UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
David BELAJ
VPLIV TRANSPOZONSKIH ELEMENTOV, MALIH RNA IN METILACIJE NA SPOL RASTLINE
DIPLOMSKO DELO
Univerzitetni študij - 1. stopnja
_
Ljubljana, 2021
ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
David BELAJ
VPLIV TRANSPOZONSKIH ELEMENTOV, MALIH RNA IN METILACIJE NA SPOL RASTLINE
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
EFFECT OF TRANSPOSONS, SMALL RNA AND METILATION ON PLANTS SEX DETERMINATION
B. SC. THESIS
Academic Study Programmes
.
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.
Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala izr. prof. dr. Natašo Štajner.
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednik: doc. dr. Iztok PRISLAN
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: prof. dr. Katarina VOGEL MIKUŠ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Član: izr. prof. dr. Nataša ŠTAJNER
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo
Datum predstavitve: 06.09.2021
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du1
DK UDK 601.4:577.21:581.16(043.2)
KG transpozon, mikro RNA, metilacija, spol rastlin AV BELAJ, David
SA ŠTAJNER, Nataša (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN VPLIV TRANSPOZONSKIH ELEMENTOV, MALIH RNK IN METILACIJE NA SPOL RASTLINE
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja) OP VI, 16 str., 3 sl., 32 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Spol in njegova determinacija je pri rastlinah manj raziskana kot pri živalih. Zaradi različnih kombinacij in sistemov izražanja spola pri rastlinah, še niso raziskani vsi mehanizmi determinacije, ter oblike, ki je pri živalih ni moč zaslediti. Nekateri mehanizmi so že stari, nekateri pa so se razvili šele nedavno. Raziskovanje ima tudi praktično uporabnost pri pridobivanju hibridov, saj nam olajša delo in omogoča bolj ekonomično pridelavo. Znanje je uporabno tudi za določanje spola pri rastlinah, kjer nimamo samooplodnih vrst ali pa rastlinam lahko določimo spol šele ob cvetenju po več letih. Zanimivo je tudi raziskovanje mehanizmov določanja spola, kot je npr. metilacija, RNA interferenca in vpliv transpozonov, itd.. Ti mehanizmi so bili raziskani pri meloni, kakiju in topolu. Pri meloni za pridobivanje hibridov uporabimo fenotip z le ženskimi cvetovi, kar regulira transpozon. Pri kakiju sicer poznamo samooplodne vrste, vendar se za proizvodnjo uporabljajo tudi nekatere enospolne rastline, pri čemer so zaželene ženske rastline, kar regulirata gena preko miRNA in RNA interference. Topol je modelna olesenela rastlina in spol je determiniran preko vzorca metilacije.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 601.4:577.21:581.16(043.2)
CX transposon, micro RNA, methylation, plant sex AU BELAJ, David
AA ŠTAJNER, Nataša (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study in Biotechnology PY 2021
TI EFFECT OF TRANSPOSONS, SMALL RNA AND METILATION ON PLANTS SEX DETERMINATION
DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes) NO VI, 16 p., 3 fig., 32 ref.
LA sl AL sl/en
AB Sex determination in plants is less studied than in animals. The multiple and very different time periods over which sex emerges in plants make it difficult to understand because of the diversity of systems, but at the same time provide us with a unique opportunity that does not exist in animals. This is an insight into how sex evolves over time, as some mechanisms are old, and others are young. The research also has a practical use for the production of hybrids, as it facilitates them and allows for more economical production. The findings are also useful for determining the sex of plants where we do not have self-fertile species or can only determine the sex of plants at flowering time after several years. Also of interest are more unusual mechanisms of sex determination, such as methylation, RNA interference, and transposons. These mechanisms have also been studied in melon, persimmon and poplar. In melon hybrids are wanted and for their production a phenotype with female-only flowers regulated by transposon can be used. In persimmon, there are available self-fertile species, but some dioecious varieties are still used, so there we want female plants and sex in this case is regulated by miRNA and RNA interference. Poplar is a model woody plant where sex can be determined by a methylation pattern.
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ... III KEY WORDS DOCUMENTATION ...IV KAZALO VSEBINE ... V KAZALO SLIK...VI
1 UVOD ...1
1.1 NAMEN IN POVOD DELA ...1
2 PREUČEVANJE SPOLA PRI RASTLINAH ...2
2.1 SISTEMI SPOLNIH KROMOSOMOV ...2
2.2 POJAV DVODOMNOSTI...3
3 VPLIV RAZLIČNIH EPIGENETSKIH MEHANIZMOV NA IZRAŽANJE SPOLA .4 3.1 TRANSPOZONSKI ELEMENTI...4
3.2 MALE RNA ...5
3.2.1 RNA interferenca ...5
3.2.2 Vpliv miRNA na transpozone ...5
3.3 METILACIJA ...6
4 PRIMERI VPLIVA RAZLIČNIH MEHANIZMOV NA IZRAŽANJE SPOLA ...8
4.1 VPLIV METILACIJE NA SPOL ...8
4.2 VPLIV miRNA NA SPOL ...9
4.3 PRIMER VPLIVA TRANSPOZONA NA SPOL...10
5 POMEN RAZUMEVANJA SPOLOV RASTLIN ...12
6 VIRI ...13
VI KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Prikaz metiliranosti genoma na različnih mestih in razlike med spoloma ... 8 Slika 2: Prikaz korakov prehoda kakija iz enodomne v dvodomno rastlino z razvojem MeGI in OGI genov ... 10 Slika 3: Prikaz interakcij med geni, ki določajo spol v meloni ... 11
1 1 UVOD
Pri rastlinah je determinacija spola bolj zapletena kot pri živalih, pri katerih so se spoli razvili že davno in le enkrat, kar kaže akumulacija mutacij (Charlesworth, 2013). Pri nekaterih rastlinah so se različni spoli razvili že v preteklosti, pri drugih pa šele nedavno. To se kaže v razvitosti nerekombinantnih regij za gene povezane z določitvijo spola in v homolognosti kromosomov. Starejši sistemi imajo večje nerekombinantne regije, ki poleg spolnih genov vsebujejo tudi mutacije, transpozone, itd. in kromosoma se ločita po velikosti. Pri mlajših sistemih pa je nerekombinantna regija majhna in je histološko težko določljiva.
1.1 NAMEN IN POVOD DELA
Spol pri rastlinah je pomemben predvsem iz gospodarskega vidika in kot tudi za pridobivanje bazičnih znanj. Gospodarsko je pomemben spol pri rastlinah, kjer:
• je rastna doba dolga, preden se lahko določi spol po cvetovih (kivi, datljeve palme),
• divje rastline za križanje niso hermafroditi (divje vrste vinske trte),
• ima le en spol želen produkt (hmelj, jagode, indijska konoplja),
• je zaželena hermafroditna oblika rastline (papaja).
Raziskovanje in razumevanja pojava in razvoja spolov pri rastlinah, v nasprotuje z živalmi, kjer so se spoli razvili že davno, je bolj raznoliko, saj so se ti pojavili večkrat in so različnih starosti, kar lahko sklepamo iz akumulacije mutacij (Charlesworth, 2013). Te se nabirajo zaradi prenehanja rekombinacij med geni, ki so povezani z določanjem spola. Če lahko ocenimo kako hitro se te dogajajo, lahko ocenimo starost, vendar je takšna ocena starosti le približna, saj potrebuje še veliko dela, saj je treba za vsako vrsto posebej določiti pogostost mutacij, na kar vplivajo tudi dolge generacijske dobe rastlin (Gaut in sod., 1996). Razumevanje, kako se takšni geni razvijejo skozi čas, nam pomaga razumeti mehanizme v nerekombinatnih regijah.
V nalogi sem proučil kako transpozoni, mala RNA in metilacijalahko določa spol rastlin. To je v primerjavi s klasičnim načinom spolnega kromosoma z spolnimi geni bolj neobičajen in redek način. Pojavljanje v nekaterih pomembnih kmetijskih rastlinah in porast zanimanja za hibride, kaže na pomembnost razumevanja tudi redkih mehanizmov.
2 2 PREUČEVANJE SPOLA PRI RASTLINAH
Preučujemo lahko le rastline, ki se razmnožujejo spolno. To je 11 % vseh rastlin, kar vključuje eno in dvodomne rastline, teh je 14.620 od 240.000 kritosemenk, kar predstavlja približno 6 % (Kristenhusz in Byng, 2016). Enodomnim ne moremo določiti spola, vendar lahko še vedno raziskujemo mehanizme razvoja cvetov, še posebej kjer so cvetovi ločeni, kot na koruzi.
Njihovo raziskovanje otežuje dejstvo, da ne moremo s sekvenciranjem določiti spolnih genov.
Pri vrstah kjer imamo veliko primerkov, kot so kmetijske rastline, imamo tudi mutante za gene povezane s določitvijo spola, kar olajša delo iskanja genov. Pri dvodomnih je lažje določiti kje se nahajajo spolni geni. Z napredkom tehnologije sekvenciranja je to še lažje, vendar so nekatere vrste šele nedavno razvile dvodomnost in kromosomi še niso jasno ločeni.
2.1 SISTEMI SPOLNIH KROMOSOMOV
Sistem spolnih kromosomov pomeni, kako je določen spol posameznika glede na kombinacije kromosomov in kako ti vplivajo na spol. Najpogosteje se pri rastlinah pojavlja sistem XY, kjer je X največkrat daljši in ima več genov kot pa Y. Sistem XX določa ženski spol in ima dve kopiji genov, zato se ena kopija izklopi, da ne vpliva na razmerje izraženih genov in posledično proteinov. Moški spol določa Y kromosom, ki je krajši in ima manj genov, vendar so nekateri različni od tistih na X kromosomu. Drug pogost sistem je ZW, ki je najbolj pogost pri pticah in ostalih plazilcih, pri rastlinah pa je prisoten pri arašidih (Kafkas in sod., 2015), jagodah (Spigler in sod., 2008) in vrbi (Pucholt in sod., 2015). Razlika med XY in ZW je, da v slednjem homologna kromosoma ZZ določata moškega posameznika.
2.2 RAZVOJ CVETOV
Trenuten model za razvoj cvetov pri rastlinah je osredotočen na prisotnost in kombinacije štirih genov ABCDE ki vplivajo na razvoj cvetov. Geni skupine A vplivajo na razvoj čašnih listov in skupaj z B na razvoj venčnih listov. Geni skupine B in C skupaj vplivajo na razvoj prašnikov, razvoj pestiča pa vplivajo samo geni iz skupine C. V skupino E spadajo geni, ki vplivajo na vse dele cvetov in po modelu kompleksa dveh proteinskih dimerov pomagajo pri interakcijah s proteini in DNA in s tem pri določitvi cvetnih struktur. Geni skupine D vplivajo na razvoj plodnice. Predhodno je bil postavljen model ABC i sicer glede na analize mutant Arabidopsis thaliana in Antirrhinum majus, pri katerih so deli cvetov zamenjani z drugimi, na primer na mestu prašnikov so venčni listi, namesto venčnih so čašni listi, itd. Pri poskusih spreminjanja navadnih listov v cvetove preko indukcije izražanja ABC genov in neuspehu, so predvideli, da verjetno obstajajo še drugi geni, ki vplivajo na razvoj cvetov in tako so odkrili D in E skupini genov (Weigel in Meyerowitz, 1994).
3 2.3 POJAV DVODOMNOSTI
Teoretični model predpostavlja, da se morata zgoditi vsaj dve spremembi za razvoj dvodomnosti iz enodomnosti (za XY sistem) - recesivna mutacija za moško sterilnost in dominantna žensko-supresivna mutacija. Najverjetneje se je najprej pojavil ženski spol, ki so imele več semen, ker niso porabile hrane za moške organe. To jim je omogočilo, da so se lahko razširile v populaciji in nastala je mešanica ženskih in hemafroditnih rastlin. Ti geni se ne smejo rekombinirati, saj vsak spodbuja svoj spol in zavira oz. sterilizira drugega. Če pride do rekombinacije, lahko pride do situacije, kjer ima rastlina gena za sterilnost za oba spola in s tem je cela rastlina sterilna, ter jo evolucija izloči. Tako so na spolnih kromosomih nerekombinantne regije, ki se pojavijo:
• Z inverzijo regije,
• Z inaktivacija preko metilacije in nabiranjem mutacij skozi čas,
• Okoli centromer.
K razumevanju mehanizmov nastanka dvospolnih rastlin nam pomaga različna starost spolnih kromosomov in s tem povezana njihova razvitost. Tako dobimo zaporedje dogodkov v prehajanju iz eno- v dvodomne rastline, kar pri živalih ni možno (Charlesworth, 2013).
4
3 VPLIV RAZLIČNIH EPIGENETSKIH MEHANIZMOV NA IZRAŽANJE SPOLA Različni molekularni mehanizmi, kot je npr. metilacija, RNA interferenca in premeščanje transpozonov imajo vpliv na izražanje spola pri rastlinah. Pri različnih rastlinskih vrstah so odkrili vpliv različnih mehanizmov na izražanje spola (npr. od melone, kakija in topola).
Nekateri mehanizmi se prekrivajo, kot npr. premik transpozona, ki povzroči metilacijo, le-ta pa ustavi transkripcijo.
3.1 TRANSPOZONSKI ELEMENTI
Transpozoni so genski elementi, ki imajo zmožnost premikanja znotraj genoma. To lahko storijo na več načinov, vendar se delijo na dve večji skupini, retrotranspozoni in DNA transpozoni. Slednji so med premeščanjem v DNA obliki, prvi pa se spremenijo v RNA in nato nazaj v DNA. DNA transpozoni imajo več načinov premeščanja. Najbolj raziskan je način, kjer se transpozon izreže in vstavi nekje drugje v genomu. To jim omogoča njihov genski zapis za encim transpozazo. Ta v kombinaciji z dolgimi terminalnimi ponavljajočimi odseki (ang. Long terminal repeats oz. LTR) na koncih transpozona, omogoča izrez, prenos na drug del in ponovno vgraditev v genom. Ob vsaki vgraditvi se lahko transpozon poveča na koncih, kjer se doda nekaj nukleotidov, odvisno od vrste transpozona. Transpozoni se lahko tudi podvojujejo (Wicker in sod., 2007) in v kombinaciji LTR so eden glavnih razlogov za povečevanje genomov. V koruzi predstavljajo 70 % genoma (Baucom in sod., 2009)
Retrotranspozoni so v genomu v DNA obliki, nato preko transkripcije nastane nova RNA kopija, ki se s pomočjo reverzne transkriptaze spremeni v DNA in takšna vgradi v genom. Ker vsakič nastane nova kopija, so eden najbolj pogostih ponovljivih delov genoma (Vastenhouw in Plasterk, 2004). So najpogostejši transpozonski elementi v rastlinah in so veliki od nekaj sto do 25 tisoč baznih parov. Obdajajo jih LTR, ki obsegajo od nekaj sto do 5 tisoč baznih parov.
Pri vgradnji se ti podaljšajo še za 4-6 baznih parov. Vsebujejo gene za RNAzo, reverzno transkriptazo za prepis iz RNA v DNA; integrazo za vgraditev DNA v genom; ter nekaj virusnih genov kot je genza virusni proteinski plašč, proteaza za razcep proteinov na delujoče dele, gene za polimerizacijo in signale za pakiranje. To kaže na sorodnost LTR transpozonov in retrovirusov. Tako je možno, da so virusi nastali iz transpozonov in/ali, da so transpozoni inaktivirani virusi.
DNA transpozoni nimajo vmesne RNA faze. Najenostavnejši in najbolj raziskan način je, da prerežejo obe verigi in se cel transpozon premakne drugam. S premikom iz že podvojene DNA v nepodvojeno oziroma pred replikacijske vilice, lahko povečajo svoje število. Tako se transpozon podvoji dvakrat in ena od hčerinskih celic vsebuje dve kopiji (Wicker in sod., 2007).
5 3.2 MALE RNA
Male RNA molekule ali sRNA (ang. Small RNA) so skupina RNA molekul, ki so v rastlinah večinoma dolge 21-24 nukleotidov. Odkrite so bile šele pred dobrimi 20 leti in s prejemom Nobelove nagrade leta 2006 za njihovo odkritje, se je zanimanje zanje povečalo. Razlog za velik del zanimanja je njihova funkcija v celicah in organizmu, saj lahko spreminjajo nivo izražanja genov. To je zanimivo v medicini, kjer bi lahko zdravili z utišanjem nezaželenega gena ali obratno, odpravili utišanje željenega gena. Uporabno je tudi drugje v znanosti, saj njihova specifičnost omogoča preučevanje vpliva zmanjšanega izražanja genov na fenotip.
3.2.1 RNA interferenca
Male RNA se delijo glede na to iz kakšne oblike RNA je nastala molekula in kakšen je njen izvor. Večina malih RNA je znotrajceličnega izvora, kjer je pomemben del celične regulacije.
Rečemo jim mikroRNA in tako kot mRNA nastanejo s transkripcijo. Prepoznamo jih po njihovi strukturi, saj se enoverižna RNA zvije, da nastane lasnica in komplementarno poveže in tako strukturo encimi prepoznajo kot dvoverižno RNA (dsRNA, ang. Double stranded RNA). V jedru encimi procesirajo pri-miRNA v miRNA, ki se premesti v citoplazmo. Tam encim ribonukleaza III odcepi lasnico in ostane le še dsRNA. Te male RNA še niso funkcionalne in se morajo vezati z več proteini, eden izmed njih je najpogosteje iz skupine proteinov Argonaut.
RNA in proteini tvorijo RISC kompleks (ang. RNA-induced silencing complex). Takšen kompleks se lahko poveže s komplementarno mRNA v dvoverižno RNA in povzroči odcep adenina iz poli-A repa ter razgradnjo mRNA. Druga pot za nastanek miRNA je eksogenega izvora, oziroma izven celice. Pride lahko na primer iz virusa ali pa je umetno sintetizirana dvoverižna RNA. Ta RNA, ki se imenuje mala interferenčna RNA (siRNA, ang. small- interference RNA) Lahko vpliva na regulacijo v celici, zato se celica poskuša zaščititi, Ta RNA potuje preko ribonukleaze III do kompleksa RISC, kjer se vgradi. Ob kompletaciji z RNA v citoplazmi razcepi tujo ali endogeno RNA in to je npr. tudi eden od mehanizmov preprečevanja izgradnje virusnih ali nezaželenih proteinov. Skupno se ti procesi imenujejo RNA interferenca (Morgado, 2020).
3.2.2 Vpliv miRNA na transpozone
RNA interferenca vpliva tudi na transpozone, še posebej na ponovljive dele oziroma LTR. LTR so lahko miRNA ali rasiRNA (repeat-associated siRNA), torej siRNA, ki vsebuje ponavljajoče elemente. Tako celica lahko prepreči podvajanje retrotranspozonov, ko so ti v obliki RNA.
Dodatno obstaja še en mehanizem RNA interference, ki lahko povzroči začetek oziroma jedro metilacije. Preko vezave siRNA na proteinski kompleks RITS (RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing) namesto na RISC, se lahko metilira citozin. V človeških celicah, vinski mušici in Schizosaccharomyces pombe je bilo pokazano, da je na tak način lahko metiliran promotor. Ta se nato poveže s histonom in tako postane del zvitega neaktivnega genoma oziroma heterokromatina. Mehanizem delovanja RNA usmerjene DNA metilacije
6
(RdDM, ang. RNA-directed DNA methylation) je najbolj raziskan na vrsti Arabidopsis thailana oz. navadnem repnjakovcu (Vastenhouw in Plasterk, 2004).
Vpliv malih RNA na razvoj rastlin je viden na mutantu A. thaliana, ki ima mutiran gen CARPEL FACTORY ali CAF. S kloniranjem teha gena so ugotovili, da je verjetno sestavljen iz RNA helikaze in ribonukleaze III (Voinnet, 2001), brez katere ni možna RNA interferenca in s tem regulacija ekspresije genov. To se v cvetovih odraža kot neregulirane celične delitve, kar povzroči večje število prašnikov, podaljšane internodije med prašniki in pestiči, ter večje število sterilnih nezdruženi pestičov in več pestičem podobnih struktur, ki se ne razvijejo. Pod mikroskopom se vidi, da ima večina prašnikov le polovico pelodnih vrečk, nekateri pa nobene.
Pelod je funkcionalen, vendar pa so pestiči zaradi svoje rastni sterilni. Vpliva tudi na ostale dele rastline, povzroči npr. manjše klične in odrasle liste, ki so lahko tudi huje okvarjeni. Skoraj vedno so odsotni stranski poganjki, ki tudi ob odrezu glavne poganjka ne poženejo, kar namiguje na njihovo odsotnost in ne le hormonsko zaviranje rasti (Bohmert in sod., 1998).
3.3 METILACIJA
Metilacija je proces vezave CH3 skupine na drugo molekulo, med drugimi tudi na DNA. To je v evkariontih skoraj vedno citozin in redkeje adenin. Ta mesta se delijo glede na sekvence in kjer sta citozin in gvanin zaporedna v verigi oziroma sta povezana s fosfatom se sekvenca zapiše kot CpG (ang. Cytosine phosphate guanine). Metilirane so tudi sekvence CpNpG in CpNpN, kjer je N lahko adenin, citozin ali timin (Massimiliano in Vincento, 2011). Razmerje med temi sekvencami je odvisno od organizma, na primer v celicah sesalcev je sekvenc CpNpG in CpNpN malo, pri vrsti A. thaliana pa predstavljajo skupaj tretjino metiliranih mest (Massimiliano in Vincento, 2011). V celicah metilacijo izvaja DNA metiltransferaza, ki citozin pretvori v 5-metilcitozin. Večina CpG mest v človeškem genomu je metiliranih, vendar izstopajo mesta, ki jim rečemo CpG otoki, ki niso metilirana. Ta so povezana s promotorji, saj je metilacija obratno korelirana s transkripcijsko aktivnostjo (Vanyushin in Ashapkin, 2011, Cokus in sod. 2006). Tako geni, kateri so nujni in stalno izraženi, nimajo metiliranih promotorjev. Pri vrsti A. thaliana, ki so mutante za gene MET in zato nimajo mehanizma metilacije, imajo naslednje generacije zavrto rast. To kaže na pomembnost regulacije genov preko metilacije (Dowen in sod., 2012).
Metilacija ni stalna sprememba in se čez čas lahko spremeni. Pomemben del diferenciacije celice je tudi sprememba metilacijskega profila. V človeških embrionalnih matičnih celicah so metilirani tudi CpNpG in CpNpN, kar izgine z diferenciacijo (Ramsahoye in sod., 2000).
V prokariontih je večinoma metiliran adenin. (O'Brown in Greer, 2016). Na osnovi metilacije je omogočeno razločevanje med prokariontsko in tujo DNA. Metiladenin so zaznali tudi v celicah sesalcev, vendar prisotnosti zaradi tehnoloških omejitev ter bakterijskih in RNA kontaminacij, ni mogoče dokončno potrditi (Douvlataniotis in sod. 2014).
7
Metilira se lahko tudi RNA, kar ima vpliv na funkcijo mRNA (Wassenegger in sod., 1994).
Metilacija se dogaja v jedru, po transportu v citoplazmo pa je metilacija pri vezavi s proteini signal, ki vpliva na stabilnost, translacijo in lokalizacijo mRNA. Eden izmed vplivov metilacije mRNA je tudi na izrezovanje in spajanje mlade v zrelo mRNA, kar so pokazali pri v vinski mušici (Drosophila melanogaster). Tako metilacija vpliva na zaporedje končne mRNA gena Sex lethal, ki vpliva na spol vinske mušice (Lence in sod., 2016).
Raziskovanje metilacije je možno na različne načine. Dva pogosta sta z restrikcijskim encimi in BS-seq (tretiranje z natrijev bisulfitom in sekvenciranje). Prvi način na osnovi restrikcijskih encimov omogoča ločevanje metiliranih in nemetiliranih vzorcev na osnovi restrikcijskih encimov občutljivih na metilacijo. Tako lahko na restrikcijskem mestu ugotovimo, če je DNA metilirana. Vendar pa je resolucija pri tem načinu nizka, zato je v primeru, da želimo imeti boljšo resolucijo, kar se tiče metilacije, uporabimo BS-seq. Pri tretiranju z natrijevem bisulfitom se nemetiliran citozin spremeni v uracil, metiliran citozin pa ostane nespremenjen, kar lahko zaznamo s sekvenciranjem. Tako po primerjavi z netretirano sekvenco dosežemo resolucijo 1 baznega para (Cokus in sod., 2008).
Rastline imajo glede na živali več metilirane DNA in metiltransferaz. CpNpG in CpNpN mesta so metilirana večinoma preko RNA usmerjene metilacije. Takšna mesta so tudi DNA zaporedja, kjer se veže represor. V takem primeru metilacija preko male RNA povzroči povečano izražanje gena. Poznamo primer pri petunijah, kjer so po vnosu transgena pMADS3:GUS (transkripcijski faktor združen z genom za obarvanje tkiva) opazili neobičajno povečanje izražanja fenotipa pMADS3, ki se kaže kot deformirani cvetovi. Raziskava je pokazala, da gre verjetno za malo RNA, ki preko mehanizma, možno preko vezave na metiltransferazo (Zhang in sod., 2015), povzroči metilacijo na mestu vezave represorja oziroma cis-elementa na DNA in prepreči njegovo vezavo. Tako spodbudi transkripcijo (Shibuya in sod., 2009). To je nenavadno, saj večina metilacij zmanjša ekspresijo zaporedji, kar je pomembno tudi pri regulaciji transpozonov in nekodirajoče DNA. Tako so v regijah, kjer so zapisane sRNA opazili večjo stopnjo metilacije (Glaich in sod., 2019).
8
4 PRIMERI VPLIVA RAZLIČNIH MEHANIZMOV NA IZRAŽANJE SPOLA 4.1 VPLIV METILACIJE NA SPOL
Olesenele rastline imajo velikokrat dolge rastne dobe preden lahko preko cvetov določimo spol.
Med olesenelimi rastlinami je topol modelna rastlina, na kateri je narejenih veliko raziskav.
Topol je večinoma dvodomna rastlina z moškimi cvetovi mačicami in ženskimi, ki se oprašijo s pomočjo vetra in se razvijejo v majhna rjava semena (Rushforth,1999). Bräutigam in sod.
(2017) so preučevali povezavo med metilacijo genoma in izražanjem spola pri topolu. Odvzeli so vzorce ksilema, ga tretirali z bisulfitom in sekvencirali (BS-seq). Po primerjavi so ugotovili največje razlike v regiji gena PbRR9. Ta ima pri moških rastlinah metiliran promotor in prvi intron, četrti intron pa je metiliran nadpovprečno glede na ostale introne v genomu (slika 1). Po primerjavi s homolognima genoma ARR16 in ARR17 iz Arabidopsis thaliana so sklepali, da PbRR9 spada v skupino prenašalcev signalov citokininov. Ti so povezani z začetkom razvoja socvetji. Na osnovi rezultatov raziskave so predvideli, da obstaja gen za metiltransferazo, ki metilira PbRR9 gen in s tem zmanjša izražanje gena.
Slika 1: Rdeče so ženske rastline, modre pa moške. Na levi je os za odstotek metiliranih citozinov. V prvih in zadnjih dveh razlika v metilaciji med spoloma ni dovolj velika, da bi ju ločili. V ostalih pa je razlika očitna. To kaže na spolno specifično metilacijo (Bräutigam in sod., 2017: 2)
9 4.2 VPLIV miRNA NA SPOL
Kaki spada v rod ebenovcev (Diospyros) in je ena iz najpomembnejših kmetijskih rastlin iz tega rodu. Akagi in sod. (2014) so preiskovali mehanizme določanja spola pri kakiju. Čeprav obstajajo sorte, ki so samoplodne, se uporabljajo tudi enospolne vrste. Drevesa začnejo cveteti po nekaj letih (vsaj 5 let) in šele takrat lahko določimo spol rastlin. Zaradi tega je iz gospodarskega vidika pomembno, da lahko že v zgodnji fazi lahko določimo spol pri rastlini, saj plodove dobimo le na ženskih rastlinah.
Ne glede na spol imajo vsi cvetovi zasnovo za vse dele cveta, vendar pa se posamezni deli ne razvijejo do konca. Tako imajo moški cvetovi razvite prašnike, pri pestiču pa je rast v določeni fazi zavrta in se ne razvije. Ženski cvetovi imajo razvite pestiče in prašnike, vendar se cvetni prah v njih ne formira. Pri moških rastlinah se lahko razvijejo trije cvetovi skupaj, pri ženskih rastlinah pa zraste le glavni cvet, stranska se lahko le nakažeta in propadeta. To razliko v spolu so opazili že pri mutantu ječmena, kjer mutacija Vrs1 (Homeodomain leucine zipper protein) gena omogoči razvoj stranskih cvetov. Njemu ortologna gena, OGI (po japonsko moško drevo) in MeGI (po japonsko žensko drevo), določata spol rastlin kakija. OGI je je moško specifičen gen oz. dominatni žensko-supresivni gen, ki se izraža v razvijajočih popkih, ima več stop kodonov ter se nahaja na Y kromosomu. MeGI gen je prisoten pri obeh spolih, saj se nahaja na avtosomnem kromosomu in njegovo izražanje usmeri razvoj v ženske cvetove.
Za ugotovitev mehanizma delovanja so v navadnem repnjakovcu (A. thaliana), kjer so dobro razvite metode transformacije, z vnosom konstitutivnega promotorja in gena MeGI dobili rastline s sterilnimi prašniki. Ugotovili so, da ekspresija OGI gena vpliva na zmanjšano transkripcijo MeGI gena. Pri analizi so ugotovili, da pride do nastanka lasnične zanke zaradi visoke podobnosti med regijami OGI in MeGI gena, kar pomeni, da se OGI gen obnaša kot interferenčna RNK (slika 2).
V ženskih rastlinah se gen MeGI prepiše in nastanek produkta vpliva na sterilnost prašnikov. V rastlinah z OGI genom oziroma moških, se ta prepiše, RNA se transportira iz jedra in razcepi na miRNA. Zaradi homologije pride do hibridizacije med mRNA MeGI gena in miRNa nastale iz OGI gena. To prepreči prepis MeGI gena v protein zaradi fizične prepreke, pospešenega odcepljanjja poli-A repa in hitrejšega razpada mRNA.
OGI je dominantni žensko-supresivni gen, MeGI je recesivni gen, ki povzroča moško sterilnost.
V modelu za pojav dvodomnosti manjka mehanizem za žensko sterilnost. Verjetno obstaja gen, ki v moških rastlinah prepreči razvoj ženskih delov cvetov in s tem nastanek hermafroditov ali pa gen OGI po neznanem mehanizmu vpliva na razvoj pestičev.
10
Slika 2: Slika prikazuje prehod iz enodomne v dvodomno. Prvo se pojavi gen MeGI, ki prepreči razvoj prašnikov in rastline se delijo na enodomne in ženske. Druga delitev je posledica pojava inverzije MeGI, ki jo sedaj poimenujemo OGI (Akagi in sod., 2020: 12)
4.3 PRIMER VPLIVA TRANSPOZONA NA SPOL
Spol v melonah je v primerjavi z kakijem in topolom določen s tremi geni, ki so med seboj povezani. Tako ima melona 5 različnih fenotipov glede na to kakšni cvetovi so na rastlini in sicer: andromonoecična, kjer ima moške in hermafroditne cvetove, dvodomno, kjer ima le ženske ali le moške cvetove, enodomno z enospolnimi cvetovi in hermafroditno, kjer so prisotni dvospolni cvetovi. Gospodarsko so pomembni hibridi, vendar je njihovo pridobivanje časovno zahteven postopek. Postopek lahko poenostavimo tako, da križamo ženske in andromonoecične rastline, ter tako nadzorujemo oprašitev in preprečimo samooprašitev. Tako so potomci ženskih rastlin hibridi. Ženskih in andromonoecičnih kultivatorjev je malo, zato je pomembno poznavanje mehanizmov razvoja spola in analiza markerjev za zaznavanje takih rastlin po mutagenezi ali načrtovanju genskih sprememb.
Andromonoecičen gen (a) ima zapis za protein CmACS11 (1-aminociklopropan-1-karboksilna kislina sintaza 11), ki preprečuje delovanje CmWIP1 (transkripcijski faktor), gena za žensko obliko (g). CmWIP1 prepreči razvoj pestičev in delovanje CmACS-7 (1-aminociklopropan-1- karboksilna kislina sintaza 7), ki ima zapis za enodomnost (m). Različne kombinacije izražanja povzročijo različne fenotipe. Interakcije med geni so prikazane tudi na sliki 3.
Boualem in sod. (2008) so preučevali vpliv vgraditev transpozona blizu ženskega gena na njegovo izražanje. Močno metiliran transpozon se premakne v bližino gena in povzroči
11
metilacijo sosednjih nukleotidov. Med njimi tudi odprtega bralnega okvira 3 (ORF3), ki je v ženskih rastlinah hipermetiliran. To bi lahko pripisali že predhodni metilaciji, ki služi kot podlaga za nadaljno metilacijo. Če se transpozon umakne, se metilacija povrne na prejšnjo raven. To omogoči prepis gena, ki se v hipermetilirani oblike ne more izražati. Pomanjkanje CmWIP1 proteina povzroči, da so vsi cvetovi ženski.
Slika 3: Mehanizmi delovanja med spolnimi geni v meloni. Pod točko A so prikazani različni spolni fenotipi in njihovi genotipi. Kombinacije g, m in a lokusov določa različne fenotipe. Pod točko B so prikazane interakcije med temi lokusi oziroma geni, ki jih predstavljajo. Tako v rastlinah, ki ima transpozon vgrajen blizu gena CmWIP1 ali pa imajo aktiven alel gena CmACS11, se CmWIP1 ne izraža in razvije se pestič. Odsotnost aktivnega alela dodaja več možnosti genotipa, kot je to v primeru hermafroditnega fenotipa (Boualem in sod., 2015)
12
5 POMEN RAZUMEVANJA SPOLOV RASTLIN
Razumevanje mehanizmov določitve spola pri rastlinah je manj raziskano kot pri živalih, kar je glede na večjo raznolikost kombinacij fenotipov vezanih na spol, pričakovati. Raziskave so trenutno omejene na modelne in nekatere kmetijske rastline. Zelo pomembne pa so molekularne tehnike in metode, kot npr., transformacije, ki so ključne pri pridobivanju transgenih rastlin. S pomočjo molekularnih tehnik lahko spreminjamo pogoje v celicah rastlin oz. vplivamo na delovanje genov in tako raziskujemo delovanje teh kompleksnih sistemov. Za transformacijo rabimo za vsak rod ali celo vrsto posebej razvit postopek, kar je dolgotrajno in drago, zato so ti postopki razviti in uporabni predvsem pri pomembnih kmetijskih rastlinah. Razumevanje različnih mehanizmov in delovanje genov je uporabno tudi pri pridobivanju hibridov. Pri vrstah, kjer je to enostavno, so hibridi široko komercialno uporabni, pri zahtevnejših vrstah kot je melona, pa so potrebne dodatne raziskave. Te so pomembne za razumevanje mehanizmov in poznavanje markerjev, ki olajšajo najti željeno rastlino po mutagenezi, ali kaj spreminjamo pri genski transformaciji. Modelna rastlina je A. thaliana, kjer na osnovi izbijanja (homolognih) genov določajo funkcijo posameznega gena. Pri nekaterih vrstah, kot so kaki, melona in topol, pa so redkejši primeri odkritja novih mehanizmov in novih metod genskega spreminjanja.
Področje je še zelo neraziskano, veliko je še skrite uporabne vrednosti, še posebej za žlahtnjenje novih boljših sort.
13 6 VIRI
Akagi T., Henry I. M., Tao R., Comai L. 2014. A Y-chromosome-encoded small RNA acts as a sex determinant in persimmons. Science, 346, 6209: 646-650
Akagi T., Shirasawa K., Nagasaki H., Hirakawa H., Tao R., Comai L., Henry I. M. 2020. The persimmon genome reveals clues to the evolution of a lineage-specific sex determination system in plants. PLoS Genetics, 16, 2, e1008566, doi:10.1371/journal.pgen.1008845: 26 str.
Baucom R.S., Estill J.C., Chaparro C., Upshaw N., Jogi A., Deragon J.M., Westerman R.P., SanMiguel P.J., Bennetzen J.L. 2009. Exceptional diversity, non-random distribution, and rapid evolution of retroelements in the B73 maize genome. Plos Genetics 5, e1000732, doi:10.1371/journal.pgen.1000732: 13 str.
Bohmert K., Camus I., Bellini C., Bouchez D., Caboche M., Benning C. 1998. AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. The EMBO Journal, 17, 1: 170–
180
Boualem A., Fergany M., Fernandez R., Troadec C., Martin A., Morin H., Sari M. A. , Collin F., Flowers J. M., Pitrat M., Purugganan M. D., Dogimont C., Bendahmane A. 2008. A conserved mutation in an ethylene biosynthesis enzyme leads to andromonoecy in melons.
Science, 321, 5890: 836-838
Boualem A., Troadec C., Camps C., Lemhemdi A., Morin H., Sari M. A., Fraenkel-Zagouri R., Kovalski I., Dogimont C., Perl-Treves R., Bendahmane A. 2015. A cucurbit androecy gene reveals how unisexual flowers develop and dioecy emerges. Science. 350, 6261: 688-691 Bräutigam K., Soolanayakanahally R., Champigny M., Mansfield S., Douglas C., Campbell M.
M., Cronk Q. 2017. Sexual epigenetics: gender-specific methylation of a gene in the sex determining region of Populus balsamifera. Scientific Reports, 7, 45388, doi:
10.1038/srep45388: 13 str.
Charlesworth D. 2013. Plant sex chromosome evolution. Journal of Experimental Botany, 64, 2: 405–420
Christenhusz M. J. M., Byng J. W. 2016. The number of known plants species in the world and its annual increase. Phytotaxa, Magnolia Press, 216, 3: 201-217
14
Cokus S. J., Feng S., Zhang X., Chen Z., Merriman B., Haudenschild C. D., Pradhan S., Nelson S. F., Pellegrini M., Jacobsen S. E. 2008. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning. Nature, 452, 7184: 215–219
Gaut B. S., Morton B. R., McCaig B. C., Clegg M. T. 1996. Substitution rate comparisons between grasses and palms: synonymous rate differences at the nuclear gene Adh parallel rate differences at the plastid gene rbcL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93, 19: 10274–10279
Glaich O., Parikh S., Bell R. E., Mekahel K., Donyo M., Leader Y., Shayevitch R., Sheinboim D., Yannai S., Hollander D., Melamed Z., Lev-Maor G., Ast G., Levy C. 2019. DNA methylation directs microRNA biogenesis in mammalian cells. Nature Communications, 10, 1, 5657: doi:10.1038/s41467-019-13527-1: 11 str.
Dowen R. H. , Pelizzola M., Schmitz R. J., Lister R., Dowen J. M., Nery J. R., Dixon J. E., Ecker J. R. 2012. Stress-induced dynamic DNA methylation. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109, 32: 2183-2191
Douvlataniotis K., Bensberg M., Lentini A., Gylemo B., Nestor C. E. 2020. No evidence for DNA N6-methyladenine in mammals. Science Advances, 6, 12, doi:
10.1126/sciadv.aay3335: 9 str.
Morgado L. 2020. Diversity and types of small RNA. V: Plant Small RNA. Academic Press:
37-47
Kafkas S., Khodaeiaminjan M., Güney M., Kafkas E. 2015. Identification of sex-linked SNP markers using RAD sequencing suggests ZW/ZZ sex determination in Pistacia vera L.. BMC Genomics, 16, 1, 98, doi: 10.1186/s12864-015-1326-6: 11 str.
Lence T., Akhtar J., Bayer M., Schmid K., Spindler L., Ho C. H., Kreim N., Andrade-Navarro M. A., Poeck B., Helm M., Roignant J. Y. 2016. m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature, 540, 7632: 242–247
Martin A., Troadec C., Boualem A., Rajab M., Fernandez R., Morin H., Pitrat M., Dogimont C., Bendahmane A. 2009. A transposon-induced epigenetic change leads to sex determination in melon. Nature, 461, 7267: 1135-1138
O'Brown Z. K., Greer E. L. 2016. N6-Methyladenine: A Conserved and Dynamic DNA Mark. Advances in Experimental Medicine and Biology, 945: 213–246
15
Pucholt P., Rönnberg-Wästljung A. C., Berlin S. 2015. Single locus sex determination and female heterogamety in the basket willow (Salix viminalis L.). Heredity, 114, 6: 575–583 Ramsahoye B. H., Biniszkiewicz D., Lyko F., Clark V., Bird A. P., Jaenisch R. 2000. Non -CpG
methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3a. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America, 97, 10: 5237-5243
Rushforth K. 1999. Trees of Britain and rope. 1st ed. Harpercollins Pub Ltd: 1336 str.
Shibuya K., Fukushima S., Takatsuji H. 2009. RNA-directed DNA methylation induces transcriptional activation in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America, 106, 5: 1660-1665
Spigler R. B., Lewers K. S., Main D. S., Ashman T. L. 2008. Genetic mapping of sex determination in a wild strawberry, Fragaria virginiana, reveals earliest form of sex chromosome. Heredity, 101, 6: 507–517
Vanyushin B. F., Ashapkin V. V. 2011. DNA methylation in higher plants: Past, present and future. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms, 1809, 8: 360- 368
Vastenhouw N. L., Plasterk R. H. 2004. RNAi protects the Caenorhabditis elegans germline against transposition. Trends in genetics : TIG, 20, 7: 314–319
Voinnet O. 2001. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in genetics : TIG, 17, 8: 449–459
Zhang G., Estève P. O., Chin H. G., Terragni J., Dai N., Corrêa I. R. Jr., Pradhan S. 2005. Small RNA-mediated DNA (cytosine-5) methyltransferase 1 inhibition leads to aberrant DNA methylation. Nucleic Acids Research, 13, 43, 12: 6112-6124
Wassenegger M., Heimes S., Riedel L., Sänger H. L. 1994. RNA-directed de novo methylation of genomic sequences in plants. Cell, 76, 3: 567–576
Weigel D., Meyerowitz E. M. 1994. The ABCs of floral homeotic genes. Cell, 78, 2: 203–209 Wicker T., Sabot F., Hua-Van A., Bennetzen J. L., Capy P., Chalhoub B., Flavell A., Leroy P., Morgante M., Panaud O., Paux E., SanMiguel P., & Schulman A. H. 2007. A unified classification system for eukaryotic transposable elements. Nature reviews. Genetics, 8, 12:
973–982
16
Yamasaki S, Fujii N, Matsuura S, Mizusawa H, Takahashi H. 2001. The M locus and ethylene- controlled sex determination in Andromonoecious cucumber plants. Plant & Cell Physiology, 42, 6: 608–619
