UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Sendy ZUPANC
VREDNOTENJE UČINKOVITOSTI EKSTRAKCIJE PIGMENTOV IZ LIOFILIZIRANIH ŽIVIL
RASTLINSKEGA IZVORA Z BIOOBNOVLJIVIM TOPILOM CYRENE
TMMAGISTRSKO DELO
Magistrski študij – 2. stopnja Prehrana
Ljubljana, 2022
UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ODDELEK ZA ŽIVILSTVO
Sendy ZUPANC
VREDNOTENJE UČINKOVITOSTI EKSTRAKCIJE PIGMENTOV IZ LIOFILIZIRANIH ŽIVIL RASTLINSKEGA IZVORA Z
BIOOBNOVLJIVIM TOPILOM CYRENE
TMMAGISTRSKO DELO
Magistrski študij – 2. stopnja Prehrana
EVALUATION OF THE EFFICIENCY OF EXTRACTION OF PIGMENTS FROM LYOPHILIZED FOODS OF PLANT ORIGIN
WITH THE BIO-RENEWABLE SOLVENT CYRENE
TMM. SC. THESIS
Master Study Programmes: Field Nutrition
Ljubljana, 2022
Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Prehrana. Delo je bilo opravljeno na Katedri za biokemijo in kemijo živil Oddelka za živilstvo na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani.
Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorja magistrskega dela imenovala prof. dr. Blaža Cigića, za somentorja izr. prof. dr. Tomaža Polaka in za recenzenta prof. dr. Rajka Vidriha.
Mentor: prof. dr. Blaž CIGIĆ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Somentor: izr. prof. dr. Tomaž POLAK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Recenzent: prof. dr. Rajko VIDRIH
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik:
Član:
Član:
Član:
Datum zagovora:
Sendy Zupanc
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Du2
DK UDK 547.97:66.061.18:633.86(043)=163.6
KG rastlinski pigmenti, ekstrakcija, topilo, CyreneTM, UV-VIS spektrofotometrija, DPPH, ABTS, Folin-Ciocalteu, antioksidanti
AV ZUPANC, Sendy, dipl. inž. živ. in preh.
SA CIGIĆ, Blaž (mentor), POLAK, Tomaž (somentor), VIDRIH, Rajko (recenzent) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2022
IN VREDNOTENJE UČINKOVITOSTI EKSTRAKCIJE PIGMENTOV IZ
LIOFILIZIRANIH ŽIVIL RASTLINSKEGA IZVORA Z BIOOBNOVLJIVIM TOPILOM CYRENETM
TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja Prehrana) OP X, 48 str., 29 sl., 10 pregl., 69 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Magistrska naloga obravnava karakterizacijo bioobnovljivega topila CyreneTM in njegovo uporabo za namen ekstrakcije pigmentov iz liofiliziranih vzorcev rastlinskega izvora. Ugotovili smo, da CyreneTM močno absorbira v UV delu spektra, medtem ko je absorbanca nad 430 nm zanemarljiva. Vodne raztopine CyreneTM so kisle (pH = 3,8). CyreneTM je reaktiven v testih za določevanje antioksidativnega potenciala. V Folin Ciocalteu testu smo določili za CyreneTM 132 TE/L 100 % CyreneTM, v ABTS testu 20,7 TE/L 100 % CyreneTM in v DPPH testu 13,2 TE/L 100
% CyreneTM. Z vodnimi raztopinami CyreneTM smo učinkovito ekstrahirali pigmente iz liofilizirane pšenične trave, koruznega glutena, korenčka, rdeče pese, aronije in borovnice. Nepolarne karotene iz korenčka smo najučinkoviteje ekstrahirali s 100 % CyreneTM, polarnejše ksantofile iz skupine karotenoidov, s katerimi je bogat koruzni gluten, pa z 80 % CyreneTM. Klorofili iz pšenične trave so se najbolj učinkovito ekstrahirali s 95 % CyreneTM, medtem ko je bila ekstrakcija relativno polarnih antocianinov iz aronije in borovnice ter betalainov iz rdeče pese najučinkovitejša s 40 % do 60 % CyreneTM. Razmerje med liofilizatom in topilom v razponu od 1:10 do 1:100 je imelo relativno majhen vpliv na učikovitost ekstrakcije. Primerjava učinkovitosti ekstrakcije z vodnimi raztopinami CyreneTM in tradicionalno uporabljenimi topili je razkrila, da se betalaini najučinkoviteje ekstrahirajo z raztopino CyreneTM, medtem ko je ekstrakcija ostalih pigmentov slabša v primerjavi s klasičnimi topili.
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du2
DC UDC 547.97:66.061.18:633.86(043)=163.6
CX plant pigments, extraction, solvent, CyreneTM, UV-VIS spectroscopy, DPPH, ABTS, Folin-Ciocalteu, antioxidants
AU ZUPANC, Sendy
AA CIGIĆ, Blaž (supervisor), POLAK, Tomaž (co-advisor), VIDRIH, Rajko (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and Technology
PY 2022
T EVALUATION OF THE EFFICIENCY OF EXTRACTION OF PIGMENTS FROM LYOPHILIZED FOODS OF PLANT ORIGIN WITH THE BIO- RENEWABLE SOLVENT CYRENETM
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Field Nutrition) NO X, 48 p., 29 fig., 10 tab., 69 ref.
LA sl AL sl/en
AB The master's thesis aims to characterize the sustainable solvent CyreneTM and its application for the extraction of pigments from lyophilized samples of plant origin.
We found that CyreneTM strongly absorbs in the UV part of the spectrum, while is the absorbance above 430 nm negligible. CyreneTM aqueous solutions are acidic (pH
= 3.8). CyreneTM interfers in tests for the analysis of antioxidant potential. In the Folin Ciocalteu test, CyreneTM gives 132 TE/L 100 % CyreneTM, 20.7 TE/L 100 % CyreneTM in the ABTS test and 13.2 TE/L 100 % CyreneTM in the DPPH test.
Pigments from lyophilized wheat grass, corn gluten, carrot, beetroot, chokeberry and blueberry were effectively extracted with aqueous CyreneTM solutions. Nonpolar carotenes from carrot were the most efficiently extracted with 100 % CyreneTM, and more polar xanthophylls of the carotenoid group, from corn gluten, with 80 % CyreneTM. Chlorophylls from wheat grass were most efficiently extracted with 95%
CyreneTM, while extraction of relatively polar anthocyanins from chokeberry and blueberry, and betalaine from beetroot was the most effective with 40% to 60%
CyreneTM. The ratio of lyophilisate to solvent in the range of 1:10 to 1: 100 had a relatively small effect on the extraction efficiency. A comparison of the extraction efficiency with aqueous CyreneTM solutions and traditionally used solvents revealed that betalains are the most efficiently extracted with CyreneTM solution, while the extraction of other pigments is poorer as compared to conventional solvents.
KAZALO VSEBINE
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ... IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO SLIK ... VII KAZALO PREGLEDNIC ... IX OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ... X
1 UVOD ... 1
1.1 OPREDELITEV PROBLEMA ... 1
1.2 DELOVNE HIPOTEZE ... 1
1.3 NAMEN IN CILJ RAZISKAVE ... 2
2 PREGLED OBJAV ... 3
2.1 CYRENETM ... 3
2.2 EKSTRAKCIJA RASTLINSKIH PIGMENTOV ... 4
2.2.1 Karotenoidi ... 5
2.2.2 Klorofili ... 7
2.2.3 Antocianidini in antocianini ... 9
2.2.4 Betalaini ... 11
2.3 ANTIOKSIDATIVNI TESTI ... 13
3 MATERIAL IN METODE ... 15
3.1 MATERIAL ... 15
3.1.1 Topila ... 15
3.1.2 Vzorci rastlinskih živil ... 15
3.1.3 Ostale kemikalije ... 15
3.1.4 Aparature ... 16
3.1.5 Ostala laboratorijska oprema ... 16
3.2 METODE ... 16
3.2.1 Ekstrakcija rastlinskih pigmentov s CyreneTM – vpliv koncentracije topila ... 17
3.2.2 Ekstrakcija rastlinskih pigmentov s CyreneTM – vpliv razmerja med
volumnom topila in maso vzorca ... 17
3.2.3 Primerjava učinkovitosti ekstrakcije CyreneTM z etanolom/acetonom .. 18
3.2.4 Izračun koncentracije pigmentov po Beer-Lambertovem zakonu ... 18
3.2.5 Antioksidativni testi ... 18
3.2.5.1 DPPH metoda ... 18
3.2.5.2 ABTS metoda ... 19
3.2.5.3 Folin–Ciocalteu metoda ... 20
4 REZULTATI Z RAZPRAVO ... 22
4.1 SPEKTRALNE IN ANTIOKSIDATIVNE LASTNOSTI CYRENETM ... 22
4.1.1 Absorpcijski spekter CyreneTM v UV in vidnem delu spektra ... 22
4.1.2 Antioksidativne lastnosti CyreneTM ... 23
4.1.3 DPPH metoda ... 23
4.1.4 ABTS metoda ... 24
4.1.5 Folin–Ciocalteu metoda ... 25
4.2 EKSTRAKCIJA RASTLINSKIH PIGMENTOV S CYRENETM ... 26
4.2.1 Klorofili ... 26
4.2.2 Karotenoidi ... 27
4.2.3 Betalaini ... 31
4.2.4 Antocianidini in antocianini ... 32
4.2.5 Vpliv razmerja med maso vzorca in volumnom topila CyreneTM na izkoristek ekstrakcije ... 36
4.2.6 Relativna učinkovitost ekstrakcije s CyreneTM v primerjavi s standardnimi topili za ekstrakcijo ... 37
5 SKLEPI ... 40
6 POVZETEK ... 42
7 VIRI ... 44 ZAHVALA
KAZALO SLIK
Slika 1 Sinteza CyreneTM iz biomase/celuloze (Misefari, 2017). ... 3
Slika 2 Ravnotežje ketona/hidrata pri CyreneTM v vodni raztopini (Misefari, 2017)... 3
Slika 3 Strukturna formula zeaksantina (A), luteina (B) in β-karotena (C) (Mezzomo in Ferreira, 2016). ... 6
Slika 4 Absorpcijski spektri karotenoidov (Solovchenko, 2010). ... 7
Slika 5 Strukturna formula klorofila a (Scheer, 2006). ... 8
Slika 6 Absorpcijski spekter klorofila a in b (Pugliesi, 2008). ... 9
Slika 7 Tetrahidroksihalkon (Flamini in sod. 2013). ... 10
Slika 8 Absorpcijski spektri antocianinov (Qin in sod., 2010). ... 10
Slika 9 S kondenzacijo betalamične kisline (A) in ciklo-DOPA (B) nastane betanidin (C) (Rupnik, 2016) ... 11
Slika 10 Absorpcijski spekter betalainov v soku, vodi, raztopini metanola in raztopini etanola (Dumbrava in sod., 2012). ... 12
Slika 11 Strukturni formuli difenilpikrilhidrazila (DPPH●) (levo) in difenilpikrilhidrazina (DPPH-H) (desno) (Molyneux, 2004). ... 13
Slika 12 Umeritvena krivulja s Troloksom za DPPH metodo pri pH 5. ... 19
Slika 13 Umeritvena krivulja s Troloksom za ABTS metodo pri pH 5. ... 20
Slika 14 Umeritvena krivulja s Troloksom za Folin-Ciocalteu metodo. ... 21
Slika 15 Spekter CyreneTM posnet v UV delu spektra. ... 22
Slika 16 Spekter CyreneTM posnet v vidnem delu spektra (400 do 800 nm)... 23
Slika 17 Umeritvena krivulja s CyreneTM z acetatnim pufrom pH 5 za DPPH metodo. ... 24
Slika 18 Umeritvena krivulja s CyreneTM z acetatnim pufrom pH 5 za ABTS metodo. ... 24
Slika 19 Umeritvena krivulja s CyreneTM za Folin - Ciocalteu metodo. ... 25
Slika 20 Absorpcijski spektri pšenične trave v prahu pri različnih koncentracijah CyreneTM. ... 26
Slika 21 Absorpcijski spektri koruznega glutena v prahu pri različnih koncentracijah CyreneTM. ... 28
Slika 22 Absopcijski spektri ekstraktov koruznega zdroba v prahu pri različnih koncentracijah CyreneTM. ... 29
Slika 23 Absorpcijski spektri korenja v prahu pri različnih koncentracijah CyreneTM. ... 29
Slika 24 Vpliv dodatka kisline na absorbanco ekstrakta korenja v prahu pripravljenega s 60 ut. % CyreneTM ... 30 Slika 25 Absorpcijski spektri rdeče pese v prahu pri različnih koncentracijah CyreneTM. . 31 Slika 26 Absorpcijski spektri aronije v prahu pri različnih koncentracijah CyreneTM. ... 32 Slika 27 Primerjava absorbcijskih spektrov aronije v prahu z dodano HCl in brez. ... 33 Slika 28 Absorpcijski spektri borovnice v prahu pri različnih koncentracijah CyreneTM. .. 34 Slika 29 Primerjava absorpcijskih spektrov borovnice v prahu z dodano HCl in brez. ... 35
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica 1 Razmerja topila CyreneTM in vode. ... 17 Preglednica 2 Primerjava vrednosti AOP vrednosti za izbrane tekoče vzorce in CyreneTM . ... 26 Preglednica 3 Podatki o koncentraciji klorofilov, vsebnosti v liofilizatu in izkoristku ekstrakcije v vzorcu pšenične trave v prahu. ... 27 Preglednica 4 Podatki o koncentraciji karotenoidov, vsebnosti v liofilizatu in izkoristku ekstrakcije v vzorcu koruznega glutena v prahu. ... 28 Preglednica 5 Podatki o koncentraciji karotenoidov, vsebnosti v liofilizatu in izkoristku ekstrakcije v vzorcu korenja v prahu. ... 30 Preglednica 6 Podatki o koncentraciji betalainov, vsebnosti v liofilizatu in izkoristku ekstrakcije v vzorcu rdeče pese v prahu. ... 32 Preglednica 7 Podatki o koncentraciji antocianinov, vsebnosti v liofilizatu in izkoristku ekstrakcije v vzorcu aronije v prahu. ... 34 Preglednica 8 Podatki o koncentraciji antocianinov, vsebnosti v liofilizatu in izkoristku ekstrakcije v vzorcu borovnice v prahu. ... 35 Preglednica 9 Podatki o relativnem izkoristku ekstrakcije s topilom CyreneTM pri različnih razmerjih med maso vzorca in volumnom topila. ... 36 Preglednica 10 Relativna učinkovitost ekstrakcije rastlinskih pigmentov s topilom CyreneTM v primerjavi s standardnimi topili pri različnih razmerjih liofilizata in topila. ... 38
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI A520 Absorbanca pri valovni dolžini 520 nm
A734 Absorbanca pri valovni dolžini 734 nm A765 Absorbanca pri valovni dolžini 765 nm
ABTS 2,2'-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina AOP Antioksidativni potencial
CyreneTM Dihidrolevoglukozanon
DPPH 2,2-difenil-1-pikrihidrazil radikal
EFSA Evropska agencija za varno hrano (ang. European Food Safety Authority) FC Folin-Ciocalteu reagent
HPLC Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (ang. High Performance Liquid Chromatography)
TE Ekvivalent Troloksa (ang. Trolox equivalent)
Troloks 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilna kislina Ut. % Masni delež v odstotkih
UV-VIS Ultravijolična in vidna spektrofotometrija
1 UVOD
Za ekstrakcijo bioaktivnih snovi iz različnih rastlinskih materialov se glede na njihovo polarnost uporablja različna organska topila kot so alkoholi, estri, halogenirani alkani in alkani. Pogosto so uporabljena topila toksična ali ekološko sporna. Zato obstaja vse večji interes za uporabo bioobnovljivih topil z manj toksičnimi učinki, ki so del tako imenovanega krožnega gospodarstva.
S pigmenti so bogata predvsem živila rastlinskega izvora. Pigmenti značilni za rastline so strukturno raznolika skupina spojin, a za vse je značilna prisotnost večjega števila konjugiranih dvojnih vezi ali aromatskih obročev, ki prispevajo k absorbanci v vidnem delu spektra. Najmanj polarni pigmenti so karotenoidi iz skupine karotenov, ki so zgrajeni samo iz atomov ogljika in vodika. Nekoliko večjo polarnost imajo ksantofili, ki se od karotenov razlikujejo v tem, da imajo v strukturi še najmanj en kisikov atom, največkrat v obliki OH skupine, ki prispeva k večji polarnosti. Klorofili so spojine, za katere je značilen večji obroč, ki ga tvorijo štiri pirolovi obroči na sredini katerega je koordiniran magnezijev ion. Kljub relativno velikemu deležu elektronegativnih atomov kisika in dušika v strukturi, so tudi klorofili relativno nepolarne spojine, k čemur prispeva predvsem fitolni rep, s katerim so ugnezdeni v membrano. Med bolj polarne pigmente, ki so topni tudi v vodi, uvrščamo antocianidine iz skupine flavonoidov, kjer k razlikam v barvi prispevajo substituenti na aromatskih obročih, k povečani topnosti pa kovalentno vezani sladkorji. V nekaterih kulturno pomembnih rastlinah kot so rdeča pesa in amarant pa so prisotni pigmenti imenovani betalaini, ki jih podobno kot antocianidine uvrščamo med bolj polarne, vodotopne pigmente.
1.1 OPREDELITEV PROBLEMA
Spojina, imenovana dihidrolevoglukozenon (CyreneTM), ki se jo sintetizira v dveh korakih iz celuloze, je bioobnovljivo topilo. Proizvodnja topila se v zadnjih letih močno povečuje in po trenutnih ocenah obstaja tržni potencial za letno proizvodnjo v obsegu enega milijona ton. Topilo se z redkimi izjemami še ne uporablja na področju prehrane in živilstva, prav tako v dostopni literaturi ni podatkov o uporabnosti tega topila za ekstrakcijo pigmentov iz rastlinskih materialov.
Ker se pigmenti razlikujejo v polarnosti, pričakujemo, da bomo z različnimi razmerji relativno nepolarnega CyreneTM in vode lahko ekstrahirali posamezne pigmente in določili izkoristke ekstrakcije. Ker imajo nekateri pigmenti tudi antioksidativni učinek, je potrebno preveriti, ali CyreneTM reagira v testih za določevanje vsebnosti antioksidantov.
1.2 DELOVNE HIPOTEZE
Tekom raziskave smo postavili naslednje hipoteze:
Delež vode v mešanici s CyreneTM bo selektivno vplival na izkoristek ekstrakcije pigmentov z različno polarnostjo.
Z uporabo različnih mešanic CyreneTM in vode bomo lahko selektivno ekstrahirali ksantofile in karotene iz liofiliziranih živil.
CyreneTM ne reagira v DPPH, ABTS in Folin-Ciocalteau testih.
1.3 NAMEN IN CILJ RAZISKAVE
Namen in cilj magistrske naloge je bil vezan na uporabo CyreneTM za ekstrakcijo karotenoidov iz liofiliziranega koruznega glutena in korenja, klorofilov iz liofilizirane pšenične trave, antocianinov iz liofilizirane aronije in betalainov iz liofilizirane rdeče pese.
Učinkovitost ekstrakcije smo vrednotili spektrofotometrično z merjenjem absorbance v vidnem in UV delu spektra, saj omenjeni pigmenti absorbirajo pri specifičnih valovnih dolžinah. Za ekstrakcijo smo uporabili različne mešanice CyreneTM in vode ter različna razmerja med topilom in liofilizati. Primerjali smo tudi učinkovitost ekstrakcije s CyreneTM v primerjavi s topili, ki se rutinsko uporabljajo za ekstrakcijo zgoraj omenjenih pigmentov.
Ovrednotili smo tudi reaktivnost CyreneTM v antioksidativnih testih ter na ta način uporabnost topila za ekstrakcijo antioksidantov.
2 PREGLED OBJAV 2.1 CYRENETM
Dihidrolevoglukozanon (CyreneTM) je relativno novo aprotično topilo, ki temelji na biološki proizvodnji osnovne surovine. Njegova proizvodnja iz biomase je dokaj preprosta, saj je možna v dveh korakih. Najprej se celulozo v biomasi spremeni v levoglukozanon pri povišani temperaturi in ob prisotnosti kisline kot katalizatorja, nato se hidrogenira alifatsko dvojno vez ob prisotnosti zadostne količine paladija (Pd) kot katalizatorja, kar ima za rezultat nastanek dihidrolevoglukozanona, znanega kot CyreneTM. Proces sinteze je prikazan na sliki 1 (Misefari, 2017).
Slika 1 Sinteza CyreneTM iz biomase/celuloze (Misefari, 2017).
Dihidrolevoglukozanon je bistra tekočina, bledo rumene barve in se meša tako z vodo kot tudi z mnogimi organskimi topili. Vrelišče ima pri 116 °C, njegovo tališče je pri temperaturi -20 °C. Testi akutne toksičnosti so se izvajali na podganah, ki so jim spojino aplicirali oralno.
Ovrednotili so LD50, ki znaša 2000 mg/kg. Ostali testi občutljivosti so pokazali, da je dražilen za oči (in vitro), dermalni testi na zajcih pa niso pokazali preobčutljivosti ob stiku s kožo (Circa, 2018).
CyreneTM vsebuje karbonilno funkcionalno skupino, zato ob stiku z vodo tvori hidrat (geminalni diol), ki je prevladujoča oblika v vodnih raztopinah. Pri večini ketonov drugače velja, da je ravnotežje pomaknjeno v smer nastanka ketona, medtem ko je pri aldehidih pomaknjeno v smer nastanka geminalnega diola. Do premika ravnotežja v smer nastanka ketonov pride zaradi stabilizacije karbonilne skupine z metilno skupino, ki je donor elektronov in delno stabilizira pozitivni naboj ogljika v karbonilni skupini. Kljub temu je pri cikličnih ketonih, med katere spada CyreneTM, situacija drugačna, saj tudi na primer ciklopropanon v vodni raztopini obstaja samo kot geminalni diol. Izolacija geminalnega diola je pogostokrat problematična, saj ima odstranjevanje vode kot posledico ponoven nastanek ketona (Misefari, 2017).
Slika 2 Ravnotežje ketona/hidrata pri CyreneTM v vodni raztopini (Misefari, 2017).
Celuloza
Levoglukozanon
Dodatek vode k CyreneTM prispeva tudi k spremembi gostote in viskoznosti. Misefari je ugotovil, da dodatek vode poveča gostoto Cyrene iz 1,2517 g/mL (100 % CyreneTM) na 1,2672 g/mL (80 % CyreneTM), maksimum pa doseže pri približno 70 ut. % in znaša 1,304 g/mL. V nasprotju z gostoto, se viskoznost znatno spreminja ob dodatku vode in ima maksimum v enakem območju kot je maksimum gostote. To je tudi območje, kjer so prisotne približno enake količine CyreneTM kot tudi njegovega geminalnega diola. Dodajanje vode do 45-50 ut. % CyreneTM in tvorba geminalnega diola ima kot rezultat večjo polarnost raztopine, s tem pa širše območje uporabe topila in aplikacijo v različnih industrijah (Misefari, 2017).
To lastnost smo nameravali izkoristiti tudi pri ekstrakciji različnih vrst rastlinskih pigmentov. Predvidevali smo, da bomo bolj nepolarne pigmente kot so karotenoidi in klorofili ekstrahirali z raztopinami, z višjim ut. % CyreneTM, medtem ko bo ekstrakcija antocianidinov in betalainov bolj učinkovita z vodnimi raztopinami z nižjim ut. % CyreneTM. Kljub relativno kratkemu času od kar je CyreneTM komercialno dostopen, so ga že učinkovito vključili v številne panoge, kot so farmacevtska industrija, sintetična ter polimerna kemija (Meng in sod., 2020). Z oksidacijo dihidrolevoglukozanona s perocetno kislino in ocetno se npr. tvori 5-hidroksimetildihidro furanon, ki je prekurzor glavne učinkovine zdravil za zdravljenje HIV-a, dideoksicitidina (Koseki in sod., 1992). Dvo-stopenjska hidrogenacija CyreneTM ob prisotnosti kovinskih katalizatorjev rezultira v tvorbi 1,6-heksandiola, ki je prekurzor za proizvodnjo poliestra in poliuretana (Allgeier in sod., 2014).
CyreneTM je pritegnil veliko pozornosti, tudi zaradi možnosti zamenjave topil pridobljenih iz fosilnih goriv. Aprotična topila, kot je tudi CyreneTM, se uporabljajo za ekstrakcijo in ločevanje aromatskih in alifatskih spojin ter karboksilnih kislin. Splošno mnenje je, da ima CyreneTM zagotovo široko območje aplikacij v različne sisteme, vendar bi se moralo na tem področju opraviti še več raziskav. Tudi veleprodajna cena CyreneTM je v območju ostalih tradicionalnih topil, saj naj bi bila cena 1 kg CyreneTM v območju 2 EUR (Brouwer in Schuur, 2020).
Možnost uporabe za ekstrakcijo flavonoidov so opisali Milescu in sod. v članku, kjer so iz odpadnih produktov predelave živil ekstrahirali rutin in hesperidin, ki se nahajata v citrusih in listih črnega čaja. Za ekstrakcijo flavonoidov se največkrat uporabljata metanol in etanol.
Izkazalo se je, da je za ekstrakcijo rutina in hesperidina do 3-krat bolj učinkovita 70 % vodna raztopina CyreneTM v primerjavi z enako koncentracijo vodne raztopine etanola. Prav tako je zvišanje temperature CyreneTM (do 65 °C) povečalo izkoristek ekstrakcije do 91 % (Milescu in sod., 2020). Za namen trajnostnega krožnega gospodarstva, je potrebno zmanjšati količino uporabljenih topil in poiskati manj škodljivo, bio-osnovano topilo.
2.2 EKSTRAKCIJA RASTLINSKIH PIGMENTOV
Pigmenti v rastlinah igrajo pomembno vlogo pri metabolizmu rastlin. Mnogi pigmenti so tudi bioaktivne spojine, pomembne v naši prehrani, hkrati pa, zaradi obarvanosti, pritegnejo našo pozornost in vplivajo na našo percepcijo določenega živila. Glavne skupine rastlinskih
pigmentov sestavljajo karotenoidi, antocianini, betalaini in klorofili. Klorofili in karotenoidi so ključnega pomena v procesu fotosinteze in so locirani v plastidih. Antocianini so v odvisnosti od strukture in pH v rdečih ali modrih odtenkih, nahajajo se v citoplazmi in plastidih. Pojavljajo se tako v cvetovih kot v sadežih rastlin in služijo za privabljanje opraševalcev in živali, da zaužijejo plodove, so antioksidanti in predstavljajo zaščito rastlin pred UV svetlobo. Betacianini, ki so rdeče-vijolične barve, in betaksantini, ki so rumene barve, se nahajajo v citoplazmi ter se v rastlinah pojavljajo neodvisno od antocianinov (Simon, 1996).
2.2.1 Karotenoidi
Karotenoidi so skupina pigmentov, ki so prisotni v mnogih obarvanih vrstah sadja in zelenjave ter so pogosti povsod v naravi, sintetizirajo pa jih tako rastline in alge kot tudi nekatere vrste bakterij. V naravi se pojavljajo kot karoteni, katerih najbolj znan predstavnik je β-karoten, ter ksantofili, ki imajo v svoji strukturi najmanj en kisikov atom, med katere uvrščamo lutein, zeaksantin, neoksantin in violaksantin. Večina karotenoidov je tetraterpenoidov, pri čemer je 8 enot izoprenoidov povezanih tako, da tvorijo linearno in simetrično molekulo. Nekateri karotenoidi imajo v svoji strukturi dva obroča, ki sta lahko kemijsko modificirana (oksidacija, hidrogeniranje). Za karotenoide je značilen sistem konjugiranih dvojnih vezi, kar ključno prispeva k absorbanci molekul v vidnem delu spektra.
Zaradi dvojnih vezi, so karotenoidi reaktivni v reakcijah izomerizacije ali oksidacije (Mezzomo in Ferreira, 2016).
Različne vrste sadja in zelenjave vsebujejo od 40 do 50 različnih karotenoidov, ki so posledično vključeni v prehrano, nekateri od njih imajo pozitivne učinke na zdravje ljudi.
Karotenoide v prehrani lahko delimo na karotenoide, iz katerih se lahko sintetizira vitamin A (provitamin A) in tiste, iz katerih se v našem organizmu ne morejo sintetizirati molekule z vitaminskim učinkom. Za človekovo zdravje so pomembni tako prekurzorji vitamina A kot tudi nekateri drugi karotenoidi, za katere je bilo ugotovljeno, da imajo pomembno funkcijo pri delovanju imunskega sistema, rasti in razvoju (Higdon in sod., 2016).
Do sedaj so ugotovili, da imajo nekateri karotenoidi pozitiven vpliv na kardiovaskularno in nevrokognitivno zdravje ter zdravje oči, prav tako zmanjšujejo tveganje za nastanek raka.
Na biološko učinkovitost vpliva njihova koncentracija, stopnja absorpcije iz hrane ter sinergističen učinek med njimi. Največkrat so v raziskavah s pozitivnimi učinki povezali molekule likopena, luteina, zeaksantina in β-karotena. V pogosto zaužiti hrani v Koreji so določili tako skupno količino karotenoidov kot tudi količino posameznih spojin. Med prvih dvajset rastlinskih živil z visoko vsebnostjo luteina so se uvrstili listi rdeče paprike, navadni pelin, peteršilj, špinača, zelje, mlada čebula ter blitva. Vsa našteta živila, z izjemo zelja, so se pojavila tudi na seznamu dvajsetih rastlinskih živil z visoko vsebnostjo β-karotena, k njim pa lahko dodamo še korenje in rdečo redkev (Gun-Ae Yoon in sod., 2012).
Slika 3 Strukturna formula zeaksantina (A), luteina (B) in β-karotena (C) (Mezzomo in Ferreira, 2016).
Za ekstrakcijo karotenoidov se uporabljajo rastlinska olja in organska topila, vendar imajo nekatera topila, ki se uporabljajo za ekstrakcijo tudi negativne učinke na človekovo zdravje ter okolje. Karotenoidi so občutljivi na encimsko in neencimsko oksidacijo, ki je odvisna od strukture molekule, prisotnosti kisika, encimov, kovin, prooksidantov, antioksidantov, temperature in izpostavljenosti svetlobi. Dejavniki, kot so povišana temperatura, svetloba in nizek pH lahko vodijo do cis/trans izomerizacije. Posledica izomerizacije je izguba vitaminskega učinka, medtem ko je vpliv izomerizacije na barvo in antioksidativne lastnosti manjši. Do izomerizacije prihaja pri konvencionalnih metodah ekstrakcije z organskimi topili, saj se uporabljajo visoke temperature, ki velikokrat vodijo do izgube deleža pigmentov, hkrati pa lahko končni izdelek vsebuje sledove topila (Mezzomo in Ferreira, 2016).
Za ekstrakcijo karotenoidov so uporabili tudi mešanico metanola in tetrahidrofurana v razmerju 20/80 (v/v). Ekstrakcija je potekala pri 40 °C, 5 minut in tlaku 103 bare. Ekstrakte so nato prečistili s petroletrom in jih pripravili za HPLC analizo, kjer so jih identificirali na osnovi primerjave s komercialno dostopnimi standardi. Dobljenim ekstraktom so izmerili absorpcijske spektre na UV-VIS spektrofotometru in določili absorpcijske maksimume (Zaghoudi in sod., 2017). Absorpcijski maksimumi β-karotena ekstrahiranega iz korenja v heksanu so pri 442, 467 in 500 nm, njegova najvišja izmerjena absorbanca je pri 467 nm (Ullah in sod., 2018).
(C)
Slika 4 Absorpcijski spektri karotenoidov (Solovchenko, 2010).
V turški raziskavi so analizirali vsebnost karotenoidov v različnih sortah korenja. Največ so določili β-karotena, katerega vsebnost je bila v območju 41,60 - 71,62 mg/kg sveže snovi, sledil mu je α-karoten s 13,44 - 30,11 mg/kg sveže snovi ter lutein, katerega vsebnost je znašala 0,02 - 1,44 mg/kg sveže snovi (Bozalan in Karadeniz, 2011). Vsebnost luteina, ki ga, zaradi dveh hidroksilnih spojin, uvrščamo med ksantofile in je polarnejši od karotenov, je v korenju relativno majhna. Koruza je precej boljši vir in določena vsebnost luteina v izolatu koruznega glutena (koruzni gluten dejansko ne vsebuje glutena, ampak netopne zeine in gluteline) je 166 mg/kg (Wang in sod., 2019).
2.2.2 Klorofili
Klorofili so pigmenti, ki so vključeni v pretvorbo sončne energije v procesu fotosinteze in se nahajajo v kloroplastih v vseh delih rastline, v katerih fotosinteza poteka. Klorofili so vključeni v tilakoidno membrano, vendar jih lahko ekstrahiramo z organskimi topili.
Kemično gledano so klorofili sestavljeni iz porfirinskega obroča s keliranim magnezijevim atomom v sredini ter nepolarno fitolno verigo, s katero se klorofil veže z nepolarnimi deli proteinov, ki so integrirani v membrano (Sudhakar in sod., 2016). Klorofili oz. klorini so reducirani derivati porfirinov, katerih najpomembnejši predstavnik je hemoglobin. Tako za porfirine kot tudi klorine je enak prekurzor uroporfirinogen III. Klorinov je več vrst, vendar je v naravi najpogostejši klorofil a (Scheer, 2006).
β-karoten- lutein zeaksantin violaksantin neoksantin
karoten
Valovna dolžina
Slika 5 Strukturna formula klorofila a (Scheer, 2006).
Že v preteklosti so povezovali uživanje zelene zelenjave s pozitivnim vplivom na naše zdravje. Študije kažejo na to, da bi derivati klorofila lahko imeli vpliv pri zmanjševanju tveganja za nastanek raka, saj imajo antigenotoksične, antimutagene, antioksidativne ter protivnetne učinke, njihov neposredni učinek na zaviranje raka pa je indukcija apoptoze, ki je v kancerogenezi zmanjšana ali je ni. In vitro študije kažejo na pozitiven vpliv uživanja klorofilov in njihovih derivatov pri zdravljenju raka, kar so potrdile tudi nekatere in vivo študije na preprostih organizmih, živalih in ljudeh. Med druge pozitivne vplive na zdravje spada pomoč pri zdravljenju razjed na želodcu, pospešeno celjenje ran in opeklin, pomoč pri zdravljenju različnih vrst infekcij, zmanjševanje nastanka aken ter blaženje neprijetnega telesnega vonja. Čeprav se klorofile lahko uporablja v živilsko-prehranski industriji in medicini, je potrebno pred uporabo v industriji dobro preučiti njihovo stabilnost, sestavo in čistost. Trenutno se klorofili uporabljajo kot naravna barvila za živila pod oznako E140i ter E140ii, za katero Evropska agencija za varno hrano (EFSA, ang. European Food Safety Authority) trenutno ne more podati ustrezne ocene varnosti, predvsem zaradi nejasne rabe strokovnih izrazov za klorofilin s strani znanstvenikov in industrije za barvila za hrano, ter slabo definirane sestave aditivov E140i in E140ii. Na drugi strani se klorofili z bakrom kot centralnim ionom, ki v živilski industriji nosijo oznako E141, uporabljajo od leta 1926 in njihova raba je odobrena tako v Evropski Uniji kot tudi v Združenih Državah Amerike.
Klorofilne pigmente največkrat ekstrahirajo iz kalčkov lucerne, ržene ali pšenične trave.
Barvila se uporabljajo za obarvanje testenin, konzervirane zelenjave, gorčice, marmelad in džemov, žitaric, sladoledov, njihova uporaba pa ni omejena samo na živilsko industrijo, saj ga uporabljajo za obarvanje zobnih past, kozmetičnih izdelkov in zdravil (Solymosi in Mysliwa-Kurdziel, 2016).
Za ekstrakcijo klorofilov se največkrat uporablja metanol, aceton in heksan, vendar se, zaradi teženj po uporabi bolj ekoloških topil, vse bolj poslužujejo vodnih raztopin etanola. Z optimizacijo procesa dosežemo večjo učinkovitost ekstrakcije kot s heksanom (Derrien in sod., 2017). Koncentracijo klorofila v raztopini določimo tako, da po ekstrakciji z organskim topilom pomerimo absorbanco v vidnem delu spektra. Absorbcijski maksimumi in molarni absorpcijski koeficienti klorofilov se razlikujejo (slika 6). Manjši vpliv na absorbanco ima tudi topilo, v katerem se klorofili nahajajo. Absorpcijski maksimumi klorofila a, izmerjeni v dietil etru, so npr. 430 ter 665 nm (Gross, 1991).
Slika 6 Absorpcijski spekter klorofila a in b (Pugliesi, 2008).
Pšenična trava je rastlina bogata s klorofili, vsebuje pa tudi številna druga hranila in pigmente kot so esencialne aminokisline, prehransko vlaknino, β-karoten, vitamin E, kalij, cink, baker, mangan, železo in fosfor (Mujoriya, 2011). Thakur in sod. so analizirali sestavo liofilizirane pšenične trave ter njeno vsebnost mineralov in vitaminov. Analize so pokazale, da liofilizirana pšenična trava vsebuje 7,46 mg/g klorofila ter 9,3 mg/100 g vitamina C, ki je antioksidant, kar lahko pomembno vpliva na stabilizacijo klorofilov med sušenjem ali liofilizacijo (Thakur in sod., 2019).
2.2.3 Antocianidini in antocianini
Antocianidini so pomembna skupina rastlinskih pigmentov in spadajo v skupino kemičnih spojin imenovanih flavonoidi. Do sedaj so odkrili že več kot 500 različnih vrst antocianinov, rastlinam, sadežem in cvetju pa dajejo širok nabor barv v območju od rožnate, škrlatne, vijolične do modre. Poleg njihove antioksidativne učinkovitosti delujejo tudi protivnetno, protimikrobno in antikancerogeno (Sudhakar in sod., 2016). Visok antioksidativni potencial so Boo in sod. dokazali z DPPH (2,2-difenil-1-pikrihidrazil) testom pri rdečem zelju, grozdni kožici in murvi. Našteta živila so imela tudi protimikrobno delovanje in sicer so pigmenti rdečega zelja na agarju najbolj inhibirali rast bakterije Escherichia coli, pigmenti grozdne kožice so najbolje inhibirali bakterije Escherichia coli, Bacillus subtilis in Vibrio paraheamolyticus, barvila v murvi pa so bila zelo učinkovita proti vsem testiranim mikrobom (Escherichia coli, Bacillus subtilis, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella typhymurium, Proteus mirabilis, Micrococcus luteus) (Boo in sod., 2012).
Antocianini so metaboliti, ki nastanejo iz fenilalanina po fenilpropanoidni poti. Prekurzor za nastanek antocianinov in flavonoidov je tetrahidroksihalkon (slika 7), ki nastane iz molekule p-kumaril koencima A in treh molekul malonil koencima A (Flamini in sod., 2013; Hozjan, 2017). V tej metabolni poti se sintetizirajo številne molekule, kot so flavanoni, flavan-3-oli, izoflavanoidi, proantocianidini in antocianidi. V citosolu iz antocianidinov z glikozilacijo določenih hidroksilnih skupin na obročnih sistemih nastanejo antocianini, ki se skladiščijo v vakuolah celic. Molekule antocianidinov se v rastlinah nahajajo predvsem v glikozilirani
Klorofil b
Klorofil a
Valovna dolžina (nm) A
b s o r b a n c a
obliki. Posledica glikozilacije je večja polarnost molekul, kakor tudi večja kemijska stabilnost, saj se hidroksilne skupine, na katere so vezani sladkorji, ne morejo oksidirati.
Slika 7 Tetrahidroksihalkon (Flamini in sod., 2013).
Tako kot za ekstrakcijo nepolarnih pigmentov, kot so klorofili in karotenoidi, se tudi za ekstrakcijo polarnih pigmentov kot so antocianini uporablja vodna raztopina etanola, vendar z različnim razmerjem med vodo in etanolom. Za optimizacijo tega procesa so ugotavljali vpliv temperature na ekstrakcijo, vpliv razmerja med topilom in suho snovjo ter koncentracijo raztopine etanola. Poskusi so pokazali, da ima največji vpliv na ekstrakcijo razmerje med topilom in suho snovjo, vendar pri koncentracijah etanolne raztopine 65 % in več nima več vpliva na izkoristek (Cacace in Mazza, 2003). Na osnovi izmerjene absorbance ekstrakta in podatka o molarnem absorpcijskem koeficientu pri absorpcijskem maksimumu lahko izračunamo koncentracijo antocianinov. Absorpcijski maksimumi (slika 8) so v območju od 450 do 550 nm (Qin in sod., 2010).
Slika 8 Absorpcijski spektri antocianinov (Qin in sod., 2010).
V okviru študije, kjer so analizirali vsebnost bioaktivnih komponent v borovnicah, so določali tudi antocianine. Povprečna vsebnost vseh antocianinov je znašala 199 mg/100 g, od katerih je bilo največ malvidina 79,4 mg/100 g (Stevenson in Scalzo, 2012). Raziskovalci z univerze v Osijeku so primerjali vsebnost polifenolov in antioksidativno delovanje aronije z drugim jagodičevjem. Njihova raziskava je pokazala, da je antocianinov v aroniji 4341 mg/100 g, kar je bila višja vsebnost v primerjavi z jagodami, robidami in malinami (Jakobek in sod., 2007).
A b s o r b a n c a
Valovna dolžina (nm)
2.2.4 Betalaini
Betalaini so vodotopni pigmenti, ki jih najdemo skoraj izključno pri rastlinah iz reda klinčkovcev (Caryophyllales) ter pri glivah reda Basidiomycetes. Izraz betalain se je začel uporabljati kot opis za omenjene pigmente, ki nastanejo iz betalamične kisline (slika 9).
Betalamična kislina je metabolit, ki se sintetizira iz molekule tirozina. Spadajo med pomembne specializirane pigmente, saj so antioksidanti in zvišajo toleranco na različne stresne pogoje. Nahajajo se v podobnih organelih in imajo podobno vlogo v rastlini kot antocianini, vendar rastline sintetizirajo bodisi betalaine bodisi antocianidine.
Najpomembnejši sprožilni dejavnik biosinteze pigmentov je svetloba, k sintezi pa prispevata tudi temperatura in delovanje fitohormonov (Tossi in sod., 2021). Boo in sod. so z DPPH testom dokazovali antioksidativne sposobnosti rdeče pese v prahu in njeno protimikrobno učinkovitost. V primerjavi z antocianidini, so betalaini bili manj protimikrobno učinkoviti in so inhibirali predvsem rast bakterije vrste Bacillus subtilis. Inhibicija rasti je bila nekoliko slabša za bakterije vrste Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus in Micrococcus luteus, medtem ko pri bakterijah vrste Salmonella typhymurium in Proteus mirabilis inhibicije ni bilo (Boo in sod., 2012).
Vijolično obarvani pigmenti spadajo med betacianine, betaksantini pa so rumeno-oranžno obarvani, na njihov odtenek vpliva predvsem kemijska struktura molekule betalaina. V svoji strukturni formuli vedno vsebujejo vsaj en heterocikličen atom dušika, vendar ne spadajo med alkaloide, saj imajo kislinsko naravo, zaradi vezanih karboksilnih skupin. Molekule betalainov so sestavljene iz ostanka betalamične kisline in molekule, ki je nanjo vezana.
Glede na vrsto molekule, ki se veže z ostankom betalamične kisline, se betalainske molekule razlikujejo med seboj (Böhm in Rink, 1988). Na sliki 9 so prikazani prekurzorji in struktura betanidina, ki je kvantiativno najbolj pomemben betalain in se tudi uporablja kot aditiv v živilih (E162).
Slika 9 S kondenzacijo betalamične kisline (A) in ciklo-DOPA (B) nastane betanidin (C) (Esatbeyoglu in sod., 2015)
Ekstrakcije antocianinskih in betalainskih pigmentov imajo skupno točko, saj zaradi njihove polarne narave pigmente najučinkoviteje ekstrahiramo s polarnimi topili, kot je vodna raztopina etanola. Problem uporabe betalainskih pigmentov v živilski industriji je tudi v nizki stabilnosti teh spojin. Betalaine lahko ekstrahiramo z vodo, vendar je učinkovitost in končna koncentracija pigmentov v ekstraktu višja ob uporabi vodne raztopine etanola ali metanola. Delgado-Vargas in sod. so ugotovili, da uporaba 20-50 % raztopine etanola izboljša izkoristek ekstrakcije, včasih je potrebna aerobna fermentacija s kvasovko vrste Saccharomyces cerevisiae ali plesnijo vrste Aspergillus niger, da se izboljša izkoristek ekstrakcije (Delgado-Vargas in sod., 2000). Rdeča pesa vsebuje tako betaksantine (vulgaksantin I in II) ter betacianine (betanin in isobetanin), vendar so njihovi deleži v živilu različni. Betacianinski rdeče-vijolični pigmenti kot so betanin in betanidin absorbirajo pri 535 in 542 nm, rumeni betalainski pigmenti kot so vulgaksantin imajo absorpcijski maksimum pri 480 nm, betalamična kislina pa ima absorpcijski maksimum pri 424 nm (Dumbrava in sod., 2012). Sawicki in sod. so preučevali vpliv različnih sort in delov rdeče pese na vsebnost betalainov in so ugotovili, da je najvišja vsebnost betalainov v olupku rdeče pese in nižja v notranjosti sadeža. Povprečna vsebnost najbolj zastopanega barvila betanina je bila 2,62-5,32 mg/g suhe snovi (Sawicki in sod., 2016).
Slika 10 Absorpcijski spekter betalainov v soku, vodi, raztopini metanola in raztopini etanola (Dumbrava in sod., 2012).
Betalaini so za živilsko industrijo pomembni tako zaradi svojih antioksidativnih lastnosti, kot tudi barvnega razpona. Težavo pri njihovi uporabi predstavlja občutljivost ekstrahiranih pigmentov na pH, temperaturo, kisik, prisotnost kovinskih ionov, encimsko aktivnost in vodno aktivnost (aw). Betalaine, še posebej betanin, se ceni zaradi njihovih ugodnih učinkov na človekovo zdravje, saj podobno kot antocianini delujejo antioksidativno, protimikrobno in antikancerogeno. Tudi zaradi teh razlogov, bi lahko odpadke v živilski industriji, ki nastanejo pri predelavi živil z betalaini, uporabili v fitofarmaciji in v obliki prehranskih dopolnil (Zin in sod., 2020).
Sok Voda Metanol Etanol
Valovna dolžina (nm) A
b s o r b a n c a
2.3 ANTIOKSIDATIVNI TESTI
Različne klinične študije so pokazale, da obstaja obratno sorazmerje med zaužito količino sadja in zelenjave ter pojavnostjo različnih bolezni, kar so nekateri pripisovali tudi relativno veliki vsebnosti antioksidantov v teh živilih. Posledično se je pojavil interes za hitro vrednotenje antioksidativnega potenciala (AOP) v pogojih in vitro, saj bi lahko na osnovi tovrstnih meritev sklepali na potencialno ugodne učinke na zdravje. Za vrednotenje AOP je na voljo več metod, od katerih ima vsaka določene prednosti in pomanjkljivosti, saj ima tako izbor metode, topilo v katerem poteka reakcija in čas ob katerem vrednotimo velik učinek na izmerjen AOP (Huang in sod., 2005). Z določenim AOP naj bi ovrednotili sposobnost neke spojine, da pretvori proste radikale v manj reaktivne oblike ter tako zaščiti celico pred oksidativnim stresom. Za merjenje AOP se uporabljajo indirektne in direktne metode, pri slednjih gre za neposredno reakcijo med radikali in prisotnimi antioksidanti. Primer indirektne metode je ORAC (ang. Oxygen radical absorbance capacity) in temelji na razbarvanju tarčne molekule fluorescina, ki se ob prisotnosti radikalov razgradi in fluorescenca se zmanjša. Direktne metode so med največkrat uporabljenimi, od katerih so najbolj poznane reakcije s kromogenimi radikali kot sta 2,2-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6- sulfonska kislina (ABTS) ter 2,2-difenil-1-pikrihidrazil (DPPH) ali fosfo-molibdatom in volframatom v Folin-Ciocalteujevem (FC) reagentu. Vse tri metode temeljijo na ovrednotenju redoks reakcije, kjer se vrednoti količina elektronov, ki jih spojina lahko odda.
Hitrost reakcije je odvisna od strukture molekule antioksidanta, vrste topila in pH spojine (Grobin, 2016).
Metoda s prostim radikalom DPPH● je ena izmed najstarejših indirektnih metod za merjenje AOP. DPPH je stabilen prosti radikal, ki zaradi delokalizacije elektrona okoli molekule ne tvori dimera, delokalizacija pa povzroči močno vijolično obarvanje raztopine DPPH.
Absorpcijski maksimum je pri valovni dolžini 520 nm. Ko to raztopino reduciramo s snovjo, ki odda vodikov atom, se vijolična barva pretvori v bledo rumeno barvo, difenilpikrilhidrazil pa se spremeni v difenilpikrilhidrazin (Molyneux, 2004).
Slika 11 Strukturni formuli difenilpikrilhidrazila (DPPH●) (levo) in difenilpikrilhidrazina (DPPH-H) (desno) (Molyneux, 2004).
Tako kot metoda z DPPH radikalom je tudi metoda določanja AOP z ABTS radikalom indirektna in precej uporabljena, zaradi preprostosti in možnosti rutinske analize. Njena slabost je, da reagira z hidroksilnimi spojinami, ne glede na to, ali te prispevajo k
antioksidativni aktivnosti ali ne. ABTS radikal je stabilen in zeleno-modre barve, ki se po redukciji pretvori v spojino, ki ne absorbira v vidnem delu spektra (Roginsky in Lissi, 2005).
S Folin-Ciocalteujevim reagentom določamo vsebnost skupnih fenolnih spojin, pri čemer poteče redukcija molibdatov in volframatov, ki imajo absorpcijski maksimum pri 765 nm.
Ionizirana oblika fenolov (fenolatni ioni) so prisotni le pri višjem pH, zato reakcijo izvajamo v šibko bazičnem okolju. Vsebnost kromogena določimo spektrofotometrično z merjenjem pri 765 nm in s pomočjo umeritvene krivulje določimo vsebnost antioksidantov. Umeritveno krivuljo naredimo tako, da pripravimo različne koncentracije čiste fenolne spojine ali drugega antioksidanta, ki lahko reducira molibdate in volframate v FC reagentu. Slabost te metode, kakor tudi DPPH in ABTS metod, je nespecifičnost, saj lahko reagirajo tudi z vitaminom C, nekaterimi aminokislinami, sulfiti, ipd. (Hodnik, 2014).
V analizah leta 2018 so Abramovič in sod. ugotovili, da je najprimernejša spojina za vrednotenje AOP testov spojina Troloksa, saj je pri vseh treh metodah izmenjala enako število elektronov. Prav tako se je izkazalo, da so vse spojine z izjemo Troloksa izmenjale skoraj dvakratno količino elektronov pri FC testu kot pri testu DPPH (Abramovič in sod., 2018). V splošnem pa velja, da na osnovi AOP testov ne moremo sklepati na učinek in vivo, saj lahko testi in vitro pokažejo antioksidativno učinkovitost, vendar ni nujno da delujejo po tem mehanizmu tudi in vivo (Halliwell, 1995).
3 MATERIAL IN METODE
CyreneTM ima v odvisnosti od masnega deleža v vodnih raztopinah lahko bolj polarne ali bolj nepolarne karakteristike, zato smo to lastnost uporabili za ekstrahiranje rastlinskih pigmentov različne polarnosti iz vzorcev rastlinskih živil. Za testiranje ekstrakcije s CyreneTM smo izbrali širok nabor posušenih/liofiliziranih rastlinskih vzorcev, za katere je značilna relativno velika vsebnost posamezne skupine pigmentov v primerjavi z drugimi, kar načeloma omogoča kvantitativno vrednotenje vsebnosti posameznih pigmentov na osnovi izmerjenih absorbanc v vidnem delu spektra. Po ekstrakciji smo raztopine ustrezno razredčili in jim pomerili absorbance v območju 400 – 800 nm. Vse vzorce smo pred meritvijo ustrezno redčili v topilu, s katerim smo izvedli ekstrakcijo, da absorbanca v območju absorpcijskega maksimuma ni presegala 1,5.
3.1 MATERIAL 3.1.1 Topila
CyreneTM (Sigma-Aldrich),
Aceton (Sigma-Aldrich),
96 % etilni alkohol (KEFO).
3.1.2 Vzorci rastlinskih živil
Korenje v prahu (Super Garden, liofilizirano)
Pšenična trava v prahu (bonatura, sušeno)
Aronija v prahu (bonatura, sušeno)
Rdeča pesa v prahu (Trije kralji, sušeno)
Koruzni gluten v prahu
Borovnica v prahu (Super Garden, liofilizirano)
Špinača v prahu (Super Garden, liofilizirano)
Brokoli v prahu (Super Garden, liofiliozirano)
Pomarančne lupine v prahu (Spar NaturPur, sušeno)
Koruzni zdrob (Spar NaturPur) 3.1.3 Ostale kemikalije
Metanol (Supelco)
2,2'-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina – ABTS (Sigma-Aldrich)
2,2-difenil-1-pikrihidrazil – DPPH (Sigma-Aldrich)
Manganov oksid (Kemika)
6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilna kislina – Troloks (Sigma- Aldrich)
Folin – Ciocalteu fenolni reagent (Sigma-Aldrich)
mQ voda
250 mM acetatni pufer pH 5 3.1.4 Aparature
Analitska tehtnica (Mettler)
UV-VIS spektrofotometer (Cary 100 Bio)
Vrtinčnik
Centrifuga (Centric 200)
Centrifuga
Kroglični homogenizer MM400 (Retsch)
Inkubator (Rotator)
Ultrazvočna kopel
Zamrzovalna skrinja (-20 °C)
Zamrzovalna skrinja (-80 °C)
pH meter
3.1.5 Ostala laboratorijska oprema
Polipropilenske mikrocentrifugirke (2 mL, 1,5 mL)
Polipropilenske centrifugirke z rumenim pokrovom (15 mL, 50 mL)
Avtomatske pipete
UV kivete (1,5 mL)
Polistirenske kivete (1,5 mL)
Laboratorijska steklovina
Kapalke
Alu folija
Magnetno mešalo
Spatula
Plastična brizga (50 mL)
Najlonski filtri s premerom 13 mm (0,45 μm)
Stojalo za centrifugirke
Stojalo za mikrocentrifugirke 3.2 METODE
Pred začetkom eksperimentov smo vse rastlinske vzorce homogenizirali s krogličnim homogenizatorjem MM400. Vsak homogenizacijski tulec smo napolnili s 5 g posušenega/liofiliziranega rastlinskega vzorca in dodali 3 kroglice premera 15 mm.
Homogenizacija je potekala 1 minuto s frekvenco 30 s-1.
Pripravili smo mešanice topila CyreneTM z vodo v različnih deležih in sicer s 100 %, 95 %, 90 %, 80 %, 60 % in 40 % CyreneTM. Topilo smo mešali v razmerjih prikazanih v Preglednici 1.
Preglednica 1 Razmerja topila CyreneTM in vode.
Delež topila CyreneTM (%) Masa CyreneTM (g) Masa vode (g)
100 30 0
95 28,5 1,5
90 27 3
80 24 6
60 18 12
40 12 18
3.2.1 Ekstrakcija rastlinskih pigmentov s CyreneTM – vpliv koncentracije topila Pri ekstrakciji posameznega vzorca smo pripravili po tri 2 mililitrske polipropilenske mikrocentrifugirke za vsako koncentracijo topila (3 x 6 = 18 mikrocentrifugirk). V vsako mikrocentrifugirko smo zatehtali ≈ 80 mg rastlinskega vzorca. Maso smo zatehtali na 0,1 mg natančno v območju od 79,0 mg do 81,0 mg. Dejansko maso zatehte smo si zapisali.
Takoj po tehtanju smo centrifugirke zaprli, da se vsebina ni navlažila. V vsako centrifugirko smo odpipetirali po 1600 μL topila ustrezne koncentracije, tako je bilo razmerje suhe snovi vzorca (masa v mg) in topila (volumen v L) 1:20. Po dodatku topila smo centrifugirke premešali na vrtinčniku in jih dali za 1 minuto v ultrazvočno kopel. Po ultrazvočni kopeli smo centrifugirke prenesli v inkubator, kjer smo jih 30 min stresali pri temperaturi 25 °C.
Ekstrakcijo smo prekinili s centrifugiranjem na 12000 × g v centrifugi Centric 200. V 1,5 mL centrifugirke smo prenesli vsaj 1 mL supernatanta, ki smo ga ustrezno razredčili (če je bila absorbanca več kot 1,5) in nato pomerili absorbance v območju 400 – 800 nm. Razpon razredčitev je bil različen, saj so bili ekstrakti pšenične trave v prahu, rdeče pese v prahu, borovnice v prahu ter aronije v prahu bolj obarvani v primerjavi s koruznim glutenom v prahu in korenjem v prahu. Ekstrakte borovnice v prahu smo redčili s CyreneTM v razmerju 1:39, 1:19 in 1:9, prav tako smo v razmerju 1:19 in 1:9 redčili ekstrakte aronije v prahu.
Najvišje razmerje med ekstraktom in CyreneTM smo uporabili za redčenje ekstrakta rdeče pese in pšenične trave v prahu. Razpon redčenja je bil od 50-krat redčenega najintenzivneje obarvanega ekstrakta do 5-krat redčenega ekstrakta. Najintenzivneje obarvan ekstrakt korenja v prahu smo redčili 5-krat z ustrezno koncentracijo CyreneTM, nekatere smo lahko pomerili tudi nerazredčene. Podobno velja za ekstrakte koruznega glutena v prahu, kjer je bil najbolj obarvan ekstrakt redčen 5-krat z ustrezno koncentracijo CyreneTM.
3.2.2 Ekstrakcija rastlinskih pigmentov s CyreneTM – vpliv razmerja med volumnom topila in maso vzorca
Na osnovi rezultatov eksperimentov, ki so prikazani pod točko 3.2.1, smo za posamezen posušen rastlinski material določili topilo z deležem CyreneTM, v katerem je bila ekstrakcija najbolj učinkovita. To topilo smo uporabili za vrednotenje učinkovitosti ekstrakcije v
različnih razmerjih med posušenim rastlinskim materialom in topilom. Poleg razmerja 1:20 za vzorec in topilo, smo ekstrakcijo izvajali v razmerjih 1:10 (160 mg : 1600 μL), 1:50 (32 mg : 1600 μL) in 1:100 (16 mg : 1600 μL). Z vzorci smo postopali po enakem postopku kot pri ekstrakciji v poglavju 3.2.1. Tudi v tem primeru smo za vsako razmerje pri posameznem vzorcu pripravili tri paralelke (zatehte).
3.2.3 Primerjava učinkovitosti ekstrakcije CyreneTM z etanolom/acetonom
Učinkovitost ekstrakcije s topilom CyreneTM smo primerjali s topili, ki so se na osnovi znanstevnih publikacij izkazala kot učinkovita pri ekstrakciji posameznih pigmentov. Pri vzorcih bogatih z betalaini in antocianini smo uporabili 70 % raztopino etanola, pri vzorcih z velikim deležem luteina (relativno »polaren« karotenoid) in klorofilov smo uporabili 93 % raztopino etanola in za vzorce z velikim deležem β-karotena (nepolaren karotenoid) 100 % aceton. Za namene primerjave CyreneTM z »optimalnimi« topili smo izvedli ekstrakcijo pri enakih razmerjih kot je opisano pod točko 3.2.2. Tudi v tem primeru smo za vsako razmerje pri posameznem vzorcu pripravili tri paralelke (zatehte).
3.2.4 Izračun koncentracije pigmentov po Beer-Lambertovem zakonu
Beer-Lambertov zakon se uporablja za računanje molarne koncentracije (c) topljencev na osnovi podatkov o absorbanci (A), dolžini poti žarka (l) ter molarne absorptivnosti (ε).
𝐴 = 𝜀 ∗ 𝑙 ∗ 𝑐
...(1)𝑐 =
𝐴𝜀∗𝑙 ...(2)
Pri izračunu koncentracij posameznih pigmentov smo uporabili molarne absorpcijske koeficiente za posamezne pigmente pri njihovih absorpcijskih maksimumih, ki so navedeni v literaturi. Vrednosti molarnih absorpcijskih koeficientov so navedene v okviru preglednic, kjer so podani podatki o učinkovitosti ekstrakcije s posameznimi topili.
3.2.5 Antioksidativni testi
V literaturi nismo našli podatkov o antioksidativni učinkovitosti CyreneTM, zato smo nameravali ovrednotiti, ali CyreneTM reagira v DPPH, ABTS in Folin–Ciocalteu testih.
Podatki o morebitni antioksidativni učinkovitosti so pomembni, saj bi lahko v primeru uporabe CyreneTM kot topila le-ta vplival na lažno pozitivno določen AOP ekstrahiranih vzorcev. Po drugi strani pa bi morebitna antioksidativna aktivnost CyreneTM lahko prispevala k stabilizaciji antioksidantov v fazi ekstrakcije.
3.2.5.1 DPPH metoda
Reagent DPPH pripravimo tako, da v 50 mL polipropilensko centrifugirko zatehtamo 12 mg DPPH in raztopimo v 30 mL metanola. Reagent redčimo tako, da je absorbanca raztopine pri 520 nm približno 2,4 (Abramovič, 2018). Umeritveno krivuljo smo izdelali tako, da smo si pripravili raztopino Troloks reagenta s koncentracijo 5 mM, iz katere smo pripravili
raztopine s koncentracijami 100, 200, 300, 400, 500, 600 in 700 μM. Po 50 μL teh raztopin smo odpipetirali v 1,5 mL centrifugirke, dodali 50 μL 250 mM acetatnega pufra pH 5 in 400 μL mQ vode ter 500 μL ustrezno razredčene raztopine DPPH. Končna koncentracija Troloksa v centrifugirkah je bila 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 in 35 μM. Vzorce smo nato 60 minut inkubirali pri 25 °C in jih prenesli v 1,5 mL kivete. Spektrofotometer smo umerili na vrednost nič s slepim vzorcem (50 μL 250 mM acetatnega pufra pH 5 in 450 μL mQ vode ter 500 μL metanola) in izmerili absorbance pri valovni dolžini 520 nm.
Slika 12 Umeritvena krivulja s Troloksom za DPPH metodo pri pH 5.
Za vrednotenje AOP CyreneTM smo pripravili raztopine ustreznih koncentracij ter v 2 mL mikrocentrifugirke odpipetirali po 50 μL ustrezno razredčenih raztopin, v katere smo kot v primeru umeritvene krivulje s Troloksom dodali 50 μL 250 mM acetatnega pufra pH 5 (ali 50 μL mQ vode) in 400 μL mQ vode ter 500 μL ustrezno razredčene raztopine DPPH.
Nadalje smo postopali enako kot v primeru umeritvene krivulje. AOP CyreneTM smo izračunali iz enačbe premice, ki smo jo dobili iz umeritvene krivulje in jo ob upoštevanju razredčitev izrazili kot ekvivalent Troloksa (TE) na gram CyreneTM (μmol/g).
3.2.5.2 ABTS metoda
V čašo smo zatehtali 25 mg reagenta ABTS in dodali 70 mg manganovega dioksida ter 10 mL mQ vode. Vsebino čaše smo 1 uro mešali v temi in nato nekaj sekund centrifugirali. Po centrifugiranju smo raztopino filtrirali skozi 0,45 μm filter in tako pripravljen reagent hranili v hladilniku do uporabe (Abramovič, 2018). AOP Troloksa smo izvedli na enak način kot DPPH. V 2 mL mikrocentrifugirko smo dodali ustrezno razredčen Troloks, 50 μL 250 mM acetatnega pufra pH 5 in 400 μL mQ vode. Nato smo dodali še 500 μL predhodno razredčene raztopine ABTS (raztopina z absorbanco ~2 pri 734 nm). Tako pripravljene vzorce smo nato inkubirali 60 min pri 25 °C. Po inkubaciji smo vsebino prenesli v 1,5 mL kivete in s spektrofotometrom izmerili absorbance pri valovni dolžini 734 nm. Spektrofotometer smo predhodno umerili na vrednost nič s slepim vzorcem.
y = 0,0209x R² = 0,9947
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
0 10 20 30 40
A520
C troloks (μM)
AOP CyreneTM smo določali na enak način, le da smo namesto raztopin Troloksa uporabili različno razredčene raztopine CyreneTM ter v test dodali 50 μL 250 mM acetatnega pufra pH 5 ali 50 μL mQ vode.
Slika 13 Umeritvena krivulja s Troloksom za ABTS metodo pri pH 5.
3.2.5.3 Folin–Ciocalteu metoda
Standardno raztopino Folin-Ciocalteujevega reagenta smo razredčili z mQ vodo v razmerju 1:2 (1 mL FC + 2 mL mQ vode) (Abramovič, 2018). Tako pripravljeno raztopino smo porabili v roku 1 ure. V dve 1,5 mL centrifugirki (paralelki) smo odpipetirali 50 μL ustrezno razredčenih raztopin Troloksa in dodali 700 μL mQ vode ter 125 μL delovne raztopine FC reagenta. Za slepi vzorec smo namesto vzorca dodali 50 μL mQ vode. Raztopine smo nato dobro premešali na vrtinčniku in počakali 5 minut. Po pretečenem času smo dodali 125 μL 20 % raztopine Na2CO3, ponovno premešali na vrtinčniku in inkubirali nadaljnjih 55 minut na 25 °C. Inkubaciji je sledilo prenašanje vzorcev v 1,5 mL kivete in merjenje absorbance na spektrofotometru pri valovni dolžini 765 nm. Spektrofotometer smo predhodno umerili na vrednost nič s slepim vzorcem. Končne koncentracije Troloksa v centrifugirkah so bile 10, 20, 30, 40, 50 60, 70, 80 in 90 μM.
Reaktivnost CyreneTM v FC testu smo določali na enak način, le da smo namesto raztopin Troloksa v test dodali 50 μL ustrezno razredčenega CyreneTM.
y = 0,0246x R² = 0,9977
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
0 5 10 15 20 25 30
A732
C troloks (μM)
y = 0,0071x R² = 0,9826
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
0 10 20 30 40 50 60
A765
C troloks (μM)
Slika 14 Umeritvena krivulja s Troloksom za Folin-Ciocalteu metodo.
4 REZULTATI Z RAZPRAVO
4.1 SPEKTRALNE IN ANTIOKSIDATIVNE LASTNOSTI CYRENETM 4.1.1 Absorpcijski spekter CyreneTM v UV in vidnem delu spektra
Absorpcijski spekter CyreneTM smo posneli v UV (200 - 400 nm) in v vidnem delu spektra (400 - 800 nm). Na osnovi preliminarnih eksperimentov smo ugotovil, da CyreneTM močno absorbira pri valovnih dolžinah pod 300 nm, zato smo za namene meritev v tem delu spektra topilo razredčili v volumskem razmerju 1:499 z miliQ vodo. Absorbanca normalizirana na nerazredčen CyreneTM (dejansko izmerjena absorbanca pomnožena s 500 in deljena z gostoto CyreneTM (1,25 g/mL)) je prikazana na sliki 15. Ker smo v UV delu spektra pomerili absorbanco z vodo razredčenega topila, smo dejansko izmerili absorbanco hidratiziranega CyreneTM, ki je v obliki geminalnega diola (Misefari, 2017), kar zagotovo vpliva na absorbanco. Zaradi relativno visoke absorbance topila v UV delu spektra, lahko le-to predstavlja problem pri kvantifikaciji učinkovitosti ekstrakcije spojin, ki absorbirajo pri teh valovnih dolžin (npr. polifenoli) z direktnim merjenjem absorbance. Tovrstno topilo lahko interferira tudi s kromatografsko analizo v primeru spektrofotometrične detekcije, če pride do koelucije CyreneTM z analiti.
Slika 15 Spekter CyreneTM posnet v UV delu spektra.
Na sliki 16 je prikazana absorbanca nerazredčenega CyreneTM v vidnem delu spektra.
Razvidno je, da topilo absorbira pri valovnih pod 500 nm, vendar je do 430 nm absorbanca čistega topila še vedno pod 0,1. Absorbanca v vidnem delu spektra prispeva tudi k bledo rumeno rjavi barvi samega topila. Zaradi relativno majhne absorbance v večjem delu vidnega spektra, topilo omogoča direktno merjenje absorbance v njem raztopljenih pigmentov kot so klorofili, karotenoidi, antocianini ali betalaini, ki imajo absorpcijske maksimume pri valovnih dolžinah nad 450 nm.
-100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
200 250 300 350 400
Absorbanca
λ(nm)
Slika 16 Spekter CyreneTM posnet v vidnem delu spektra (400 do 800 nm).
V okviru karakterizacije topila smo pomerili tudi pH vodne raztopine CyreneTM. Raztopina 10 ut. % CyreneTM je imela pH 3,8 pri sobni temperaturi (22 °C). H kislosti raztopine bi lahko prispevale nečistoče v samem topilu, možno pa je, da je nizek pH tudi posledica nastanka geminalnega diola v vodnih raztopinah, za kar pa nismo našli potrditev v dostopni literaturi.
4.1.2 Antioksidativne lastnosti CyreneTM
Ekstrakti, pripravljeni iz različnih rastlinskih materialov, pogostokrat vsebujejo redoks aktivne spojine, ki jih lahko ovrednotimo z različnimi testi za določanje AOP. Za topila, ki jih uporabljamo za ekstrakcijo, je potrebno določiti AOP, saj v primeru morebitne reaktivnosti topilo lahko vpliva na izmerjen AOP spojin, ki jih ekstrahiramo. Po drugi strani pa takšno topilo tudi preprečuje oksidacijo ekstrahiranih redoks aktivnih spojin, kar bi lahko predstavljajo prednost pri uporabi.
Reagent in vzorce smo pripravili tako kot je opisano za posamezno metodo v poglavjih 3.2.5.1, 3.2.5.2 in 3.2.5.3 ter ovrednotili antioksidativni potencial CyreneTM v primerjavi s Troloksom. CyreneTM ima gostoto 1,25 kg/L in molsko maso 128 g/mol, kar pomeni, da je molarna koncentracija čistega topila 9,76 mol/L. CyreneTM smo pred določanjem AOP predhodno ustrezno razredčili, da smo prišli v območje meritev v okviru posameznega testa.
4.1.3 DPPH metoda
Na osnovi preliminarnih eksperimentov smo pripravili ustrezne razredčene raztopine CyreneTM, ki smo jih dodali v test za določanje AOP z DPPH testom. Umeritveno krivuljo smo pripravili s koncentracijami CyreneTM v testu (kivete), v območju od 3,91 mmol/L do 31,25 mmol/L kot je prikazano na sliki 17.
-0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
400 500 600 700 800
Absorbanca
λ (nm)
