BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ŠTUDIJ BIOTEHNOLOGIJE
Nika DRNOVŠEK
NOVEJŠI PRISTOPI GENETSKIH MODIFIKACIJ RASTLIN ZA OBRAMBO PROTI VIRUSOM
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
Ljubljana, 2021
Nika DRNOVŠEK
NOVEJŠI PRISTOPI GENETSKIH MODIFIKACIJ RASTLIN ZA OBRAMBO PROTI VIRUSOM
DIPLOMSKO DELO Univerzitetni študij - 1. stopnja
NEW APPROACHES OF PLANT GENETIC MODIFICATIONS FOR DEFENCE AGAINST VIRUSES
B. SC. THESIS Academic Study Programmes
Ljubljana, 2021
II
Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študijskega programa prve stopnje Biotehnologija.
Študijska komisija 1. in 2. stopnje študija biotehnologije je za mentorja diplomskega dela imenovala prof. dr. Jerneja Jakšeta.
Komisija za oceno in predstavitev:
Predsednik: prof. dr. Polona JAMNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: prof. dr. Jernej JAKŠE
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: doc. dr. Minja ZORC
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za zootehniko
Datum predstavitve: 3. 9. 2021
III
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Du1
DK UDK 602.6:582.5/.9:632.38(043.2)
KG rastlinski virusi, RNAi, ZFN, TALEN, CRISPR-Cas AV DRNOVŠEK, Nika
SA JAKŠE, Jernej (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij biotehnologije, Univerzitetni študijski program prve stopnje Biotehnologija
LI 2021
IN NOVEJŠI PRISTOPI GENETSKIH MODIFIKACIJ RASTLIN ZA OBRAMBO PROTI VIRUSOM
TD Diplomsko delo (Univerzitetni študij - 1. stopnja) OP VI, 22 str., 1 sl., 67 vir.
IJ sl JI sl/en
AI Rastlinski virusi so intracelulearni patogeni, ki povzročajo veliko škodo v kmetijstvu.
Virusne bolezni povzročajo občuten padec v kvaliteti in količini pridelka, kar ogroža svetovno preskrbo s hrano. Tradicionalne metode nadzora nad virusi niso zadosti učinkovite, zato so vse bolj pomembni novi biotehnološki pristopi. Prvi takšen pristop je zaščita na osnovi RNA interference (RNAi). RNA interferenca je sekvenčno specifičen mehanizem za utišanje genov, ki ga posredujejo majhne interferenčne RNA ali mikroRNA.
Ta tehnologija je že bila uporabljena za obrambo mnogo gospodarsko pomembnih rastlin pred virusi, kot so krompirjev Y virus (PVY), virus mozaika kumare (CMV), virus šarke (PPV) in virus obročkaste pegavosti papaje (PRV). Drugi pristop uporablja različne proteinske in encimske sisteme, ki specifično ciljajo viruse in njihove sestavne dele ter s tem zagotavljajo zaščito pred virusi. Med te sisteme spadajo tehnologije preurejanja genoma, kot so ZFN, TALEN in CRISPR-Cas. Študije so pokazale, da so te metode učinkovite v obrambi pred številnimi rastlinskimi virusi še posebej pred virusi iz družin Geminiviridae in Potyviridae.
IV
KEY WORDS DOCUMENTATION ND Du1
DC UDC 602.6:582.5/.9:632.38(043.2)
CX plant viruses, RNAi, ZFN, TALEN, CRISPR-Cas AU DRNOVŠEK, Nika
AA JAKŠE, Jernej (supervisor)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Academic Study Programme in Biotechnology
PY 2021
TI NEW APPROACHES OF PLANT GENETIC MODIFICATIONS FOR DEFENCE AGAINST VIRUSES
DT B. Sc. Thesis (Academic Study Programmes) NO VI, 22 p., 1 fig., 67 ref.
LA sl AL sl/en
AB Plant viruses are intracellular pathogens that cause great damage in agriculture. Viral diseases present a threat to world’s food supply as they significantly reduce crop quality and yield. Traditional methods of virus control are not effective, therefore new biotechnological approaches are gaining importance. First strategy is protection based on RNA interference (RNAi). RNA interference is sequence-specific mechanism for gene silencing, mediated by small interfering RNAs or microRNAs. This technology has already been used to protect many economically important plants against viruses such as potato Y virus (PVY), cucumber mosaic virus (CMV), plum pox virus (PPV) and papaya ringspot virus (PRV). The second approach uses different protein and enzyme systems that specifically target viruses and their components, thus providing protection against viruses.
These systems include genome editing technologies such as ZFN, TALEN and CRISPR- Cas. Studies have shown that these plant modification methods are effective in protecting plants against several plant viruses, especially viruses from the families Geminiviridae and Potyviridae.
V
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO SLIK VI
1 UVOD 1
2 RASTLINSKI VIRUSI 1
2.1 RAZŠIRJANJE VIRUSOV 1
2.2 REPLIKACIJA 2
2.3 PRENOS VIRUSA PO RASTLINI 2
2.4 SIMPTOMI VIRUSNIH OKUŽB RASTLIN 3
2.5 DRUŽINA Potyviridae 3
2.6 DRUŽINA Geminiviridae 4
3 TEHNOLOGIJE MALIH RNA 4
3.1 UPORABA TEHNOLOGIJ MALIH RNA ZA OBRAMBO PROTI VIRUSOM 5
3.1.1 Postranskripcijsko utišanje inducirano s smiselno in protismiselno orientirano RNA 5 3.1.2 Postranskripcijsko utišanje genov inducirano z lasnično RNA 5 3.1.3 Postranskripcijsko utišanje inducirano z umetnimi miRNA 6 3.1.4 Postranskripcijsko utišanje inducirano s transaktivirajočimi siRNA 7
4 METODE PREUREJANJA GENOMA 7
4.1 NUKLEAZE CINKOVIH PRSTOV 8
4.1.1 Uporaba nukleaz cinkovih prstov za pridobitev odpornosti na viruse 8
4.2 TALE NUKLEAZE 9
4.2.1 Uporaba TALE nukleaz za pridobitev odpornosti na viruse 10
4.3 CRISPR-CAS SISTEMI 10
4.3.1 CRISPR-Cas9 11
4.3.2 CRISPR-Cas13 11
4.3.3 CRISPR-Cas12 11
4.3.4 CRISPR-Cas14 12
4.4 UPORABA CRISPR-Cas SISTEMOV ZA PRODOBITEV ODPORNOSTI 12
VI
4.4.1 Uporaba CRISPR-Cas sistemov za pridobitev odpornosti na DNA viruse 12 4.4.2 Uporaba CRISPR-Cas sistemov za pridobitev odpornosti na RNA viruse 12 4.4.3 Uporaba CRISPR-Cas SISTEMOV za pridobitev odpornosti s ciljanjem
gostiteljskih faktorjev 13
5 PRIMERJAVA PRISTOPOV 14
6 ZAKLJUČEK 15
7 VIRI 16
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Prikaz delovanja strategij RNAi in CRISPR-Cas za ciljanje rastlinskih virusov
(prirejeno po Zhao in sod., 2020) 15
1
1 UVOD
Zaradi strmega naraščanja svetovnega prebivalstva škoda, ki jo rastlinski virusi povzročajo v kmetijstvu, resno ogroža preskrbo s hrano. Za razliko od drugih rastlinskih patogenov virusov ne moremo nadzorovati s kemičnimi sredstvi, druge metode nadzora, kot so križna zaščita in gensko odporne sorte, pa imajo zaradi pogostih mutacij genoma rastlinskih virusov le časovno omejeno sposobnost obrambe proti virusom. Napredek genskega inženiringa je privedel do novih pristopov v zaščiti rastlin proti virusom. Prvi pristop je zaščita na osnovi RNA interference, drugi pristop pa za zaščito rastlin uporablja tehnologije preurejanja genoma, kot so ZFN, TALEN in CRISPR-Cas.
2 RASTLINSKI VIRUSI
Rastlinski virusi so obligatorni paraziti, saj je njihovo razmnoževanje odvisno od gostitelja (Rampersad in Tennant, 2018). Virusni genomi kodirajo le nekaj proteinov, zato sami nimajo ustreznih mehanizmov za replikacijo in jih morajo dobiti od gostitelja (Choudhary in sod., 2020).
Ločimo dvoverižne DNA (dsDNA) viruse, enoverižne DNA (ssDNA) viruse, dvoverižne RNA (dsRNA) viruse, viruse s pozitivno usmerjeno enoverižno RNA (ssRNA), viruse z negativno usmerjeno enoverižno RNA in viruse z reverzno transkripcijo RNA in DNA. Mednarodni komite za virusno taksonomijo (ang. International Committee on Taxonomy of Viruses; ICTV) klasificira rastlinske viruse v 19 družin, največ jih spada med viruse s pozitivno usmerjeno ssRNA (ICTV, 2020).
Glede na življenjski slog delimo viruse na perzistentne, akutne, kronične in endogene viruse.
Večina rastlinskih virusov je persistentnih virusov in rastline, ki so okužene s perzistentnim virusom, načeloma ne kažejo znakov okužbe. Perzistentni virusi ne potujejo med rastlinskimi celicami in se prenašajo le vertikalno z gametami. Akutni virusi se prenašajo tako vertikalno kot horizontalno in zelo dobro uspevajo v monokulturah. Kronični virusi se od akutnih razlikujejo v trajanju okužbe, saj kronični v rastlini ostanejo dlje časa. Endogeni virusi so integrirani v rastlinski genom (Rossinck, 2010).
2.1 RAZŠIRJANJE VIRUSOV
Rastlinski virusi se največkrat prenašajo z vektorji, semeni in cvetnim prahom, redkeje tudi med rastlinami, z okuženo vodo ali zemljo. Kar 70 % vektorjev za razširjanje virusov je insektov, največ jih spada v rod Hemiptera. Poleg insektov so vektorji še pajkovci, glive, nematode in protisti (Lefeuvre in sod., 2019).
Insekti širijo viruse na dva načina. Prvi način je notranji način, pri katerem virus vstopi v prebavila insekta z zaužitjem okužene rastline. Virus nato potuje po črevesju in vstopi v hemolimfo, preko
2
katere se prenese do žlez slinavk. Na koncu se prek cevk v zadnji čeljusti sprosti v floem (Raccah in Fereres, 2009).
Pri zunanjem prenosu virus ne vstopa v obtočilni sistem (Raccah in Fereres, 2009). Virusni delci se specifično in reverzibilno vežejo na ustni aparat insekta in se sproščajo s slino (Lefeuvre in sod., 2019).
2.2 REPLIKACIJA
Virusi za replikacijo od gostiteljske celice potrebujejo aminokisline, nukleotide, energijo, sisteme za sintezo proteinov in nukleinskih kislin ter nekatere strukturne komponente celice, kot je celična membrana (Hull, 2014).
Po vstopu v rastlino se virus veže na membranske receptorje in z endocitozo ali fuzijo prodre v celico. Sledi razgradnja kapside in sprostitev genoma v celico. Po sprostitvi genoma pride do replikacije, ki je odvisna od tipa virusnega genoma. Genom in virusni proteini se združijo v virione, sledi faza zorenja virionov. Zadnji korak je sprostitev viriona v medcelični prostor z lizo ali brstenjem (Louten, 2016).
Procesi replikacije dvoverižnih DNA virusov so najbolj podobni procesom, ki potekajo pri podvojevanju rastlinskega genoma. DsDNA se prepiše v mRNA, čemur sledi translacija in pomnožitev dsDNA v jedru. Enoverižni DNA virusi morajo najprej pretvoriti ssDNA v dsDNA, nato poteče replikacija na isti način kot pri dsDNA virusih (Rampersad in Tennant, 2018).
Dvoverižni RNA virusi imajo v virionih zapis za RNA sintezne encime. V celici se ena izmed verig prepiše v pozitivno usmerjeno ssRNA, temu sledi translacija ssRNA z gostiteljskimi sistemi za translacijo. Pozitivno usmerjena RNA služi tudi kot matrica za sintezo negativno usmerjene ssRNA, ki je matrica za nastajanje dsRNA. Enoverižna RNA virusov s pozitivno usmerjeno ssRNA služi kot mRNA in se direktno prevede v protein. Virusi z negativno usmerjeno ssRNA morajo imeti v virionu zapis za RNA-replicirajoči encim, ki kopira negativno usmerjeno RNA v pozitivno usmerjeno RNA, ki se naprej prevede v protein. Isti encim sintetizira genomsko negativno usmerjeno RNA na podlagi pozitivno usmerjene RNA. Retrovirusni virioni nosijo zapis za reverzno transkriptazo, ki spremeni ssRNA v dsDNA (Rampersad in Tennant, 2018).
2.3 PRENOS VIRUSA PO RASTLINI
Transport virusov po rastlini nadzorujejo gibalni (ang. movement) proteini. Po replikaciji se virus po celici prenese do plazmodezm, preko katerih se naprej prenaša med celicami (Tilsner in sod., 2014). Pomembno vlogo pri prenašanju virusov po rastlini imajo citoskelet in celični organeli.
Endoplazmatski retikulum pomaga pri prenašanju gibalnih proteinov do plazmodezem,
3
mikrofilamenti sodelujejo pri prehajanju virusov med celicami, mikrotubuli pa pri razgradnji gibalnih proteinov (Nelson in Citovsky, 2005). Plazmodezme so zelo majhne in se morajo za prehod virusov v drugo celico razširiti. Nekateri gibalni proteini preoblikujejo plazmodezme tako, da tvorijo tubul, skozi katerega lahko virusi preidejo v sosednjo celico. Virusi se intercelularno prenesejo do floema, po katerem se prenašajo na dolge razdalje. Plazmodezme sitastih celic niso selektivne in omogočajo enostaven prehod virusov v žilni sistem rastlin, zato je glavna ovira za virus omejen vstop skozi simplast preko celic spremljevalk (Tilsner in sod., 2014).
2.4 SIMPTOMI VIRUSNIH OKUŽB RASTLIN
Sprva so bili virusi karakterizirani glede na simptome, ki so jih kazale okužene rastline. Vendar takšna karakterizacija ni merodajna, saj več različnih virusov povzroča enake simptome, podobni simptomi pa se kažejo tudi ob okužbi z bakterijami ali nematodami (Bhat in Rao, 2020).
Znaki okužbe so odvisni od gostiteljske rastline, časa okužbe, seva virusa in okolja. Pogosti zunanji simptomi so lokalne lezije, ki se razvijejo blizu mest, kjer je virus vstopil v rastlino. Virusi povzročajo kloroze in nekroze okuženih celic, organov ali tkiv. Prav tako ovirajo rast, spremenijo obliko listov, cvetov, sadežev, korenin, internodijev in vplivajo na pigmentacijo cvetov. Na listih in plodovih lahko povzročijo nastanek svetlo in temno zelenih mozaikastih ali pegastih vzorcev. V celicah virusi povzročajo spremembe organelov. Virusna infekcija se kaže tudi v tvorbi inkluzijskih telesc (Bhat in Rao, 2020).
2.5 DRUŽINA Potyviridae
Družina Potyviridae je največja družina RNA virusov. Predstavniki te družine imajo pozitivno usmerjen enoverižni RNA genom velik približno 9,7 kb. Virioni so nitasti, dolgi 680–900 nm in široki 11–20 nm ter vsebujejo 30–36 kDa veliko kapsido. Družina je razdeljena na sledečih 8 rodov:
Brambyvirus, Bymovirus, Ipovirus, Macluravirus, Poacevirus, Potyvirus, Rymovirus in Tritimovirus. Večina virusov te družine ima monopartitni genom, le predstavniki rodu Bymovirus imajo bipartitnega (Wylie in sod., 2017). Rodovi imajo različne vektorje. Potyviruse in macluraviruse prenašajo listne uši, ipoviruse ščitkarji, poaceviruse, rymoviruse in tritimoviruse pršice, ter bymoviruse plazmodioforidi. Simptomi okužbe z virusi te družine so mozaikavost, pegavost, zakrnela rast in pojav kloroz ter nekroz. V družino Potyviridae spadajo številni virusi, ki okužujejo gospodarsko pomembne rastline. Primeri teh virusov so virus šarke (PPV), virus pritlikavosti in mozaika koruze (MDMV), virus progastega mozaika pšenice (WSMW) in virus mozaika solate (LMV) (Valli in sod., 2015).
4 2.6 DRUŽINA Geminiviridae
Družina sodi med viruse s krožno enoverižno DNA, kamor sodita tudi družini Nanoviridae in Circoviridae. Imajo značilno parno ikozaedrično obliko, po kateri so dobili ime. Genom geminivirusov je velik 2,7 kb in se prepisuje v obe smeri (Rizvi in sod., 2015). Na podlagi razlik v organizaciji genoma, vektorjev, načinov ekspresije genov, delovanja virusnih proteinov in podobnosti zaporedji delimo na družino Geminiviridae na sedem rodov: Becurtovirus, Begomovirus, Curtovirus, Eragovirus, Mastevirus, Topocuvirus in Turncurtovirus (Rizvi in sod., 2015; Buck, 1999). Vektorji Curtovirusov in mastevirusov so različne vrste malih škržatkov, begomoviruse pa raznašajo tobakovi ščitkarji (Bemisia tabaci). Predstavniki te družine povzročajo veliko škodo v gospodarstvu, saj okužujejo kmetijsko pomembne rastline, kot so paradižnik, koruza in stročnice (Rizvi in sod., 2015).
3 TEHNOLOGIJE MALIH RNA
Delovanje tehnologij malih RNA molekul za obrambo proti virusom temelji na konceptu, da prekomerna prisotnost ključnega genskega produkta virusa ali prisotnost disfunkcionalne oblike tega produkta ovira delovanje virusa v gostitelju, pri tem pa ne škoduje rastlini (Sanford in Johnston, 1985). V prvih poskusih so odpornost poskušali pridobiti s transgenimi rastlinami, ki so izražale virusne proteine (Taliansky in sod., 2021). Kot prvi so ta koncept uporabili Abel in sod.
(1986), ki so v tobak vstavili gen za plaščni protein virusa mozaika tobaka (TMV). Kasneje se je v mnogih primerih izkazalo, da odpornost posreduje RNA interferenca (Taliansky in sod., 2021).
RNA interferenca (RNAi) je sekvenčno specifičen sistem, ki z razgradnjo lastne ali tuje mRNA nadzoruje izražanje genov (Taliansky in sod., 2021). Ima pomembno vlogo pri razvoju, nadzoru transpozonov, metilaciji DNA in preoblikovanju kromatina. RNAi je tudi naravna obramba rastlin proti virusom, na kar kažejo prisotnost virusnih malih interferenčnih RNA molekul med virusno okužbo, povečana dovzetnost za virusno okužbo pri rastlinah z mutacijami v komponentah RNAi in razvoj mehanizmov za zaviranje RNAi pri večini virusov (Szittya in Burgyan, 2013).
Proces utišanja sprožijo dvoverižne ali lasnične RNA molekule. Te molekule DICER-ju podobni encimi (ang. DICER-like; DCL) preoblikujejo v 21–24 nukleotidov dolge male RNA, ki jih delimo na male interferenčne RNA (siRNA) in mikroRNA (miRNA). Male RNA molekule se nato vključijo v RISC kompleks (ang. RNA-induced silencing complex). Del RISC kompleksa je Agronaut protein (AGO), ki veže male RNA in tarčno mRNA. Prepoznavanje tarčne RNA poteka prek parjenja dušikovih baz. RISC kompleks razgradi mRNA in s tem utiša izražanje tarčnega gena. Od RNA odvisna RNA polimeraza (RDR) prepiše enoverižno RNA v dvoverižne RNA, ki jih nato ponovno preoblikuje DICER-ju podoben protein. S tem se cikel nadaljuje in ojača utišanje (Khalid in sod., 2017).
5
3.1 UPORABA TEHNOLOGIJ MALIH RNA ZA OBRAMBO PROTI VIRUSOM
Tehnologije malih RNA za odpornost proti virusom delimo v štiri skupine: postranskripcijsko utišanje inducirano s smiselno in protismiselno orientiranim virusnim zaporedjem, postranskripcijsko utišanje inducirano z lasnično RNA, postranskripcijsko utišanje inducirano z umetnimi miRNA in postranskripcijsko utišanje inducirano s transaktivirajočimi siRNA. Te tehnologije so bile uporabljene za pridobitev odpornosti pri mnogih gospodarsko pomembnih rastlinah npr. papaji, bananah, paradižniku, krompirju in papriki (Khalid in sod., 2017). Delovanje tehnologij malih RNA je skupaj s tehnologijami CRISPR-Cas prikazano na sliki 1.
3.1.1 Postranskripcijsko utišanje inducirano s smiselno in protismiselno orientirano RNA Postranskripcijsko utišanje inducirano s smiselno (ang. sense) in protismiselno (ang. antisense) orientirano RNA je prva generacija tehnologij malih RNA. RDR prekomerno izražena smiselna ali protismiselna zaporedja prepiše v dvoverižno RNA, ki se nato razreže v siRNA in ojača utišanje, ki so ga inducirale virusne siRNA iz replikacije. Nekatere rezistentne rastline pridobljene s to tehnologijo so že odobrene za komercialo uporabo. Največ dovoljenj so izdali v ZDA, največkrat pa so odobrene odporne linije krompirja. Pomanjkljivost metode je, da je rezistenca dobljena s to metodo zelo variabilna in nestabilna (Khalid in sod., 2017).
Krompir, ki je bil transformiran s konstruktoma s smiselnim zaporedjem ali s konstruktom s protismiselnim zaporedjem, je bil odporen na virus zvijanja listov krompirja (PLRV) (Kawchuk in sod., 1991). De Haan in sod. (1992) so dokazali, da je odpornost tobaka na virus pegavosti in uvelosti paradižnika (TSWV) RNA posredovana, saj je bila odpornost pri tobaku, ki je izražal le transkript, enaka kot odpornost pri tobaku, ki je izražal protein. Štiri linije z vstavljenim genom za nukleoprotein so imele povečano odpornost in so bile odporne tako na mehansko okužbo kot na okužbo s cvetličnim resarjem (Frankiniella occidentalis), ki je naravni vektor prenosa virusa.
Odpornost ni bila prisotna pri vseh rastlinah iz teh linij, zato so te razvile tipične simptome okužbe.
Prav tako te linije niso bile odporne na okužbe z drugimi topovirusi. Zanek in sod. (2008) so vzgojili pomaranče, ki izražajo gen za plaščni protein virusa krastavosti lubja citrusov (CPsV).
Količine izraženega gena so bile nizke in so variirale med linijami. Nobena izmed 21 linij ni razvila odpornosti proti CPsV.
3.1.2 Postranskripcijsko utišanje genov inducirano z lasnično RNA
Lasnična RNA (ang. hairpin RNA, hpRNA) je sekundarna struktura RNA, ki varuje mRNA pred razgraditvijo, vodi zvijanje RNA in deluje kot substrat za encimske reakcije (Svoboda in Di Cara, 2006). Lasnična struktura se tvori tudi iz inverznih ponovitev virusnih zaporedji ločenih z vmesnikom in inducira RNAi (Duan in sod., 2012). HpRNA konstrukti za razliko od smiselno in
6
protismiselno orientiranih konstruktov za tvorjenje dvoverižne RNA ne potrebujejo poti preko RDR (Mitter in Dietzgen, 2012).
Kalantidis in sod. (2001) so v tobak vnesli DNA konstrukt z inverznimi ponovitvami cDNA virusa mozaika kumare (CMV). Transformirane rastline so izražale hpRNA, ki so sprožile gensko utišanje. Tobak so okužili s CMV in po desetih do petnajstih dneh po okužbi so vse netransformirane rastline kazale hude znake okužbe. Za okužbo je bilo dovzetnih tudi 72 % transgenih rastlin, vendar so imele blažje simptome od netransformiranih. Nekatere transformirane rastline so sprva imele simptome okužbe, kasneje pa so okrevale in so na njih zrastli listi, ki so bili popolnoma brez simptomov. Popolnoma odpornih je bilo 17 % transgenih rastlin.
Luan in sod. (2020) so transformirali sojo s konstruktom, ki je vseboval inverzne ponovitve GmVma12 zaporedja. 25,63 % rastlin iz prve generacije in 60,54 % rastlin iz druge generacije je bilo visoko odpornih na okužbo z virusom mozaika navadne soje (SMV). V prvi generaciji transformirane soje se je močno zmanjšalo izražanje transkriptov za plaščni protein, pri drugi generacij pa transkriptov ni bilo več mogoče zaznati. Semena transformiranih rastlin so bila manj pegava kot semena netransformirane soje, kar še dodatno potrdi, da so rastline odporne na virus.
3.1.3 Postranskripcijsko utišanje inducirano z umetnimi miRNA
MikroRNA so ključne pri razvoju rastlin, prenašanju signalov, razgradnji proteinov, odgovoru na biotski in abiotski stres in interakcijah med rastlino in virusom (Liu in sod., 2017). Za razliko od siRNA, ki nastane iz dvoverižne RNA, ima primarni transkript miRNA značilno lasnično strukturo, ki jo kodirajo MIR geni (Taliansky in sod., 2021).
MIR gene prepisuje, tako kot protein kodirajoče gene, RNA polimeraza II. DCL1 s pomočjo SE (serat), dsRBP (ang. double strand RNA binding protein) in HYL1 (ang. hyponastic leaves 1) razreže primarni miRNA transkript (pri-miRNA) v pre-miRNA, katerega DCL1 in HEN1 predelata v 21–24 nukleotidov dolge dupleks miRNA. Duplekse HEN1 (ang. Hua enhancer 1) metilira v zrele miRNA duplekse, ki se transportirajo v citoplazmo. Vodeča veriga se veže na AGO protein in sestavi se RISC. V citoplazmi miRNA regulira izražanje genov z inhibicijo translacije ali s cepljenjem mRNA (Liu in sod., 2017).
Ta naravni mehanizem regulacije genov so uporabili za izdelavo umetnih mikroRNA (ang.
artificial microRNA; amiRNA). V kaseti amiRNA so 21 nukleotidov dolge zrele miRNA sekvence v pre-miRNA zamenjane z enako dolgimi zaporedji iz tarčnih genov. V primerjavi z metodama prve in druge generacije ima induciranje utišanja s hpRNA večjo specifičnost in manj izven tarčnih dogodkov (Gasparis in sod., 2017).
Niu in sod. (2006) so izdelali vektor za izražanje amiRNA, ki cilja zaporedje supresorja utišanja genov P69 v virusu rumenega mozaika repe (TYMV) in HC-Pro v virusu mozaika repe (TuMV).
7
Transgene rastline, ki so izražale amiRNA, ki je ciljala gen supresorja P69, so bile odporne na TYMV, niso pa bile odporne na TuMV in obratno. Rastline, ki so izražale amiRNA, ki je ciljala obe zaporedji, pa so bile odporne na oba virusa. Podobno so Qu in sod. (2012) izdelali kaseto za izražanje amiRNA, ki cilja zaporedje supresorja utišanja genov pri virusu mozaika kumare.
AmiRNA je preprečila ekspresijo supresorja, zato so bile transgene rastline odporne na okužbo s CMV.
3.1.4 Postranskripcijsko utišanje inducirano s transaktivirajočimi siRNA
Sintezo transaktivirajoče siRNA (ta-siRNA) sestavljajo komponente sinteznih poti siRNA in miRNA. AGO1, ki ga vodi miRNA, razreže enoverižni RNA transkript. Transkript se ne razgradi, temveč ga RDR6 preoblikuje v dvoverižno RNA. DCL4 razreže dvoverižno RNA molekulo, da nastanejo sekundarne siRNA. Če sekundarne siRNA ciljajo transkripte v trans, jim rečemo transaktivirajoče siRNA (Jacobs in sod., 2016).
Singh in sod. (2015) so za ciljanje zaporedja supresorskih proteinov AC2 in AC4 newdelhijskega virusa kodravosti listov paradižnika (ToLCNDV) uporabili ta-siRNA ekspresijski vektor. Vektor so z Agrobacterium tumefaciens vnesli v tobak in paradižnik in po 6 dneh rastline inokulirali s ToLCNDV. Rastline so bile odporne na virus, niso kazale simptomov, titri virusne DNA pa so bili nizki. Druga generacija tobaka je bila odporna na ToLCNDV in na ganski virus kodravosti paradižnika (ToLCGV). Ta-siRNA tehnologijo so uporabili tudi za pridobivanje rezistence na CMV in TuMV v rastlini Arabidopsis thaliana (Chen in sod., 2016).
4 METODE PREUREJANJA GENOMA
Tehnologije preurejanja genoma temeljijo na nukleazah, ki se jih da programirati za natančno spreminjanje genoma. Sekvenčno specifične nukleaze cepijo dvoverižne DNA, nato zlom popravijo popravljalni mehanizmi. Glavna popravljalna mehanizma sta združevanje nehomolognih koncev (ang. nonhomologous end-joining; NHEJ), ki je pogostejši mehanizem, vendar pogosto vodi v insercije ali delecije in popravljanje s homologno rekombinacijo (ang. homology-directed repair; HDR), ki je manj pogost, a natančnejši mehanizem (Langner in sod., 2018).
V prvo generacijo metod za preurejanje genoma spadajo meganukleaze, nukleaze cinkovih prstov (ang. zinc finger nuclease; ZFN) in efektorske nukleaze podobne transkripcijskim faktorjem (ang.
transcription activator-like effector nuclease; TALEN). Največkrat pa se za preurejanje genoma uporablja novejša CRISPR-Cas metoda (Langner in sod., 2018).
8 4.1 NUKLEAZE CINKOVIH PRSTOV
Nukleaze cinkovih prstov sestavljajo FokI endonukleaza, ki cepi dvojno vijačnico DNA, in trije Cys2His2 cinkovi prsti, ki vežejo DNA. FokI domena mora dimerizirati, da lahko cepi DNA (Lloyd in sod., 2005).
Posamezen cinkov prst sestavlja 30 aminokislin in se na DNA sekvenco veže s tremi baznimi pari.
Cinkovi prsti se zvijejo v ββα konfiguracijo in z dvema histidinskima in dvema cisteinskima ostankoma usmerjajo cinkov ion. Z genskim inženiringom lahko cinkove prste spremenimo tako, da vežejo katero koli zaporedje. Z združevanjem različnih prstov, ki vežejo različne bazne pare, se spremeni splošna vezavna specifičnost domene in sprememba enega ali več ostankov v α-heliksu spremeni specifičnost vezave DNA pri posameznem prstu (Porteus in Carroll, 2005).
Za izdelavo ZFN je potrebno najprej izbrati tarčni gen in poiskati vezavna mesta za proteine cinkovih prstov. Sledi selekcija kombinacij cinkovih prstov za izbrano mesto in izdelava ustreznih kodirajočih sekvenc. ZF kodirajoče sekvence je potrebno nato klonirati v okvir z nukleazno domeno. Zadnji korak je ekspresija sekvence in očiščenje cinkovih prstov (Carroll in sod., 2006).
Bibikova in sod. (2001) so pokazali, da ZFN najučinkoviteje deluje, ko so vezavna mesta med seboj ločena za 6 nukleotidov, obratno usmerjena, in ko med vezavno in cepilno domeno ni prisotnega povezovalca. Specifičnost cepljenja se veča z dodajanjem cinkovih prstov. Do sedaj je bilo za preurejanje genoma uporabljenih največ šest cinkovih prstov, morajo pa biti vsaj trije (Caroll in sod., 2006).
4.1.1 Uporaba nukleaz cinkovih prstov za pridobitev odpornosti na viruse
Tehnologija umetnih cinkovih prstov (ang. artificial zinc finger protein; AZP) je bila prvič uporabljena za obrambo Arabidopsis thaliana proti virusu močne kodravosti vršičkov pese (BSCTV). Umetni cinkovi prsti, ki se vežejo na vezavno mesto Rep proteina, so bili skonstruirani z racionalnim inženiringom z uporabo tabele nedegenerativnih kod za prepoznavanje. E. coli ekspresijski vektor je bil v rastline A. thaliana vnešen z inokulacijo z A. tumefaciens sev GV3101.
Transformirane in netransformirane rastline so bile izpostavljene BSCTV. 84 % transformiranih rastlin ni imelo znakov okužbe, fenotipsko pa se niso razlikovale od zdravih rastlin divjega tipa.
Pri 14 primerih je prišlo do kodranja socvetji, vendar se okužba iz okuženih tkiv ni razširila po rastlini, kar je potrdil tudi southern prenos. AZP so uspešno preprečili vezavo Rep proteina na Rep vezavno mesto, če so bili v mešanici z DNA sondo prisotni pred Rep proteinom. V primeru, da je bil Rep protein prisoten pred AZP, je bila inhibicija vezave manj uspešna (Sera, 2005).
Takenaka in sod. (2007) so sestavili šest AZP za inhibicijo vezave Rep proteina virusa rumenenja in kodravosti listov paradižnika (TYLCV) na mesto začetka replikacije. AZP so preprečili vezavo
9
Rep proteina, afiniteta vezave AZP na Rep-vezavno mesto pa je bila kar tisočkrat večja od afinitete vezave Rep proteina. Koshino-Kimura in sod. (2009) so prav tako sestavili šest AZP za inhibicijo vezave Rep proteina TYLCV na mesto začetka replikacije. AZP ekspresijsko kaseto so vstavili v rastlinski genom in vzgojili transgene rastline, vendar niso izvedli nadaljnjih raziskav, s katerimi bi potrdili, da so rastline odporne TYLCV.
V prej omenjenih raziskavah so poskušali vzpostaviti odpornost rastlin na en virus. Chen in sod.
(2014) so AZP oblikovali na podlagi visoko ohranjenih zaporedij v genomih begomovirusov, kar pomeni, da so ti AZP zmožni inhibicije vezave Rep proteina pri vseh begomovirusih, ki vsebujejo to zaporedje. Z združitvijo C konca AZP in katalitične domene FokI nukleaze so dobili AZFN (ang.
artificial zinc finger nuclease). AZFN ne le inhibira vezavo Rep proteina, ampak tudi razkroji virusno DNA. Rastline tobaka so okužili z različnima begomovirusoma in s RT-qPCR spremljali količino virusnega genoma. V rastlinah, ki so izražale AZFN, je bila količina akumuliranega virusa občutno nižja kot v kontrolnih rastlinah.
4.2 TALE NUKLEAZE
TALEN sestavlja TALE DNA vezavna domena in Fok I domena, ki cepi DNA (Chen in Gao, 2013). TALE domeno običajno sestavlja 34 aminokislin, zadnja ponovitev v domeni je skrajšana na 20 aminokislin. TALE nukleaze so zasnovane v parih, ki se vežejo na nasprotujoča si tarčna mesta, ki ju ločuje vmesnik, kar omogoča združitev FokI monomerov v dimer in dvoverižni zlom DNA verige (Bogdanove in Voytas, 2011).
Večina TAL efektorjev ima med 13 in 28 ponovitev. Polimorfizem je v veliki večini primerov prisoten na ostankih na mestih 12 in 13, čemur pravimo variabilni dipeptidni motivi (ang. repeat variable diresidue; RDV) (Bogdanove in Voytas, 2011). TALE ponovitve so sestavljene iz dveh heliksov, ki sta povezana z zanko, ki vsebuje RVD. Ponovitve skupaj tvorijo superheliksno strukturo, ki potuje po smiselni verigi DNA. Polimorfizem na mestu 13 sodeluje pri prepoznavanju DNA zaporedja, polimorfizem na mestu 12 pa nima direktnega stika z DNA, ampak pomaga pri stabilizaciji superheliksne strukture (Chen in Gao, 2013).
Različni RVD se preferenčno povezujejo z različnimi nukleotidi. Štirje najpogostejši motivi so HD, ki se povezuje z citozinom, NG, ki se povezuje s timinom, NI, ki se povezuje z adeninom in NN, ki se povezuje z gvaninom. Od RVD in števila ponovitev je tudi odvisno katero sekvenco bodo TALE nukleaze prepoznale. Vezavna zaporedja morajo na začetku nujno vsebovati timin in biti dolga vsaj 13 nukleotidov. TALE specifičnost je odvisna tudi od dolžine vmesnika, ki ločuje vezavni mesti (Bogdanove in Voytas, 2011).
10
Tudi TALE nukleaze lahko spremenimo, da ciljajo specifično zaporedje. Za sestavo TALEN sistema se uporabljajo standardne metode kloniranja, Golden Gate metode in sinteza na trdnih nosilcih (ang. Solid phase assembly) (Chen in Gao, 2013).
4.2.1 Uporaba TALE nukleaz za pridobitev odpornosti na viruse
Do sedaj sta znana dva primera uporabe TALE nukleaz za obrambo rastlin pred virusi.
Za pridobitev rezistence na več begomovirusov so Cheng in sod. (2015) na podlagi 12 nukleotidov dolgega ohranjenega zaporedja iz genoma begomovirusov razvili TALE1 in TALE2 proteina.
Proteina nista vsebovala FokI domene in sta se direktno vezala na tarčno zaporedje. TALE1 in TALE2 nista popolnoma inhibirala virusne replikacije; najverjetneje zaradi prekratke tarčne sekvence. Tobak je bil delno odporen na tri begomoviruse in je imel v primerjavi s kontrolnimi rastlinami upočasnjen razvoj simptomov, blažje simptome in zmanjšano akumulacijo virusne DNA. Tobak je bil na viruse odporen tudi ob prisotnosti beta satelita.
Khan in sod. (2018) so s TAL efektorji pridobili delno odpornost proti kokhranskem virusu kodravosti bombaža (CLCuKoV) v tobaku. V rastlinah, ki so izražale TALE, so se znaki okužbe pojavili pet do šest dni kasneje kot pri kontrolnih rastlinah, simptomi so bili blažji, nekatere rastline so po 30 dneh popolnoma okrevale. S qPCR so zaznali tudi 60–80 % zmanjšanje akumulacije virusne DNA.
4.3 CRISPR-CAS SISTEMI
CRISPR-Cas sistemi za preurejanje genoma temeljijo na imunskem sistemu, ki varuje arheje in bakterije pred virusi in plazmidi. Prva faza delovanja sistema je akvizicija, pri kateri pride do prepoznavanja in integracije virusnih vmesnikov med sosednji ponovitvi v CRISPER lokusu. Sledi ji faza ekspresije. CRISPR lokusi se prepišejo kot prekurzorji CRISPR RNA (pre-crRNA).
Endoribonukleaze nato cepijo pre-crRNA v CRISPR RNA (crRNA). Zadnja faza je interferenca.
crRNA se vključi v kompleks CASCADE (ang. CRISPR associated complex for antiviral defence), ki prepozna in se veže s komplementarnimi nukleotidnimi bazami virusa. Ta vezava sproži degradacijo ali utišanje tujega zaporedja (Liu in Fan, 2014).
Poznamo 4 tipe CRISPR sistemov, ki se ločijo glede na organizacijo lokusov in značilne gene. Pri CRISPR sistemih tipa I je značilen gen cas3, pri sistemih tipa II cas9 in pri sistemih tipa III cas10 (Makarova in sod., 2018). Tipi se med seboj razlikujejo tudi glede na organizme, v katerih jih najdemo. Sisteme tipa I najdemo tako v bakterijah kot v arhejah, sisteme tipa II najdemo izključno v bakterijah, sistemi tipa III pa so pogostejši v arhejah (Liu in Fan, 2014).
11 4.3.1 CRISPR-Cas9
CRISPR-Cas9 izvira iz bakterije Streptococcus pyrogenes in je še posebej zanimivo orodje za preurejanje genoma, saj je enostaven, učinkovit in vsestranski (Langner in sod., 2018; Liu in Fan, 2014).
Cas9 je dvoverižna endonukleaza in ima šest domen: REC I, ki veže gRNA, REC II, katere vloga še ni znana, Bridge Helix, ki sproži cepljenje po vezavi DNA, PAM interacting, ki zagotavlja PAM specifičnost, HNH, ki cepi komplementarno DNA verigo in RuvC, ki cepi nekomplementarno DNA verigo (Gupta in sod., 2019).
Za prepoznavanje in rezanje tarčne sekvence s Cas9 sta potrebna kratko, močno ohranjeno zaporedje PAM (ang. Protospacer adjustment motif) in vodeča RNA (ang. single guide RNA;
sgRNA) (Jinek in sod., 2012). sgRNA je majhna nekodirajoča enoverižna RNA, sestavljena iz crRNA in transaktivirajoče RNA (tracrRNA) (Langner in sod., 2018). Vezava sgRNA in Cas9 povzroči konformacijske spremembe, ki aktivirajo Cas9. Aktiviran Cas9 išče tarčno zaporedje tako, da išče z gvaninom bogate PAM (5’-NGG-3’). Ko najde ustrezno sekvenco, poveže komplementarno regijo s sgRNA, kar omogoči destabilizacijo tarčnega zaporedja, Cas9 nato povzroči dvoverižne zlome 3–4 bazne pare pred PAM zaporedjem. Zlomi sprožijo popravljalne mehanizme (Gupta in sod., 2019). Jinek in sod. (2012) so pokazali, da lahko s konstruiranjem sintetičnih sgRNA-Cas9 kompleksov ciljamo katero koli dsDNA zaporedje, kar dodatno poveča uporabnost te tehnologije.
4.3.2 CRISPR-Cas13
CRISPR-Cas13 spada pod CRISPR sisteme tipa II in ima štiri podtipe: Cas13a, Cas13b, Cas13c in Cas13d (Yan in sod., 2019). Namesto DNaznih domen imajo Cas13 proteini dve HEPN (ang.
Higher eucaryotes and prokaryotes nucleotide-binding) domeni in za nastanek enoverižnega zloma potrebujejo PFS (ang. Protospacer flanking site) (Yan in sod., 2019; Langner in sod., 2018).
Najpomembnejša lastnost CRISPR-Cas13 sistemov je sposobnost ciljanja RNA, ki jo lahko izkoristimo za pridobitev odpornosti proti RNA virusom. CRISPR-Cas13 se uporablja tudi v diagnostiki in za zaznavanje nukleinskih kislin (Yan in sod., 2019).
4.3.3 CRISPR-Cas12
Trenutno so poznani Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d in Cas12f (Yan in sod., 2019). Cas12a deluje podobno kot Cas9, le da za vezavo tarčnih regij v genomu ne potrebuje z gvaninom bogatega PAM zaporedja, temveč s timinom bogato PAM zaporedje (Langner in sod., 2018). Za vodenje
12
potrebuje le 42 nukleotidov dolgo crRNA regijo in nima HNH domene. Pri rezanju verige dela lepljive konce (Manghwar in sod., 2019).
CRISPR-Cas12 zaenkrat še ni bil uporabljen za pridobitev na viruse rezistentnih rastlin.
4.3.4 CRISPR-Cas14
Cas14 je 40–70 kDa velik protein, ki ga kodira Cas14 lokus. Ima tri podtipe. CRISPR-Cas14a cilja enoverižna DNA zaporedja, za kar ne potrebuje PAM. Zaradi sposobnosti cepljenja ssDNA je zanimiv kandidat za zaščito proti virusom iz družin Geminiviridae in Nanoviridae (Khan in sod., 2019).
4.4 UPORABA CRISPR-Cas SISTEMOV ZA PRODOBITEV ODPORNOSTI 4.4.1 Uporaba CRISPR-Cas sistemov za pridobitev odpornosti na DNA viruse
CRISPR-Cas9 se je izkazal kot učinkovito orodje za inženiring odpornosti proti rastlinskim virusom.
Ji in sod. (2015) so z vektorjem za izražanje sgRNA-Cas9 kompleksa transformirali A. thaliana in N. benthamiana, ter vanju z agroinokulacijo vnesli BSCTV. V obeh primerih so imele kontrolne rastline hude simptome okužbe. Linije z nizko ekspresijo Cas9 so imele blage simptome, pri linijah z višjo ekspresijo pa ni bilo simptomov. Southern prenos je potrdil, da je koncentracija virusne DNA v listih odvisna od nivoja ekspresije Cas9.
Kasneje so orodje preizkusili tudi na ne modelnih organizmih. Kis in sod. (2019) so CRISPR-Cas9 uporabili za pridobitev odpornosti ječmena na virus pritlikavosti pšenice (WDV), Tripathi in sod.
(2019) pa za pridobitev odpornosti banan na virus pegavosti banan (BSV).
Liu in sod. (2018) so na primeru virusa mozaika cvetače (CaMV) pokazali, da je CRISPR/Cas9 ustrezno orodje za zagotavljanje zaščite proti dsDNA virusom.
4.4.2 Uporaba CRISPR-Cas sistemov za pridobitev odpornosti na RNA viruse
CRISPR-Cas9 ne more ciljati RNA zaporedij, zato se za pridobitev odpornosti na RNA viruse uporabljata predvsem CRISPR-FnCas9 iz Francisella novivida in CRISPR-Cas13a iz Leptotrichia shahii.
Zhang in sod. (2018) so bili prvi, ki so za ciljanje RNA v rastlini uporabili FnCas9. Dva tedna po okužbi s CMV so kontrolne rastline tobaka kazale znake okužbe, rastline, ki so izražale FnCas9, pa so bile brez simptomov. Virusni titri, določeni s postopkoma ELISA in RT-qPCR, so bili v
13
rastlinah s FnCas9 konstruktom za 40–50 % nižji kot v kontrolnih. Tobak so inokulirali tudi z virusom mozaika tobaka, ki je imel za lažje opazovanje okužb vstavljen gen za zeleni fluorescenčni protein (GFP). V transformiranih linijah je bila fluorescenca občutno šibkejša. Iste raziskave so opravili še na A. thaliana. Tudi tu so se v kontrolnih rastlinah pojavili simptomi. V transformiranih linijah so opazili le blage simptome okužbe, nekatere so bile brez simptomov. ELISA in RT-qPCR analizi sta potrdili, da v teh rastlinah ni bilo prisotne virusne RNA. Ugotovili so, da za inhibicijo virusa niso ključna mesta cepljenja verige ampak z argininom bogati motivi, kamor se FnCas9 veže.
Aman in sod. (2018) so Cas13a optimizirali za rastlinske kodone. Konstrukt so subklonirali v pK2GW7 binarni vektor, ki so ga z elektroporacijo vstavili v A. tumefaciens. Rastline N.
bentahmiana so agroinokulirali in z western prenosom potrdili izražanje Cas13a. Za preizkus funkcionalnosti CRIPSR/Cas13a so skonstruirali crRNA komplementarne GFP1, GFP2, HC-Pro in CP sekvencam TuMV-GFP genoma. Rastline so okužili s TuMV-GFP. V rastlinah s crRNA, ki je ciljala HC-Pro in GFP2 zaporedja, je prišlo kar do 50 % znižanja fluorescence, medtem ko je bilo zmanjšanje fluorescence pri tistih, ki so ciljali plaščni protein in GFP1 zaporedje, manjše.
Western prenos je potrdil, da se je koncentracija GFP najbolj zmanjšala v rastlinah, kjer je crRNA ciljala HC-Pro in GFP2. Tudi northern prenos je pokazal, da je bilo v rastlinah s crRNA, ki cilja HC-Pro in GFP2, akumuliranega najmanj TuMV genoma.
4.4.3 Uporaba CRISPR-Cas SISTEMOV za pridobitev odpornosti s ciljanjem gostiteljskih faktorjev
Odpornost proti virusom pridobimo tudi z recesivnimi mutacijami genov, ki kodirajo gostiteljske faktorje, ki so nujno potrebni za virusni življenjski cikel. Najpogostejše tarče za povzročitev mutacij s CRISPR-Cas9 sta gostiteljska faktorja eIF4E, eI4G in njuni izoformi eIF(izo)4E in eIF(izo)4G (Cao in sod., 2020).
Chandrasekaran in sod. (2016) so s CRISPR-Cas9 naredili mutacije na dveh mestih eIF4E gena kumare. Liniji CEC1-1-7-1 in CEC2-5-M-4n sta bili odporni na okužbo z virusom rumenenja žil kumare (CVYV), virusom rumenega mozaika bučke (ZYMV) in virusom obročkaste pegavosti papaje-W (PRSV-W). 25 dni po okužbi z ZYMV so nekatere rastline izgubile odpornost. Te rastline so razvile blage simptome in imele nizke titre virusnega genoma. Odpornost na PRSV-W je bila šibkejša od odpornosti na ZYMV in CVYV. V rastlinah so zaznali nizek titer virusne RNA in razvoj blagih simptomov. Pridobljena odpornost kaže, da ima eIF4E pomembno vlogo v življenjskih ciklih testiranih rastlin.
Pyott in sod. (2016) so s tehnologijo CRISPPR-Cas9 naredili delecije v eIF4E lokusu rastline A.
thaliana. Teden po inokulaciji z virusom so na podlagi izražanja GFP preverili okuženost rastlin.
Okuženih je bilo 92,5 % kontrolnih rastlin in nobena izmed transformiranih rastlin. Z RT-PCR
14
analizo v listih mutiranih rastlin niso zaznali virusno specifičnih pomnožkov. Da bi potrdili odpornost, so tobak, ki je zelo dovzeten za okužbo s TuMV in razvije znake okužbe že pri nizkih titrih virusa, inokulirali s sokom transformiranih in kontrolnih rastlin. Pet dni po inokulaciji so bili listi, ki so bili inokulirani s sokom kontrolnih rastlin, okuženi, listi inokulirani s sokom mutiranih rastlin z odpornostjo, pa so bili zdravi.
5 PRIMERJAVA PRISTOPOV
Velika večina virusov ima razvite mehanizme za zaviranje gostiteljske RNAi, kar močno zmanjša uporabnost tehnologij malih RNA za zaščito rastlin. Te težave nima CRISPR-Cas sistem, saj izvira iz prokariontov in se ni razvijal skupaj z virusi evkariontov, ki zato niso mogli razviti zaviralnih mehanizmov proti njemu (Zhao in sod., 2020).
Med tehnologijami za preurejanje genoma se za zaščito rastlin proti virusom najpogosteje uporabljajo CRISPR-Cas sistemi. ZFN in TALEN za svoje delovanje potrebujeta DNA vezavne domene, katerih konstrukcija je zahtevna, dolgotrajna in draga. CRISPR-Cas je v primerjavi s tem lažji za konstrukcijo in uporabo, bolj specifičen ter bolj učinkovit (Khandagale in Nadaf, 2016).
Glavna omejitev CRISPR-Cas9 je potreba po PAM zaporedju za prepoznavanje in rezanje tračnih zaporedji. Njegovo uporabnost znižujejo tudi netarčni dogodki, ki so sicer redkejši kot pri TALEN in ZFN in velikost sistema, ki znižuje učinkovitost urejanja (Manghwar in sod., 2019). Ali in sod.
(2016) so ugotovili, da lahko ciljanje kodirajočih zaporedij v geminivirusih privede do nastanka novih različic virusa, ki so se zmožne replicirati. Ciljanje nekodirajočih regiji povzroči interferenco in zmanjša možnosti nastanka takšnih različic virusa, kar je pomembno z vidika zagotavljanja dolgotrajne zaščite pred virusi.
15
Slika 1: Prikaz delovanja strategij RNAi in CRISPR-Cas za ciljanje rastlinskih virusov (prirejeno po Zhao in sod., 2020)
6 ZAKLJUČEK
Študije so pokazale, da so metode genskih modifikacij rastlin učinkovite v obrambi pred številnimi rastlinskimi virusi. Vsaka metoda ima svoje prednosti in slabosti, najbolj uporabljena pa je tehnologija CRISPR-Cas, ki je med opisanimi tehnologijami najnovejša. Za močnejšo in dolgotrajnejšo odpornost bi lahko v prihodnosti uporabili kombinacijo različnih metod.
Uporabo teh tehnologij poleg omejitev samih metod ovira tudi negativna nastrojenost javnost proti gensko spremenjenim organizmom. Regulativa na področju preurejanja genoma še ni enotna oz. je še v presojanju, ali so rastline s preurejenim genomom gensko spremenjeni organizmi ali ne.
Strategije malih RNA in preurejanja genoma za zaščito rastlin so zelo perspektivne, vendar bo potrebno za njihovo širšo aplikacijo premagati še številne ovire.
16 7 VIRI
Abel P. P., Nelson R. S., De B., Hoffmann N., Rogers S. G., Fraley R. T. Beachy R. N. 1986. Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene. Science, 232, 4751: 738–743
Ali Z., Ali S., Tashkandi M., Zaidi S. S. E. A., Mahfouz M. M. 2016. CRISPR/Cas9-Mediated immunity to geminiviruses: differential interference and evasion. Scientific Reports, 6, 26912:
doi: 10.1038/srep26912: 13 str.
Aman R., Ali Z., Butt H., Mahas A., Aljedaani F., Khan M. Z., Ding S., Mahfouz M. 2018. RNA virus interference via CRISPR/Cas13a system in plants. Genome Biology, 19, 1: doi:
10.1186/s13059-1381-1: 9 str.
Bhat A. I., Rao G. P. 2020. Characterization of plant viruses: methods and protocols. Springer protocols handbooks. New York. Humana Press: 552 str.
Bibikova M., Carroll D., Segal D. J., Trautman J. K., Smith J., Kim Y. G., Chandrasegaran S. 2001.
Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases.
Molecular and Cellular Biology, 21, 1: 289–297
Bogdanove A. J., Voytas D. F. 2011. TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.
Science, 333, 6051: 1845-1846
Buck K. W. 1999. Geminiviruses (Geminiviridae). V: Encyclopedia of virology. 2. izd. Granoff A., Webster R. G. (ur.). Amsterdam, Elsevier: 597–606
Cao Y., Zhou H., Zhou X, Li F. 2020. Control of plant viruses by CRISPR/Cas system-mediated adaptive immunity. Frontiers in Microbiology, 11: doi: 10.3389/fmicb.2020.593700: 9 str.
Carroll D., Morton J. J., Beumer K. J., Segal J. D. 2006. Design, construction and in vitro testing of zinc finger nucleases. Nature Protocols, 1, 3: 1329–1341
Chen K., Gao C. 2013. TALENs: customizable molecular DNA scissors for genome engineering of plants. Journal of Genetics and Genomics, 40, 6: 271–279
Chen L., Cheng X., Cai J., Zhan L., Wu X., Liu Q., Wu X. 2016. Multiple virus resistance using trans-acting siRNAs. Journal of Virological Methods, 228: 16–20
17
Chen W., Qian Y., Wu X., Sun Y., Cheng X. 2014. Inhibiting replication of begomoviruses using artificial zinc finger nucleases that target viral-conserved nucleotide motif. Virus Genes, 48, 3:
494–501
Cheng X., Li F., Cai J., Chen W., Zhao., Sun Y., Guo Y., Yang X., Wu X. 2015. Artificial TALE as a convenient protein platform for engineering broad-spectrum resistance to begomoviruses.
Viruses, 7, 8: 4772–4782
Choudhary N., Kumari P., Panda S. 2020. RNA plant viruses: biochemistry, replication and molecular genetics. V: Applied plant virology. 1. izd. Awasthi L. P. (ur.). Amsterdam,
Academic Press: 183–195
Chandrasekaran J., Brumin M., Wolf D., Leibman D., Klap C., Pearlsman M., Sherman A., Arazi T., Gal-On A. 2016. Development of broad virus resistance in non-transgenic cucumber using CRISPR/Cas9 technology. Molecular Plant Pathology, 17, 7: 1140–1153
De Haan P., Gielen J. J., Prins M., Wijkamp I. G., van Schepen A., Peters D., Golsbach R. 1992.
Characterization of RNA-mediated resistance to tomato spotted wilt virus in transgenic tobacco plants. Bio/Technology, 10, 10: 1133–1137
Duan C. G., Wang C. H., Guo H. S. 2012. Application of RNA silencing to plant disease resistance.
Silence, 3, 1: doi: 10.1186/1758-907X-3-5: 8 str.
Gasparis S., Kala M., Przyborowski M., Orczyk W., Nadolska-Orczyk A. 2017. Artificial microRNA-based specific gene silencing of grain hardness genes in Polyploid Cereals
Appeared to be not stable over transgenic plant generations. Frontiers in Plant Science, 7: doi:
10.3389/fpls.2016.02017: 13 str.
Gupta D., Bhattacharjee O., Mandal D., Sen M. K., Dey D., Dasgupta A., Kazi T. A., Gupta R., Sinharoy S., Acharya K., Chattopadhyay D., Ravichandiran V., Roy S., Ghosh D. 2019.
CRISPR-Cas9 system: A new fangled dawn in gene editing. Life Sciences, 232, 116636: doi:
10.1016/j.lfs.2019.116636: 15 str.
Hull R. 2014. Replication of plant viruses. Plant Virology, 5: 341–421
ICTV. 2020. Virus Taxonomy: the ICTV report on virus classification and taxon nomenclature.
International Committee on Taxonomy of Viruses.
Talk.ictvoniline.org/ictv-reports/ictv_oneline_report (16. avg. 2021)
18
Jacobs T. B., Lawler N. J., LaFayette, Vodkin L. O., Parrott W. A. 2016. Simple gene scilencing using the trans-acting siRNA pathway. Plant Biotechnology Journal, 14, 1: 117–127
Ji X., Zhang H., Zhang Y., Wang Y., Gao C. 2015. Establishing a CRISPR-Cas-like immune system conferring DNA virus resistance in plants. Nature Plants, 1, 10: doi:
10.1038/NPLANTS.2015.144: 4 str.
Jinek M. Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. 2012. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337, 6096: 816–
821
Kalantidis K., Psaradakis S., Tabler M., Tsagris M. 2001. The occurrence of CMV-specific short Rnas in transgenic tobacco expressing virus-derived double-stranded RNA in indicative of resistance to virus. Molecular Plant-Microbe Interactions, 15, 8: 826–833
Kawchuk L. M., Martin R. R., McPherson J. 1991 Sense and antisense RNA-mediated resistance to potato leafroll virus in Russet Burbank potato plants. Molecular Plant-Microbe Interactions, 4, 3: 127–134
Khalid A., Zhang Q., Yasir M., Li F. 2017. Small RNA based genetic engineering for plant viral resistance: application in crop protection. Frontiers in Microbiology, 8, 43: doi:
10.3389/fmicb.2017.00043: 11 str.
Khan Z. M., Haider S., Mansoor S., Amin I. 2019. Targeting plant ssDNA viruses with engineered miniature CRISPR-Cas14a. Trends in Biotechnology, 37, 8: 800–804
Khan Z., Khan S. H., Sadia B., Jamil A., Mansoor S. 2018. TALE-mediated inhibition of replication of begomoviruses. International Journal of Agriculture and Biology, 20: 109–118 Khandagale K., Nadaf A. 2016. Genome editing for targeted improvement of plants. Plant Biotechnology Reports, 10, 6: 327–343
Kis A., Hamar E., Tholt G., Ban R., Havelda Z. 2019. Creating highly efficient resistance against wheat dwarf virus in barley by employing CRISPR/Cas9 system. Plant Biotechnology Journal, 17, 6: 1001–1006
19
Koshino-Kimura Y., Takenaka K., Domoto F., Ohashi M., Miyazaki T., Aoyama Y., Sera T. 2009.
Construction of plants resistant to TYLCV by using artificial zinc-finger proteins. Nucleic Acids Symposium Series, 53: 281–282
Langner T., Kamoun S. in Belhaj K. 2018. CRISPR crops: plant genome editing toward disease resistance. Annual Review of Phytopathology, 56: 479–612
Lefeuvre P., Martin D. P., Elena S. F., Shepherd D. N., Roumagnac P., Varsani A. 2019. Evolution and ecology of plant viruses. Nature Reviews Microbiology, 17, 10: 632–644
Liu H., Soyars C. L., Li J., Fei Q., He G., Peterson B. A., Meyers B. C., Nimchuk Z. L., Wang X.
2018. CRISPR/Cas9-mediated resistance to cauliflower mosaic virus. Plant Direct, 2, 3:
e00047: doi: 10.1002/pld3.47: 9 str.
Liu L., Fan X. D. 2014. CRISPR-Cas systems: a powerful tool for genome engineering. Plant Molecular Biology, 85, 3: 209–218
Liu S. R., Zhou J. J., Hu C. G., Wei C. L., Zhanh J. Z. 2017. MicroRNA mediated gene silencing in plant defense and viral counter-defense. Frontiers in Microbiology, 8: doi:
10.3389/fmicb.2017.01801: 12 str.
Lloyd A., Plaisier C. L., Carroll D., Drews G. N. 2005. Targeted mutagenesis using zinc-finger nucleases in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102, 6: 2232–1137
Louten J. 2016. Virus Replication. Essential Human Virology, 1: 49–70
Luan H., Liao W., Song Y., Niu H., Hu T., Zhi H. 2020. Transgenic plant generated by RNAi- mediated knocking down of soybean Vma12 and soybean mosaic virus resistance evaluation.
AMB Express, 10, 1: doi: 10.1186/s13468-020-00997-6: 10 str.
Makarova K. S., Wolf Y. I., Koonin E. V. 2018. Classification and nomenclature of CRISPR-Cas systems: where from here? The CRISPR Journal, 1, 5: 325–336
Manghwar H., Lindsey K., Zhang X., Jin S. 2019. CRISPR/Cas system: recent advances and future for genome editing. Trends in Plant Science, 24, 12: 1102–2225
20
Mitter N., Dietzgen R. G. 2012. Use of hairpin RNA constructs for engineering plant virus resistance. V Antiviral resistance in plants: methods and protocols. Methods in molecular
biology vol 894. Watson J. M., Wang M. (ur.). Totowa, Humana Press: 191–208
Nelson R. S., Citovsky V. 2005. Plant viruses. Invaders of cells and pirates of cellular pathways.
Plant Physiology, 138, 4:1809-1814
Niu Q. W., Lin S. S., Reyes J. L., Chen K. C., Wu H. W., Yeh S. D., Chua N. H. 2006. Expression of artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nature Biotechnology, 24, 11: 1420–1428
Porteus M. H., Carroll D. 2005. Gene targeting using zinc finger nucleases. Nature Biotechnology, 23, 8: 967-973
Pyott D. E., Sheehan E., Molnar A. 2016. Engineering of CRISPR/Cas9-mediated potyvirus resistance in transgene-free Arabidopsis plants. Molecular Plant Pathology 17, 8: 1276–1288 Qu J., Ye J., Fang R. 2012. Artificial microRNAs for plant virus resistance. V Antiviral resistance in plants: methods in molecular biology. Methods and protocols vol 894. Watson J., Wang M. B. (ur.). Totowa, Humana Press: 209–222
Raccah B., Fereres A. 2009. Plant Virus Transmission by Insects. Encyclopedia of Life Sciences:
doi: 10.1002/9780470015902.a0000760.pub2: 9 str.
Rizvi I., Choudhury N. R., Tuteja N. 2015. Insights into functional characteristics of geminivirus rolling circle replication initiator protein and its interaction with host factors affection viral
DNA replication. Archives of Virology, 160, 2: 375–387
Rampersad S., Tennant P. 2018. Replication and expression strategies of viruses. V: Viruses. 1.
izd. Tennant P., Fermin G., Foster J. (ur.). Academic Press: 55–82
Rossinck M. J. 2010. Lifestyles of plant viruses. Philosophical Transactions of Royal Society B:
Biological Sciences, 365, 1548: 1899–1905
Sanford J. C., Johnston S. A. 1985. The concept of parasite-derived resistance-deriving resistance genes from the parasite’s own genome. Journal of Theoretical Biology, 113, 2: 395–405
21
Sera T. 2005. Inhibition of virus DNA replication by artificial zinc finger proteins. Journal of Virology, 79, 4: 2614–2619
Singh A. Taneja J., Dasgupta I., Mukherjee S. K. 2015. Development of plants resistant to tomato geminiviruses using artificial trans-acting small interfering RNA. Molecular Plant Pathology,
16, 7: 724–734
Svoboda P., Di Cara A. 2006. Hairpin RNA: a secondary structure of primary importance. Cellular and Molecular Life Sciences, 63: 901–908
Szittya G., Burgyan J. 2013. RNA interference-mediated intrinsic antiviral immunity in plants.
Current Topics in Microbiology and Immunology, 371: 153–181
Takenaka K., Koshino-Kimura Y., Aoyama Y., Sera T. 2007. Inhibition of tomato yellow leaf curl virus replication by artificial zinc-finger proteins. Nucleic Acids Symposium Series, 51, 1: 429–
430
Taliansky M., Samarskaya V., Zavriev S. K., Fesenko I., Kalinina N. O., Love A. J. 2021. RNA- based technologies for engineering plant virus resistance. Plants, 10, 82: doi:
10.3390/plants10010082: 19 str.
Tilsner J., Taliansky M. E., Torrance L. 2014. Plant Virus Movement. Encyclopedia of Life Sciences, doi: 10.1002/9780470015902.a0020711.pub2: 12 str.
Tripathi L., Ntui V. O., Tripathi J. N. 2019. Application of genetic modification and genome editing for developing climate-smart banana. Food and Energy Security, 8, 4: e00168: doi:
10.1002/fes3.168: 16 str.
Valli A., Garcia J. A., Lopez-Moya J. J. 2015. Potyviridae. Encyclopedia of Life Sciences: doi:
10.1002/9780470015902.a0000755.pub3: 10 str.
Wylie S. J., Adams M., Chalam C., Kreuze J., Lopez-Moya J. J., Ohshima K., Praveen S., Rabenstein F., Stenger D., Wang A., Zernini F. M., ICTV Report Consortium. 2017. ICTV virus taxonomy profile: Potyviridae. Journal of General Virology, 98, 3: 352–354
Yan F., Wang W., Zhang J. 2019. CRISPR-Cas12 and Cas13: the lesser known siblings of CRISPR-Cas9. Cell Biology and Toxicology, 35, 6: 489–492
22
Zanek M. C., Reyes C. A., Cervera M., Pen E. J., Velazquez K., Costa N., Plata M. I., Grau O., Pena L., Garcia M. L. 2008. Genetic transformation of sweet orange with coat protein gene of Citrus psorosis virus and evaluation of resistance against the virus. Plant Cell Reports, 27, 1:
57–66
Zhang T., Zheng Q., Yi X., An H., Zhao Y., Ma S., Zhou G. 2018. Establishing RNA virus resistance in plants by harnessing CRISPR immune system. Plant Biotechnology, 16: 1415–
1423
Zhao Y., Yang X., Zhou G., Zhang T. 2020. Engineering plant virus resistance: from RNA silencing to genome editing strategies. Plant Biotechnology Journal, 18, 2: 328–336
