BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA AGRONOMIJO
Neža ŠPENKO
UČINKOVITOST PRIPRAVKA IZ MIKROALG NA IZBRANE PARAMETRE RASTI IN FIZIOLOŠKEGA
STANJA SOJE (Glycine max (L.) Merr.)
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
Ljubljana, 2022
ODDELEK ZA AGRONOMIJO
Neža ŠPENKO
UČINKOVITOST PRIPRAVKA IZ MIKROALG NA IZBRANE PARAMETRE RASTI IN FIZIOLOŠKEGA STANJA SOJE
(Glycine max (L.) Merr.)
MAGISTRSKO DELO Magistrski študij - 2. stopnja
EFFICIENCY OF THE MICROALGAE PREPARATION ON SELECTED GROWTH PARAMETERS IN THE PHYSIOLOGICAL
STATE OF SOYBEAN (Glycine max (L.) Merr.)
M. SC. THESIS Master Study Programmes
Ljubljana, 2022
Magistrsko delo je zaključek Magistrskega študijskega programa druge stopnje Agronomija.
Delo je bilo opravljeno na Katedri za aplikativno botaniko, ekologijo, fiziologijo rastlin in informatiko Oddelka za agronomijo Biotehniške fakultete.
Študijska komisija Oddelka za agronomijo je za mentorja magistrskega dela imenovala doc.
dr. Klemna ELERJA, za somentorja pa doc. dr. Roka MIHELIČA.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednica: doc. dr. Zalika ČREPINŠEK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: doc. dr. Klemen ELER
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: doc. dr. Rok MIHELIČ
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Član: prof. dr. Dominik VODNIK
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo
Datum zagovora:
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD Du2
DK UDK 635.655:631.811.98:582.3:581.142:631.559(043.2)
KG soja, Glycine max, mikroalge, Scenedesmus sp., bioefektor, biostimulator, kalitveni poskus, poljski poskus, učinkovitost
AV ŠPENKO, Neža
SA ELER, Klemen (mentor)
KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo, Magistrski študijski program druge stopnje Agronomija
LI 2022
IN UČINKOVITOST PRIPRAVKA IZ MIKROALG NA IZBRANE PARAMETRE RASTI IN FIZIOLOŠKEGA STANJA SOJE (Glycine max (L.) Merr.)
TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja) OP IX, 38 str., 6 pregl., 17 sl., 64 vir.
IJ sl JI sl/en
AI V nalogi smo preučevali biostimulativni vpliv mikroalgnega izvlečka na sojo (Glycine max (L.) Merr.) in sicer v dveh segmentih. V prvem segmentu smo v obstoječem gnojilnem poljskem poskusu na Laboratorijskem polju Biotehniške fakultete v Ljubljani sojo foliarno tretirali z raztopino metanolnega izvlečka mikroalg. Merili smo višino rastlin, vsebnost klorofila, nodulacijo, indeks listne površine in količino pridelka tretiranih in kontrolnih ploskev. Drugi del poskusa je potekal v laboratorijskih razmerah, kjer smo obravnavali vpliv različnih koncentracij mikroalg na kalitev soje in koreninske parametre. Tako v kontroliranih razmerah kot tudi na Laboratorijskem polju, izbrani izvleček na rast soje pri veliki večini obravnavanih parametrov ni imel statistično značilnega vpliva. Mikroalgni izvleček je imel stimulativen učinek le na število koreninskih vršičkov pri koncentraciji 0,5 g/L. Pri ostalih parametrih poskusa v kontroliranih razmerah (delež kalivosti, dolžina, površina in premer korenin) statistično značilnega vpliva mikroalg ni bilo.
V poskusu na Laboratorijskem polju ni bilo statistično značilnega vpliva bioefektorja. NPK gnojenje je imelo na rast soje večji vpliv kot bioefektor, kar se je pokazalo v večji vsebnosti klorofila, višji višini rastlin in večji masi nodulov na gnojenem delu. Za razliko od velike večine znanstvenih študij, opravljenih na različnih vrstah rastlin, z uporabljeno metodo dela v naši raziskavi nismo potrdili učinkovitosti mikroalg na parametre rasti soje.
KEY WORDS DOCUMENTATION
ND Du2
DC UDC 635.655:631.811.98:582.3:581.142:631.559(043.2)
CX soybean, Glycine max, microalgae, Scenedesmus sp., bioeffector, biostimulant, germination test, field experiment, efficiency
AU ŠPENKO, Neža
AA ELER, Klemen (mentor)
PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101
PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Agronomy, Master Study Programme in Agronomy
PY 2022
TI EFFICIENCY OF THE MICROALGAE PREPARATION ON SELECTED GROWTH PARAMETERS IN THE PHYSIOLOGICAL STATE OF SOYBEAN (Glycine max (L.) Merr.)
DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes) NO IX, 38 p., 6 tab., 17 fig., 64 ref.
LA sl AL sl/en
AB The research presented in this thesis was undertaken with the purpose of investigating the biostimulative effect of microalgae extract. on soybean (Glycine max (L.) Merr.) in two segments. The first segment was existing field fertilizer experiment at the Laboratory Field of the Biotechnical faculty in Ljubljana, where soybean was foliar treated with a solution of methanolic microalgae extract. Plant height, chlorophyll content, nodulation, leaf area index and yield of treated and control plots were measured. The second part of the experiment was conducted under laboratory conditions, where the effect of different concentrations of microalgae on soybean germination and root parameters was investigated. Both experiments - under controlled conditions and at the Laboratory field, showed that selected extract had no statistically significant effect on soybean growth for the vast majority of parameters considered. The microalgae extract had a stimulating effect only on the number of root tips at a concentration of 0.5 g/L. The other parameters of the experiment under controlled conditions (germination rate, length, area and diameter of roots) were not statistically significantly affected. At the Laboratory field experiment, there was no statistically significant effect of the bioeffector. Fertilisation with NPK had a greater effect on soybean growth than the bioeffector, as reflected in higher chlorophyll content, plant height and nodule mass on the fertilised part. Unlike the vast majority of scientific studies, carried out on different plant species, the method of work used in our study did not confirm the effectiveness of microalgae on soybean growth parameters.
KAZALO VSEBINE
Str.
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III
KEY WORDS DOCUMENTATION IV
KAZALO VSEBINE V
KAZALO PREGLEDNIC VIII
KAZALO SLIK VIII
1 UVOD 1
1.1 NAMEN IN DELOVNE HIPOTEZE 2
2 PREGLED OBJAV 3
2.1 SOJA (Glycine max (L.) Merr.) 3
2.1.1 Izvor in današnja razširjenost 3
2.1.2 Opis rastline 3
2.1.3 Kalitev soje 4
2.1.4 Nodulacija 4
2.2 RASTLINSKI BIOEFEKTORJI 5
2.2.1 Ogljikovi hidrati, beljakovine, aminokisline in lipidi kot bioefektorji 7
2.2.2 Huminska in fulvo kislina kot bioefektorja 7
2.2.3 Biostimulativni učinki živih mikroorganizmov 7
2.2.4 Alge in njihovi izvlečki kot bioefektorji 8
2.2.4.1 Mikroalge 8
2.2.4.2 Pridobivanje mikroalg in njihovih izvlečkov 9
2.2.4.3 Postopek nanašanja morskih alg 10
2.2.4.4 Učinek izvlečkov alg 10
2.2.4.5 Način delovanja algnih izvlečkov 12
3 MATERIALI IN METODE 15
3.1 PRIPRAVA IZVLEČKA 15
3.2 LABORATORIJSKI KALILNI POSKUS 15
3.2.1 Postavitev poskusa 15
3.2.2 Meritve na kalicah 17
3.2.3 Statistična analiza 17
3.3 POSKUS NA LABORATORIJSKEM POLJU 17
3.3.1 Zasnova poskusa 17
3.3.2 Aplikacija 18
3.3.3 Meritve na rastlinah 19
3.3.4 Statistična analiza 21
3.4 VREMENSKE RAZMERE 22
4 REZULTATI 23
4.1 LABORATORIJSKI KALILNI POSKUS 23
4.2 POSKUS NA LABORATORIJSKEM POLJU 24
4.2.1 Meritve na koreninah 24
4.2.2 Parametri rasti soje 25
4.2.3 Končna biomasa in pridelek zrnja soje 27
5 RAZPRAVA IN SKLEPI 29
6 POVZETEK 32
7 VIRI 33
ZAHVALA
KAZALO PREGLEDNIC
Str.
Preglednica 1: Pregled učinkov bioefektorjev od celičnega nivoja do pričakovanih
gospodarskih in okoljskih koristi (prirejeno po Du Jardin, 2015). ... 6
Preglednica 2: Načrt tretiranja rastlin soje z mikroalgnim izvlečkom. ... 18
Preglednica 3: Statistični F in p vrednosti za spremenljivke: delež kalivost, dolžina korenin, površina korenin, premer korenin in število koreninskih vršičkov. ... 23
Preglednica 4: Statistični F in p vrednosti za parametre koreninskega segmenta. ... 25
Preglednica 5: Statistični F in p vrednosti za parametre rasti... 26
Preglednica 6: Statistični F in p vrednosti za parametre segmenta pridelek. ... 28
KAZALO SLIK
Str.
Slika 1: Tridimenzionalni fotobioreaktor za gojenje alg (Varicon aqua, 2021). 9 Slika 2: Delež kalivosti semen sladkorne pese tretiranih z različnimi koncentracijami mikroalg Chlorella vulgaris (A) ali Scenedesmus quadricauda (B) za 3., 4., 5. in 7. dan po nastavitvi poskusa. C pomeni koncentracije mikroalg: C0 = 0 mg Corg/L;C1 = 0,1 mg Corg/L; C2 = 1 mg Corg/L; C3 = 2 mg Corg/L; C4 = 5 mg Corg/L; C5 = 10 mg Corg/L. Stolpci, ki imajo enake črke, se po Fisherjevem testu med sabo statistično ne razlikujejo (α = 0,05). Odsotnost črk nad stolpci kaže, da podatki niso statistično
značilni (Puglisi in sod., 2020). 12
Slika 3: Povzetek mehanizmov delovanja algnih izvlečkov na rastlino (prirejeno po
Van Oosten in sod., 2017). 14
Slika 4: Mikroalgne raztopine v koncentracijah: 0,2 g/L; 0,5 g/L; 1 g/L; 5 g/L (1), razporeditev semen na papirnati brisački, navlaženi z mikroalgno raztopino (2), dodana druga plast papirnate brisačke na razporejena semena (3) ter ohlapno zavita sloja
brisačke s semeni soje v sredini (4). 16
Slika 5: Zvitek postavljen v steklen kozarec, pokrit s plastično vrečko, označen s priležno oznako koncentracije mikroalgne raztopine (levo) in zvitek s semeni po osmih
dneh od nastavitve poskusa (desno). 16
Slika 6: (1) Postavitev kalic na skenerju v plastični posodi z vodo. (2) Skeniranje na skenerju Epson Perfection V700 Photo, posoda je pokrita z modrim papirjem, ki služi
kot ozadje. (3) Končni rezultat. 17
Slika 7: Shema trajnega poskusa na Laboratorijskem polju Biotehniške fakultete. 18 Slika 8: Merjenje višine rastlin soje s tračnim metrom v prvem (30.6.2020) – levo in drugem terminu (6.8.2020) – desno (Foto: Lenarčič D., 2020). 19 Slika 9: Merjenje vsebnosti klorofila s SPAD metrom v prvem terminu (30.6.2020). 19 Slika 10: Merjenje indeksa listne površine v prvem terminu (30.6.2020). 20 Slika 11: Nodule smo za namen štetja in tehtanja biomase odstranili z rastline in jih
položili na petrijevko. 20
Slika 12: Pridelek s posameznih podparcel v vrečah iz jute po pobiranju (levo).
Zrelo polje soje 2.11.2020 (desno). 21
Slika 13: Prikaz dnevnih povprečij temperature tal (°C) in vlažnosti tal (%) za leto 2020. Rumena črta prikazuje podatke na 10 cm globine, rdeča črta na 20 cm in črna črta na 35 cm globine. Podatki so bili izmerjeni v poskusu s sojo na Laboratorijskem polju Biotehniške fakultete v Ljubljani (vir podatkov: Pečan, 2020). 22 Slika 14: Okvir z ročaji za izmerjene parametre laboratorijskega poskusa glede na
aplicirano koncentracijo bioefektorja (0,2 g/L; 0,5 g/L; 1 g/L; 5 g/L; k – netretirane rastline). Črn kvadrat predstavlja povprečno vrednost, vodoravna črta znotraj
obarvanega okvirja pa mediano. 24
Slika 15: Okvir z ročaji za izmerjene parametre koreninskega sistema soje po ravneh gnojenja za z mikroalgami tretirane (A) in netretirane (0) ploskve. Črn kvadrat
predstavlja povprečno vrednost, vodoravna črta znotraj obarvanega okvirja pa mediano. 25
Slika 16: Okvir z ročaji za parametre rasti soje po ravneh gnojenja za z mikroalgami tretirane (A) in netretirane (0) ploskve Črn kvadrat predstavlja povprečje, vodoravna
črta znotraj obarvanega okvirja pa mediano. 27
Slika 17: Okvir z ročaji za izmerjene parametre nadzemnega dela rastline in pridelka soje po ravneh gnojenja za z mikroalgami tretirane (A) in netretirane (0) ploskve. Črn kvadrat predstavlja povprečno vrednost, vodoravna črta znotraj obarvanega okvirja pa
mediano. 28
1 UVOD
Glede na predvideno rast prebivalstva in spremembe v vzorcih potrošnje (poraba mesa) se predvideva, da se bo morala kmetijska proizvodnja v prihodnjih desetletjih potrojiti.
Svetovno prebivalstvo naj bi se do leta 2050 povečalo na 9,8 milijarde ljudi, do leta 2100 pa na 11,2 milijardi (Lampridi in sod., 2019). Čeprav se ugotavlja, da je proizvodnja hrane v zadnjih desetletjih dohajala naraščajoče povpraševanje, in da sta danes ključni vprašanji distribucija in dostop, se povečuje zaskrbljenost zaradi groženj svetovni preskrbi s hrano zaradi podnebnih sprememb pa tudi konkurence proizvodnje krme za živino in biogoriv (Van Beek in sod., 2010).
Trajnost - ravnovesje med družbo, okoljem in gospodarstvom, je ena izmed glavnih usmeritev, ki se pojavlja ob načrtovanju Skupne kmetijske politike za obdobje 2023-2027.
Da trajnost udejanjimo, pa je potrebno veliko znanja. Napredki na področju agronomije lahko pomagajo ublažiti nekatere vplive podnebnih sprememb na proizvodnjo hrane, vendar so za uresničitev izboljšane preskrbe s hrano, potrebne velike naložbe v raziskovanje in implementacijo na trg. Spremeniti je potrebno kmetijske prakse, sorte in vrste poljščin pa tudi ozavestiti javnost in s tem izboljšati odnos do tega problema (Anderson in sod., 2020).
Eden izmed novih in okolju prijaznejših pristopov sodobnega kmetijstva, ki so v fazi preizkušanja, je tudi uporaba rastlinskih bioefektorjev, ki lahko zmanjšajo odvisnost od kemičnih pripravkov, zlasti sintetičnih gnojil in fitofarmacevtskih sredstev, in s tem zagotovijo stabilen, kakovosten pridelek tudi v neugodnih okoljskih razmerah. Bioefektorji so mikroorganizmi ali iz različnih organizmov ali organskih materialov pridobljeni izvlečki, ki jih v majhnih količinah nanašamo na rastline, s čimer spodbudimo rast in razvoj poljščin, vplivamo na njihovo odpornost na okoljski stres ali obrambno sposobnost proti škodljivim organizmom. Nanašamo jih na seme, v tla ali na rastlino, kjer uravnavajo in krepijo fiziološke procese, kot so deaktivacija reaktivnih kisikovih vrst, stabilizacija membran, regulacija listnih rež, hormonsko stanje (Van Oosten in sod., 2017).
Mikroalge so fotosintetični mikroorganizmi, prokariontski ali evkariontski, ki naseljujejo vse vodne ekosisteme – oceane, morja, sladke vode ali vlažna tla. Znanost in industrija izkoriščata mikroalge v najrazličnejših področjih, in sicer v farmaciji, kozmetiki, prehrani, bioenergiji in v okolju, vse to pa zaradi tega, ker so bogate s številnimi bioaktivnimi molekulami. V zadnjem desetletju sta bili sestava in biološka aktivnost morskih alg in mikroalg velikokrat predmet raziskav. Ugotovili so protivirusne, antioksidativne, protibakterijske, protiglivične, protirakave učinke, pa tudi stimulacijske učinke na rast in razvoj rastlin (Farid in sod., 2019).
Nekateri viri mikroalge uvrščajo med biološka gnojila. Razlika med gnojilom in bioefektorjem je v tem, da z gnojilom dodamo zadostno količino gnojil za potrebe kulture, z bioefektorjem pa dodamo malo ali skoraj nič hranil. Rezultati kažejo, da so alge dober alternativni vir mineralnemu dušiku, saj za pridobivanje alg porabimo manj energije, so stroškovno učinkovite in lahko dostopne, hkrati pa ne povzročajo onesnaževanja okolja
(Dineshkumar in sod., 2020). Bioefektorji sami po sebi niso hranila, temveč le olajšajo sprejem le teh ali na drugačen način koristno prispevajo k pospeševanju rasti ali odpornosti na stres, če jih nanesemo v manjših količinah. Novo nastala paradigma poudarja, da rastline
niso samostojne enote znotraj okolja, temveč so gostitelji in partnerji mikroorganizmom (npr. bakterijam in glivam). Ta povezava rastlinam omogoča, da se pravočasno odzovejo in prilagodijo na abiotski in biotski stres. Mehanizmi delovanja bioefektorjev v kmetijstvu so še dokaj slabo raziskani, obstoječe raziskave pa kažejo mešane rezultate – nekateri dokazujejo uspešno učinkovanje bioefektorjev, drugi pa vpliva le teh na rast in razvoj rastline ne dokazujejo (Van Oosten in sod., 2017).
1.1 NAMEN IN DELOVNE HIPOTEZE
Namen našega poskusa je bil preučiti biostimulativni vpliv mikroalg na sojo in sicer na dva načina. Prvi je bil kot foliarni nanos mikroalgne raztopine na sojo v poljskem poskusu na Laboratorijskem polju BF, drugi pa v kontroliranih razmerah, kjer smo obravnavali vpliv različnih koncentracij izvlečka alg na kalitev in rast korenin soje. Z raziskavo smo skušali raziskati morebiten biostimulativen učinek mikroalg na rast in kalitev soje, kar predstavlja enega izmed okolju prijaznejših načinov pridelave poljščin.
V naši raziskavi smo si zastavili naslednje delovne hipoteze:
- Kalivost soje se bo v kontroliranih razmerah povečala že pri nizkih koncentracijah mikroalgnega ekstrakta.
- Na parametre rasti podzemnega in nadzemnega dela rastline soje NPK gnojenje vpliva bolj kot dodatek mikroalg.
- Pridelek rastlin, tretiranih z mikroalgami, bo večji kot ne-tretiranih.
2 PREGLED OBJAV
2.1 SOJA (Glycine max (L.) Merr.) 2.1.1 Izvor in današnja razširjenost
Izvor soje umeščamo v obdobje 1100 do 1700 pred našim štetjem, in sicer na območje vzhodne Azije. Najverjetneje resnični začetki pridelave segajo še dlje v preteklost. Območje pridelave soje se je najprej razširilo nad osrednjo in južno Kitajsko, v 18. stoletju pa so jo začeli gojiti tudi v ZDA. V Evropo je soja prišla v 19. stoletju, kjer so jo sprva uporabljali v okrasne namene, šele kasneje pa so jo pričeli uporabljati za prehrano (Kocjan Ačko in Ačko, 2016).
Pridelava soje po svetu je v letu 2019 obsegala 120,5 milijonov hektarjev, pridelka pa je bilo 333,8 milijonov ton. Kar 86,1 % vse soje v svetu je pridelane v Ameriki, sledita Azija z 9,5
% in Evropa s 3,5 %. Med države, ki pridelajo največ soje, spadajo Brazilija, ZDA, Argentina in Kitajska. Med prvih deset pridelovalk se uvršča samo ena evropska država in sicer Ukrajina (FAO, 2021). Statistični podatki za pridelavo soje v Sloveniji v letu 2019 kažejo, da se je pri nas posejalo 1430 hektarjev soje, kar je prineslo 4240 ton pridelka.
Pridelava soje v Sloveniji je v letu 2013 zaradi spodbud kmetijske politike (proteinska krma, fiksacija N) začela naraščati. Vrh pridelave smo dosegli v letu 2017, ko je bilo posejanih 2908 hektarjev soje. Od takrat število površin posejanih s sojo ponovno pada (FAO, 2021).
V letu 2019 je bilo kar 48,2 % soje po svetu gensko spremenjene, s čimer soja zaseda prvo mesto med gensko spremenjenimi poljščinami po svetu. Zasajenih je kar 91,9 milijonov hektarjev gensko spremenjene soje (ISAAA, 2019). V letu 2015 je Evropski parlament in Svet sprejel direktivo glede možnosti držav članic, da same omejijo gojenje gensko spremenjenih organizmov na območju svoje države. Takrat se je Slovenija skupaj še z 18 državami članicami Evropske Unije odločila za prepoved gojenja gensko spremenjenih rastlin. Na ta način je pridelovanje gensko spremenjenih rastlin tudi v Sloveniji prepovedano (European Commission, 2021).
2.1.2 Opis rastline
Koreninski sistem pri soji je vretenast, glavna korenina pa je zelo močna. Zanjo je značilno, da korenine lahko razvije kar do dveh metrov globoko. Večina korenin se sicer nahaja v območju med 20 in 30 centimetri, kar rastlini omogoča učinkovito črpanje vode in hranil (Đorđević in Nenadić, 1980). Steblo pri soji je močno, dlakavo in značilno razvejano. Zraste od 40 do 100 cm visoko. Steblo ima 8 do 12 nodijev. Listi so pri soji trojnati (trolist), zrastejo od 3 do 15 cm. Plod soje je strok, v katerem se oblikuje eno do pet semen (Kocjan Ačko in Ačko, 2016). Sojino zrno je približno kroglaste oblike. Tehta od 100 do 300 miligramov, premer pa znaša 4 do 8 milimetrov. Zrno soje je sestavljeno iz 20 % lipidov, 40 % beljakovin, 35 % ogljikovih hidratov in 5 % suhe snovi. Deleži so precej spremenljivi, saj so odvisni od sorte in rastnih razmer (Snyder, 2003). Gojimo jo v toplih razmerah - v tropih, subtropih in zmernem podnebju. Soja je razmeroma odporna na nizke in zelo visoke temperature, vendar se stopnja rasti zmanjša pri temperaturah nad 35 °C in pod 18 °C. Pridelovati jo je mogoče na različnih tleh, razen na zelo peščenih. Optimalni pH tal se giblje od 6 do 6,5. Potrebe po
gnojenju so 15 do 30 kg/ha fosforja in 25 do 60 kg/ha kalija. Ker je soja sposobna vezave atmosferskega dušika, veliko dušika ni potrebno dodajati, vendar je začetni odmerek 10 do 20 kg/ha N koristen za dobro zgodnjo rast. Celotno obdobje rasti traja od 100 do 130 dni ali več. Soja se v svetu pogosto znajde v kolobarju z bombažem, koruzo in sirkom. Le 25 do 30 odstotkov cvetov tvori stroke, njihovo končno število pa je odvisno od vitalnosti rastline v času cvetenja, kar je najbolj odvisno od nihanja medletnih temperatur. Pridelki soje se gibljejo nekje med 1,5 in 3,5 tone semena na hektar, odvisno od lastnosti tal, reliefa, osončenosti, padavin oziroma namakanja, gnojenja, vrstnih razdalj, veliko pa tudi od izbrane sorte (FAO, 2021).
2.1.3 Kalitev soje
V nekaj urah od setve v vlažna tla se delež vlage v zrnu soje spremeni z manj kot 13 % na skoraj 50 %. V enem ali dveh dneh prva korenina – radikula vzklije iz semenske lupine.
Radikula soje raste v smeri navzdol, iz nje pa se razvije primarna korenina. Ta se podaljša, ob strani pa začenjajo poganjati stranske korenine. Tu poženejo koreninski laski, ki jih imamo za glavne absorpcijske strukture. Po petih do desetih dneh soja zraste tik pod površino tal. Hipokotil se začne podaljševati in tvori hipokotilno kljuko. Ta prodre skozi tla in klične liste - kotiledone potegne navzgor. Ti služijo kot začasen vir hrane za mlado rastlino (Extension, 2015). Kmalu po vzniku se kotiledoni zaradi sončne svetlobe odprejo in ozelenijo. S fotosintezo začnejo proizvajati dodatno hrano. Ob razprtju kotiledonov se pokaže še epikotil, kmalu na njem poženejo pravi listi (Kruger seeds, 2019).
2.1.4 Nodulacija
Soja spada med stročnice (Fabales), v družino metuljnic (Fabaceae). Za to družino je značilno, da tvorijo na koreninah simbiozo z nekaterimi bakterijami (diazotrofi), ki so sposobne vezave zračnega N₂ in pretvorbe v NH3. Fiksacija dušika v tem primeru poteka zaradi simbiotske nodulacije korenin (Araújo in sod., 2007). Noduli so kroglaste strukture, ki nastanejo na koreninah in nudijo prostor simbiontskim bakterijam. Največkrat se v nodule naselijo bakterije iz vrst Rhizobium sp. in Bradyrhizobium sp. Atmosferski dušik (N₂) spremenijo v amonijsko obliko (NH₄⁺). Nato se sintetizira glutamin, ki je značilen za nodule z nezaključeno rastjo (nedeterminantni noduli). Reakcija teče tako: l-glutamat + NH₄⁺ + ATP
→ l-glutamin + ADP + Pi + H⁺. Za sojo so še posebej značilni kroglasti (determinantni) noduli, kjer bakteroid kot dušikove spojine tvori ureide (alantoin, alantoinska kislina, citrulin), s katerim se hrani rastlina (Collier in Tegeder, 2012; Betti in sod., 2012). Proces simbioze poteka v obe smeri. Soja bakterijam nudi energijo za njihovo delovanje – ogljikove hidrate, ki jih proizvaja v fotosintezi. Ob zadostni količini vode je nodulacija najboljša pri sorazmerno visokih temperaturah - nad 30 °C, a je to odvisno od vrste bakterij in sorte soje in njune interakcije. Fiksacija dušika se s starostjo stročnic zmanjšuje, predvsem zaradi pomanjkanja kalcija. Kisel pH negativno vpliva na razvoj nodulov, zato je optimalen pH okoli nevtralnega do rahlo bazičnega. Na koreninsko nodulacijo z bakterijami lahko vpliva tudi mikoriza (Mohammadi in sod., 2012).
2.2 RASTLINSKI BIOEFEKTORJI
Bioefektorji so snovi organskega izvora ali mikroorganizmi, ki se uporabljajo za boljši sprejem hranil, spodbujanje rasti, izboljšanje odpornosti pred biotskim in abiotskim stresom, povečano fotosintetsko aktivnost in posledično izboljšano kakovost pridelka (Van Oosten in sod., 2017). Vseeno pa definicija bioefektorjev ni tako enostavna in se je skozi čas razvijala, dopolnjevala. Razpravo o tako imenovanih biogenih stimulatorjih je leta 1933 pričel ruski profesor Vladimir P. Filatov, ki je razvil tkivno terapijo. "Vsako živo tkivo (človeško, živalsko in rastlinsko), se biokemično prestrukturira, kadar je izpostavljeno neugodnim, vendar ne smrtonosnim pogojem, pri čemer v njem nastanejo posebne snovi, ki so biogeni stimulatorji nespecifične narave, ki spodbudijo življenjske reakcije organizma, v katerega so vneseni, tako ali drugače". S to definicijo je prvi nakazal, da lahko biološki materiali, pridobljeni iz različnih organizmov (vključno z rastlinami), vplivajo na presnovne in energetske procese pri ljudeh, živalih in rastlinah. Leta 1994 je Herve opisal koristi bioefektorjev pri gojenju kmetijskih rastlin, kot snovi, ki delujejo v majhnih odmerkih in niso okolju škodljive. Leta 2009 so bili bioefektorji definirani v Uredbi Evropskega parlamenta in Sveta. Danes jih Uredba uvršča pod gnojila, v 22. členu je navedeno, da delujejo kot dopolnilo gnojilom, s ciljem izboljšanja učinkovitosti in posledično k zmanjšanju odmerka gnojila (Uredba EU št. 1069/2009 …, 2019).
Opredelitev načina delovanja bioefektorjev je zahtevna naloga, saj mednje uvrščamo raznolike kemijske snovi in taksonomske skupine živih organizmov. Vključujejo morske alge, bakterije, glive, surovine iz rastlin in živali in humusne spojine. Postopki, ki se uporabljajo za pripravo bioefektorjev, se prav tako zelo razlikujejo med sabo (Yakhin in sod., 2017). Mnogi so opozorili na zmedo, ki velja na področju bioefektorjev (Torre in sod., 2013). Številni menijo, da velik del trga bioefektorjev nima znanstveno dokazanih rezultatov, ter da je njihova učinkovitost vprašljiva, prodaja pa bazira na psevdoznanosti in dobremu trženju. Neučinkovitost določenih pripravkov ni presenetljiva, saj so biološki sistemi po naravi zapleteni, problem je tudi pomanjkanje ponovitev in neodvisnost raziskav.
Vseeno imamo po svetu opravljenih veliko poskusov, ki potrjujejo učinkovitost, poleg tega pa tudi trg pozitivno sprejema določene pripravke, kljub temu da mehanizem delovanja še ni povsem raziskan (Yakhin in sod., 2017).
V literaturi se je skozi leta za bioefektorje uporabljalo več različnih, a podobnih izrazov.
Izraz bioefektor je bil opisan kot sinonim ali različica z imeni: biostimulant, biogeni stimulans, pospeševalec presnove, ojačevalec rastlin, regulator rasti rastlin, elicitor, alelopatski pripravek, sredstvo za krepitev rastlin, fitostimulator, biognojilo (čeprav po definiciji bioefektorjev ne uvrščamo med pesticide ali gnojila). Po pregledu definicij skozi zgodovino, so Yakhin in sod. (2017) osnovali sledečo definicijo, ki naj bi po njegovem mnenju najbolj celostno opredelila bioefektorje: »Izdelek biološkega izvora, ki rastlini izboljša produktivnost, zaradi izvorno prisotnih ali novo nastalih lastnosti kompleksa sestavin in ne zgolj zaradi prisotnosti znanih esencialnih rastlinskih hranil, rastnih regulatorjev ali rastlinskih zaščitnih spojin«.
V dobrih razmerah za pridelovanje lahko bioefektorji pripomorejo k doseganju nadpovprečnega pridelka tako glede količine kot tudi kakovosti. Pomagajo izboljšati izkoristek vode in hranil, pospešijo vznik in začetni razvoj rastline, vplivajo na potek
cvetenja, oplodnje in dozorevanja s tem da podaljšajo rastno dobo in spremenijo skladiščno sposobnost plodov. Ko so razmere za pridelovanje slabe in je rastlina izpostavljena stresnim razmeram (zaradi mraza, vročine, suše, toče…), bioefektorji pomagajo pri regeneraciji rastline. Prav tako rastlina hitreje nadoknadi zaostanek v rasti in lažje sprejme hranila v neustreznih razmerah. V stresnih razmerah zaradi neustreznega pH, slanosti ali dolgotrajnih sušnih razmer se rastlina, tretirana z bioefektorji, lažje prilagodi s spremembo fizioloških ciklov (Lešnik, 2017).
Predvideva se, da bodo imeli bioefektorji za kmetijstvo v bodoče velik pomen, saj naj bi prispevali k bolj trajnostnemu in na stresne razmere odpornemu kmetijstvu. Predstavljajo alternativno možnost sintetičnim zaščitnim sredstvom, ki so med potrošniki vse manj priljubljeni in prispevajo k degradaciji tal, vode (Van Oosten in sod., 2017; Gautam in sod., 2021). Verjetno so tudi zato rastlinski stimulanti, ki temeljijo na naravnih materialih, v zadnjih 25 letih poželi kar nekaj pozornosti iz strani znanstvenikov in komercialnih podjetij (Yakhin in sod., 2017).
Za potrebe te magistrske naloge bomo uporabili razvrstitev bioefektorjev, ki so jo zasnovali Van Oosten in sod. (2017). Bioefektorje so razvrstili v štiri glavne skupine glede na njihov učinek na rast rastline in prilagajanje abiotskim stresnim dejavnikom (suša, poplave, slanost, mraz, vročina, oksidativni stres, …):
- ogljikovi hidrati, beljakovine, aminokisline in lipidi, - huminska in fulvo kislina,
- mikroorganizmi (bakterije, glive), - izvlečki morskih alg.
Preglednica 1: Pregled učinkov bioefektorjev od celičnega nivoja do pričakovanih gospodarskih in okoljskih koristi (prirejeno po Du Jardin, 2015).
Izvlečki morskih alg Huminske kisline Beljakovinski hidrolizati
Rast spodbujajoče rizobakterije Celični
mehanizem
Spodbujajo izražanje genov, ki kodirajo prenašalce mikrohranil (npr. Cu, Fe, Zn).
Aktivirajo plazmatsko membrano, črpajo protone, spodbujajo celično prožnost in podaljševanje celic v koreninah.
Spodbujajo izražanje encimov in genov fenilalanin-amoniak- liaze ter proizvodnjo flavonoidov v slanostnem stresu.
Sproščajo avksine in aktivirajo njihove signalne poti, ki so vključene v morfogenezo korenin.
Fiziološka funkcija
Povečane koncentracije mikrohranil v tkivih in prenos mikrohranil iz korenin v poganjke.
Povečana linearna rast korenin in koreninska biomasa.
Zaščita s flavonoidi pred UV-žarki in oksidativnimi poškodbami.
Povečana gostota stranskih korenin in površina koreninskih laskov.
Funkcija v agronomiji
Izboljšana mineralna sestava rastlinskih tkiv.
Povečana sposobnost vsrkavanja hranil v korenine in boljša izraba hranil.
Boljša odpornost rastlin na abiotski stres.
Povečana sposobnost vsrkavanja hranil v korenine in boljša izraba hranil.
Gospodarske in okoljske koristi
Izboljšana hranilna vrednost, (povečana vsebnost S, Fe, Zn, Mg, Cu).
Večji pridelki, manjša poraba gnojil, manjše izgube v okolju.
Boljši pridelek v
stresnih pogojih. Večji pridelek, manjša poraba gnojil, manjše izgube v okolje.
2.2.1 Ogljikovi hidrati, beljakovine, aminokisline in lipidi kot bioefektorji
Ogljikovi hidrati, beljakovine, aminokisline in lipidi lahko povečajo odpornost rastline na stres (Van Oosten in sod., 2017). Aminokisline vplivajo na pretok ionov v membranah, kar se kaže v zmanjšanju vpliva NaCl na odtekanje kalija. Izvlečki bogati z aminokislinami zato vplivajo na odpornost rastlin na nizke temperature, tako da izboljšajo stomatalno prevodnost.
Dodatek beljakovinskih hidrolizatov na rastlino, ki je občutljiva na slanostni stres, je pripomogel k izboljšanju razvejanosti koreninskega sistema, k povečanju svežega pridelka, suhe biomase, povečanju koncentracije osmolitov, glukozinolatov, terpenov in sterolov.
Prav tako beljakovinski hidrolizati prispevajo k zmanjšanemu vodnemu potencialu (Van Oosten in sod., 2017). Neposredni vplivi na rastline vključujejo tudi uravnavanje encimov, ki sodelujejo pri asimilaciji dušika, njihovih strukturnih genov in signalno pot vnosa dušika v korenine. Aminokisline lahko rastlino zaščitijo pred težkimi kovinami in prispevajo k mobilnosti in pridobivanju mikrohranil. Znano je, da beljakovinski hidrolizati povečujejo mikrobno biomaso in aktivnost, dihanje tal in na splošno povečajo rodnost rastlin (Du Jardin, 2015). Poskus nanosa aminokislin na sojo je pokazal izboljšanje količine in kakovosti pridelka ter tudi izboljšanje hranilne vrednosti soje. V primerjavi s kontrolo so se povečali parametri: število strokov in semen (32 %), višina rastlin (38 %), vsebnost fenolov (34 %), vsebnost flavonoidov (74 %) in redukcijska moč (210 %) (Kocira in sod., 2019).
2.2.2 Huminska in fulvo kislina kot bioefektorja
Humusne snovi so naravne sestavine talne organske snovi, ki so posledica razgradnje rastlinskih, živalskih in mikrobnih ostankov. Glede na molekulsko maso in topnost jih delimo v tri skupine: humin, fulvo kisline in huminske kisline (Du Jardin, 2015). Huminska in fulvo kislina nastaneta z biološko razgradnjo organske snovi, pri čemer se tvori mešanica kislin, ki vsebuje fenolat in karboksilne skupine (Van Oosten in sod., 2017). Če želimo huminske spojine učinkovito uporabljati kot bioefektorje, je potrebno okrepiti interakcijo med organsko snovjo, mikrobi in rastlinskimi koreninami. Na učinkovitost vpliva izvor huminskih snovi, okoljske razmere, rastlina, odmerek in način nanašanja. Večina biostimulativnih učinkov humusnih snovi se nanaša na izboljšanje vnosa hranil prek korenin, najverjetneje zaradi povečane kationske izmenjalne kapacitete tal. Naslednji možen mehanizem je stimulacija H+-ATPaz v plazmalemi, ki energijo sproščeno pri hidrolizi ATP, pretvorijo v protonsko gonilno silo, ki se uporablja za vnos dušika in drugih hranil s simportom. Opisani so tudi hormonski učinki, vendar pogosto ni jasno, če humusne snovi vsebujejo funkcionalne skupine, ki jih prepoznajo signalni kompleksi rastlinskih hormonskih poti ali sproščajo ujete hormonske spojine ali pa spodbujajo mikroorganizme, ki proizvajajo hormone. Humusne snovi povečajo aktivnost ključnih encimov metabolizma fenilpropanoidov, ki je osrednjega pomena za proizvodnjo fenolnih spojin, ki so vključene v številne odzive rastlin na stres (Du Jardin, 2015). Koristni učinki dodatka huminske in fulvo kisline so se pokazali ob sušnem in slanostnem stresu (Van Oosten in sod., 2017).
2.2.3 Biostimulativni učinki živih mikroorganizmov
Ta kategorija vključuje koristne bakterije in glive. Večinoma so to rast spodbujajoče rizobakterije, lahko pa so tudi prosto živeče, rizosferne ali endosimbiontske (Du Jardin, 2015). Bakterije, ki jih uporabljamo kot bioefektorje, izvirajo iz okolja, ki je podvrženo
različnim okoljskim stresom – ekosistemi s slanimi, bazičnimi ali kislimi in sušnimi tlemi.
Tovrstne bakterije pripadajo različnim rodovom: Rhizobium, Bradyrhizobium, Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas in Bacillus. Razvile so strategije za prilagajanje in posledično uspevanje v neugodnih razmerah. Med načini prilagoditve sta spremenjena sestava celične stene in sposobnost kopičenja topljencev. Topljenci izboljšajo zadrževanje vode in posledično zmanjšajo osmotski stres. Celična stena zaradi obogatitve z eksopolisaharidi in lipopolisaharidnimi proteini in polisaharidnimi lipidi tvori zaščitni film na površini korenine.
Bakterije rodu Rhizobium imajo visoko vsebnost indol ocetne kisline (IAA) in dokazano blažijo slanostni, sušni stres in zmanjšajo negativne učinke neugodnega pH in ekstremnih temperatur (Van Oosten in sod., 2017). Med rastlinami in glivami so se skozi evolucijo razvile številne interakcije od vzajemnosti do parazitizma. Mikorizne glive so tiste, ki z več kot 90 % rastlin vzpostavljajo simbiozo. Ena izmed poznanih je arbuskularna mikoriza, kjer hife gliv prodrejo v celice korenin in tvorijo razvejane strukture, arbuskule. Za mikorizo je v kmetijstvu vse več zanimanja, saj rastlini omogočijo boljšo prehranjenost z makro in mikro hranili, pomagajo pri preskrbi z vodo, povečujejo rast in jo zaščitijo pred abiotskim in biotskim stresom. Ker mikoriza ne povezuje le glive in rastline, temveč tudi rastline med sabo, omogoča signalizacijo med rastlinami, kar prav tako prinaša prednosti. Obnašanje mikorizne združbe v agroekosistemih je dokaj slabo poznamo ( Du Jardin, 2015).
2.2.4 Alge in njihovi izvlečki kot bioefektorji
Morske alge so ključen člen obalnih in morskih ekosistemov. Nudijo zavetje in hrano številnim živalskim in rastlinskim vrstam, pomembno vplivajo tudi na fizikalno – kemijske lastnosti vode (Battacharyya in sod., 2015). Ločujemo rdeče, zelene in rjave makroalge. Kot organsko gnojilo se uporabljajo že tisočletja (Van Oosten in sod., 2017). Antični viri razkrivajo, da so Rimljani rastlinske korenine ovili z algami, da bi dlje ohranili zeleno barvo listov. V Čilu so našli 15.000 let stare dokaze o uporabi morskih alg v prehrani ljudi.
Etnografske študije kažejo na to, da je človek poznal mnoge načine uporabe alg – v prehrani, zdravilstvu in kasneje medicini, v kmetijstvu, kot kozmetični izdelki, barvila in tekstil.
Poznamo 10.000 vrst morskih alg, kar predstavlja 10 % celotne morske produktivnosti, majhen delež pa je pomemben tudi v kmetijstvu v obliki izvlečkov (Battacharyya in sod., 2015). Kmetje so v preteklosti poznali načine uporabe alg, v petdesetih letih prejšnjega stoletja pa so namesto algnih organizmov začeli raje uporabljati njihove izvlečke. Večina komercialnih izdelkov je pridobljena iz rdečih (npr. Lithothamnium calcareum) in rjavih (npr. Ascophyllum nodosum, Durvillaea potatorum) makroalg (Van Oosten in sod., 2017).
2.2.4.1 Mikroalge
Mikroalge so netaksonomska skupina prokariontskih ali evkariontskih fotosintetskih mikroorganizmov, mednje po nekaterih definicijah spada ves fitoplankton, vključno s cianobakterijami. Velike so med 1 in 50 mikrometri. Naseljujejo vse vodne ali vlažne sisteme - morja, oceane, sladke vode ali vlažna tla. Večina vrst mikroalg opravlja fotosintezo, pri čemer uporablja sončno svetlobo kot vir energije in CO2 pa kot vir ogljika za izgradnjo biomase. V tem procesu alge kot stranski produkt proizvajajo kisik. Ugotovili so protivirusne, antioksidativne, protibakterijske, protiglivične, protirakave učinke mikroalg in njihovih izvlečkov, pa tudi stimulacijske učinke na rast in razvoj rastlin. Z raziskavami so
potrdili učinke na rast in razvoj rastlin ter odpornost na abiotski stres (Farid in sod., 2019;
Wolkers in sod., 2011).
Prva uporaba mikroalg seže 2000 let nazaj, ko so mikroalge Nostoc na Kitajskem uporabljali kot nadomestni vir hrane v času lakote. Biotehnologija mikroalg se je začela razvijati v sredini dvajsetega stoletja. Danes poznamo številne načine rabe mikroalg v komercialne namene. Uporabljajo se za izboljšanje hranilne vrednosti živil in živalske krme, kot sestavina v kozmetiki in na splošno kot vir dragocenih molekul. Polinenasičena maščobnokislinska olja se na primer dodajajo v nadomestek za materino mleko in prehranska dopolnila, pigmenti pa so pomembni kot naravna barvila (Spolaore in sod., 2006). V literaturi je kar nekaj virov, ki mikroalge v prvi vrsti omenjajo v zvezi s proizvodnjo biogoriv in njihovo uporabo v medicini, farmaciji (antibiotiki) in v človeški prehrani, predvsem kot prehranska dopolnila in nadomesten vir beljakovin. Število raziskav iz tega področja se povečuje (Garrido-Cardenas in sod., 2018), a so raziskave glede uporabe mikroalg v kmetijstvu v manjšini.
2.2.4.2 Pridobivanje mikroalg in njihovih izvlečkov
Poznamo štiri načine gojenja mikroalg. Najpogosteje uporabljeni so nizki ovalni bazeni na prostem, kjer se voda meša s pomočjo mešala. Njihova prednost je nizka cena, a je upravljanje težje kot v zaprtem sistemu s cevmi. Problem predstavlja izhlapevanje vode, možnost okužb in omejenost z izbiro vrste alg, saj morajo biti odporne in hitro rastoče. Tudi fotosintetska učinkovitost sistemov je slaba – le 1,5 %, saj sonce težko prodre v globine motne vode. Alge na vrhu prestrežejo glavnino svetlobe, ki je ne zmorejo učinkovito izrabiti.
Produktivnost je veliko večja v dobro osončenih krajih. Druga možnost je gojenje alg v prozornih, horizontalno položenih ceveh. V takem sistemu je proces lažje nadzorovati, produktivnost na m² pa je večja kot v bazenih. Povečevanje proizvodnje je lažje, saj cevi samo dodajamo. Problem lahko predstavlja kopičenje kisika, premočna osvetljenost in višja cena napeljave. Podobno temu je tudi gojenje alg v tridimenzionalnih ceveh (Slika 1), le da je tu problem s svetlobo manjši, saj se cevi med sabo senčijo, pridelek na hektar pa je večji zaradi večjega števila cevi. Četrta možnost je gojenje alg v ploščatem reaktorju. Tak sistem je teoretično najproduktivnejši, saj ni težav s kopičenja kisika in prekomerno osvetlitvijo.
Ploščati paneli so energetsko zelo potratni, tehnologija je zahtevnejša. Vsak od teh sistemov je v procesu razvijanja in izboljševanja, zato je težko reči, kateri sistem bi bil obče optimalen (Wolkers in sod., 2011).
Slika 1: Tridimenzionalni fotobioreaktor za gojenje alg (Varicon aqua, 2021).
V medceličnini alg se nahaja alginska kislina, ki povezuje celice alg. Z namenom porušitve vezi med celicami in s tem dostopa do koristnih sestavin alg, se uporablja široka paleta postopkov ekstrakcije (Khairy in El-Shafay, 2013). Najpogosteje so v raziskavah uporabljene metode ekstrakcije s kislinami ali bazami, poznamo pa še druge - klasična ekstrakcija z organskimi topili (metanol, etanol, heksan), ekstrakcija z vodo (avtoklaviranje, homogenizacija, vrenje), novejše tehnike ekstrakcije (ultrazvok, mikrovalovi) (Michalak in Chojnacka, 2014). Kemična sestava izvlečka je v veliki meri odvisna od metode ekstrakcije in uporabljenih kemičnih snovi za ekstrahiranje. Zaradi tega je biološka aktivnost izvlečkov iste morske alge, pridobljene z različnimi postopki ekstrakcije, lahko zelo različna (Khairy in El-Shafay, 2013).
2.2.4.3 Postopek nanašanja morskih alg
Poznamo več različnih postopkov nanašanja morskih alg na rastline oz. vegetacijo z namenom izboljšanja rastnih parametrov ali agronomskih lastnosti. Izbira zavisi predvsem od oblike, v kateri se nahajajo alge – cele morske alge, prah ali tekoči izvleček. Cele morske makroalge se že dolgo uporablja za gnojenje in sicer tako, da se jih razdeli po površini in nato vdela v tla. Organska snov razgrajenih alg izboljša fizikalno-kemijske lastnosti tal, sposobnost zadrževanja vode in ščiti rastlino pred neugodnimi vremenskimi razmerami (ekstremne temperature, pomanjkanje vode ali presežek hranil). Najbolj pogosta oblika morskih alg za uporabo v kmetijstvu so izvlečki, ki jih uporabljamo kot bioefektorje v nižjih koncentracijah. Poznamo jih v tekoči obliki ali kot vodotopen prašek. Izvlečke v tekoči obliki nanašamo v območje korenin. Dodamo jih v tekočino, s katero zalivamo rastlino ali v kapljični namakalni sistem, možnost je tudi, da pred setvijo semena namočimo v algno raztopino. Široko uporabljeni so tudi foliarni pripravki – na poljščinah, sadju, vrtninah in okrasnem cvetju. Najbolj učinkovit nanos foliarnega pripravka bomo dosegli, ko so listne reže odprte. Učinkovitost pripravka je odvisna od razvojne faze rastline (Battacharyya in sod., 2015).
2.2.4.4 Učinek izvlečkov alg
Znanstveniki proučujejo raznovrstne učinke izvlečkov mikroalg na rastline. Raziskave kažejo različne rezultate – nekateri učinka izvlečka alg niso dokazali, saj so bili rezultati tretiranih rastlin primerljivi s kontrolo. V drugih raziskavah so že pri nizkih koncentracijah ugotovili vrsto fizioloških odzivov rastlin, kot so izboljšana kalitev, rast rastlin ter cvetenje, povečanje ter izboljšanje kakovosti pridelka, izboljšana hranilna sestava užitnega dela rastline in podaljšan rok trajanja. Mnogo raziskav dokazuje povečano odpornost rastline na slanostni, vročinski in sušni stres ter na nizke temperature zaradi dodatka mikroalg.
(Battacharyya in sod., 2015; Van Oosten in sod., 2017). V nadaljevanju je opisanih nekaj raziskav, kjer so proučevali učinke algnih izvlečkov na rastline.
V poskusu na koruzi so Bradáčová in sod. (2016) ugotovili odpornost rastlin na nižje temperature pri dodatku izvlečkov alg, predvsem pri takih, ki so bogati s cinkom in manganom. V tem primeru je pozitiven učinek verjetno posledica oskrbe rastline z dodatnimi mikrohranili, ki imajo vlogo kofaktorjev antioksidativnih encimov.
Odpornost rastline na stres zaradi visokih temperatur se zaradi citokininov iz izvlečkov morskih alg izboljša, kar sta dokazala Zhang in Ervin (2008) na travi Agrostis stolonifera.
En teden po tretiranju rastlin z izvlečkom morskih alg so rastline izpostavili vročinskemu stresu. Izvleček morske alge je bil učinkovit, saj so imele tretirane rastline za 30 % boljšo vizualno kvaliteto in večjo maso svežih korenin v primerjavi s kontrolo. Aplikacija enake vrste morske alge v prahu (zmešana z vodo) ni bila učinkovita, kar nakazuje na to, da je oblika morskih alg in način tretiranja rastline eden izmed ključnih dejavnikov biostimulativne učinkovitosti morskih alg. Avtorji so ugotovili podoben odziv rastline tretirane z izvlečkom morskih alg tudi ob sušnem stresu.
Na travniški latovki (Poa pratensis L.) izpostavljeni slanostnemu stresu so Nabati in sod.
(1994) raziskali učinke izvlečka morske alge. Tako nadzemna rast kot tudi rast korenin, je bila na tretiranih rastlinah boljša v primerjavi s kontrolo. Rezultati so pokazali znatno zmanjšanje kopičenja natrijevih ionov v tretiranih tkivih trave.
Poleg raziskovanja učinkov algnih izvlečkov na odpornosti rastline proti stresu, znanstveniki proučujejo tudi učinke izvlečkov alg na rast in razvoj rastline. Carvalho in sod. (2013) so dokazali izboljšano kalitev fižola (Phaseolus vulgaris L.) zaradi dodatka izvlečka morske alge. Kalitev je bila za 38 % hitrejša, korenin je bilo več in bile so daljše v primerjavi s kontrolo. Podobno so ugotovili tudi na paradižniku, jajčevcu in čiliju (Crouch in Van Staden, 1992; Rao in Chatterjee, 2014).
Izvlečki mikroalg izboljšajo učinkovitost izrabe vode. Poskusi na mandljih (Prunus dulcis M.), tretiranih z izvlečki alg, so pokazali povečano rast, povečano listno površino in večje število listov v primerjavi s kontrolo (Saa in sod., 2015).
Thirumaran in sod. (2009) so potrdili prejšnje študije, da se ob dodatku izvlečka morskih alg v rastlini poveča vsebnost klorofila in karotenoidov. Semena so namakali v 10 %, 20 %, 30
%, 40 %, 50 %, 100 % koncentracije morskih alg. Najboljši učinek je bil dosežen pri nižji (20 %) koncentraciji.
Vpliv mikroalg na delež kalivosti so preučevali tudi Puglisi in sod. (2020). Izbrali so si dve različni vrsti mikroalge (Chlorella vulgaris in Scendesmus quadricauda) in tretirali semena sladkorne pese (Beta vulgaris). Izvleček mikroalg so pripravili v petih različnih koncentracijah (od 0,1 do 10 mg Corg/L), ki so bile izračunane na podlagi vsebnosti organskega ogljika posameznega izvlečka. Poskus so opravili v treh ponovitvah, vsaka je bila sestavljena iz 100 semen. Po kalitvi so opravili morfološko analizo korenin v programu WinRhizo. Ugotovili so, da sta bili na kalitev kot tudi na morfološke značilnosti korenin najbolj učinkovita nanosa mikroalg v koncentracijah 1 in 2 mg Corg/L (Slika 2).
Slika 2: Delež kalivosti semen sladkorne pese tretiranih z različnimi koncentracijami mikroalg Chlorella vulgaris (A) ali Scenedesmus quadricauda (B) za 3., 4., 5. in 7. dan po nastavitvi poskusa. C pomeni koncentracije mikroalg: C0 = 0 mg Corg/L;C1 = 0,1 mg Corg/L; C2 = 1 mg Corg/L; C3 = 2 mg Corg/L; C4 = 5 mg Corg/L; C5 = 10 mg Corg/L. Stolpci, ki imajo enake črke, se po Fisherjevem testu med sabo statistično ne razlikujejo (α = 0,05). Odsotnost črk nad stolpci kaže, da podatki niso statistično značilni (Puglisi in sod., 2020).
2.2.4.5 Način delovanja algnih izvlečkov
Čeprav so bili učinki izvlečkov morskih alg zabeleženi pri številnih vrstah, je o mehanizmih, ki stojijo za tem, dejansko zelo malo znanega. Zaradi spremenljive in zapletene narave teh snovi je težko natančno določiti, katere sestavine imajo ključno vlogo (Van Oosten in sod., 2017). Obsežne študije o kemični sestavi raznovrstnih izvlečkov različnih morskih alg so pokazale, da vsebnost hranil (običajno N, P, K) v izvlečku ni zadostovala za sprožitev fizioloških odzivov pri uporabljenih koncentracijah izvlečkov morskih alg (Khan in sod., 2009). Fiziološki in biokemijski učinek teh izvlečkov je v veliki meri izzvan zaradi kemičnih spojin, ki spodbujajo rast, in elicitorjev, ki sprožajo odziv rastline ob stresu. Morske alge so bogat vir rastlinskih hormonov (avksin, giberelin, citokinin), polisaharidov (agar, celuloza, alginska kislina), vitaminov in fenolnih spojin, vsebujejo pa tudi osmolite (betain), aminokisline, proteine in sekundarne metabolite. Naštete snovi najbrž sinergistično delujejo, vendar podrobnosti večinoma niso znane (Gautam in sod., 2021; Battacharyya in sod., 2015).
V kmetijstvu interakcija med živo mikroalgo in rastlino vsaj teoretično prinaša številne prednosti. Deluje kot simbioza, saj določene mikroalge s fiksacijo rastlini priskrbijo dušik (NH₄⁺) iz zraka, druge izboljšajo kalivost semen, spodbudijo delovanje obrambnih mehanizmov v rastlini, izboljšajo dostopnost in prenos mikrohranil. Mikroalga v zameno dobi bolj stabilno in predvsem bolj vlažno okolje, ki prepreči, da bi se posušila (Gautam in sod., 2021).
Vpliv na parametre rasti in pridelka soje so Ferreira in sod. (2021) preučevali z mikroalgo Synechocystis, ki so jo gojili v odpadnih vodah. Kalitev semen soje se je izboljšala za 65 % v primerjavi s kontrolo. V poskusu so obravnavali tudi druge rastline (kumare, paradižnik, pšenico), na katere so bolj kot Synechocystis vplivale druge mikroalge (C. vulgaris, T.
obliquus). Ker imajo semena soje visoko vsebnost beljakovin, je potreba po dušiku zelo velika, soja ga prejme z bakterijsko simbiozo. Synechocystis sp. lahko fiksira zračni dušik, kar lahko pojasni najboljši učinek tega rodu na sojina semena.
Študija vsebnosti vlaknin v krmi soje je pokazala, da je najvišji delež vlaknin dosegla sorta, tretirana z algnim pripravkom. Razlike v vsebnosti vlaknin so bile posledica števila odmerkov bioefektorjev in njihove koncentracije, močno pa je na rezultate vplivala tudi sorta soje (Kocira in sod., 2019).
V eni izmed zgodnjih raziskav delovanja mikroalg na pšenico sta Gantar in Elhai (1999) ugotovila, da so sadike pšenice, gojene v hidroponskem sistemu z algami rodu Nostoc, vzpostavile dobro povezavo - cianobakterije so kar trikrat uspešneje tvorile kolonije na koreninah pšenice in penetrirale v medcelični prostor in celice epiderma korenin na tretiranih sadikah pšenice v primerjavi s kontrolo. Ta raziskava je tlakovala pot do modela interakcije med rastlino, ki ni stročnica, in mikrobom z namenom izboljšanja pridelka.
Morske alge vplivajo na boljšo dostopnost in vsrkavanje hranil, predvsem v stresnih razmerah. Na boljšo dostopnosti hranil naj bi med drugim vplivala aktivna komponenta izvlečka morskih alg kahidrin. Ta je derivat vitamina K1 in sproža izločanje vodikovih ionov v apoplast, kar zakisa rizosfero. To spremeni redoks potencial tal in dostopnost kationov.
Izvleček alg vpliva tudi na boljšo izraženost transportnega gena na nitrat, ki je odgovoren za zaznavanje dušika in transport avksina. Boljša izraženost gena posredno povzroči boljšo rast korenin in boljše vsrkavanje dušika iz tal (Luthje in Bottger, 1995).
Rayirath in sod. (2009) so v raziskavi ugotavljali katera aktivna komponenta morske alge Ascophyllum nodosum je ključna za povečanje odpornosti na zmrzovanje rastline Arabidopsis thaliana. Ločili so organske frakcije izvlečka in z vsako od teh tretirali Arabidopsis t. in nato tretirano rastlino zamrznili. Najbolje je delovala frakcija bogata z maščobnimi kislinami in steroli, ta je povečala odpornost na zmrzovanje (pri temperaturah od -2,5 do -5,5 °C). Tretirane rastline so hitreje in bolje okrevale, imele obstojnejše celične membrane in imele 70 % manj poškodb fotosintetskih tkiv ter povečano izražanje ključnih genov za odpornost proti mrazu. Wilson (2001) je dokazal, da izvlečki mikroalg povzročijo zmanjšanje osmotskega potenciala listov, ki ima ključno vlogo na delovanje listnih rež, kar izboljša toleranco na nizke temperature.
V raziskavi so Mancuso in sod. (2006) preučevali učinek foliarnega nanosa izopropanolnih izvlečkov mikroalg na vinsko trto (Vitis vinifera L.). Ugotovili so, da so imele tretirane rastline višji vodni potencial listov od netretiranih oz. je bila hitrost odziva listnih rež večja.
Tretirane rastline so imele tudi večjo vsebnost fenolov, prolina in flavonoidov.
Pri špinači (Spinacia oleracea L.) je pripravek iz makroalge A. nodosum vplival na povečanje relativne vsebnosti vode, povečala pa se je tudi sveža in suha masa rastline. Tak odziv naj bi bil zaradi citokininom podobnih snovi iz izvlečka skupaj s povečano močjo
vsrkavanja kalija. Vpliv pripravka je bil zaznan samo v sušnih razmerah in ne tudi v razmerah z zadostno količino vode (Xu in Leskovar, 2015).
Izvlečki morskih alg vplivajo na fiziologijo rastline. Številne raziskave so pokazale spremembo transkriptoma in metaboloma pri tretiranju z izvlečki mikroalg. Nedaven napredek na področju raziskav izvlečkov morskih alg nakazuje na mnogotere vplive izvlečkov na izražanje genov presnovnih procesov v rastlinah. Številčnejši je bil prepis regulatornih encimov vpletenih v presnovo dušika, boljša je bila kapaciteta antioksidantov (glutation reduktaza) in sinteza betaina. Vse to je povezano s povečanjem koncentracije topnih proteinov, antioksidantov, fenolov in flavonoidov. Flavonoidi kot sekundarni metaboliti igrajo pomembno vlogo v razvoju rastline in pri njeni interakciji z okoljskimi faktorji (npr. odziv na UV svetlobo in ostale abiotske in biotske strese). Po tretiranju rastline z izvlečki morskih alg se poveča tudi encim halkon izomeraza (CHI), ki je ključen pri biostintezi prekurzorjev potrebnih za obrambo rastline. Eden izmed pogostih odzivov rastline je tudi povečanje vsebnosti klorofila (Battacharyya in sod., 2015). Študija molekularnih odzivov oljne ogrščice na algne izvlečke je pokazala, da je to zaradi povečane biogeneze kloroplastov, zmanjšane degradacije klorofila in zakasnjenega staranja.
Cisteinske proteaze, povezane s senescenco, so se zmanjšale, medtem ko se je izražanje genov povezanih s fotosintezo, celično prenovo in odzivom na stres povečalo. Na zaščito in večjo delitev kloroplastov deluje tudi citokinin, katerega sintezo spodbujajo izvlečki morskih alg (Jannin in sod., 2013).
Slika 3: Povzetek mehanizmov delovanja algnih izvlečkov na rastlino (prirejeno po Van Oosten in sod., 2017).
Potrebno je opozoriti, da je bila, pri večini primerov navedenih zgoraj, uporabljena komercialna formulacija izvlečkov. Zaradi spremenljive narave, različne sestave izdelkov in metod dela so učinki lahko spremenljivi. Komercialne formulacije so pogosto zaščitene, natančna sestava in metode ekstrakcije so skrite, zaradi česar je težko razločiti, katera komponenta ima ključno vlogo pri učinkovitosti izvlečkov. Opredelitev dejanske sestave najpogostejših komercialnih izdelkov na osnovi alg bi bila koristna za razumevanje mehanizma delovanja (Van Oosten in sod., 2017). Ena izmed glavnih težav pri uporabi mikroalg kot bioefektorja je tudi pomanjkanje znanja o primernih količinah odmerka za posamezno rastlino, kar onemogoča v polnosti izkoristiti potencial mikroalg (Gautam in sod., 2021).
3 MATERIALI IN METODE
V sklopu magistrske naloge smo izvedli dva ločena poskusa. V obeh poskusih je bil namen dela enak, saj smo želeli ugotoviti, kako pripravek iz mikroalg učinkuje na parametre rasti soje. Prvi poskus je bil izveden v laboratoriju, kjer smo opravili kalilni test na soji s proučevanjem učinka več koncentracij algnega pripravka na kalivost in izbrane parametre korenin kalic. Drugi poskus smo izvajali na Laboratorijskem polju BF, kjer smo v okviru že obstoječega poskusa primerjali višino rastlin, vsebnost klorofila, nodulacijo, indeks listne površine, količino pridelka med parcelami tretiranimi s pripravkom iz mikroalg in kontrolnimi parcelami.
3.1 PRIPRAVA IZVLEČKA
Mikroalge so bile gojene v odprtih bazenih površine 6,25 m², globine 20 cm. Bazen se nahaja v poskusnem rastlinjaku Biotehniške fakultete. Mikroalge so bile hranjene z bioplinskim digestatom iz podjetja Koto d.o.o., ki je zagotovilo tudi matično kulturo mikroalg–
inokulum. Združba iz bazena je bila bakterijsko-algna združba, v kateri so prevladovale mikroalge iz rodu Scenedesmus sp.. Po sedimentaciji vsebine bazenov je bila koncentrirana mikroalgna biomasa posušena pri 40 °C in suha zmleta v keramični terilnici. Na suhih algah je bila opravljena analiza ogljika. Povprečno alge vsebujejo 46 % C.
Koncentrat mikroalg smo pripravili tako, da smo 100 g suhih alg prelili s 400 mL metanola, podobno kot so to storili Puglisi in sod. (2020). Metanol deluje kot organsko topilo, ki razkroji celično steno, zaradi česar lahko pridemo do znotrajcelične vsebine mikroalg. V erlenmajerici smo suspenzijo čez noč mešali na magnetnem mešalu pri 400 r/min. Naslednji dan smo mešanico v električnem mešalniku mešali za 5 min pri visoki hitrosti. Mešanico smo nato precedili skozi filter z luknjicami premera 100 µm in dobili končni metanolni ekstrakt. Izvleček mikroalg se je do uporabe hranil v hladilniku. Ta izvleček mikroalg se je uporabil tako pri poljskem poskusu kot pri poskusu v kontroliranih razmerah.
3.2 LABORATORIJSKI KALILNI POSKUS
Poskus vpliva mikroalg na kalitev in izbrane parametre soje, smo leta 2021 izvedli v laboratoriju Oddelka za agronomijo, na Katedri za aplikativno botaniko, ekologijo, fiziologijo rastlin in informatiko.
3.2.1 Postavitev poskusa
Preverili smo 4 različne koncentracije metanolnega izvlečka mikroalg (0,2 g/L; 0,5 g/L; 1 g/L; 5 g/L) in kontrolo (destilirana voda). Želeli smo izbrati koncentracije, ki bi bile primerljive z drugimi raziskavami na tem področju (Puglisi in sod., 2020). Za zasnovo poskusa smo izbrali tehniko kalitve semen med dvema plastema papirnate brisačke. Metodo smo izbrali, ker je primerna za večja semena, kamor spada soja s približnim premerom semena 1 cm. Semena vzklijejo med dvema plastema vlažne papirnate brisače. Za seme smo uporabili pridelek semena soje Laboratorijskega polja iz leta 2020. Semen pred kalitvijo nismo razkuževali, saj v predhodnih manjših poskusih nismo ugotovili razlike med razkuženim in nerazkuženim semenom. Pripravili smo 4 mikroalgne raztopine. Za 1g
mikroalg/L smo zmešali 4 mL ekstrakta alg in dodali destilirano vodo do 1L, v enakem razmerju raztopine tudi za ostale koncentracije. Na razkuženi površini smo razprostrli eno papirnato brisačko, jo navlažili s pripadajočo mikroalgno raztopino in na sredino brisačke v eno vrsto v razmaku približno 2 cm položili 10 semen. Nato smo čezenj položili drugo plast papirnate brisačke, dodatno navlažili in zavili v ohlapen zvitek. Zvitek smo položili v steklen kozarec in ga zaprli s plastično vrečko, da bi preprečili izhlapevanje vode. Vsako koncentracijo smo pripravili na način 10 semen na kozarec in v 4 ponovitvah / kozarcih.
Kozarce z zavitki semen smo postavili v rastno komoro na Oddelku za agronomijo. Razmere za kalitev so bile kontrolirane: stalna svetloba; temperatura 25 °C; stalna vlaga. V rastni komori smo kozarce pustili 8 dni. Osmi dan smo brisačke razvili in prešteli skaljena semena in naredili ostale meritve. Za skaljeno seme se je štelo tisto z vsaj 1 cm radikule.
Slika 4: Mikroalgne raztopine v koncentracijah: 0,2 g/L; 0,5 g/L; 1 g/L; 5 g/L (1), razporeditev semen na papirnati brisački, navlaženi z mikroalgno raztopino (2), dodana druga plast papirnate brisačke na razporejena semena (3) ter ohlapno zavita sloja brisačke s semeni soje v sredini (4).
Slika 5: Zvitek postavljen v steklen kozarec, pokrit s plastično vrečko, označen s priležno oznako koncentracije mikroalgne raztopine (levo) in zvitek s semeni po osmih dneh od nastavitve poskusa (desno).
3.2.2 Meritve na kalicah
Za vsako ponovitev (kozarec) smo po osmih dneh od nastavitve poskusa določili delež kalivosti. Zatem smo kalice poskenirali na skenerju Epson Perfection V700 Photo na Gozdarskem inštitutu Slovenije. Rastlino smo na skener položili v prozorni posodi napolnjeno z vodo. Kot podlago smo uporabili modro barvo, saj ustvari nazoren kontrast s koreninami. Analize poskeniranih rastlin smo izvedli v programu WinRhizo (Regent Instruments Inc., Ville de Quebec, Kanada). Dobili smo podatke o skupni površini korenin, skupni dolžini korenin, povprečnem premeru korenin in številu koreninskih vršičkov.
Slika 6: (1) Postavitev kalic na skenerju v plastični posodi z vodo. (2) Skeniranje na skenerju Epson Perfection V700 Photo, posoda je pokrita z modrim papirjem, ki služi kot ozadje. (3) Končni rezultat.
3.2.3 Statistična analiza
Poskus vpliva mikroalg na parametre kalivosti in nekaj lastnosti korenin soje smo statistično analizirali po zasnovi slučajnih skupin s petimi koncentracijami mikroalgnega pripravka (kontrola; 0,2 g/L; 0,5 g/L; 1 g/L; 5 g/L) in štirimi ponovitvami vsake od teh. Značilnost razlik med koncentracijami smo preverjali z enosmerno ANOVA pri α < 0,05. Homogenost varianc smo testirali z Levene-ovim testom; v primeru nehomogenosti (za dolžino in površino korenin) smo podatke transformirali z logaritmiranjem. V primeru značilne ANOVA smo izvedli multiple primerjave s Tukey-evim HSD testom. Vse analize so bile opravljene s statistično računalniško programsko opremo R (R različica 4.1.1), v RStudiu (RStudio-2021.09.0-351).
3.3 POSKUS NA LABORATORIJSKEM POLJU 3.3.1 Zasnova poskusa
Poljski poskus je bil izveden na Laboratorijskem polju Biotehniške fakultete v Ljubljani in sicer v okviru trajnega poljskega poskusa, ki poteka od leta 1999. Poskus ima dva proučevana dejavnika: tip obdelave tal na glavnih parcelah (orano vs. neobdelano/no-till), ter vrsto gnojenja na podparcelah (4 ravni: brez gnojenja, NPK, kompost + NPK, kompost).
Kot mineralno NPK gnojilo je bil uporabljen Entec Perfect: 14-7-17 (+ 2 Mg + 11 S).
Kompost je imel C/N razmerje 10,4, vrednost pH je znašala 7,4. Na NPK podparcelo je bilo odmerjenih 3930 g NPK gnojila (120 kg N/ha), za kompost+NPK 1960 g (60 kg N/ha) NPK
gnojila in 50 L komposta, na podparcelah, kjer je bil samo kompost pa 100 L komposta. Na vsaki glavni parceli je posamezen način gnojenja trikrat ponovljen. Podparcela meri 5,6 x 8 m.
V maju 2020 je bila posejana soja. Uporabljena medvrstna razdalja je bila 40 cm, kar pomeni, da je bilo na eni podparceli poskusa 14 vrst. Za namen ugotavljanja vpliva učinkov mikroalg na rast soje smo izbrali le glavno parcelo, ki je obdelana na klasičen način z oranjem. Pri načinu gnojenja smo v poskus vključili le 3 (brez gnojenja, NPK, kompost). Izbrane podparcele smo predelili na polovico. Sedem vrst soje na podparceli je bilo tretirano z metanolnim izvlečkom mikroalg (A), preostalih sedem pa je služilo kot negativna kontrola, tretirana z vodo in metanolom (0), da bi upoštevali morebiten učinek vode in metanola.
Slika 7: Shema trajnega poskusa na Laboratorijskem polju Biotehniške fakultete.
3.3.2 Aplikacija
Raztopina za aplikacijo na poljski poskus je bila zamešana tako, da smo 4 mL ekstrakta raztopili v 1000 mL vode. Končna koncentracija je bila tako 1 g suhe snovi/L. Poraba mikroalgne raztopine na hektar je znašala 400 L mikroalgne raztopine/ha, kar znaša 0,04 L/
m². Odmerki so bili ob vsakem terminu apliciranja enaki. Aplikacijo smo izvajali z ročno škropilnico in sicer v treh terminih. Prvi termin je bil 23.6.2020, ko je bila soja v fenološki fazi 105 (trojnati list na petem nodiju je razgrnjen) (Meier, 2001). V času drugega tretiranja (7.7.2020) je bila soja pred tem, da se odprejo cvetni brsti, v fenološki fazi 509 (Meier, 2001) V predvidenem času tretjega tretiranja smo bili zaradi deževnega vremena primorani odložiti aplikacijo in jo prestavili na termin 10. avgust, ko je bilo cvetenje končano in so bili vidni prvi stroki (609) (Meier, 2001).
Preglednica 2: Načrt tretiranja rastlin soje z mikroalgnim izvlečkom.
Pripravek fenološka faza
soje
odmerek datum aplikacije
metanolni izvleček mikroalg 105 400L/ha 23.6.2020
metanolni izvleček mikroalg 509 400L/ha 7.7.2020
metanolni izvleček mikroalg 609 400L/ha 10.8.2020
3.3.3 Meritve na rastlinah
Tekom rasti soje smo spremljali fiziološko – morfološke in biomasne parametre. Višina rastlin je bila merjena v dveh terminih. Merjenje je potekalo s tračnim metrom. V prvem terminu (30.6.2020) smo izmerili 15 naključno izbranih rastlin na vsaki podparceli. V drugem terminu (6.8.2020) smo izmerili 10 rastlin na podparcelo.
Slika 8: Merjenje višine rastlin soje s tračnim metrom v prvem (30.6.2020) – levo in drugem terminu (6.8.2020) – desno (Foto: Lenarčič D., 2020).
Vsebnost klorofila smo merili s SPAD metrom (SPAD-502, Minolta, Japonska), ki je nedestruktivna, posredna metoda meritve vsebnosti klorofila. Merili smo v dveh terminih, enako kot višino rastlin (30.6.2020 in 6.8.2020). Ob vsakem merjenju smo vsebnost klorofila izmerili na petih naključnih rastlinah na najvišjem polno razvitem listu.
Slika 9: Merjenje vsebnosti klorofila s SPAD metrom v prvem terminu (30.6.2020).
Indeks listne površine smo merili z merilcem Licor LAI-2200 (Li-Cor, Lincoln, ZDA).
Meritve smo izvedli dvakrat v času rasti soje – 30.6.2020 in 6.8.2020. Na vsaki podparceli smo LAI izmerili petkrat v različnih vrstah. Med posamezno podparcelo smo merili še nad vegetacijo (Above meritve). Za meritev smo na ceptometer namestili pokrovček z 270°
odprtostjo. Surove vrednosti prestrezanja svetlobe smo obdelali v programu FV2200 (Li- Cor, Lincoln, ZDA) in pridobili LAI ocene.
Slika 10: Merjenje indeksa listne površine v prvem terminu (30.6.2020).
Nodulacijo soje smo ugotavljali 11.8.2020 na destruktiven način, saj smo sojo v ta namen izkopali. Soja je bila takrat v fenološki fazi 609. Ob izkopu rastline z namenom štetja nodulov, smo poskušali ohraniti čim več korenin in nodulov na izkopani rastlini. Na vsaki podparceli smo izkopali 7 rastlin. Celotne gmote tal s koreninami in noduli smo namočili v vedro vode, da so se tla zmehčala in v čim večji meri odpadla brez ročnega trganja. Sledilo je dodatno izpiranje pod curkom vode nato pa ročno odstranjevanje nodulov iz opranih korenin. Prešteli smo aktivne nodule (posušene ali odmrle nodule smo zavrgli). Stehtali smo suho maso korenin in suho maso nodulov.
Slika 11: Nodule smo za namen štetja in tehtanja biomase odstranili z rastline in jih položili na petrijevko.
