3 Nanopore iz grafena

(1)

Oddelek za ziko

Seminarska naloga pri predmetu Molekularna biozika

Grafen in DNA

Avtor: Matjaº Li£en

Mentor: prof. dr. Rudolf Podgornik Ljubljana, September 2013

Povzetek

V seminarju so opisane dosedanje raziskave na podro£ju uporabe grafena za sekvenciranje DNA. Sprva je na kratko opisana osnovna ideja sekvenciranja s pomo£jo nanopor in predstavljenih nekaj primerov moºnih izvedb, nato pa so predstavljeni nekateri rezultati iz znanstvene literature, ki sku²ajo oceniti uporabnost grafena za sekvenciranje DNA.

Opisano je oblikovanje nanopor iz grafena, simulacija in eksperiment prehajanja grafena skozi nanoporo v grafenu ter poskus meritve blokade ionskega toka, na koncu pa so na kratko opisane ²e nekatere druge uporabe grafena pri sekvenciranju DNA, ki so ²e manj raziskane.

(2)

Kazalo

1 Uvod 2

2 Sekvenciranje DNA s pomo£jo nanopor 2

3 Nanopore iz grafena 4

3.1 Izdelava nanopor iz grafena . . . 4

3.2 Merjenje ionskega toka . . . 6

3.2.1 Ra£unalni²ke simulacije . . . 6

3.2.2 Eksperimentalni rezultati . . . 7

3.3 Transverzalni tok . . . 10

4 Zaklju£ek 14

1 Uvod

Raziskave na podro£ju DNA v veliki meri zavira visoka cena sekvenciranja - branja zaporedja nukleotidov. Cena prokelta Human Genome Project, ki je sekvenciral skoraj celoten £love²ki genom in se je zaklju£il leta 2003, je ocenjena na 2,7 milijarde dolarjev [1]; cilj je ceno zmanj²ati na arbitrarno postavljeno mejo 1000 $, kar bi omogo£alo sekvenciranje DNA vsakega posame- znika. Sekvenciranje s pomo£jo nanopor predstavlja preprost koncept za sekvenciranje DNA:

molekula prehaja skozi nanoporo nukleotid za nukleotidom, pri £emer sproti identiciramo nukleotide, ki prehajajo skozi nanopore. Pri tem imamo precej razli£nih na£inov, kako bi nukleotide identicirali, vendar noben ni o£itno najbolj²i kandidat za raziskave, saj se vsakokrat pojavi vrsta teºav na primer nezmoºnost kontroliranja hitrosti in orientacije DNA v nanopori ali podobni signali za razli£ne nukleotide. Od leta 2010 dalje, ko sta A. Geim in K. Novoselov uspela na zelo preprost na£in pridobiti enoatomne plasti grafena [2], so se hitro za£ele raziskave usmerjene v uporabo grafena v sekvenciranju DNA, saj ima precej obetajo£ih lastnosti.

2 Sekvenciranje DNA s pomo£jo nanopor

Nanopore je luknja nanometrskih dimenzij. Lahko je biolo²ke narave - ustvari jo protein v lipi- dnem dvosloju ali sinteti£na - izdolbena v materialih kot je grafen, SiN,SiO2 itd.. Nanopore v membranah lahko izkoristimo za detekcijo posameznih molekul, tako da merimo koli£ine, ki se pri prehodu molekule skozi nanoporo spremenijo. V primeru DNA doseºemo prehajanje skozi poro z razliko v elektri£nem potencialu na eni in na drugi strani nanopore. Do uporabnega postopka pridemo, £e lahko zaznamo vsako bazo posebej in £e vsaka baza povzro£i unikaten signal. V praksi to pomeni, da se mora v nanopori nahajati zgolj ena baza, kar daje prednost

£im tanj²im plastem v katere izdolbemo nanopore - idealno debeline nanometrskega reda, saj je dolºina baznega para pribliºno 0,35 nm. [3] Ker je tak²no debelino teºko realizirati, se veli- kokrat posluºujejo dodatnih metod, ki so predstavljene na sliki 1. Hkrati moramo zagotoviti, da se baza v nanopori nahaja dovolj £asa, da povzro£i prakti£no merljivo spremembo. Tre- nutno ne poznamo zanesljivega na£ina za nadzorovanje hitrosti prehajanja DNA. Raziskave potekajo v razli£nih smereh, na primer v smeri DNA tranzistorja [4], elementa sestavljenega iz zaporednih plasti kovine in dielektrika, ki bi z napetostjo sproºal tok DNA skozi nanoporo,

(3)

tako kot obi£ajen tranzistor sproºa elektri£ni tok. He et al se ukvarjajo z u£inki temperaturnih gradientov na hitrost prehajanja [5], nekateri encimi prepu²£ajo DNA po en nukleotid naenkrat, ipd. e uspemo te pogoje zagotoviti, imamo postopek, ki v realnem £asu bere zaporedje DNA in ne zahteva komplicirane priprave vzorca.

Slika 1: Na£ini detekcije pri sekvenciranju DNA s pomo£jo nanopore. (a) Osnovno prehajanje DNA skozi poro α−hemolizina, kjer merimo ionski tok skozi poro. e je nanopora zapolnjena z DNA molekulo, je ionski tok manj²i, kot £e je nanopora prazna. Zaradi velikosti α−hemolizina je nemogo£e lo£evati med posameznimi nukleotidi. (b) Na sliki je ilustrirana eksonukleaza (svetlo modro), ki je vezana na α −hemolizin . Eksonukleaza reºe posamezne nukleotide, ki povzro£ajo unikatne spremembe ionskega toka skozi poro, ko potujejo skozi aminociklodikstrin (rde£e). (c) Sekvenciranje s pomo£jo sinteti£nega DNA in opti£nega od£ita- vanja. Vsakega od nukleotidov prvo pretvorimo v dalj²a zaporedja DNA - v primeru na sliki jih zakodiramo s pomo£jo dveh razli£nih oligomerov iz dvanajstih baz - nato na oligomere hibridiziramo molekule, ki se ob prehajanju skozi nanoporo ponovno lo£ijo in pri tem oddajo unikaten svetlobni sunek, iz katerega razberemo zaporedje v originalnem DNA. (d) Detekcija na osnovi tunelskega toka preko nanopore, ki se spremeni ob prisotnosti nukleotida. Naprava bi morala biti sposobna lo£evati posamezne nukleotide. [6]

(4)

3 Nanopore iz grafena

Grafen je ravna monoatomna plast ogljikovih atomov, ki so med seboj povezani v dvodimen- zionalno mreºo iz ²estkotnikov. Je prevoden za elektri£ni tok in izjemno trden. Nanopore iz grafena imajo vrsto prednosti pred nanoporami iz kovin in biolo²kimi nanoporami. Ker je plast debela zgolj za velikost ogljikovega atoma je znotraj nanopore prisotna le ena baza DNA, tako da na meritve vpliva po ena baza naenkrat, kar nam da ºeleno resolucijo. Hkrati je v grafenu relativno preprosto izdelovati nanopore. Energija potrebna za izbitje C-atoma vezanega s tremi sp2 vezmi zna²a 17 eV, 15 eV pa, £e je kateri od sosednjih atomov manjka in je atom, ki ga ºelimo izbiti, vezan le z dvema vezema. V okolici nanopore lahko manjka tudi ve£ atomov, tako da je ta energija ²e niºja; luknjanje grafena je tako mogo£e ºe z ºarki energije 80 keV. Za primerjavo je za dolbenje nanopore v 10 - 30 nm debelem sloju kroma in zlata potreben elektronski ºarek z energijo nad 200 keV. Za name£ek je take pore teºje oblikovati in so pogosto nestabilne. [7] Prednost grafena je tudi v moºnosti izdelave nanopor velikosti le nekaj nanometrov, kar pomeni da prehajanje molekula bolje zapolni nanoporo in zato povzro£i ve£jo spremembo ionskega toka. Ker je grafen prevoden za elektri£ni tok in debel le za velikost atoma je tudi idealen kandidat za izdelavo elektrod, ki bi zaznavale posamezne nukleotide. Zaradi vseh teh lastnosti se veliko pri£akuje od nadaljnjih raziskav potenciala grafena pri sekvenciranju DNA.

3.1 Izdelava nanopor iz grafena

Nanopore v grafenu izdelujejo z izbijanjem ogljikovih atomov iz re²etke z elektroni razli£nih energij. Elektronski ºarki vi²jih energij so bolj u£inkoviti pri izbijanju atomov vendar povzro£ajo tudi ve£je ²tevilo in obseºnej²e nepravilnosti v re²etki grafena - poru²ena kristalna struktura ali neºelene luknje v grafenu - s £emer so imeli teºave v eksperimentu opisanem pod 3.2.2. Simulirali so tudi ºe izdelovanje nanopor z obstreljevanjem grafena z ioni (Au, Si, C) [8], vendar se postopek redko uporablja, predvsem zaradi teºav s fokusiranjem ºarka ionov na nekaj kvadratnih nanometrov veliko podro£je.

Za primer bom opisal postopek, ki so ga za izdelovanje nanopor v listi£ih grafena uporabili M. Drndi¢ et al. [9] Listi£e grafena so z mehani£no eksfoliacijo iz grafena nanesli na 300 nm debel sloj SiO2, ki je bil premazan z 100 nm slojem polimetilmetakrilata (PMMA) in nato prenesli na 50 nm debelo membrano izSiN_x, v kateri so bile zSF₆ioni izjedkane luknje povr²ine pribliºno 1µm². Uporabili so naslednji postopek: listi£e grafena so na povr²ini PMMA na²li z opti£nim mikroskopom in jim dodali kapljo isopropanola in jih pokrili z membrano izSiNx. Izhlapevanje isopropanola in segrevanje na 200 ^◦C za pribliºno 5 minut je dodatno zbliºalo povr²ini PMMA inSiNx. Nato so z acetonom raztopili PMMA in grafen se je obdrºal naSiNx

membrani. Predele grafena, ki so leºali nad luknjami vSiNxmembrani, so na²li s TEM. Listi£i so bili debeli od 1 do 20 slojev, ve£inoma pa okrog 5 slojev. Oblikovanje struktur iz grafena je bilo opravljeno pri sobni temperaturi in med postopkom ni povzro£ilo zvijanja membrane, kon£ne strukture pa so bile obstojne. Dolbenje posamezne nanopore traja zgolj nekaj sekund.

Rezultati so prikazani na sliki 2.

Skupina Bo Song et al je raziskovala prej omenjene defekte zaradi obsevanja z elektroni.

[10] Ugotovili so, da ima temperatura mo£an vpliv na spremembe, ki jih je povzro£il 300 keV ºarek elektronov na okolico nanopore. Pri sobni temperaturi ºarek povzro£i amorzacijo okoli²ke re²etke. Pri temperaturi 500^◦Cse monokristalni grafen pretvori v polikristalni grafen.

(5)

Slika 2: Slike grafena in izdelanih nanopor pod TEM. Velikosti merila so po vrsti 50, 50, 20, 2, 10, 5 nm. (a) Slika listi£a grafena pod TEM. (b) Enako podro£je po izdelavi nanopore. (c) Nanopora pod ve£jo pove£avo. S ²tetjem ²tevila prog okrog nanopore je mogo£e dolo£iti ²tevilo slojev grafena. (d) Brez teºav je mogo£e izdelati tudi ve£je ²tevilo nanopor, ki so blizu druga drugi. (e) Rob listi£a, kjer se sloji grafena zvijejo in ustvarijo vidne proge. (f) Povpre£je ²estih presekov intenzitete progastega roba nanopore na sliki (c). (g) Enako za rob listi£a na sliki (e). Grafen se lokalno zvije tako, da leºi vzporedno z elektronskim ºarkom, posledi£no vsak sloj povzro£i temno progo na sliki TEM. Razdalja med posameznimi progami je konsistentna z razdaljo med sloji piroliti£nega grata (0,34 nm). [9]

Pri temperaturi 700^◦C pa grafen ohrani kristalno strukturo tudi pri obsevanju z mo£nej²imi ºarki. Avtorji ugotavljajo, da ogljikovi atomi, ki so se adsorbirali na povr²ino grafena po izbitju iz nanopore, zapolnijo izbite atome iz re²etke izven podro£ja nanopore. Mehanizem prevladuje nad temperaturo 600 ^◦C, pod temperaturo 400 ^◦C pa prevladuje amorzacija.

Nekaj rezultatov je prikazanih na sliki 3.

(6)

Slika 3: Vpliv temperature na ²tevilo defektov v kristalni re²etki po obsevanju. Velikost merila je 1 nm. (a) Obsevanje pri sobni temperaturi povzro£i amorfno strukturo v okoli nanopore in dodatno neºeleno nanoporo na desni strani slike. (b) Obsevanje pri 200^◦Cpovzro£a amorfne strukture okrog nanopore. Rde£e pike na vstavljeni sliki predstavljajo razpoznavne ²estkotnike, modre predstavljajo adsorbirane atome, bela £rta pa pribliºno obliko nanopore. Ve£ kot je razpoznavnih ²estkotnikov, manj je struktura amorfna. (c) Obsevanje pri 500 ^◦C se kon£a z polikristalnim grafenom. Rde£a pu²£ica nakazuje adsorbiran atom. (d) Pri 700^◦C se grafen ponovno sestavi v monokristalno strukturo. [10]

3.2 Merjenje ionskega toka 3.2.1 Ra£unalni²ke simulacije

Ker je preizku²anje razli£nih oblik nanopor, debelin grafena, napetosti ipd. z eksperimenti zamudno po£etje, sku²a ve£ skupin ra£unalni²ko simulirati obna²anje DNA pri prehajanju skozi nanoporo v grafenu. Dodatno lahko s simulacijo natan£neje opazujemo obna²anje DNA pri prehajanju skozi membrano in vpliv njene orientacije na izmerjeno zmanj²anje ionskega toka. V simulacijah se ve£inoma predpostavi veliko ve£je napetosti med eno in drugo stranjo membrane, saj bi realne napetosti zahtevale dalj²i £as simulacije - hitrost prehajanja DNA je namre£ sorazmerna z napetostjo. Tako se namesto napetosti okrog 100 mV simulirajo napetosti 500 mV in ve£. Rezultati simulacije, ki so jo opravili D. B. Wells et al, so prikazani na slikah 4, 5 in 6. Z molekularno dinamiko so simulirali okrogle in elipti£ne nanopore razli£nih velikosti in membrane razli£nih debelin, skozi katere je prehajala ssDNA pod razli£nimi napetostmi. DNA so simulirali kot verige istovrstnih nukleotidov A, G, C, T in mC. Z elipti£nimi nanoporami so ºeleli zmanj²ati ²tevilo orientacij pri katerih lahko DNA prehaja skozi nanoporo in tako

(7)

olaj²ati prepoznavanje posameznih nukleotidov, vendar se je izkazalo, da so elipti£ne nanopore ve£ino povzro£ale zatikanje DNA v nanopori, vendar je mogo£e, da bi uporaba niºjih napetosti omogo£ila laºje prehajanje. Vseeno DNA skozi nanoporo ne prehaja v popolnoma naklju£ni orientaciji, kar je prikazano na sliki 5 b. Iz rezultatov simulacije lahko sklepamo, da je iz spremembe ionskega toka mogo£e izlu²£iti zaporedje nukleotidov v DNA, vendar bi morala DNA prehajati skozi ve£ nanopor s speci£nimi orientacijami. Dodatne teºave se pojavijo pri na£inu prehajanja, ki lahko poteka v korakih po eno bazo, lahko pa tudi presko£i nekaj baz, kar pomeni, da bi morali imeti na£in za nadzor nad hitrostjo prehajanja DNA skozi nanoporo.

Slika 4: (a) Ilustracija DNA pri prehajanju skozi nanoporo. Ob za£etku simulacije je teºi²£e postavljeno stran od membrane, nato pa se DNA zaradi hidrofobnosti membrani pribliºa, tako da na eni strani nima stika z vodo. (b) tevilo nukleotidov na drugi strani nanopore v odvisnosti od £asa, za razli£ne debeline plasti. Opazno je skakajo£e prehajanje - £as med prehodi posameznih nukleotidov je dalj²i od £asa, ki ga porabi nukleotid da se odlepi iz ene strani membrane, preide na drugo stran, in se tam zaradi hidrofobnosti veºe na drugo stran membrane. Pu²£ica nakazuje skok, kjer je skozi nanoporo hkrati sko£ilo ve£ nukleotidov. V splo²nem hitrost prehajanja skozi membrano ni bila odvisna od ²tevila slojev v grafenu. Na grafu za eno plast grafena opazimo tudi vra£anje nukleotida, kar je dodatna teºava tega na£ina merjenja. Pore s tremi plastmi grafena so se izkazale za bol²je od dvoplastnih in enoplastnih nanopor po ²tevilu skokov ve£ih nukleotidov naenkrat: v povpre£ju je skozi tri plasti grafena 54% nukleotidov pre²lo posami£no, za dve plasti je ta deleº 40%, za eno plast pa 29%. [11]

3.2.2 Eksperimentalni rezultati

Leta 2010 so tri skupine preverile uporabnost grafena kot membrane pri sekvenciranju DNA [12, 13, 14], s podobnimi rezultati. Tu bom opisal eksperiment C. A. Mercahnt et al. Na sliki 7 (a) je ilustrirana postavitev za merjenje z nanoporo iz grafena. V silicijevem £ipu prekritim z 5 µm SiO2 in 40 nm SiN je izjedkana luknja, tako da dobimo prostovise£o SiN membrano povr²ine pribliºno 50 µm. Nato so z litograjo z elektronskim ºarkom in jedkanjem z SF₆ plazmo v SiN membrani ustvarili luknje s premerom 1,5µmin £eznje postavili grafen debeline med 3 in 15 sloji. Nanopore v velikosti od 5 do 10 nm so v grafenu izdolbli z elektronskim ºarkom. Dodatno so postavitev za 5 minut izpostavili UV ºarkom in ozonu, da so grafenu zmanj²ali hidrofobnost. Z Ag/AgCl elektrodami so med rezervoarjema z elektrolitom na vsaki strani membrane vzpostavili napetost med 100 in 150 mV, ki je povzro£ila ionski tok skozi nanoporo in elektroforeti£no potiskala DNA iz enega rezervoarja v drugega.

(8)

Slika 5: (a) Prikaz skakajo£ega prehajanja verig razli£nih nukleotidov skozi nanoporo iz treh slojev grafena. Na y-osi je nane²ena oddaljenost od sredine nanopore, na x-osi pa £as simulacije. Vsak zaporedni nukleotid je predstavljen z druga£no barvo za laºje branje grafa. Na desni strani so prikazane normalizirane porazdelitve po oddaljenosti od sredi²£a nanopore. Opazimo, da se nukleotid ve£inoma nahaja na enem ali dveh mestih znotraj nanopore. (b) Verjetnost za razli£ne orientacije posameznih nukleotidov znotraj nanopore. Kotaβ inγ, ki predstavljata rotacijo in naklon nukleotida, sta denirana na zgornji sliki, porazdelitev po teh dveh kotih pa na spodnji. Barve ozna£ujejo adenin (£rna), citozin (rde£a), gvanin (zelena) in timin (modra).

Ker se DNA oprijema grafena preden vstopi v nanoporo, so nukleotidi ve£inoma orientirani na nekaj speci£nih na£inov. [11]

Slika 6: Prikaz blokad ionskega toka za razli£ne orientacije nukleotidov. Na levi strani je prikazana ilustracija adenina v nanopori za dano orientacijo. Veliko- sti tokov so povezane s presekom nukleotida v membrani: orientacija O₁ ima najve£ji presek in tako blokira najve£ toka, orientacija O2 pa iz istega razloga naj- manj. S kombinacijo vseh petih orientacij je mogo£e identicirati nukleotid. Iz orientacije O1 lo£imo C od ostalih, iz O2

lahko identiciramo T in tako dalje. Se- veda teh orientacij ne moremo zagotoviti;

potrebovali bi vezavna mesta v nanopori, ki bi zagotovila, da se posamezni nukleotidi orientirajo v ºeleni smeri. [6, 11]

(9)

Slika 7: (a) Ilustracija postavitve eksperimenta. (b) Histogram izmerjenih dogodkov in kraj²i izsek meritve ionskega toka. Koli£inaIBL je denirana kotIBL=hI_zaprtai − hI_odprtai, kjer sta hI_zaprtaiinhI_odprtai£asovni povpre£ji toka med prehajanjem DNA skozi poro in toka, ko je nanopora nezasedena. Pri prehajanju DNA skozi nanoporo se je ionski tok v povpre£ju zmanj²al za 0,45, 0,9 ali 1,35 nA, kar ustreza prehajanju neprepognjene DNA, enkrat prepognjene DNA in dvakrat prepognjene DNA. Ve£krat prepognjena DNA bolje zapre nanoporo, zato je tudi sprememba ionskega toka ve£ja. [12]

Ugotovili so, da je ionski tok skozi nezapolnjeno nanoporo lahko zavzel vrednosti, ki so se med seboj razlikovale za kar dva reda velikosti. Ionski tok ni bil koreliran z velikostjo nanopore ali debelino membrane - predpostavljajo, da so za te razlike krive dodatne luknje v membrani, ki jih povzro£i elektronski ºarek pri izdelavi nanopore in obdelava z ozonom in UV svetlobo.

Razli£ne vrednosti ionskega toka za nezasedeno nanoporo v principu ne ovirajo same meritve, saj so neºelene luknje premajhne, da bi skoznje lahko prehajal DNA. Rezultati pridobljeni s to postavitvijo so prikazani na sliki 7.

Potrebno je poudariti, da je le 10% od 50 preizku²enih membran bilo sposobnih zaznavanja prehajanja DNA. V 30% primerov so s TEM opazili luknje v membrani, 30% membran se je med meritvijo raztrgalo, v preostalih 30% primerov pa se membrane niso pravilno omo£ile.

Dodatna teºava, ki se je pojavila pri zgornji postavitvi, je bil velik ²um, ki je imel pri nizkih frekvencah1/f odvisnost. V nadaljnjih eksperimentih so na obe strani grafena nanesli nekaj nm debel slojTiO2, za katerega je bilo demonstrirano, da zniºa ²um pri nizkih frekvencah in pove£a omo£itev membrane. Podobne u£inke lahko doseºemo tudi z Al2O3. [7] Spektralna gostota za nekaj eksperimentalnih postavitev je prikazana na sliki 8 (a). Za grafen je ²um tipi£no vi²ji kot za SiN nanopore, ²e posebno 1/f komponenta. Prekrivanje grafena s TiO2

zniºa ²um pri nizkih frekvencah za red velikosti, kar avtorji pripisujejo bolj²i omo£itvi membrane. e vedno pa je ²um ve£ji kot pri SiN membranah. um zaradi kapacitivnosti spremeni

²um iz oja£evalnikove napetosti v ²um toka, kar praviloma prevladuje pri vi²jih frekvencah.

(10)

Slika 8: (a) Spektralna gostota mo£i za nanoporo v grafenu s premerom 7,5 nm, 8 nm nanoporo v membrani iz grafena inTiO₂ ter 6 nm nanoporo v membrani iz SiN. (b) Blokiran ionski tok je sorazmeren z napetostjo med eno in drugo stranjo membrane, kar je tudi rezultat za druge nanopore. (c) Hitrost prehajanja DNA izraºena v bazah na £asovno enoto v odvisnosti od napetosti. Odvisnost je linearna, kar je enako kot pri SiN nanoporah. (d) tevilo pre²tetih prehodov v odvisnosti od dolºine meritve za dve razli£ni napetosti v logaritemski skali. Poraz- delitev je Poissonska, kar nakazuje na nekorelirano naravo dogodkov. Pri vi²jih napetostih se v kraj²em £asu zgodi ve£ dogodkov, ker se oddaljenost od nanopore pri kateri elektri£no polje zajame DNA z ve£anjem napetosti zmanj²uje. [12]

3.3 Transverzalni tok

Namesto ionskega toka skozi nanoporo lahko merimo tudi elektri£ne tokove pravokotno na DNA. Na to temo je bilo narejenih precej teoreti£nih raziskav in ra£unalni²kih simulacij, malo pa je dejanskih eksperimentalnih podatkov. Rezultati simulacij so obetajo£i, vendar se ve- likokrat zaradi ra£unske zahtevnosti izpu²£a detajle, na primer vpliv ionov in molekul vode, orientacije nukleotidov, ipd.

Zamisel, da bi lahko nukleotide prepoznali s pomo£jo toka, ki tunelira preko DNA iz ene strani nanopore na drugo, se je pojavila ºe pred razmahom raziskav grafena. [15] Namesto grafena se lahko za elektrode uporabi zlato, ki je dober prevodnik in tunelski tok je zaradi ve£jih zunanjih orbital atomov zlata v primerjavi z atomi ogljika ve£ji, vendar je elektrode teºko oblikovati tako, da bi na tunelski tok vplival le en nukleotid, saj bi morale biti elektrode zelo tanke. Tu se s svojo tankostjo ponovno izkaºe grafen, ki je v principu najtanj²i moºen material. Ilustracija postavitve je predstavljena na slikah 10 a in 10 b. DNA elektroforeti£no potiskamo skozi nanoporo v membrani in pri tem spremljamo spremembe elektri£nega toka med elektrodama. Ko je nanopora prazna, je tok enak neki minimalni vrednosti, ko je nanopora zapolnjena z nukleotidom in je napetosti med elektrodama zadostna, se tok pove£a (slika 10 c). Simulacije takih meritev nakazujejo, da je odvisnost toka od orientacije nukleotida znotraj nanopore ²ibka, tako da je mogo£e lo£iti signali posameznih nukleotidov. Hkrati na meritev le malo vplivajo sosednji nukleotidi, tako da je signal enak, ne glede na zaporedje baz v DNA molekuli. [16] Na sliki 10 d so prikazani rezultati simulacije, ki so jo opravili Zhao et al pri izbrani orientaciji nukleotidov. Na grafu se lahko razlo£ijo vsi ²tirje nukleotidi DNA. [17]

(11)

Druga£na zasnova meritve je predstavljena na sliki 11 a. DNA elektroforeti£no potiskamo skozi nanoporo v nanotraku v smeri z osi, napetost pa je na nanotrak priklju£ena v smeri osi x. Zaradi lastnosti nanotrakov iz grafena, ki imajo cikcakaste robove (angle²ko zigzag graphene nanoribbon), ve£ina toka te£e po robeh traku, tako da se pri meritvi ne ve£ zana²amo na tuneliranje preko nanopore, ampak merimo spremembo prevodnosti celotnega traku, ki jo povzro£i prisotnost DNA v nanopori. Tokovi, ki nastopajo pri meritvi, so nekaj redov velikosti ve£ji od tistih pri meritvi ionskega toka ali tunelskega toka (µA proti nA), tako da je meritev manj ob£utljiva na spremembe zaradi temperaturnih uktuacij membrane, uktuacij DNA pri prehajanju skozi nanoporo ali vplive ionov in molekul vode. Ve£ji tokovi bi hkrati lahko omilili potrebo po upo£asnjevanju DNA molekul. Za razliko od tunelskega toka, se tu ponovno pojavi odvisnost od orientacije nukleotida, kot je prikazano na sliki 11 b. [18] Podoben princip so raziskali Min et al. [19] Namesto da DNA vpliva na prevodnost tako, da potuje skozi nanoporo v nanotraku, ta potuje zgolj pod nanotrakom (slika 11 e). Nanotrak iz grafena je postavljen pravokotno na kanal iz Si3N4 po katerem se premika DNA. Pri prehajanju pod trakom se tvorijoπ−π vezi med DNA in nanotrakom, tako da se prevodnost traku spremeni, hkrati pa se DNA upo£asni, kar omogo£a dalj²e meritve. V simulaciji so Min et al na ta na£in uspeli prepoznati vse ²tiri razli£ne nukleotide v naprej izbranem zaporedju, ki so ga premikali pod nanotrakom.

Slika 9: Rezultati ra£unalni²ke simulacije vpliva hidrogeniacije robov na prevodnost elektrod iz grafena pri tuneliranju preko DNA. (a) Prikaz simulacije: sive krogle predstavljajo ogljikove atome v grafenu, bele krogle vodikove atome na robovih elektrod, pali£asta struktura v sredini pa DNA. Prekinjeni rumeni £rti nakazujeta vodikove vezi med vodikom na elektrodi in du²ikom v DNA. (b) Porazdelitev prevodnosti za gole elektrode (rde£e) in hidrogenizirane elektrode (£rno). Modra £rta nakazuje porazdelitev prevodnosti za primer, ko vodikove atome nadomestimo z atomi z enakimi orbitalami, vendar ne dovolimo tvorbe vodikovih vezi. Po- razdelitev nakazuje, da efekt izvira iz vodikove vezi in ni zgolj posledica manj²e odprtine med elektrodami. Prikazan graf ustreza prevodnosti adenina, pridobljeni s simulacijo prehajanja poliadenina med elektrodami. [20]

Vezanje spojin na rob nanopore ali elektrode predstavlja moºno izbolj²avo v ve£ pogledih.

Pri merjenju ionskega toka se s spojinami, ki mo£neje veºejo nukleotide, sku²a upo£asniti prehajanje DNA in zagotoviti dolo£eno orientacijo DNA pri prehodu. V primeru tunelskega toka lahko poleg na²tetega izbolj²amo tudi prevodnost; s tem kompenziramo slab²o prevodnost grafena v primerjavi z denimo zlatimi elektrodami. Najpreprostej²i kandidat je vodik: vodikovi

(12)

atomi vezani na ogljik tvorijo ²ibko vodikovo vez z negativno nabitimi atomi nukleotidov.

Ra£unalni²ka simulacija He et al nakazuje, da s hidrogenizacijo doseºemo vse tri na²tete efekte, sama vez pa je dovolj ²ibka, da se nukleotidi v nanopori ne ustavijo. [20] Rezultat te simulacije je prikazan na sliki 9. Drugi atomi in spojine dajejo razli£ne rezultate: na sliki 11 d so poleg rezultatov za vodik prikazani tudi tisti za du²ik.

Slika 10: (a) Skica simulacije prevajanja toka pravokotno na DNA: hrbtenica je bila posta- vljena pravokotno na elektrode, zelena pu²£ica nakazuje smer elektri£nega polja. (b) Slika iz simulacije. (c) Tunelski tok v odvisnosti od napetosti med elektrodama za prazno nanoporo in nanoporo v kateri je adenozin. Okrog napetosti 1 V je opazen prag pri katerem se za£ne eksponentna odvisnost toka od napetosti za polno nanoporo, prazna nanopora pa ohranja enak tok. (d) Odvisnost toka od napetosti med elektrodama za razli£ne nukleotide. Razli£ni tokovi izvirajo iz razli£nih velikosti nukleotidov in razli£ne vezave nukleotidov na ogljikove atome.

Ve£ji nukleotidi omogo£ajo laºje tuneliranje, tako da so tokovi razvr²£eni po velikosti nukleotidov. Gvanin in citidin s po tremi vodikovimi vezmi omogo£ata ve£je tokove kot adenin in timin s po dvema. [17]

(13)

Slika 11: Rezultati simulacije, ki so jo opravili Saha et al (a - d) [18] in ilustracija simulacije Min et al (e) [19]. (a) Gra£en prikaz simulacije. DNA prehaja skozi nanoporo v smeri osi z, napetost med elektrodama ozna£enima z znakoma + in - pa je v smeri osi x. Na rob cikcakastega nanotraku so vezani vodikovi atomi (belo), na rob znotraj nanopore pa v tem primeru du²ikovi (zeleno). (b) Razmazanost prevodnosti zaradi orientacije nukleotida. Modri pravokotniki ozna£ujejo prevodnosti, ki jih lahko izmerimo za razli£ne orientacije posameznik nukleotidov, ²rarana podro£ja pa ozna£ujejo prekrivanja intervalov razli£nih nukleotidov.

Meritev take vrednosti prevodnosti bi lahko pomenila en ali drugi nukleotid v nanopori. (c, d) Prevodnosti traku pri sobni temperaturi v odvisnosti od atomov vezanih na rob nanopore za prazno nanoporo in za nanoporo zapolnjeno z eno od baz DNA, ki leºi vy−zravnini. Vsaki£

sta uporabljeni dve razli£ni metodi za izra£un rezultata (rde£a in modra £rta).

(14)

4 Zaklju£ek

Uporaba grafena za razvoj sekvenciranja DNA se je v zadnjih letih mo£no pove£ala. Od leta 2010 so razli£ne raziskovalne skupine demonstrirale, da je iz grafena mogo£e relativno eno- stavno izoblikovati nanostrukture, ki jih potrebujemo za sekvenciranje DNA in da se ga da uporabiti kot membrano z nanoporo skozi katero potiskamo DNA. Posebno veliko je ra£unalni²kih simulacij, ki namigujejo, da je z grafenom mogo£e izbolj²ati trenutne postopke, kot sta merjenje ionskega toka in tunelskega toka, ali pa ga uporabiti za popolnoma nove na£ine sekvenciranja DNA. e vedno pa ostaja veliko nere²enih problemov in eksperimentalnega dela, preden bo mogo£e grafen izkori²£ati za komercialno sekvenciranje DNA.

Literatura

[1] http://www.genome.gov/ (2013).

[2] E. Gerstner. Nat. Phys. 6, 11 (2010).

[3] Z. S. Siwy. Nat Nano 5, 10 (2010).

[4] B. Luan, H. Peng, S. Polonsky. Phys. Rev. Lett. 104, 23 (2010).

[5] Y. He, M. Tsutsui, R. H. Scheicher. ACS Nano 7, 1 (2013).

[6] D. Branton, D. W. Deamer, A. Marziali. Nat. Biotechnol. 26, 10 (2008).

[7] B. M. Venkatesan, D. Estrada, S. Banerjee. ACS Nano 6, 1 (2012).

[8] L. Weisen, L. Liang, S. Zhang. arXiv:1308.3305 [cond-mat.mes-hall] (2013).

[9] M. D. Fischbein, M. Drndic. Appl. Phys. Lett. 93, 11 (2008).

[10] B. Song, F. Schneider, Q. Xu. arXiv:1102.0971 [cond-mat.mtrl-sci] (2011).

[11] D. B. Wells, M. Belkin, J. Comer. Nano Lett. 12, 8 (2012).

[12] C. A. Merchant, K. Healy, M. Wanunu. Nano Lett. 10, 8 (2010).

[13] G. F. Schneider, S. W. Kowalczyk, V. E. Calado. Nano Lett. 10, 8 (2010).

[14] S. Garaj, W. Hubbard, A. Reina. Nature 467, 7312 (2010).

[15] M. Zwolak, M. Di ventra. Nano Lett. 5, 3 (2005).

[16] T. Nelson, B. Zhang, O. V. Prezhdo. Nano Lett. 10, 9 32373242 (2010).

[17] Q. Zhao, Y. Wang, , J. Doug. J. Nano Mat. 2012 (2012).

[18] K. Saha K., M. Drndic, B. K. Nikolic. Nano Lett. 12, 1 (2011).

[19] S. Kyu Min, W. Youn Kim, Y. Cho. Nat. Nano 6, 3 (2010).

[20] Y. He, R. H. Scheicher, A. Grigoriev. arXiv:1012.0031 [physics.bio-ph] (2010).