Petra Čotar PREUČEVANJE VPLIVA NANODELCEV TiO

(1)

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA MATEMATIKO IN FIZIKO ODDELEK ZA FIZIKO

FIZIKA - BIOFIZIKA

Petra Čotar

PREUČEVANJE VPLIVA NANODELCEV TiO

₂

NA DIFUZIJO LIPIDOV V CELIČNI

MEMBRANI PLJUČNIH EPITELIJSKIH CELIC

Magistrsko delo

MENTOR: izr. prof. dr. Miha Ravnik SOMENTOR: dr. Iztok Urbančič

Ljubljana, 2022

(2)

(3)

Zahvala

Za pridobljeno znanje in izkušnje se zahvaljujem celotnemu Laboratoriju za biofiziko. V prvi vrsti Ani, za pomoč pri delu s celicami ter Boštjanu, za njegov vložen čas in potrpljenje pri uvajanju v eksperimentalno delo. Izredno zahvalo namenjam mentorjema dr. Iztoku Urbančiču in prof. dr. Mihi Ravniku, za njuno pomoč pri nastajanju magistrskega dela.

Prav tako sem hvaležna za vso podporo, ki sem jo bila deležna s strani družine.

(4)

(5)

Preučevanje vpliva nanodelcev TiO₂ na difuzijo lipidov v celični membrani pljučnih epitelijskih celic

Izvleček

Vpliv nanodelcev na naše zdravje je še zelo nejasen, pri čemer veliko novih raziskav kaže, da je njihova prisotnost v telesu povezana z raznimi obolenji. Eden od načinov vstopa nanodelcev v človeško telo je preko dihal, zato je pomembno razumevanje interakcije med nanodelci in epitelijskimi celicami, ki so eden od gradnikov pregrade med zrakom in krvjo. Nedavne raziskave so pokazale, da se ob prisotnosti nanodelcev v celici poveča produkcija holesterola, ki v celični membrani povzroči večjo urejenost lipidov, zato bi nanodelci lahko vplivali na gibljivost molekul v membrani. V tem magistrskem delu smo z uporabo fluorescenčne korelacijske spektroskopije merili hitrost difuzije lipidov v celični membrani pljučnih epitelijskih celic po izpostavitvi nanodelcem TiO₂. Raziskali smo, kako se vpliv nanodelcev na celice spreminja s časom izpostavljenosti in s količino dodanih nanodelcev, in ugotovili, da je vpliv nanodelcev največji po 24 h od izpostavitve, ko se difuzija lipidov upočasni. To nakazuje na zmanjšanje fluidnosti membrane, kar bi lahko bila posledica poskusa obrambe celice pred vdorom nanodelcev. Po 48 h ne opazimo razlike med hitrostjo difuzije lipidov v membranah celic z dodanimi nanodelci in tistimi brez njih. Zanimivo je, da ve- čja koncentracija nanodelcev ni povzročila večjega učinka na hitrost difuzije lipidov v membrani. Tekom raziskave smo kot pomemben metodološki rezultat tega dela razvili tudi sistem, ki nam omogoča avtomatizirano zajemanje podatkov, katerega glavni funkciji sta ohranjanje vzorca v goriščni ravnini med zaporednimi meritvami ter samodejno izbiro ustreznih območij v celicah za zajem signala. Avtomatizacija nam omogoča hitrejše in bolj objektivno zajemanje potrebnih meritev za nadaljnjo analizo. Osnovni koncepti metode so prenosljivi in omogočajo potencialno avtomatizacijo tudi drugih eksperimentalnih meritev. Splošneje smo s preučevanjem odziva lipidov v celični membrani na nanodelce prispevali k boljšemu razumevanju vpliva nanodelcev na celice na molekularni ravni, kar je širše prispevalo k razumevanju vpliva nanodelcev na zdravje ljudi.

Ključne besede: nanodelci, biofizika, fluorescenčna korelacijska spektroskopija, difuzija, pljučne epitelijske celice

(6)

(7)

Influence of TiO₂ nanoparticles on lipid diffusion in the cell membrane of lung epithelial cells

Abstract

Effect of nanoparticles on our health is still poorly understood, with research indi- cating correlation between exposure to nanoparticles and different diseases. One of the possible entry ways into the human body is trough the respiratory system, which highlights the importance to understand the interaction between nanoparticles and lung epithelial cells - one of the building blocks of the air-blood barrier. Recent studies show that cells exposed to nanoparticels increase the production of choles- terol, which increases lipid ordering in the cell membrane, so nanoparticles could also affect the mobility of molecules in the membrane. In this master’s thesis we use fluorescent correlation spectroscopy (FCS) to measure the diffusion rate of lipids in lung epithelial cell membrane after exposure to TiO₂ nanoparticles. We varied the dose of nanoparticles and the length of the exposure. We found that the effect is largest 24 h after exposure to nanoparticles, when the lipid diffusion slows down.

This suggests a decrease in membrane fluidity, which could result from the cell de- fense against nanoparticle intrusion. After 48 h we did not observe any difference in the diffusion rate between lipids in membranes of cells exposed to nanoparticles and the ones without added nanoparticles. Interestingly, the higher concentration of nanoparticles did not result in a greater change of lipid diffusion rate. We also developed an algorithm that allows us to automatically acquire the FCS data. The two main objectives of the program are maintaining the sample in the focal plane between consecutive measurements, and determining suitable areas of interest within the cells for data acquisition. With the introduced automation we can acquire the necessary measurements faster and without bias of the experimenter. The basic concepts of this method are transferable and therefore enable us to automate other experiments as well. More generally, this work contributes towards better understanding of the effect of nanoparticles on cells, and further to understanding of the effect of nanoparticles on our health. With a better understanding of the interaction at all levels, we will be able to predict possible complications in the entire organism after nanoparticle exposure.

Keywords: nanoparticles, biophysics, fluorescent correlation spectroscopy, diffusion, lung epithelial cells

(8)

(9)

Kazalo

1 Uvod . . . 11

2 Teoretični uvod . . . 13

2.1 Celična membrana . . . 13

2.1.1 Fosfolipidni dvosloj . . . 14

2.2 Nanodelci titanovega dioksida . . . 14

2.3 Fluorescenca . . . 14

2.3.1 Fluorescenčna korelacijska spektroskopija . . . 15

3 Eksperimentalne metode . . . 19

3.1 Priprava vzorcev . . . 19

3.1.1 Nanodelci . . . 19

3.1.2 Celice . . . 20

3.2 Meritve . . . 21

3.3 Obdelava meritev . . . 22

3.4 Statistični test . . . 25

4 Rezultati meritev difuzije lipidov . . . 27

4.1 Diskusija . . . 30

5 Avtomatizacija meritev fluorescenčne korelacijske spektroskopije 33 5.1 Samodejno popravljanje gorišča . . . 33

5.2 Samodejna izbira pozicij za meritve FCS . . . 35

6 Zaključek . . . 39

Literatura . . . 41

Dodatek A Dodatni material . . . 45

A.1 FCS meritve z nanodelci . . . 45

A.2 Primeri posnetkov celic in nanodelcev . . . 46

A.3 Primeri avtokorelacijskih funkcij . . . 47

(10)

(11)

Poglavje 1 Uvod

Uporaba nanodelcev se zaradi njihovih posebnih lastnosti, ki so velikokrat drugačne od lastnosti istega materiala v večji obliki, širi na različna področja. Uporabljajo se v različnih industrijah (kozmetika, barve, hrana, elektronika ...) [1, 2] in tudi v me- dicini za ciljno dostavo zdravil, v diagnostiki, za uničevanje tumorjev ... [3, 4] Kljub široki uporabi je vpliv nanodelcev na naše zdravje še vedno zelo nejasen. Znano je, da je dolgotrajna izpostavljenost nanodelcem povezana z razvojem pljučnih, srčno- žilnih ter drugih obolenj [5, 6]. Nanodelci, ki jih vdihnemo, lahko potujejo globoko v pljuča, vse do pljučnih mešičkov. Tam pridejo v stik s pljučnimi epitelijskimi celicami, ki so eden od gradnikov bariere med zrakom v pljučih in krvjo v žilah, ki obkrožajo mešičke. Zaradi svoje velikosti in interakcij lahko ti prehajajo preko bariere v krvožilni sistem in tako potujejo po celotnem telesu [7, 8].

Testiranja nanotoksičnosti materialov se izvajajo na živalih, predvsem glodavcih, vendar so ta zamudna in draga ter tudi zahtevajo etično presojo. Pri takih testih je rezultat le končni vpliv nanodelcev na posamezen organ ali celotni organizem. Za podrobnejše razumevanje mehanizmov škodljivosti nanodelcev so potrebni eksperi- mentis s preprostejšimi biološkimi sistemi, denimo organi na čipu [9] ali celičnimi kulturami„ kjer opazujemo direktno interakcijo med celicami in nanodelci [8, 10].

Raziskave so pokazale, da nanodelci vplivajo na več vidikov celičnega delovanja, kot je na primer urejenost citoskeleta, spremembe v medceličnih stikih, poškodbe celične membrane ... [11]. Vplivi nanodelcev so odvisni od njihovih lastnosti (povr- šina, oblika, naboj) in se lahko močno razlikujejo med različnimi vrstami [12]. Če celice ne morejo razgraditi nanomateriala, ta konstantno kroži med njimi, kar lahko vodi v kronično vnetje [8].

V Laboratoriju za biofiziko na Institutu Jožef Stefan raziskujejo vplive različnih vrst nanodelcev na pljučne celice, zaradi široke uporabe so še posebno zanimivi vplivi titanovega dioksida (TiO2). Posamezni nanodelci TiO2 lahko direktno prodrejo v celico, agregati ali večji delci pa se ovijejo v membrano in nato vstopijo v celico.

Epitelijske celice jih izločajo in tako na površini celice tvorijo večje bio-nano agregate, sestavljene iz nanodelcev in celičnega materiala [8, 13]. Pri tem se celice na nanodelce TiO₂ odzovejo s povišano produkcijo lipidov in predvsem holesterola [8], ki v membrani povzroča bolj tesno urejanje lipidov in tako upočasni njihovo difuzijo.

V tem magisterskem delu smo preučevali vpliv nanocevk TiO2 na celično membrano pljučnih epitelijskih celic. Zato nas je zanimalo, kako se spreminja gibanje lipidov v celični membrani ob prisotnosti nanodelcev. Za merjenje hitrosti difuzije lipidov v celični membrani smo uporabili fluorescečno korelacijsko spektroskopijo (FCS). To

(12)

Poglavje 1. Uvod

je neinvazivna optična tehnika, ki temelji na analizi avtokorelacijske funkcije časov- nih fluktuacij intenzitete izsevane fluorescenčne svetlobe, detektirane s konfokalnim mikroskopom. Da bi ugotovili, kako se odziv celic spreminja s časom in količino nanodelcev, smo meritve opravljali en dan in dva dni po dodatku dveh različnih koncentracij nanodelcev. Zaradi časovne zahtevnosti in monotonosti izvedbe meritev FCS na bioloških vzorcih smo se odločili, da avtomatiziramo del eksperimenta in tako zajamemo veliko število meritev brez naše prisotnosti. Pomemben metodološki rezultat dela je tako tudi razvoj sistema in pristopa za avtomatizacijo eksperimentov z biološkimi vzorci, ki nam omogoči objektivno izbiro regij interesa, s čimer se izognemo potencialnemu vplivu subjektivne izbire operaterja. Možnost spreminja- nja parametrov meritev nam omogoča prilagajanje posameznim eksperimentalnim potrebam in drugim tipom meritev, ne le FCS.

(13)

Poglavje 2

Teoretični uvod

Celična membrana se obnaša kot fluidna struktura, sestavljena večinoma iz lipidov, proteinov in nanje pripetih sladkorjev. Gibanj emolekul v membrani lahko preuču- jemo s fluorescenčno korelacijsko spektroskopijo. Na podlagi fluktuacij v intenziteti signala zaradi gibanja molekul lahko izračunamo njihove difuzijske koeficiente.

2.1 Celična membrana

Celice vseh živih bitij obkroža nekaj nanometrov tanka celična membrana, ki celico ščiti pred okolico ter uravnava izmenjavo snovi (rastlinske celice imajo okoli membrane še celično steno, ki zagotavlja mehansko trdnost). Opišemo jo lahko z modelom tekočega mozaika, saj je sestavljena iz različnih molekul, ki se lahko prosto premikajo po membrani. Membrana je sestavljena iz lipidnega dvosloja, v katerega so vgrajeni še proteini. Na lipide in proteine so na površini lahko vezani še sladkorji, ki se zaradi svoje hidrofilnosti ne morejo vgraditi v dvosloj. Med lipidi je poleg fosfolipidov pomembni gradnik membrane še holesterol. Le-ta ima pomembno vlogo v strukturi membrane, saj vpliva na njeno fluidnost. Zaradi svoje toge strukture vpliva na urejanje opletajočih lipidnih repov ter na gibanje gradnikov membrane, zato večja količina holesterola običajno zmanjša njihovo gibljivost. Proteini opra- vljajo različne naloge, kot so transport snovi čez membrano, identifikacija drugih celic, delujejo kot receptorji za medcelično komunikacijo, katalizirajo encimske re- akcije in uravnavajo integriteto celice s pritrjevanjem na zunajcelični matriks preko citoskeleta [14]. Shematski model membrane je prikazan na sliki 2.1.

Slika 2.1: Shematski prikaz celične membrane. Prirejeno po [15]

(14)

Poglavje 2. Teoretični uvod

2.1.1 Fosfolipidni dvosloj

Fosfolipidi so amfifilne molekule, saj imajo hidrofobni in hidrofilni del. Hidrofilna glava je zgrajena iz fosfatne skupine in glicerola, ki povezuje glavo z repi. Dva hidrofobna repa sta iz nepolarnih maščobnih kislin, pritrjenih na glicerol. Zaradi svoje amfifilne lastnosti lipidi v vodnem mediju tvorijo fosfolipidni dvosloj, kjer so fosfolipidi obrnjeni tako, da se stikajo z repi, polarne glave pa so obrnjene navzven proti vodi (slika 2.1).

Na fluidnost membrane vpliva struktura hidrofobnih repov. Ti so lahko sestavljeni iz nasičenih ali nenasičenih alkilnih verig, kjer so prve večinoma ravne, pri nenasi- čenih pa dvojne vezi povzročijo ukrivljenost repa. Fosfolipidi z nasičenimi alkilnimi verigami so zato lahko bližje skupaj in tvorijo bolj gosto strukturo, saj Van der Waalsove sile povzročijo večjo urejenost molekul in počasnejšo difuzijo. V celični membrani toplokrvnih živali so najpogostejši fosfolipidi z dvema nasičenima ter fosfolipidi z eno nasičeno in eno nenasičeno alkilno verigo.

Fosfolipidi znotraj membrane niso fiksni. Lahko se vrtijo okoli lastne osi in difundi- rajo po membrani. Difuzija v ravnini membrane je hitra z difuzijsko konstanto okoli 1 µm²/s. Prehajanje fosfolipidov med plastmi dvosloja pa je počasno, ti prehodi se pojavljajo na časovni skali ur [16].

2.2 Nanodelci titanovega dioksida

Nanodelci so majhni delci z eno dimenzijo manjšo od 100 nm, lahko so naravnega izvora, stranski produkt procesov (dim) ali pa so sintetizirani za uporabo v indu- striji (kozmetika, barvila, farmacija, plastika ...) [17]. Zaradi svoje majhnosti lahko vstopajo v tkiva, kar lahko vodi do raznih obolenj. Nanodelci iz zraka v telo najlažje vstopijo preko dihal. Iz nosne votline se lahko preko vohalnega živca prenesejo do možganov ali pa potujejo vse do pljučnih mešičkov, kjer prodrejo v pljučni epitelij.

Lahko ostanejo tam in vplivajo na delovanje pljuč ali pa preidejo v krvni obtok in tako po krvožilnem sistema potujejo do drugih organov. V telo lahko nanodelci vstopijo še preko prebavil in kože [5, 7].

Titanov dioksid se kot bel prah zaradi svojih optičnih lastnosti in relativno nizke cene proizvodnje uporablja v različnih izdelkih. Predvsem se uporablja kot pigment v barvah, kozmetiki, farmaciji in prehrani (E171) ter v sončnih kremah kot zaščita pred UV žarki [18]. Pri proizvodnji TiO₂ se ta nahaja tudi v zraku in lahko v naše telo vstopi z dihanjem. To predstavlja nevarnost za naše zdravje, saj so ugotovili povečanje pljučnih okužb pri testih na glodavcih, ki so bili izpostavljeni nanodelcem TiO₂ [19]. Urbančič in sodelavci so pokazali, da se zaradi močne interakcije med TiO2in lipidi tovrstni nanodelci ovijejo v celično membrano in se tako prosto gibljejo znotraj epitelijskih celic [13]. Epitelijske celice nanodelce iz svoje notranjosti izločijo v obliki bio-nano agregatov. Nanomaterial tako kroži med celicami, kar lahko vodi v kronično vnetje [8].

2.3 Fluorescenca

Pri raziskovanju procesov na molekularni ravni pogosto uporabljamo metode, ki te- meljijo na fluorescenci. Fluorescenca je emisija fotona ob prehodu molekule v nižje elektronsko stanje. Do pojava pride, potem ko molekula absorbira foton, katerega

(15)

2.3. Fluorescenca

energija ustreza energijski razliki med osnovnim in vzbujenim stanjem elektrona.

Prehode med elektronskimi stanji najlažje prikažemo z diagramom Jablonskega, ki ga prikazuje slika 2.2. Označena so tri singletna stanja, osnovno (S0) ter dve višji stanji (S₁ in S₂) in dve tripletni stanji (T₁ in T₂). Pri absorpciji fotona elektron ponavadi preide v enega od višjih vibracijskih stanj S₁ ali S₂. Molekula nato preko notranje konverzije preide v osnovno vibracijsko stanje S1. Ta proces je zelo hiter in traja le 10⁻¹² s ali manj. Nato se elektron vrne v osnovno stanje S₀ in ob tem izseva foton. Čas, potreben za ta prehod, je okoli10⁻⁹ s do10⁻⁸ s in je poimenovan

Slika 2.2: Prehodi med elektronskimi stanji z diagramom Jablonskega. S₀, S₁, S₂ označujejo singletna elektronska stanja, T₁, T₂ pa tripletna stanja. Tanjše črte označujejo vibracijska stanja molekule. Puščice prikazujejo možne poti ekscitacije ter relaksacije elektrona. Prirejeno po [20].

kot življenjski čas fluorescence. Izsevan foton ima v povprečju manjšo energijo v primerjavi z absorbiranim, kar se odraža v daljši valovni dolžini izsevane svetlobe.

Spremembi valovne dolžine med absorbirano in izsevano svetlobo, rečemo Stokesov premik. Kot vidimo iz diagrama Jabloskega, obstajajo tudi drugi načini relaksacije molekul v osnovno stanje. Eden od teh je preko tripletnega stanja, ki ga imenujemo fosforescenca in je veliko počasnejši od fluorescence (od 10⁻⁶ do 10⁻³). Molekule, pri katerih opažamo pojav fluorescence, imenujemo fluorofori [21].

Molekule lahko emitirajo le končno število fotonov. Trajno izgubo sposobnosti fluorescence imenujemo bledenje. Posamezna molekula lahko izseva manj kot tisoč ali pa tudi več milijonov fotonov, odvisno od vrste fluorofora. Na hitrost bledenja vpli- vata tudi intenziteta eksitacijske svetlobe ter okolica. Bledenje je v večini primerov nezaželen pojav, saj povzroči zmanjševanje signala fluorescence s časom [22].

2.3.1 Fluorescenčna korelacijska spektroskopija

Fluorescenčna korelacijska spektroskopija (FCS) je neinvazivna optična mikroskop- ska metoda, s katero lahko določimo različne lastnosti snovi na podlagi dinamike fluoroforov. Uporablja se za določanje lokalnih koncentracij, difuzijskih koeficientov in karakterističnih časov molekulskih reakcij [23].

Za merjenje FCS se najpogosteje uporablja konfokalni mikroskop, prikazan na sliki 2.3.

Laserski žarek preko sistema leč, dikroičnega zrcala ter objektiva fokusiramo na vzorec. Emitirana svetloba iz vzorca nato potuje preko objektiva, filtrov, leč in zaslonke do detektorja. Zaslonka prepusti le svetlobo, ki prihaja iz goriščne ravnine laserja,

(16)

Slika 2.3: Shema meritve FCS s konfokalnim mikroskopom. Dikroično zrcalo odbije svetlobo z valovno dolžino manjšo od karakteristične, ostalo pa prepusti. Emisijski filter prepusti le določen del spektra. Z rumenimi kroglicami so označene molekule v vzorcu, po katerem se premikajo (črtkana črta). V opazovanem prostoru je vzbujanje fluorescence (rdeče kroglice) najbolj učinkovito. Na sliki sta prikazana še primera grafov intenzitete fluorscenčnega signala (F(t)) v odvisnosti od časa meritve (t) ter avtokorelacijska funkcija (G(τ)) v odvisnosti od časovnega zamika (τ). Prirejeno po [24].

večino ostale pa zadrži. Laser namreč osvetljuje večje področje na vzorcu (slika 2.3, svetlo zelen snop), do detektorja pa zaradi zaslonke pride predvsem fluorescenčni signal (F(t)) iz opazovanega prostora (temno zelena). Molekule fluoroforov (rumene kroglice na sliki 2.3) se konstantno premikajo po vzorcu in posledično tudi skozi naš opazovani prostor, kar povzroči spremembe v signalu: vsakič, ko nova molekula vstopi v prostor (rdeča kroglica), se intenziteta signala poveča, ko pa ga zapusti, signal pade [25].

Z nadaljnjo analizoF(t)se nato izračuna še avtokorelacijska funkcija signala (G(τ)).

Ta primerja signal samega s seboj po časovnem zamiku τ in je definirana kot:

G(τ) = ⟨δF(t)·δF(t+τ)⟩

⟨F(t)⟩² , (2.1)

kjer je F(t) izmerjena intenziteta fluorescence, ⟨⟩ časovno povprečje, δF(t)pa fluk- tuacije signala:

δF(t) = F(t)− ⟨F(t)⟩ in ⟨F(t)⟩= 1 T

∫︂ T

0

F(t)dt, (2.2)

(17)

2.3. Fluorescenca

kjer je T celoten čas meritve.

Značilne oblike G(τ) so povezane s karakterističnimi časi fluktuacij fluorescence, ki izvirajo iz različnih pojavov (slika 2.4a). Eksperimentalno se najpogosteje preuču- jejo difuzija in tripletni prehodi, saj so časovne skale ostalih pojavov zelo kratke in zato težko merljive [25]. Slika 2.4b prikazuje vpliv koncentracije in hitrosti difuzije molekul na avtokorelacijsko funkcijo.

(a) (b)

Slika 2.4: Primeri različnih avtokorelacijskih krivulj. Slika (a) prikazuje vpliv vr- tenja molekul, tripletnih prehodov in difuzije na obliko avtokorelacijske krivulje.

Začetni vrh doseže v območju življenjskega časa fluorofora. Slika (b) podrobneje prikazuje del avtokorelacijske funkcije, ki je povezana z difuzijo molekul. Črtkana puščica označuje smer višanja koncentracije vzorca, polna puščica pa smer poča- snejše difuzije. Prirejeno po [25, 26].

Intenziteta fluorescentnega signala, ki ga merimo, je odvisna od koncentracije fluoroforov (C(r, t)) v opazovanem prostoru in jo lahko zapišemo kot:

F(t) =B

∫︂

p(r)C(r, t)dV, (2.3)

kjer jep(r)profil eksitacijske svetlobe in je za sistem opisan na sliki 2.3 enak Gaussovi funkciji, p(r) = I₀exp(−2(x²+y²)/ω₀²)exp(−2z²/z₀). I₀ je maksimalna intenziteta vpadne svetlobe, ω0 in z0 pa opisujeta opazovani prostor kot radija elipsoida v xy ravnini ter z smeri. Svetlost B je definirana kot:

B =qσQ, (2.4)

kjer soq kvantna učinkovitost detekcije,σpresek absorpcije terQkvantni izkoristek fluoroforja. Svetlost torej ni samo lastnost molekule, ampak je odvisna tudi od optičnih lastnosti sistema. Avtokorelacijska funkcija tako dobi obliko:

G(τ) = B²∫︁ ∫︁

p(r)p(r^′)⟨δC(r,0)δC(r^′, τ)⟩dV dV^′ (V C∫︁

p(r)dV)² . (2.5)

G(0) je vrednost avtokorelacijske funkcije ob času τ = 0 in je obratno sorazmerna s povprečnim številom molekul (N) v opazovanem prostoru. To sledi iz enačbe 2.5, saj je koncentracija C sorazmerna z N. Za Poissonovo porazdelitev pa velja, da je

(18)

varianca sorazmerna s kvadratnim korenom povprečja, kar pomeni, da je δC sorazmerna s √

N. Tako dobimo zvezo G(0) = 1/N [21, 23].

V primeru, ko se koncentracija fluoroforov spreminja le zaradi difuzije, lahko zapi- šemo difuzijsko enačbo

∂δC(r, τ)

∂τ =D∇²δC(r, τ), (2.6)

kjer je Ddifuzijski koeficient. Z upoštevanjem zgoraj zapisanih zvez [27, 28] dobimo avtokorelacijsko funkcijo za difuzijo v ravnini

G(τ) = G(0)(︂

1 + τ τ_D

)︂−1

, (2.7)

ter avtokorelacijsko funkcijo za difuzijo v prostoru G(τ) =G(0)

(︂

1 + τ τ_D

)︂−1(︂

1 + τ

(z₀/ω₀)²τ_D )︂−1/2

, (2.8)

kjer je τ_D karakteristični čas difuzije skozi opazovani volumen:

τ_D = ω²₀

4D. (2.9)

Ti dve zvezi za avtokorelacijsko funkcijo veljata le za primere, kjer jep(r) Gaussova funkcija, kot denimo idealno fokusiran laserski žarek. Celotno izpeljava je podrobno opisana v [27] in [28].

S prilagajanjem ustrezne funkcije našim meritvam lahko določimo τD. Da bi lahko iz dobljenihτ_D določili difuzijski koeficient, moramo poznati še velikost opazovanega prostora (ω₀), kar lahko dobimo z merjenjem funkcije širjenja intenzitete točkastega izvora (angleško point spread function - PSF) iz slik fluorescenčnih kroglic, ki so manjše od resolucije mikroskopa. Polmer prostora je enak razdalji, na kateri je intenziteta enaka 1/e² maksimalne intenzitete. Drug način meritve velikosti opazovanega prostora pa je preko meritev difuzije molekul z znanim difuzijskim koeficientom (D). Z uporabo enačbe 2.9 dobimo vrednost ω₀ [29].

(19)

Poglavje 3

Eksperimentalne metode

Preučevali smo vpliv nanodelcev TiO₂ na pljučne epitelijske celice LA-4, zato smo celice izpostavili različnim dozam TiO₂in po različnih časih preverjali hitrost difuzije lipidov v celičnih membranah. Ker smo uporabljali fluorescenčno spektroskopijo, so morali biti vsi vzorci tudi ustrezno označeni s fluorescenčnimi barvili, kar pomeni, da smo jim dodali fluorescentno označene lipidne molekule, ki smo jih lahko opazovali z našim mikroskopom. Iz vsake meritve F(t) lipidov v celični membrani, smo izračunali avtokorelacijsko funkcijo ter ji prilagodili ustrezno G(τ), in tako izraču- nali difuzijske koeficiente. Na koncu smo primerjali dobljene difuzijske koeficiente pri različnih pogojih.

3.1 Priprava vzorcev

3.1.1 Nanodelci

Za eksperimente, predstavljene v tem delu, smo uporabljali nanodelce titanovega dioksida (TiO2) v obliki nanocevk. Ker smo za analizo uporabljali fluorescenčne tehnike, je bilo nanje najprej potrebno vezati fluorescenčo barvilo. Funkcionalizi- rane nanodelce je pripravila dr. Polona Umek na Odseku za fiziko trdne snovi na Institutu Jožef Stefan. V Laboratoriju za biofiziko smo jim nato dodali še izbrano fluorescentno barvilo (celoten postopek označevanja TiO₂ je opisan v magistrskem delu Neže Golmajer Zima [30]). Za te eksperimente smo na TiO₂ vezali barvilo Atto 594, njegov absorpcijski ter emisijski spekter sta prikazana na sliki 3.1a. Končni produkt je bila raztopina označenih TiO₂ v stokrat razredčenem bikarbonatnem pufru s koncentracijo TiO₂ 1 mg/ml. Uspešnost vezave barvila na nanodelce smo potrdili z meritvami FCS (slika A.1 v dodatku).

Označujemo jih v večjih količinah (nekajmg) že pred eksperimenti. Pred vsakim po- skusom vzorec ponovno filtriramo in se tako znebimo morebitnega prostega barvila, ki se je odcepilo od nanodelcev. Pri mikroskopiji namreč ne vemo, ali fluorescen- tni signal pride od molekule barvila, vezane na nanodelec, ali od proste molekule barvila. Proste molekule barvila nanodelcev bi lahko vplivale tudi na meritve FCS drugih barvil, saj je ta metoda občutljiva na signal posameznih mobilnih molekul.

(20)

Poglavje 3. Eksperimentalne metode

(a) (b)

Slika 3.1: Absorpcijski in emisijski spekter fluorescentnih barvil Atto 594 (a) in Atto 647N (b). Prirejeno po [31, 32].

3.1.2 Celice

Poskuse smo izvajali s celično linijo LA-4. To so epitelijske celice, izolirane iz mišjega pljučnega adenoma. Gojili smo jih v celičnem laboratoriju Laboratorija za biofiziko v inkubatorju z nadzorovanim okolju (atmosfera s 5 % CO2, temperatura 37 ^◦C).

Zanje se uporablja medij F-12, ki smo mu dodali še hranila - FBS (fetal bovine serum), nenasičene aminokisline in 2 mM L-GlutaMax - ter penicilin in streptomicin za zaščito pred okužbami.

Celice smo nekaj dni pred vsakim eksperimentom nasadili v Ibidi µ-posodice (µD) in pri tem pazili, da je bila gostota celic v vseh enaka. Tem smo 24 h ali 48 h pred eksperimentom dodali še nanodelce. Vedno smo pripravili še vzorec brez nanodelcev, ki je služil za kontrolno meritev. Dodajali smo še označene nanodelce v razmerju 1 : 1 ter 10 : 1 med površino nanodelcev ter površino celic (S_n : S_c). Vzorce smo najprej pogledali s svetlobnim mikroskopom, kjer smo lahko ocenili, kolikšen procent površine je prekrit s celicami (stopnja konfluentnosti). Celotno območje, ki ga imajo na voljo za rast v µD, ima površino 3,5 cm². Nanodelci imajo specifično površino 152 m²/g [19] in so v raztopini s koncentracijo 1 mg/ml. Tako smo vzorcu, kjer so celice prekrile celotno površino, dodali 2,3µl raztopine nanodelcev za S_n : S_c = 1 : 1 ter 23 µl za S_n : S_c = 10 : 1.

Tik pred meritvami smo označili še celice z lipidnim barvilom Atto 647N-DPPE, ki se vgradi v celično membrano. Njegov absorpcijski ter emisijski spekter lahko vidimo na sliki 3.1b. Najprej smo odstranili medij, sprali vzorec s pufrom PBS in dodali 250 µl barvila Atto 647N-DPPE, razredčenega v PBS do koncentracije 3 µM. Celice smo nato prestavili v hladilnik (4 ^◦C) in jih tam pustili 10 minut. S tem upočasnimo celično delovanje, saj lahko deli membrane preko različnih procesov (na primer endocitoza) pridejo v njeno notranjost. Tako zmanjšamo vnos barvila v celico. Vzorec smo nato ponovno sprali s PBS ter mu dodali LCIS (Live Cell Imaging Solution), ki je puferska raztopina s HEPES in omogoča preživetje celic do 4 h izven inkubatorja.

(21)

3.2. Meritve

3.2 Meritve

Meritve so potekale na konfokalnem mikroskopu Abberior Instruments v optičnem laboratoriju Laboratorija za biofiziko Odseka za fiziko trdnih snovi IJS. Za ekscita- cijo smo uporabljali laserja z valovnima dolžinama 561 nm in 640 nm, za detekcijo svetlobe pa dve plazovni fotodiodi (APD). Pred detektorjema sta postavljena še emisijska filtra, ki prepuščata le del svetlobe v izbranem spektralnem oknu. Tako z APD 1 zaznavamo svetlobo z valovnimi dolžinami 605 nm ± 25 nm, z APD 2 pa 685 nm± 35 nm.

Za izračun opazovanega prostora smo opravili nekaj meritev F(t) prostega barvila Alexa 647, raztopljenem v vodi. To nam v nadaljnjih korakih služi za kalibracjo ω₀ za izračun difuzijske konstante. Vse meritve morajo biti izvedene pri enakih pogojih (valovna dolžina laserja, moč laserja, debelina stekelca), saj se drugače lahko spremeni velikost opazovanega območja. Meritve smo opravili z laserjem valovne dolžine 640 nm ter detektorjem APD 2, saj to kombinacijo uporabljamo tudi za meritve FCS fluorescenčno označenega lipida v membrani.

Odločili smo se, da merimo signal na spodnji membrani celice, kjer je ta najbolj ravna in jo najlažje izostrimo. Vedno smo pazili, da smo izbirali celice, ki so se nahajale v območjih s primerljivimi lokalnimi gostotami. Izogibali smo se prekri- vajočim se membranam in tistim s slabo definiranim robom. Primerna celica je prikazana na sliki 3.2a. Posamezna meritevF(t)je trajala 15 s z intervali vzorčenja

(a) Spodnja membrana (b) S_n : S_c= 1 : 1 (c) S_n: S_c = 10 : 1 Slika 3.2: Konfokalni posnetki celic LA-4. Na slikah je z zeleno prikazan signal barvila Atto 647N-DPPE, ki je porazdeljen predvsem v celični membrani, z rdečo pa signal barvila Atto 594, vezanega na nanodelce. Rumena predstavlja kolokalizacijo obeh signalov (bio-nano agregat). Na sliki (a) je primer spodnje membrane, na kateri smo merili FCS. Na slikah (b) in (c) vidimo celice pri dveh različnih vrednostih Sn: Sc, ki sta bili posneti višje v celici kot (a). Slike posameznih barvil so v dodatku na sliki A.2 in A.3.

2 µs. Primer meritve intenzitete izsevane svetlobe je prikazan na sliki 3.3. Meritve na enem vzorcu so potekale največ 1 h, saj potem ne moremo več zagotoviti opti- malnega stanja celic. S časom se tudi povečuje količina barvila v notranjosti celice in tako ne dobivamo signala samo iz zunanje membrane.

Zraven smo z laserjem valovne dolžine 561 nm in APD 1 opazovali nanodelce. Na njih nismo merili FCS, smo pa lahko videli količino nanodelcev v posamezni celici.

(22)

Slika 3.3: Primer posamezne meritve intenzitete detektirane svetlobe v odvisnosti od časa.

Primera celic z dodanimi TiO2 lahko vidimo na sliki 3.2a in 3.2c.

Za vsak dan meritev smo za pripravo vzorcev potrebovali skupno nekaj ur dela, tako za samo pripravo celic in nato še pripravo in dodajanje nanodelcev. V to seveda ni vštet čas, ki ga potrebujemo za sprotno vzdrževanje celične linije ter čas za ozna- čevanje nanodelcev. V posameznem dnevu smo pomerili 6 vzorcev, po dva za vsak pogoj. Pri vsakem vzorcu smo merili FCS na med 15 in 20 celicah, ter na vsakem mestu naredili še tri ponovitve. Za izvedbo meritev pri vseh pogojih s pripadajo- čimi ponovitvami smo izvedli 5 merilnih dni. Nekaj dni smo pred tem porabili še za postavitev in optimizacijo celotnega eksperimenta.

3.3 Obdelava meritev

Za analizo meritev smo uporabili program FoCuS_scan [33], s katerim lahko iz izmerjenega signala F(t) izračunamo avtokorelacijsko funkcijo in nanjo nato prilagajamo želen model. V programu smo si najprej pogledali vsako avtokorelacijsko krivuljo in glede na ustaljene kriterije določili, ali je primerna za nadaljnjo analizo [34]. G(τ)namreč zajame vplive vseh detektiranih časovnih sprememb fluorescence.

Te lahko poleg prehodov posameznih molekul skozi opazovani volumen povzroči tudi bledenja fluorescence nemobilnih molekul barvila, prehodov agregatov molekul (redki, a svetli dogodki), premikanja celic in znotrajceličnih struktur, termičnega lezenja optičnega sistema ipd. Ti neželeni pojavi so v veliki meri naključni po kraju in času, torej so meritve, posnete na različnih mestih, različno podvržene tovrstnim vplivom. TakeG(τ)imajo očitno drugačno obliko - vrednosti G ne padajo monotono ali za velike τ ne konvergirajo k vrednostim okoli 0 (primeri na slikah 3.4a in A.5).

Vplive bledenja lahko v nekaterih primerih odpravimo z vgrajenimi funkcijami v programu FoCuS_scan. Izbiramo lahko med dvema načinoma za odpravljanje vplivov bledenja, s povprečjem po času ali z upoštevanjem eksponentne funkcije bledenja.

Mi smo uporabljali popravek s povprečenjem, ki F(t) razdeli na krajše odseke ter nato povpreči avtokorelacijske funkcije posameznih delov. Na sliki 3.4 je primer avtokorelacijske krivulje pred in po uspešnem odpravljanju vplivov bledenja. Če je vpliv nezaželenih pojavov očiten iz F(t), lahko poskusimo izboljšati avtopkorela- cijsko funkcijo z obrezovanje F(t) in tako izločimo neustrezen del. Če tudi s temi pristopi nismo dobili avtokorelacijskih funkcij, ki ustrezajo zgoraj opisanim kriterijem, smo jih pred nadaljnjo obdelavo izločili, saj takih meritev seveda ne moremo

(23)

3.3. Obdelava meritev

(a) (b)

Slika 3.4: Avtokorelacijska krivulja pred (a) in po odpravljanju vplivov bledenja s povprečjem avtokorelacijskih funkcij krajših časovnih odsekov zajetega signala (b).

smiselno opisati z enostavnim difuzijskim modelom. Ker lahko uporabnost posamezne meritve ocenimo šele po izračunu G(τ), potrebujemo veliko število meritev F(t), da dobimo zadostno število merskih točk za zadovoljivo zanesljivost zaključ- kov. Dodatni primeri ustreznih in neustreznih primerov avtokorelacijskih funkcij so prikazani na sliki A.4 in sliki A.5 v dodatku.

Prečiščene podatke smo izvozili v drug del programa, ki nam je omogočal prilagajanje različnih funkcij. Difuzijo fluorescenčno označenih lipidnih molekul (Atto 647N-DPPE) v celični membrani najbolje opiše ravninsko gibanje, saj so lipidi ome- jeni na gibanje znotraj lipidnega dvosloja. Zato v teh primerih uporabimo model 2D difuzije:

G(τ)_dif = (︃(︂

1 + τ τ_D

)︂α)︃⁻¹

(3.1) Za meritve, opravljene z raztopino barvila Alexa 647, smo uporabili model 3D difuzije, saj se barvilo v tem primeru giblje prosto po vzorcu:

G(τ)_dif = (︃(︂

1 + τ τD

)︂α)︃⁻¹ (︂

1 + τ κ²τD

)︂−1/2

, (3.2)

kjer jeκ=z₀/ω₀. V primerjavi z enačbama 2.7 ter 2.8 imamo dodan še faktorα, ki upošteva neidealnosti v difuziji v kompleksnem molekularnem okolju (superdifuzija ali subdifuzija), odstopanja od predpostavk modela (npr. idealno Gaussova oblika opazovanega volumna) in heterogenost vzorca (soobstoj populacij molekul, ki difun- dirajo v različnih molekularnih okolicah, denimo bolj in manj urejenih membranskih domenah). Za vse primere smo dovolili vrednost α le v intervalu med 0,85 ter 1 - torej le manjše odstopanje od idealne difuzije, skladno z ustaljeno prakso [34]. Za meritve, posnete znotraj istega dne, smo uporabili eno vrednosti, ki smo jo izbrali na način, da je kar najbolje ustrezala večini meritev.

V nekaterih primerih opazimo tudi vpliv prehoda v tripletno stanje barvila Atto 647N DPPE, ki se izraža v spremembi oblike avtokorelacijske funkcije (slika 3.5b).

Poleg karakterističnega tripletnega stanja barvila Atto 647N DPPE z relaksacijskim časom 5µsse v primerih, ko se molekule barvila nahajajo v celicah, pojavi še prehod v drugo tripletno stanje z relaksacijskim časom okoli 100 µs. Pri meritvah s prostim barvilom Alexa 647 opazimo vpliv le enega tripletnega stanja. Tako moramo

(24)

funkciji, ki jo prilagajamo, dodati še prispevek tripletnih stanj:

G(τ)trip = 1 +A1exp (︃

− τ τ_trip1

)︃

+A2exp (︃

− τ τ_trip2

)︃

(3.3) kjer sta A₁ ter A₂ deleža prehodov iz posameznih tripletnih stanj z relaksacijskimi časi τ_trip1 inτ_trip2. Končno funkcijo, ki jo prilagajamo meritvam, tako zapišemo kot:

G(τ) = O+G(0)G(τ)_difG(τ)_trip (3.4) kjer je G(0) amplituda krivulje in O zamik krivulje po y osi.

Prosti parametri pri prilagajanju krivulje so bili torejG(0),O inτD ter v primerih, kjer je bilo potrebno uporabiti model s tripletnim stanjem, še A₁, A₂ in τ_trip2. Da smo izboljšali konsistentnost prilagojenih funkcij, smo τ_trip1 obdržali konstanten.

Vrednost τtrip1 je bila pri meritvah na barvilu Atto 647N DPPE konstantna, 5 µs.

Na sliki 3.5 sta prikazana primera prilagojene funkcije za opis 2D difuzije brez in z dodatkom tripletnega stanja. Ta dva načina smo uporabljali pri meritvah difuzije

(a) (b)

Slika 3.5: Avtokorelacijska krivulja (sive točke), izračunana iz meritev Atto 647N DPPE v celični membrani s prilagojeno funkcijo izbranega modela. Na sliki (a) je meritvam prilagojena avtokorelacijska funkcija na osnovi 2D difuzije. Na sliki (b) je prikazan primer avtokorelacijske krivulje, kjer vidimo vpliv tripletnih prehodov.

Rdeča krivulja je prilagojena funkcija, ki upošteva le 2D difuzijo, pri modri krivulji pa je dodan še tripletni del.

lipidnega barvila v membrani. Iz prilagojenih funkcij smo dobili τ_D, s katerim smo lahko z enačbo 2.9 izračunali še difuzijski koeficient.

Model proste difuzije z dodanim prispevkom prehoda v eno tripletno stanje smo uporabili na meritvah prostega barvila Alexe 647, raztopljenega v vodi. Primer take meritve je prikazan na sliki 3.6. Difuzijski koeficient Alexe 647 pri temperaturi 25^◦C je 330 µm²/s ± 10 µm²/s[35]. Mizica mikroskopa, na katero smo postavili vzorec, in objektiv sta ogrevana na 37 ^◦C. Ker se posledično ogreje tudi naš vzorec in je difuzija odvisna od temperature, moramo z Einsteinovo relacijo izračunati difuzijski koeficient, ki ustreza našim eksperimentalnim pogojem

D(T) =D(T₀)T T₀

η(T₀)

η(T), (3.5)

kjer je η viskoznost vode, ki se tudi spreminja s temperaturo [36]. Z indeksom 0so označene količine merjene pri temperaturi 25 ^◦C. S pomočjo difuzijskega koeficienta Alexe 647 in dobljenega τD smo izračunali ω0, ki je za naš sistem 0,22 µm.

(25)

3.4. Statistični test

Slika 3.6: Avtokorelacijska krivulja (sive točke), izračunana iz meritev s prostim barvilom Alexe 647, in prilagojena funkcija proste difuzije (rdeča krivulja)

3.4 Statistični test

Pri eksperimentih z biološkimi vzorci dobimo velik raztros meritev in za primerjavo rezultatov uporabljamo statistične teste, s katerimi ovrednotimo, ali so opažene razlike med pogoji lahko posledica naključnega vzorčenja iz široke porazdelitve. V našem primeru smo izbrali Mann-Whitney U test in ne najbolj pogosto uporabljen t-test, saj vse naše meritve nimajo normalne porazdelitve. Mann-Whitney U je neparametrični test, ki primerja range srednjih vrednosti dveh neodvisnih skupin.

Vse meritve najprej združimo in jih uredimo po velikosti. Najmanjša vrednost ima rang 1, največja pa rangn, kjer jenštevilo vseh meritev. Če imata skupini podobno obliko porazdelitve, se ta uporablja za primerjanje srednjih vrednosti [37].

Končni rezultat testa je p-vrednost (stopnja značilnosti), ki nam pove, kakšna je verjetnost, da imata skupini enak povprečni rang. Manjša kot je p-vrednost, večja je verjetnost, da obstaja razlika med dvema skupinama. Za prikaz vrednosti p, od najmanjšega proti največjem, se običajno uporabljajo oznake ***, **, * inn.s.(not significant) [37, 38].

Za statistične izračune smo uporabljali program JASP [39], v katerega vnesemo dve skupini meritev, ta pa nam kot rezultat vrne vrednost p. V našem primeru smo med seboj primerjali skupine meritevτ_D pri različnih pogojih. V eni skupini so bile denimo meritve na kontroli, druga pa meritve na celicah z dodanim nanomaterialom.

S tem smo lahko ocenili podobnost med vzorcema.

(26)

(27)

Poglavje 4

Rezultati meritev difuzije lipidov

Prisotnost nanodelcev vpliva na celotno delovanje epitelijskih celic [8], zato nas je zanimalo, kakšen vpliv imajo ti na difuzijo lipidov v celični membrani in kako se ta s časom spreminja. Eksperimente smo izvedli na dva načina: pri enem so bile celice inkubirane z nanodelci 24 h, pri drugem pa 48 h. Da bi določili, kako količina nanodelcev vpliva na celice, smo te dodali v dveh različnih koncentracijah. Količino smo izračunali glede na površino celic v vzorcu, tako da je bilo razmerje med celotno površino dodanih nanodelcev in površino celic 1:1 ali 10:1.

Pri vsakem eksperimentu smo imeli dva vzorca za kontrolo (celice brez nanodelcev), dva vzorca z dodanimi nanodelci v razmerju 1:1 ter dva vzorca z dodanimi nanodelci v razmerju 10:1, kjer je vzorec µD s celicami LA-4. Vedno smo vsako stanje merili v dveh vzorcih, saj tako dobimo več meritev in pregled nad spreminjanjem stanja med vzorci. Kontrola služi za primerjavo meritev med eksperimenti, opravljenimi ob različnih časih. Sprememba v meritvah, opravljenih na kontrolnih vzorcih, lahko nakazuje na spremembo v celicah ali spremembo v načinu izvajanja meritve. Iz meritev smo dobili difuzijske časeτ_D, ki so prikazani na sliki 4.1 in sliki 4.2. Vsaka točka na grafu prikazuje meritev na drugi celici. Za vsak set meritev istega tipa vzorcev je dodana tudi škatla (angleško box plot), ki opisuje porazdelitev meritev znotraj skupine. Za primerjavo porazdelitevτ_D različnih vzorcev smo uporabili Mann-Whitney U test, s katerim smo preverili, ali se rezultati meritev celic, izpostavljenih nanodelcem (razmerje površin celic in nanodelcev S_n : S_c = 1 : 1 oz. 10 : 1), razlikujejo od neizpostavljenih (S_n : S_c = 1 : 0). Na grafih smo rezultate statističnega testa za vsak primerjan par vzorcev predstavili z oznakami n.s. (not significant) za p >0,1 (predstavlja znatno verjetnost, da se porazdelitvi ne razlikujeta), * za p <0,1, ** za p <0,05 ter *** za p <0,001, ki se nahajajo nad vodoravnimi črtami, ki povezujejo primerjan par vzorcev.

(28)

Poglavje 4. Rezultati meritev difuzije lipidov

Slika 4.1: Odvisnost difuzijskega časa τD barvila Atto 647N DPPE v celični membrani za različne koncentracije dodanih nanodelcev (razmerje med površino nanodelcev ter celic S_n : S_c) pri 24-urni inkubaciji. Škatle imajo obliko določeno s spodnjim kvartilom (Q1, 25 %) in zgornjim kvartilom (Q3, 75 %) ter s sredinsko črto, ki označuje srednjo vrednost. Rezultate statističnega testa predstavljata oznaki n.s.

(not significant) za p >0,1 (znatna verjetnost, da se porazdelitvi ne razlikujeta) in

* za p <0,1, ki se nahajata nad vodoravnima črtama, ki povezujeta primerjan par vzorcev. Raztros točk vzdolž x osi znotraj ene skupine meritev je dodan za boljšo preglednost.

Eksperiment pri inkubaciji TiO₂ za 24 h smo ponovili dvakrat (ob različnih dneh) in zbrali vse meritve skupaj (slika 4.1). Tako smo vsak pogoj merili na štirih vzorcih. Podobno smo naredili tudi pri inkubaciji za 48 h, vendar pri teh eden od eksperimentov ni bil uspešen. Vrednostiτ_D na kontrolnih vzorcih so namreč občutno odstopale od ostalih ponovitev, kar pomeni, da so se pogoji spremenili. Eden od razlogov za razliko med kontrolami je lahko drugačna gostota celic v vzorcu, kot bomo predstavili kasneje. Tako so na sliki 4.2 prikazani rezultati enega eksperimenta in je zato število merskih točk manjše.

Iz srednjih vrednostiτD barvila Atto 647N DPPE v celičnih membranah, smo za vse meritve izračunali D, pri čemer smo uporabili ω₀, izračunano iz meritev z barvilom Alexa 647, z enačbo 2.9. Dobljene D smo zbrali v tabeli 4.1.

(29)

Slika 4.2: Odvisnost difuzijskega časa τ_D barvila Atto 647N DPPE v celični membrani za različne koncentracije dodanih nanodelcev (razmerje med površino nanodelcev ter celicS_n: S_c) pri 48-urni inkubaciji. Škatle imajo obliko določeno s spodnjim kvartilom (Q₁, 25 %) in zgornjim kvartilom (Q₃, 75 %) ter s sredinsko črto, ki ozna- čuje srednjo vrednost. Rezultate statističnega testa predstavlja oznaka n.s. (not significant) za p >0,1 (znatna verjetnost, da se porazdelitvi ne razlikujeta), ki se nahaja nad vodoravno črto, ki povezuje primerjan par vzorcev. Raztresenost točk vzdolž x osi znotraj ene skupine meritev, je dodan za boljšo preglednost.

D [µm²/s]

tink

S_n : S_c

0 : 1 1 : 1 10 : 1

24 h 1,6 (- 0,4 + 0,3) 1,1 (- 0,3 + 0,6) 1,5 (- 0,4 + 0,5) 48 h 1,5 (- 0,3 + 0,4) 1,5 (- 0,2 + 0,4) 1,4 (- 0,2 + 0,3) Tabela 4.1: Difuzijski koeficienti, izračunani iz srednjih vrednosti τD barvila Atto 647N DPPE v celični membrani, za različne čase inkubacije in koncentracije nanodelcev. Merske napake so podane iz spodnjega kvartila (Q₁) in zgornjega kvartila (Q3) meritev τD.

(30)

4.1 Diskusija

Pri 24-urni inkubaciji s TiO2 (slika 4.1) opazimo, da je difuzija nekoliko počasnejša pri celicah z dodanim TiO₂. Kokot in sodelavci so z meritvami transkriptomike pokazali, da pljučne epiteljiske celice po izpostavitvi TiO₂ nanodelcem, povečajo sintezo holesterola [8]. To bi lahko bil vzrok za spremembe v difuziji, saj holesterol zmanjšuje fluidnost membrane. Možno je, da celice poskušajo s povečanjem koncentracije holesterola v membrani preprečiti vdor nanodelcem v svojo notranjost.

Če primerjamo rezultate obeh časov inkubacij, opazimo večje razlike med τ_D pri inkubaciji s TiO₂ za 24 h. Razlika med srednjimi vrednostmi τ_D v celicah, izpostavljenih TiO₂ glede na neizpostavljene, je večja kot pri inkubaciji za 48 h. Tudi raztros meritev znotraj istega pogoja je večji pri inkubaciji za 24 h, kar bi lahko nakazovalo, da se v obdobju med 24 h in 48 h v celici ponovno vzpostavijo začetni pogoji. To se tudi sklada z rezultati, predstavljenimi v magistrskem delu Mojce Pušnik, ki je preučevala vpliv nanodelcev TiO2 na mitohondrije epitelijskih celic LA-4 [40]. Pokazali so, da nanodelci vplivajo na velikost in morfologijo mitohon- drijev, kar je eden od znakov celičnega stresa. Po 3-urni inkubaciji so bili ti bolj fragmentirani in sferični v primerjavi s kontrolo, po 48 h pa so se mitohondriji v veliki meri že obnovili in vrnili v prvotno stanje [8].

Med rezultati pri različnih količinah dodanih nanodelcev ne opazimo očitnih razlik.

Lahko, da smo maksimalni odziv celične membrane dosegli že z manjšo količino nanodelcev. Ob času meritve vidimo le trenutno količino nanodelcev v celici, ne vemo pa, kakšna je bila ta pred tem. Možno je, da je celica že izločila nekaj nanomateriala, kar bi tudi vplivalo na stanje celične membrane. Meritve smo opravili le v dveh časovnih točkah. Lahko, da imajo celice maksimalen odziv ob drugih časih in da se ta razlikuje za različne koncentracije.

Pri primerjavi rezultatov ne smemo pozabiti tudi na vpliv drugih dejavnikov. Eden od pomembnih je gostota celic v vzorcu. Če je celic malo, so te bolj sploščene in raztegnjene, saj iščejo sosednje celice. Ko pa je teh več, se med seboj povezujejo in so tesno ena ob drugi. To vpliva tudi na celično membrano. Tej se z gostoto celic (konfluentnost) veča njena viskoznost ter urejenost [41]. Na sliki 4.3 so prikazani rezultati meritev τ_D na različno gostih vzorcih. Iz podatkov je razvidno, da so lahko razlike zaradi konfluentnosti večje kot odziv na nanodelce, kar bi pojasnilo neujema- nje rezultatov τ_D kontrolnega vzorca, omenjenega zgoraj. Vzorci so bili sicer vedno pripravljeni na enak način, vendar je pri presajanju težko zagotoviti popolnoma enako gostoto celic v vzorcih. Tudi hitrost rasti celic ni vedno enaka in je odvisna od starosti celic (generacija od odmrznitve). Na rezultate vpliva tudi lokalna gostota na mestu, kjer smo opravljali meritve, saj se gostota celic po vzorcu spreminja.

Na rezultate lahko vpliva tudi naša izbira celic, saj ni nujno, da izbrane celice ustrezno predstavljajo celotno populacijo. Tej potencialni pristranskosti operaterja smo se posebej posvetili v naslednjem delu naloge, v okviru katerega smo razvili avtomatizirano izvedbo meritev FCS.

Meritve FCS smo opravili tudi na lipidih, ki sestavljajo bio-nano agregate na zunanji strani membrane, saj nas je zanimalo, kako se njihovo gibanje razlikuje od tistega v membrani. Ti agregati nastanejo, ko začne celica izločati z lipidi in proteini ovit nanomaterial. Pri teh meritvah je bilo bledenje fluoroforov veliko bolj izrazito in kljub popravkom nismo dobili smiselnih avtokorelacijskih krivulj. Vemo, da lahko bližina površine TiO2 vpliva na fotofizkalne lastnosti barvila, konkretno pospeši ble-

(31)

4.1. Diskusija

Slika 4.3: Odvisnost difuzijskega časa τD za vzorce z različno gostoto celic, razli- čen delež pokritosti površine s celicami. Škatle imajo obliko določeno s spodnjim kvartilom (Q₁, 25 %) in zgornjim kvartilom (Q₃, 75 %) ter s sredinsko črto, ki ozna- čuje srednjo vrednost. Rezultate statističnega testa predstavljata oznaki n.s. (not significant) zap >0,001 (znatna verjetnost, da se porazdelitvi ne razlikujeta) in ***

za p <0,1, ki se nahajata nad vodoravnima črtama, ki povezujeta primerjan par vzorcev. Raztros točk vzdolž x osi znotraj ene skupine meritev je dodan za boljšo preglednost.

denje [42]. Dodaten razlog za neustrezne avtokorelacijske krivulje, je lahko tudi sprememba mobilnosti lipidov v agregatih saj se se nekateri lipidi vežejo na povr- šino TiO₂ [13]. PrimerF(t) in avtokorelacijske krivulje take meritve je prikazan na sliki 4.4.

(a) (b)

Slika 4.4: Primer meritve FCS barvila Atto 647N DPPE na bio-nano agregatu. Na sliki (a) je prikazana odvisnost intenzitete izsevane svetlobe od časa, na sliki (b) pa njej pripadajoča avtokorelacijska krivulja. Vidimo, kako se F(t) zaradi bledenja s časom zmanjšuje.

(32)

(33)

Poglavje 5

Avtomatizacija meritev fluorescenčne korelacijske spektroskopije

Analiza heterogenih bioloških vzorcev z FCS je časovno zamudna, saj moramo opra- viti veliko število meritev, da te dobro opišejo naš vzorec. Zaradi časovne zahtevnosti in ponavljajoče oblike eksperimenta smo se odločili, da poizkusimo meritve avtoma- tizirati. Razvoj avtomatizacije meritev je tako pomemben metodološki rezultat tega dela. V prihodnosti bo avtomatizacija omogočala tudi ustrezno izbiro celic, glede na želeni kriterij, naj bo to gostota vzorca, lokalna doza nanodelcev ali pa nekaj povsem tretjega. Za delo z mikroskopom uporabljamo program Imspector, ki ima uporab- niški vmesnik Specpy v programskem jeziku Python. S pomočjo dokumentacije [43]

smo napisali svoj program za krmiljenje mikroskopa.

5.1 Samodejno popravljanje gorišča

Kot vedno pri mikroskopiji je tudi pri meritvah FCS pomembno, da naš vzorec vedno ostane v gorišču. Vzorec se lahko izmakne iz gorišča zaradi termičnih fluktuacij, ki vplivajo na mikroskop in njegove optične lastnosti. Še eden od morebitnih razlogov je nagib samega vzorca, do česar lahko pride zaradi nagiba mikroskopske mizice ali pa zaradi nepravilnosti v vsebniku vzorca. Fokus ponavadi popravljamo pred vsako meritvijo oz. ko se premaknemo na drugo pozicijo v vzorcu. Pri avtomatizaciji pa želimo, da bi mikroskop to zmogel sam. Tako je bilo potrebno v naš program dodati funkcijo, ki ugotovi, ali se je vzorec premaknil vzdolž optične osi (z), in to ustrezno popravi. To smo storili s snemanjem v ravnini xz, kjer vidimo prečni prerez vzorca (slika 5.1). Na takem posnetku lahko vidimo mejo vzorca, saj so celice razpotegnjene in pritrjene na podlago. Na delih kjer, ni celice, pa lahko vidimo rob stekelca, saj se na njem nabere nekaj fluorescentnega barvila. Z analizoxz posnetka smo želeli določiti pozicijo stekelca. Pri prehodu iz območja pod celico na območje stekelca je skok intenzitete velik. Odločili smo se, da med seboj primerjamo vsote intenzitet nekaj zaporednih vrstic vzdolž osiz. Na sliki 5.1 so z rdečimi pravokotniki označene vrstice, ki jih združimo. Velikosti pravokotnikov na sliki so simbolične in so večje za boljšo preglednost. Tako seštejemo intenziteto signala vseh pikslov znotraj enega pravokotnika, ∑︁

. Nato izračunamo razlike med vsotama sosednjih obočij:

∑︁

i−1−∑︁

i−2, ∑︁

i−∑︁

i−1, ∑︁

i+1−∑︁

i ... Kjer je razlika med sosednjima vsotama največja (torej kjer je spreminjanje signala najhitrejše, največji dF/dz), se nahaja signal stekelca, v našem primeru je to pravokotnik z indeksom i. Pred vsako meri-

(34)

Poglavje 5. Avtomatizacija meritev fluorescenčne korelacijske spektroskopije

Slika 5.1: Posnetek v xz ravnini, na katerem vidimo celico na stekelcu. Ravnina xz je prečna na optično ravnino in tako vidimo prerez celice, ki smo ji dodali lipidno barvilo Atto 647N DPPE. Temno območje na sredini celice je jedro, v katerega lipidno barvilo ne prodre, zato iz tega območja ne dobimo signala. Z rdečimi pravokotniki so označena območja, v katerih seštejemo intenziteto signala, pri določanju pozicije stekelca.

tvijo FCS tako določimo novo pozicijo stekelca in jo primerjamo z referenčno in tako ugotovimo premik vzdolž z osi, na podlagi katerega ustrezno spremenimo pozicijo objektiva. Referenčno vrednost nastavimo na začetku meritev in tako izberemo, katero ravnino želimo ohranjati v gorišču. Na sliki 5.2 je prikazan primer, kako z našim algoritmom popravimo položaj vzorca po tem, ko smo ga sami izmaknili iz gorišča.

Slika 5.2: Zaporedje slik celice, posnetih pri avtomatiziranem popravljanju fokusa.

Slike (1) so posnete v xy ravnini, slike (2) pa v xz ravnini. Na slikah (2) je z rdečo črto označena goriščna ravnina v kateri so bile posnete ujemajoče slike (1). Na sliki (a) vidimo začetni legi, sliki (b) pa sta bili posneti po tem, ko smo premaknili vzorec (vzdolž z osi). Na podlagi (2b) algoritem zazna premik glede na izhodišče, ter ustrezno prilagodi pozicijo objektiva, kar vidimo na slikah (c).

(35)

5.2. Samodejna izbira pozicij za meritve FCS

5.2 Samodejna izbira pozicij za meritve FCS

Končna ideja avtomatizacije je, da mikroskop preišče celoten vzorec ter najde pri- merne celice ter znotraj njih izbere primerno regijo in tam posname meritve FCS.

Zato smo najprej avtomatizirali premike vzorca, da smo lahko samodejno pregledali n x n vidnih polj velikosti 100 x 100 µm. Nato smo sestavili algoritem, ki vsako vidno polje razdeli na 2,5 x 2,5 µm velike kvadratke in izmed njih izbere za FCS primerno regijo glede na lokalne lastnosti signala. Za samodejno izbiro regije smo

(a) (b)

Slika 5.3: Posnetki spodnjih membran celic LA-4 z rdeče označenimi regijami, ki ustrezajo pogojem standardnega odklona in intenzitete signala. Na sliki (a) so ozna- čene vse regije v celici, ki ustrezajo kriterijem, na sliki (b) pa le tisti dve (po ena na celico), ki sta bili izbrani za meritev F(t).

postavili dva kriterija. 1) Da smo meritve omejili na dele, kjer je zanesljivo celica, ne pa barvilo na stekelcu (slika 5.3a), je morala biti celokupna intenziteta signala vseh pikslov znotraj kvadratka dovolj visoka. Nekaj signala namreč dobimo tudi od ste- kla, saj se nanj prime nekaj fluorescentnega barvila. Veliko več barvila pa se nahaja v membrani, zato je signal na teh predelih višji. 2) Da smo se znotraj celice izognili vesiklom barvila, membranskim zavihkom in podobnim neravnim strukturam, od koder običajno dobimo neuspešne in neprimerljive meritve zaradi bledenja barvila ali svetlih agregatov, je morala biti intenziteta signala znotraj kvadratka tudi dovolj homogena, kar smo ocenili z izračunom standardnega odklona vrednosti intenzitete za vse piksle znotraj kvadratka. S pomočjo preteklih meritev smo določili spodnjo mejo za vsoto intenzitete ter zgornjo za standardni odklon. Na sliki 5.3a so z rdečimi kvadratki označeni deli, ki ustrezajo našim pogojem.

Kot vidimo, je znotraj posamezne celice veliko primernih regij. Ker pa se celice med seboj razlikujejo, želimo za zanesljivo ovrednotenje celotnega vzorca meritve FCS posneti na čim več različnih celicah. V posameznem vidnem polju se lahko nahaja le ena celica, lahko pa tudi več, odvisno od konfluentnosti vzorca. V primerih, ko je v vidnem polju več celic, bi radi izbrali po eno regijo na celico. Zato smo izbrali dve, ki sta bili med seboj oddaljeni vsaj 40 µm. Tako smo poskušali izbrati regiji, ki z veliko verjetnostjo nista del iste celice. Primer take izbire vidimo na sliki 5.3b.

(36)

Mikroskop je nato vzorec premaknil na pozicijo izbrane regije, kjer je posnel F(t).

Pred vsako meritvijo je program tudi popravil gorišče mikroskopa. Poleg meritve F(t) smo shranili tudi sliko vsakega vidnega polja, na kateri so označene in oštevil- čene izbrane regije (sliki 5.3b), tudi če ni bilo nobene regije, ki bi ustrezala našim pogojem. To nam omogoča hiter pregled, saj tako vidimo, kje je mikroskop opravljal meritve, na podlagi česar lahko izločimo morebitne neustrezne izbire.

Algoritem samodejnega iskanja regij smo zasnovali tako, da omogoča čim večjo pri- lagodljivost za nadaljnje raziskovalno delo. Poleg števila območij, lahko nastavljamo tudi druge parametre in tako prilagodimo program zahtevam posameznega eksperimenta. Spreminjamo lahko velikost regij, število regij za analizo na posameznem območju, število ponovitev na posamezni regiji ter določimo časovno omejitev celotnega eksperimenta.

Naš program smo testirali na vzorcu, ki je bil pripravljen na enak način kot vsi ostali. Izbrali smo si celice z majhno konfluentnostjo ter brez dodanih nanodelcev (S_n : S_c = 0 : 1). Izračunane avtokorelacijske funkcije G(τ) smo ročno pregledali na enak način, kot je opisano prej. Rezultati τ_D iz meritev, ki so bile pridobljene z avtomatiziranim načinom merjenja, so prikazani na sliki 5.4. Na istem grafu so tudi meritve vzorca z 20 % konfluentnimi celicami, ki smo jih dobili z ročnim zajema- njem podatkov (prikazani že na sliki 4.3). Vidimo, da dobimo podobne vrednosti

Slika 5.4: Odvisnost difuzijskega časa τ_D barvila Atto 647N DPPE v celični membrani, pri avtomatiziranem in ročnem merjenju. Škatle imajo standardno obliko s spodnjim kvartilom (Q₁, 25 %) in zgornjim kvartilom (Q₃, 75 %) ter s sredinsko črto, ki označuje srednjo vrednost. Raztros točk vzdolž x osi znotraj ene skupine meritev je dodan za boljšo preglednost.

in podoben raztros meritev, ker nakazuje na zanesljivo delovanje avtomatiziranega zajemanja F(t).

Drug način validacije metode je primerjava svetlosti barvil (število izsevanih fotonov posamezne molekule na sekundo). Na svetlost izbranega barvila namreč ne vpliva sam vzorec (učinkovitost označevanja, starost celic, konfluentnost...) ampak optične lastnosti (moč in fokusiranost laserja ter učinkovitost detekcije). V našem primeru,

(37)

5.2. Samodejna izbira pozicij za meritve FCS

bi lahko bistveno vplivalo nastavljanje gorišča, saj se meritvam izven goriščne ravnine zmanjša svetlost, kar je eden od delov eksperimenta, ki smo ga avtomatizirali.

Seveda pa to ni edini faktor, vplivajo tudi druge lastnosti sistema, kot sta na primer moč laserjev in poravnanost optičnih poti, ki pa so bile pri ročnem in avtomatiziranem zajemanju podatkov enake.

Podatke o svetlosti dobimo iz programa FoCuS_scan kot ⟨F(t)⟩/N, kjer je N iz- računan iz amplitude prilagojene funkcije. Primerjava svetlosti pri ročnem in avtomatiziranem načinu merjenja, je prikazana na sliki 5.5. Prikazani so rezultati istih eksperimentov kot na sliki 5.4. Vidimo, da je srednja vrednost pri avtomatiziranem

Slika 5.5: Odvisnost svtlosti molekul barvila Atto 647N DPPE v celični membrani, pri avtomatiziranem in ročnem merjenju. Škatle imajo standardno obliko s spodnjim kvartilom (Q₁, 25 %) in zgornjim kvartilom (Q₃, 75 %) ter s sredinsko črto, ki označuje srednjo vrednost. Raztros točk vzdolž x osi znotraj ene skupine meritev je dodan za boljšo preglednost.

merjenju nekoliko višja, ter da je raztros meritev nekoliko večji. Najslabše bi bilo, če bi se svetlost pri avtomatiziram merjenju zmanjšala, saj bi to kazalo na poslab- šanje v načinu zajemanja F(t). Ker se rezultati svetlosti in τ_D pri avtomatskem zajemanju ne razlikujejo bistveno od tistih pri ročnem, lahko potrdimo zanesljivo delovanje našega programa. V primeru bistvenega odstopanja bi seveda lahko ko- relirali parametre analize (svetlost, τ) s parametri regije (povprečna intenziteta in njen standardni odklon) in tako identificirali vzroke odstopanja, kar bi nato tudi odpravili s prilagoditvijo pogojev za izbiro regije.

(38)

(39)

Poglavje 6 Zaključek

Z uporabo fluorescenčne korelacijske spektroskopije smo preučevali spreminjanje difuzije lipidov v celični membrani ob prisotnosti nanodelcev TiO2. Uspeli smo po- kazati, da ti pri krajših inkubacijskih časih (24 h) upočasnijo difuzijo lipidov, po daljšem času (48 h) pa nismo več zaznali vpliva nanodelcev na difuzijo. Pri nadalj- nih raziskavah, bi lahko opravili meritve še pri krajših inkubacijskih časih (npr. 3 h in 8 h). Tako bi lažje ocenili, kdaj je vpliv nanodelcev na membrano največji.

Glede na to, da iz naših rezultatov ni povsem očiten vpliv količine nanodelcev na difuzijo, bi lahko dodali še meritve na vzorcih z razmerjem med površino nanodelcev in celic 0,1:1 ter 100:1.

V tem delu smo želeli čim bolje opisati posamezen vzorec in smo zato meritve opravljali na čim večjem številu celic. Zanimiva pa bi bila tudi analiza difuzije znotraj posameznih celic. Lahko bi na vsaki opravili večje število meritev na različnih mestih (npr. na robu celice, na zgornji membrani blizu nanodelcev, pod jedrom...), in opazovali lokalne spremembe. Za pojave na manjših skalah bi lahko uporabili tudi STED, ki omogoča spreminjanje ločljivosti in s tem spremljanje efektivnega difuzijskega koeficienta na različnih krajevnih/časovnih skalah, kar omogoča vpogled v načine difuzije (npr. preskakovanje molekul med nanodomenami) [44].

Z novimi meritvami, bi dobili dodatne informacije o interakcijah med celicami in nanodelci: kdaj in kje je odziv membrane največji, kako se ta spreminja s koli- čino nanomaterila in koliko časa potrebuje celica, da se povrne v začetno stanje. Z meritvami v okolici bio-nano agregatov, bi lahko bolje razumeli njihov nastanek in njihovo zgradbo. Vse to pa bi lahko posplošili še na druge vrste nanomateriala ter različne celične linije.

Postavili smo tudi novo metodo za zajemanje meritev F(t), ki je v celoti avtoma- tizirana in izbira ustrezne regije na podlagi lastnosti signala. S to metodo bomo lahko denimo odziv celic primerjali z lokalno dozo nanodelcev, ki se lahko med celicami znotraj istega vzorca močno razlikuje. V nadaljnjem razvoju so mogoče nove izboljšave, ki bi še dodatno olajšale delo, predvsem pa omogočile zajem več, bolj za- nesljivih in objektivno primerljivih podatkov. S pomočjo strojnega učenja, bi lahko naučili računalnik, da sam prepozna celice. Dodatna izboljšava bi bila klasifikacija celic, ki bi omogočala izbiro le tistih, ki zadoščajo določenim pogojem eksperimenta.

Strojno učenje bi lahko uporabili tudi za klasifikacijo meritev. Računalnik bi že ta- koj, na podlagi lastnostiF(t), zavrgel tiste meritve, iz katerih ne bi dobili uporabnih avtokorelacijskih krivulj ali celo razpoznal regije, iz katerih dobimo neuporabne G.

Tak program bi lahko uporabljali tudi za številne druge eksperimente, ne le za FCS.

(40)

Poglavje 6. Zaključek

S tem magistrskim delom smo torej prispevali tako k metodološkemu razvoju na- prednih mikro-spektroskopih tehnik kot tudi k razumevanju kompleksnih bioloških procesov na hitro rastočem področju nanotoksikologije.

(41)

Literatura

[1] B. Naseer, G. Srivastava, O. S. Qadri, S. A. Faridi, R. U. Islam in K. You- nis, Importance and health hazards of nanoparticles used in the food industry, Nanotechnology Reviews7, 623 (2018).

[2] K. Schmid in M. Riediker, Use of nanoparticles in Swiss Industry: a targeted survey, Environmental science & technology42, 2253 (2008).

[3] J. R. McCarthy, J. M. Perez, C. Brückner in R. Weissleder, Polymeric Nano- particle Preparation that Eradicates Tumors, Nano Letters 5, 2552 (2005).

[4] W. Li, Z. Cao, R. Liu, L. Liu, H. Li, X. Li, Y. Chen, C. Lu in Y. Liu,AuNPs as an important inorganic nanoparticle applied in drug carrier systems, Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology 47, 4222 (2019).

[5] P. Ganguly, A. Breen in S. C. Pillai, Toxicity of Nanomaterials: Exposure, Pathways, Assessment, and Recent Advances, ACS Biomaterials Science & En- gineering 4, 2237 (2018), pMID: 33435097.

[6] WHO, Plasma membrane and cytoplasm, https://www.who.int/

westernpacific/health-topics/air-pollution, [ogled 21. 12. 2021].

[7] C. Buzea, I. I. Pacheco in K. Robbie,Nanomaterials and nanoparticles: sources and toxicity, Biointerphasel 2, MR17 (2007).

[8] H. Kokot, B. Kokot, A. Sebastijanović, C. Voss, R. Podlipec, P. Zawilska, T. Berthing, C. Ballester-López, P. H. Danielsen, C. Contini, M. Ivanov, A. Kri- šelj, P. Čotar, Q. Zhou, J. Ponti, V. Zhernovkov, M. Schneemilch, Z. Douman- dji, M. Pušnik, P. Umek, S. Pajk, O. Joubert, O. Schmid, I. Urbančič, M. Irmler, J. Beckers, V. Lobaskin, S. Halappanavar, N. Quirke, A. P. Lyubartsev, U. Vo- gel, T. Koklič, T. Stoeger in J. Štrancar, Prediction of Chronic Inflammation for Inhaled Particles: the Impact of Material Cycling and Quarantining in the Lung Epithelium, Advanced Materials 32 (2020).

[9] W. Qirui, L. Jinfeng, W. Xiaohong, F. Lingyan, W. Jinbo, Z. Xiaoli, W. Wei- jia in G. Xiuqing, Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects, BioMedical Engineering OnLine19, 17666 (2020).

[10] J. T. Buchman, N. V. Hudson-Smith, K. M. Landy in C. L. Haynes, Under- standing Nanoparticle Toxicity Mechanisms To Inform Redesign Strategies To Reduce Environmental Impact, Accounts of Chemical Research52, 1632 (2019).

[11] S. Runa, M. Hussey in C. K. Payne,Nanoparticle–Cell Interactions: Relevance for Public Health, The Journal of Physical Chemistry B 122, 1009 (2018).