvisnosti od 1/T pri katerikoli temperaturi sorazmeren spremembi entalpije pri tej temperaturi, iz enačb (19) in (20) sledi, da ima lnk maksimum pri TH [32, 36]. Podobno ima ΔG v odvisnosti od temperature maksimum pri TS, ker naklon te funkcije pri dani temperaturi določa sprememba entropije pri tej temperaturi (enačbi (11) in (18)) [36]. Enačba (20) omogoča oceno parametrov ΔC, TH in TS iz nelinearnih van't Hoffovih grafov s prilagajanjem enačbe (20) eksperimentalnim podatkom z metodo

15

najmanjših kvadratov, če je fazno razmerje kolone znano. Parametri v enačbi (20) omogočajo tudi oceno spremembe entropije in entalpije preko enačb (18) in (19) [32, 36].

Izpeljava enačbe (20) temelji na predpostavki, da se toplotna kapaciteta ne spreminja s temperaturo [36]. Če pa to ne velja, potem lahko odvisnost lnk od temperature opišemo s katerokoli funkcijo. Zaradi matematične prikladnosti in brez izgube splošnosti lahko predpostavimo, da je polinomska [3, 32]:

ln 𝑘 = 𝑎 + 𝑏 (1

𝑇) + 𝑐 (1 𝑇)

2

+ 𝑑 (1 𝑇)

3

+ ⋯ + ln 𝜙 (21)

V enačbi (21) so a, b, c, d, … numerični koeficienti nelinearne regresije, ki ustrezajo eksperimentalnim podatkom. Glavna prednost uporabe polinoma je, da omogoča enostavno odvajanje in ekstrapolacijo lnk izven eksperimentalno zajetega temperaturnega intervala [3].

V najenostavnejšem nelinearnem primeru lahko polinom aproksimiramo s kvadratno funkcijo [3, 30, 32, 36]:

ln 𝑘 = 𝑎 +𝑏 𝑇+ 𝑐

𝑇²+ ln 𝜙 (22)

Entalpijo, entropijo in toplotno kapaciteto lahko ocenimo iz parametrov a, b in c z enačbami [3, 30, 32, 36]:

𝛥𝐻 = −𝑅 (𝑏 +2𝑐

𝑇) (23)

𝛥𝑆 = 𝑅 (𝑎 − 𝑐

𝑇²) (24)

𝛥𝐶 =2𝑅𝑐

𝑇² (25)

Povprečno ΔC, izračunano iz logaritmične funkcije, lahko primerjamo z aritmetično povprečno vrednostjo ΔC, pridobljeno s kvadratno funkcijo [36].

16

Spreminjanje temperature drugače vpliva na procese v izokratski eluciji kot na procese pod trenutno spreminjajočimi pogoji med gradientno elucijo [40]. Zato moramo za določanje termodinamskih količin uporabiti izokratske pogoje pri konstantnem tlaku [32].

1.5 Tlačna odvisnost logaritma retencijskega faktorja

Vpliv tlaka na adsorpcijo proteinov v tekočinski kromatografiji je pogosto zanemarjen [3, 29], ker tekočine v običajnem HPLC tlačnem režimu (< 350 bar) obravnavamo kot nestisljive [3, 25]. Vendar pa eksperimentalni podatki kažejo, da ima tlak lahko tudi v običajnem HPLC tlačnem režimu velik vpliv na retencijo analitov [3, 25, 29]. Pri višji temperaturi se viskoznost mobilne faze zmanjša, kar privede do zmanjšanega povprečnega tlaka v koloni. Za oceno prave temperaturne odvisnosti je zato potrebno zagotoviti konstanten povprečni tlak [3, 32].

V HPLC kolonah, polnjenih s finimi delci, opazno pade tlak. Ker so tekočine nekoliko stisljive, se hitrost mobilne faze spreminja vzdolž kolone. Vpliv tlaka bi zato morali izračunati kot integral vzdolž kolone. Vendar v prvem približku zanemarimo to stisljivost in obravnavamo povprečen tlak v koloni (average column pressure, ACP) kot povprečje vstopnega in izstopnega tlaka pi in po [3]:

𝐴𝐶𝑃 =𝑝_𝑖 + 𝑝_𝑜

2 (26)

Vpliv tlaka na spremembe K lahko zanemarimo le, če je sprememba molarnega volumna analita ΔVm enaka nič. ΔVm je enaka razliki molskih volumnov analita v stacionarni fazi Va in v mobilni fazi Vb [3]:

𝛥𝑉_𝑚 = 𝑉_𝑎− 𝑉_𝑏 (27)

Iz ΔVm, ki jo povzroči adsorpcija, lahko pridobimo informacijo o povprečnih strukturnih spremembah zadržanih molekul. Pričakujemo lahko majhen ΔVm za majhne molekule z relativno rigidno strukturo, medtem ko je ΔVm lahko večji za večje molekule, sestavljene iz dolgih in fleksibilnih verig [29].

17

2 Namen dela

Mehanizmi retencije analitov na kromatografskih kolonah niso povsem pojasnjeni. To še posebej velja za biološke makromolekule, npr. proteine, pri katerih lahko zaradi njihove kompleksnejše strukture med kromatografsko ločbo prihaja do sekundarnih procesov.

Namen dela je preučiti vpliv temperature na retencijo izbranih proteinov (insulin, citokrom c, lizocim, BSA) na reverznofazni koloni na osnovi van't Hoffovih grafov. S prilagajanjem teoretičnih odvisnosti eksperimentalnim podatkom sem želela oceniti vrednosti nekaterih termodinamskih količin adsorpcije, na osnovi katerih bi lahko sklepala na sekundarne procese, do katerih prihaja med ločbo. Pri tem sem upoštevala vpliv tlaka zaradi spremembe temperature.

19

3 Eksperimentalni del

Proizvajalci uporabljenih reagentov so navedeni v tabeli 2. Vse raztopine so bile pripravljene v MiliQ vodi.

Tabela 2: Uporabljeni reagenti.

Reagent Proizvajalec

ACN Fisher Scientific

Citokrom c iz konjskega srca Sigma Aldrich

EtOH Honeywell

EDTA Fluka Analytical

BSA Sigma Aldrich

Insulin, človeški Sigma Aldrich

KCl Fisher Scientific

HCl Honeywell Fluka

Lizocim iz beljakov kokošjih jajc Sigma Aldrich

MeOH J. T. Baker

TFA Fisher Scientific

Tris Kemika

Uracil Sigma Aldrich

Kromatografske analize so bile narejene na kromatografu Nexera XR LC-20AD XR podjetja Shimadzu z detektorjem na niz diod. Vsi kromatogrami so bili posneti pri valovni dolžini 280 nm.

Za začetne kromatografske analize insulina sem uporabila kolono BIOshell A160 Peptide C18 dolžine 15 cm, notranjega premera 2.1 mm, velikosti delcev 2.7 µm in velikosti por 160 Å proizvajalca Supelco. Analize so bile narejene z izokratsko elucijo v šestih mobilnih fazah, ki so kombinirale tri organske faze (ACN, MeOH in EtOH) in dve vodni

20

fazi (0.1 M KCl in 0.1 % TFA). Deleži posameznih faz in pretoki so navedeni v tabeli 3.

Za analize z mobilno fazo, ki je vsebovala 0.1 M KCl, je bila injicirana raztopina insulina pripravljena v koncentraciji 1 mg/mL v raztopini 20 mM Tris in 2 mM EDTA, pH je bil uravnan na ~ 7.5 z 1 M HCl. Za analize z 0.1 % TFA pa je bil insulin pripravljen v koncentraciji 0.5 mg/mL v 0.1 % TFA. Temperaturo sem spreminjala od 20 °C do 80 °C v korakih po 10 °C. Čas analize je bil prilagojen retencijskemu času insulina pri posamezni temperaturi.

Tabela 3: Pogoji kromatografskih ločb insulina v začetnih eksperimentih.

Mobilna faza A Mobilna faza B Delež B v mobilni fazi [%] Pretok [mL/min]

0.1 M KCl EtOH 38 0.1

MeOH 60 0.2

ACN 30 0.3

0.1 % TFA EtOH 35 0.1

MeOH 56 0.3

ACN 30 0.4

Insulin in citokrom sem analizirala na isti koloni z izokratsko elucijo z dvema mobilnima fazama: 0.1 % TFA in ACN (70:30) ter 0.1 % TFA in MeOH (44:56). Pretok je bil v obeh primerih 0.3 mL/min. Injicirano raztopino sem pripravila z raztapljanjem obeh proteinov v 0.1 % TFA, insulin v koncentraciji 0.5 mg/mL, citokrom pa 1 mg/mL.

Analize z mobilno fazo TFA-ACN so bile narejene v temperaturnem območju 30–80 °C v korakih po 10 °C. V mobilni fazi TFA-MeOH bi bile analize pri nižjih temperaturah predolge, zato sem jih izvedla v ožjem temperaturnem območju z manjšimi koraki (40–

60 °C v korakih po 5 °C in 60–80 °C v korakih po 10 °C za insulin ter 45–60 °C v korakih po 5 °C za citokrom). Čas analize je bil prilagojen retencijskemu času pri posamezni temperaturi.

V prvem setu eksperimentov sem spreminjala samo temperaturo, v drugem pa sem pri vsaki temperaturi tlak popravila tako, da je bil ACP čim bližje najvišjemu ACP,

21

doseženem v prvem setu (TFA-MeOH, 30 °C). Tlak sem popravila z vezavo restrikcijske kapilare ustrezne dolžine za kolono.

Z metodama, s katerima sem analizirala insulin in citokrom, nisem mogla analizirati tudi lizocima in BSA, saj nisem mogla najti pogojev, pri katerih bi imeli vsi proteini primerne retencijske čase v dovolj širokem temperaturnem območju. Zato sem ta dva proteina analizirala z gradientno metodo s položnim gradientom. Poleg tega je pri BSA zaradi njegove velikosti obstajala možnost, da bi ostal v porah stacionarne faze, zato sem za njegovo analizo uporabila kolono z enako kemijo stacionarne faze (C18), vendar večjimi porami (Poroshell 300SB-C18, dolžine 75 mm, notranjega premera 2.1 mm, velikosti delcev 5 μm in velikosti por 300 Å proizvajalca Agilent). Analizo sem naredila samo s kombinacijo topil TFA-ACN, ker je ta mobilna faza dala bolj zanimive rezultate za insulin. Za ti dve analizi tudi nisem popravljala tlaka.

Oba proteina sta bila pripravljena v 0.1 % TFA. Potek gradietne elucije prikazuje tabela 4. Za lizocim je analiza trajala 30 min, za BSA pa 40 min. Temperaturo sem spreminjala od 30 do 80 °C v korakih po 10 °C.

V vseh primerih sem VM določila z injiciranjem uracila, ki se na koloni ne zadržuje.

22 Tabela 4: Pogoji kromatografskih ločb lizocima in BSA.

Pretok [mL/min] Čas [min] Delež ACN [%]

Lizocim 0.3 0.01 30

20.00 40

20.01 30

30.00 30

BSA 1 0.01 32

30.00 40

31.00 95

33.00 95

34.00 32

40.00 32

Prilagajanje modelnih funkcij eksperimentalnim podatkom sem naredila s programsko opremo Spyder. Termodinamske količine ΔH in ΔS sem izračunala iz parametrov kvadratne in logaritmične funkcije. Za izračun ΔH sem uporabila enačbi (19) in (23), za izračun ΔS pa enačbi (18) in (24). ΔC sem izračunala iz parametrov kvadratne funkcije po enačbi (25), za izračun ΔG pa sem uporabila enačbo (13).

23

4 Rezultati in razprava

4.1 Eksperimenti z insulinom v različnih mobilnih fazah

Začetni eksperimenti z insulinom so bili narejeni z različnimi kombinacijami komponent mobilne faze, ki sem jih zasledila v literaturi. V RPC proteinov se najpogosteje uporabljata mešanici ACN ali MeOH z vodo [30], najpogosteje rabljen aditiv pa je TFA [2, 26]. Ponekod v literaturi [27, 41] pa so za mobilno fazo uporabili EtOH in vodno raztopino KCl. Izoelektrična točka insulina je pri pH ~ 5.3 [4], zato ima ta v mobilni fazi, ki vsebuje 0.1 % TFA (pH ~ 2), drugačen celokupni naboj kot v mobilni fazi, ki vsebuje 0.1 M KCl (pH ~ 6).

Z eksperimenti sem poskušala zajeti čim večje temperaturno območje v čim krajšem času, zato sem za različne eksperimente uporabila različne pretoke in sestavo mobilnih faz.

Rezultati niso neposredno primerljivi, lahko pa razberemo nekatere trende. Sliki 5 in 6 prikazujeta odvisnost retencijskega časa od temperature in van't Hoffove grafe za insulin v različnih mobilnih fazah.

Slika 5: Odvisnost retencijskega časa insulina od temperature v različnih mobilnih fazah.

0 10 20 30 40 50 60 70 80

10 30 50 70 90

tR [min]

T [°C]

TFA-ACN TFA-MeOH TFA-EtOH KCl-ACN KCl-MeOH KCl-EtOH

24

Slika 6: Van't Hoffovi grafi za insulin v različnih mobilnih fazah.

V vseh primerih, kjer je mobilna faza vsebovala MeOH ali EtOH, se retencijski čas s povečevanjem temperature približno eksponentno krajša in van't Hoffov graf približno linearno narašča. Za mobilni fazi z MeOH je van't Hoffov graf nekoliko konkaven, za mobilni fazi z EtOH pa nekoliko konveksen. Konveksnost van't Hoffovega grafa za mobilno fazo KCl-EtOH se ujema z literaturo [41]. Retencijsko obnašanje insulina pa je drugačno za obe mobilni fazi, ki sta vsebovali ACN. V teh dveh primerih se je retencijski čas s povečevanjem temperature najprej podaljševal, nato pa krajšal. Maksimum opazimo tudi v obeh van't Hoffovih grafih.

Retencijski časi in van't Hoffovi grafi za insulin izkazujejo podoben trend v mobilnih fazah z istim organskim topilom. To kaže, da imata sprememba pH in prisotnost soli manjši vpliv na retencijsko obnašanje v primerjavi z vplivom organskega topila v mobilni fazi.

4.2 Korekcija tlaka zaradi spremembe viskoznosti mobilne faze

V izbranih mobilnih fazah (TFA-ACN in TFA-MeOH) se s povečevanjem temperature povprečni tlak v koloni zmanjšuje, zato sem naredila korekcijo. Kot konstantni tlak sem izbrala najvišji tlak, dosežen v eksperimentih, kjer ga nisem popravljala (214 bar v TFA- MeOH pri 30 °C). Razlika med popravljenim (konstantnim) in nepopravljenim tlakom je

-2 -1 0 1 2 3 4

0.0027 0.0029 0.0031 0.0033 0.0035

lnk

1/T [1/K]

TFA-ACN TFA-MeOH TFA-EtOH KCl-ACN KCl-MeOH KCl-EtOH

25

zato večja za sistema z ACN kot za sistema z MeOH in se veča s povečevanjem temperature. To je razvidno iz grafa odvisnosti ACP od temperature (slika 7).

Slika 7: Odvisnost povprečnega tlaka v koloni od temperature.

Kot je razvidno iz slik 8 in 9, so za oba proteina v vseh mobilnih fazah retencijski časi pri konstantnem tlaku daljši. Za insulin v ACN je povečanje retencijskega časa zaradi upoštevanja tlaka največje v okolici maksimuma. V ostalih primerih je razlika med retencijskimi časi največja pri nižjih temperaturah in se znižuje s povečevanjem temperature. Verjetno ima tlak manjši vpliv pri višjih temperaturah, ker so retencijski časi zelo kratki. Zato so bolj zanesljive vrednosti pri nižjih temperaturah. Zaradi ožjega temperaturnega območja je manj zanesljiv tudi vpliv tlaka na retencijo citokroma v MeOH.

50 70 90 110 130 150 170 190 210 230 250

20 30 40 50 60 70 80 90

ACP [bar]

T [°C]

ACN

ACN, ACP = konst.

MeOH

MeOH, ACP = konst.

26 Slika 8: Odvisnost retencijskih časov insulina od temperature.

Slika 9: Odvisnost retencijskih časov citokroma od temperature.

Van't Hoffove grafe za insulin in citokrom pri popravljenem in nepopravljenem tlaku prikazujeta sliki 10 in 11. Zaradi neupoštevanja popravka tlaka so dobljene vrednosti lnk premajhne, napaka pa se zmanjšuje s povečevanjem 1/T.

0 5 10 15 20 25 30

20 30 40 50 60 70 80 90

tR[min]

T [°C]

ACN

ACN, ACP = konst.

MeOH

MeOH, ACP = konst.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

20 30 40 50 60 70 80 90

tR[min]

T [°C]

ACN

ACN, ACP = konst.

MeOH

MeOH, ACP = konst.

27 Slika 10: Van't Hoffovi grafi za insulin.

Slika 11: Van't Hoffovi grafi za citokrom.

Vpliv tlačnega efekta na retencijske čase v MeOH je za oba proteina manjši kot v ACN, kar je verjetno posledica manjše razlike med popravljenim (konstantnim) in nepopravljenim tlakom v MeOH. Vzrok za manjši vpliv tlaka na retencijo obeh proteinov v MeOH bi lahko bila tudi manjša stisljivost insulina in citokroma v MeOH. To bi lahko razložili na dva načina. Prva možnost je, da imata molekuli insulina in citokroma v MeOH togo strukturo, druga možnost pa je, da sta že denaturirani.

-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5

0.0028 0.0029 0.0030 0.0031 0.0032 0.0033 0.0034

lnk

1/T [1/K]

ACN

ACN, ACP = konst.

MeOH

MeOH, ACP = konst.

-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

0.0028 0.0029 0.0030 0.0031 0.0032 0.0033 0.0034

lnk

1/T [1/K]

ACN

ACN, ACP = konst.

MeOH

MeOH, ACP = konst.

28

Trendi odvisnosti retencijskih časov od temperature ostajajo nespremenjeni tudi pri konstantnem tlaku, zato za njihovo preučevanje korekcija tlaka ni nujno potrebna. Ker pa ima korekcija vpliv na vrednosti retencijskih časov, vpliva tudi na termodinamske količine, ki so iz njih izračunane. Zato jo je za njihovo oceno nujno upoštevati.

4.3 Vpliv temperature

Oba uporabljena modela (kvadratna in logaritemska funkcija), ki sem ju prilagajala eksperimentalnim podatkom, dajeta v vseh primerih dobro ujemanje (r² > 99 %).

Izračunane vrednosti ΔH in ΔS so skoraj enake. V večini primerov je razlika med njimi manj od 10 %, podobno kot v literaturi [36]. Zaradi preglednosti so na vseh grafih prikazane le vrednosti, izračunane s kvadratno funkcijo. Glavna razlika med funkcijama je, da logaritemska predpostavi konstantno (temperaturno neodvisno) ΔC, kvadratna pa njeno odvisnost od temperature. Podatki iz literature [36] kažejo, da je ΔC za hidrofobne interakcije linearno odvisna od temperature, zato je kvadratna funkcija primernejša za opis eksperimentalnih podatkov. Poleg tega je enostavnejša za prilagajanje podatkom v primerjavi z logaritmično. Če nas zanima le povprečna vrednost ΔC ali njena vrednost v ozkem temperaturnem intervalu, sta primerni obe funkciji, saj se vrednost ΔC, pridobljena iz logaritmične funkcije, dobro ujema s povprečno vrednostjo ΔC, pridobljeno iz kvadratne funkcije. Prednost logaritmične funkcije pa je, da lahko iz izračunanih parametrov funkcije neposredno preberemo temperaturi TH in TS, pri katerih sta ΔH in ΔS enaki nič.

4.3.1 Insulin

Retencijske čase v odvisnosti od temperature in van't Hoffova grafa insulina v ACN in MeOH prikazujeta sliki 12 in 13. V MeOH se retencijski časi s povečevanjem temperature eksponentno krajšajo, v ACN pa se najprej povečujejo, nato pa se pri ~ 53 °C začnejo krajšati. Maksimum se pojavi tudi v van't Hoffovem grafu za ACN. Van't Hoffov graf za MeOH precej manj odstopa od linearnosti v primerjavi z grafom za ACN, saj nima ekstremov in je le nekoliko konkaven.

29

Slika 12: Odvisnost retencijskih časov insulina od temperature pri konstantnem tlaku.

Slika 13: Van't Hoffovi grafi za insulin pri konstantnem tlaku.

Odvisnost ΔG od temperature za insulin v obeh mobilnih fazah prikazuje slika 14.

Vrednosti ΔG v ACN so pri vseh temperaturah negativne in imajo minimum med 50 °C in 60 °C, ki ustreza maksimalnemu retencijskemu času. Negativne vrednosti ΔG kažejo, da je adsorpcija insulina v ACN pri vseh temperaturah termodinamsko ugoden proces. V MeOH pa vrednosti ΔG približno linearno naraščajo. Pri nižjih temperaturah so negativne, vrednosti pri 70 °C in 80 °C pa sta pozitivni. To kaže, da je adsorpcija pri

0 5 10 15 20 25 30

20 30 40 50 60 70 80 90

tR[min]

T [°C]

ACN MeOH

-2 -1 0 1 2 3 4

0.0028 0.0029 0.0030 0.0031 0.0032 0.0033 0.0034

lnk

1/T [1/K]

ACN MeOH

30

višjih temperaturah v MeOH termodinamsko neugodna. Vendar pa tudi pri teh dveh temperaturah prihaja do zadrževanja insulina na koloni, saj je retencijski čas daljši od mrtvega časa, čeprav je razlika med njima v obeh primerih krajša od minute (0.9 min in 0.4 min). Do retencije pri višjih temperaturah bi lahko prihajalo zaradi steričnih in ne termodinamskih razlogov.

Slika 14: Odvisnost ΔG od temperature za insulin pri konstantnem tlaku.

Izračunane vrednosti ΔH in ΔS adsorpcije insulina v ACN in MeOH se v obeh primerih s povečevanjem temperature linearno znižujejo (sliki 15 in 16). V MeOH so vrednosti ΔH in ΔS pri vseh temperaturah negativne, v ACN pa so pri nižjih temperaturah pozitivne, pri TH = 53 °C in TS = 57 °C pa spremenijo predznak. Za obe mobilni fazi je ΔC velika in negativna ter približno linearno narašča s povečevanjem temperature (slika 17).

-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4

20 30 40 50 60 70 80 90

ΔG [kJ/mol]

T [°C]

ACN MeOH

31

Slika 15: Odvisnost ΔH od temperature za insulin pri konstantnem tlaku.

Slika 16: Odvisnost ΔS od temperature za insulin pri konstantnem tlaku.

-120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80

20 30 40 50 60 70 80 90

ΔH [kJ/mol]

T [°C]

ACN MeOH

-400 -300 -200 -100 0 100 200 300

20 30 40 50 60 70 80 90

ΔS [J/K]

T [°C]

ACN MeOH

32

Slika 17: Odvisnost ΔC od temperature za insulin pri konstantnem tlaku.

Literatura [36] povečanje retencije proteinov s temperaturo pripisuje povečani jakosti hidrofobnih interakcij, ki so posledica temperaturno povzročenih konformacijskih sprememb proteinov in/ali sočasnemu povečanju hidrofobne kontaktne površine pri vezavi. Rezultati iz literature [3, 29] pa kažejo, da se ΔVm insulina pri T < 53 °C v kromatografski ločbi v enaki mobilni fazi na koloni C8 ne spreminja s temperaturo. To kaže, da s povečevanjem temperature adsorpcija ne inducira velikih sprememb sekundarne strukture. Do povečane retencije zato verjetno prihaja zaradi manjših sprememb, npr. struktura proteina se splošči s povečevanjem temperature [3]. Zaradi povečanja kontaktne površine se poveča jakost hidrofobnih interakcij med molekulo proteina in stacionarno fazo, kar povzroči daljše retencijske čase [3, 29].

Insulin je velika molekula v primerjavi z molekulami topila. Pri adsorpciji molekule insulina na stacionarno fazo pride do desorpcije velikega števila molekul topila s stacionarne faze in s površine proteina, kar je verjetno razlog za povečanje ΔH in ΔS [3].

Pozitivni ΔH je verjetno posledica prekinitve vezi med molekulami topila in insulinom ali stacionarno fazo. Zato je pri nižjih temperaturah adsorpcija endotermna. Desorpcija molekul topila s površine insulina ali stacionarne faze poveča nered in s tem ΔS.

Celokupna pozitivna vrednost ΔH neugodno prispeva k ΔG, prispevek pozitivne ΔS pa

-3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5

20 30 40 50 60 70 80 90

ΔC [kJ/K]

T [°C]

ACN MeOH

33

je termodinamsko ugoden. Adsorpcija je zato pri nižjih temperaturah (T < 53 °C) entropijsko vodena.

Pri temperaturah TH = 53 °C in TS = 57 °C vrednosti ΔH in ΔS postanejo negativne.

Sprememba predznaka termodinamskih količin kaže na večje spremembe kompleksa med proteinom, nepolarnimi ligandi in molekulami topila. Običajno so pripisane temperaturno induciranim konformacijskim spremembam sekundarnih struktur biomolekul [30]. Na večje spremembe strukture molekule insulina pri adsorpciji s povečevanjem temperature kažejo tudi vrednosti ΔVm iz literature [3], ki se za T > 53 °C povečujejo.

Tako bi pri višjih temperaturah (T > 53 °C) lahko prišlo do večjih konformacijskih sprememb oz. do denaturacije. Pri razvijanju molekule se izpostavijo njeni hidrofobni deli, kar povzroči povečanje hidrofobnih interakcij med verigo insulina in stacionarno fazo [3]. To je verjetno razlog, da vrednost ΔH postane bolj negativna in je adsorpcija pri višjih temperaturah eksotermna. Pri adsorpciji razvite verige na stacionarno fazo se tudi zelo zmanjša število dostopnih konformacij, kar povzroči veliko zmanjšanje ΔS [3].

Pozitivna prispevka k ΔH in ΔS zaradi desorpcije molekul topila s površine insulina ali stacionarne faze, ki prevladujeta pri nižjih temperaturah, sta pri višjih temperaturah manjša od negativnih prispevkov. Zaradi ugodnega prispevka ΔH in neugodnega prispevka ΔS k ΔG je adsorpcija entalpijsko vodena. Retencija je entropijsko vodena pri nizkih temperaturah in entalpijsko vodena pri visokih temperaturah tudi za nekatere druge procese, ki jih vodi hidrofobni efekt [36].

Vrednosti in trendi odvisnosti ΔC od temperature (slika 17) prav tako kažejo, da prihaja do konformacijskih sprememb. Povečanje ΔC s povečevanjem temperature kaže, da se topilu dostopna hidrofobna površina proteina in/ali ligandov pri povečevanju temperature zmanjša. Najverjetnejša razlaga za to je temperaturno inducirano razvijanje proteina. Pri tem se prej skrite hidrofobne aminokisline proteina izpostavijo nepolarnim ligandom.

Zaradi tega se poveča hidrofobna kontaktna površina med proteinom in nepolarnimi ligandi in zmanjša površina proteina in nepolarnih ligandov, ki je dostopna topilu [31].

Predlagana razlaga rezultatov se ujema z literaturo, saj termično razvijanje proteinov velja za vsaj dvostopenjski proces. Pri nižjih temperaturah je molekula proteina ujeta in/ali skače med različnimi metastabilnimi stanji, ki ustrezajo majhnim spremembam njene

34

kompaktne globularne strukture. Pri višjih temperaturah pa se protein popolnoma razvije [3]. Predlagano razlago podpirajo tudi zaključki [3] za insulin v isti mobilni fazi na koloni C8 in rezultati [42], ki kažejo, da monomeri insulina ohranijo nativno strukturo pri adsorpciji na hidrofobne površine pri nizkih pH in da do denaturacije pride pri segrevanju na višje temperature (65 °C). Slabost predlagane razlage pa je, da zanemarja druge možne pojave, povezane z adsorpcijo proteinov, npr. agregacijo [3].

Podobnost vrednosti in trendov grafov insulina v MeOH v celotnem temperaturnem območju s temi za insulin v ACN pri višjih temperaturah bi lahko kazala, da pri insulinu v MeOH že pri nižjih temperaturah prihaja do večjih konformacijskih sprememb oz.

denaturacije. Vrednosti ΔH so negativne, ker pride do močnejših hidrofobnih interakcij na novo izpostavljenega hidrofobnega jedra z ligandi stacionarne faze. Negativni prispevek k ΔS zaradi zmanjšanja števila dostopnih konformacij pri adsorpciji je večji od pozitivnega prispevka zaradi desorpcije molekul topila s površine insulina ali stacionarne faze. Adsorpcija je pri vseh temperaturah eksotermna in entalpijsko vodena, saj je prispevek negativne ΔH k ΔG ugoden, prispevek negativne ΔS pa ne. K bolj negativni vrednosti ΔH in ΔS v sistemu z MeOH bi lahko prispevale vodikove vezi, ki se lahko v sistemu z MeOH tvorijo v večji meri kot v sistemu z ACN.

Denaturacija insulina pri nižjih temperaturah v MeOH, ne pa tudi v ACN, je morda posledica višje koncentracije MeOH v mobilni fazi, ki je skoraj dvakrat višja od koncentracije ACN. Alkoholi lahko destabilizirajo terciarno strukturo proteina, saj lahko vplivajo na hidratacijo proteina in neurejenost vezanih molekul vode, nekateri pa lahko povzročijo tudi razvijanje elementov sekundarne strukture [43]. ACN [31] in alkoholi [44] v višjih koncentracijah denaturirajo številne proteine, ki jih v nizkih koncentracijah stabilizirajo [31, 44].

4.3.2 Citokrom

Retencijski časi citokroma v obeh mobilnih fazah se s povečevanjem temperature približno eksponentno krajšajo (slika 18). Van't Hoffov graf v MeOH je linearen, v ACN pa konkaven (slika 19). Glede na obliko van't Hoffovega grafa v ACN bi ta lahko imel maksimum pri večjih 1/T (nižjih temperaturah), kot jih je zajel eksperiment (T < 30 °C).

35

Slika 18: Odvisnost retencijskih časov citokroma od temperature pri konstantnem tlaku.

Slika 19: Van't Hoffov graf za citokrom pri konstantnem tlaku.

Odvisnost ΔG od temperature za citokrom v obeh mobilnih fazah prikazuje slika 20. Za citokrom v ACN je odvisnost ΔG od temperature konveksna, oblika grafa pa bi lahko kazala na minimum pri temperaturah, nižjih od preiskovanih (T < 30 °C). Vrednosti ΔG so negativne, kar kaže, da je adsorpcija v ACN termodinamsko ugodna pri vseh temperaturah. Za citokrom v MeOH vrednosti ΔG s temperaturo linearno naraščajo. Pri nižjih temperaturah so negativne, vrednost pri 60 °C pa je pozitivna, kar kaže na

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

20 30 40 50 60 70 80 90

tR[min]

T [°C]

ACN MeOH

-2 -1 0 1 2 3 4 5

0.0028 0.0029 0.0030 0.0031 0.0032 0.0033 0.0034

lnk

1/T [1/K]

ACN MeOH